ذبابة الفاكهة هو نظام العين أداة مفيدة لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة ، وخاصة الأمراض التنكسية العصبية البشرية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون القياس الكمي اليدوي للأنماط الظاهرية للعين الخشنة منحازا وغير موثوق به. نصف هنا طريقة يتم من خلالها استخدام ilastik و Flynotyper لتحديد النمط الظاهري للعين بطريقة غير متحيزة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
القياس الكمي ذبابة الفاكهة الظلانية للأنماط الظاهرية للعين: نهج حسابي يدمج الأحجار المرنة و Flynotyper
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ذبابة الفاكهة السوداء العين المركبة عبارة عن مجموعة جيدة التنظيم وشاملة من حوالي 800 ommatidia ، تظهر نمطا متماثلا وسداسيا. هذا الانتظام وسهولة الملاحظة يجعلان نظام العين ذبابة الفاكهة أداة قوية لنمذجة الأمراض التنكسية العصبية البشرية المختلفة. ومع ذلك ، فإن طرق تحديد الأنماط الظاهرية غير الطبيعية ، مثل الترتيب اليدوي لدرجات شدة العين ، لها قيود ، خاصة عند ترتيب التغيرات الضعيفة في مورفولوجيا العين. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير مناهج حسابية مثل Flynotyper. يسمح استخدام الضوء الدائري بالحصول على صور نوعية أفضل للوصول إلى سلامة ommatidia الفردية. ومع ذلك ، لا يمكن تحليل هذه الصور بواسطة Flynotyper مباشرة بسبب الظلال على ommatidia التي أدخلها ضوء الحلقة. هنا ، نصف طريقة غير متحيزة لتحديد الأنماط الظاهرية للعين الخشنة التي لوحظت في نماذج مرض ذبابة الفاكهة من خلال الجمع بين برنامجين ، ilastik و Flynotyper. من خلال المعالجة المسبقة للصور باستخدام المرونة ، يمكن تحقيق القياس الكمي الناجح للنمط الظاهري للعين الخام باستخدام Flynotyper.
المقدمة
يحتوي جينوم ذبابة الفاكهة السوداء على ~ 75٪ من أخصائيي تقويم العظام الجيني المرتبطين بالأمراض البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء تطور ذبابة الفاكهة ، يتم التعبير عن ما يقرب من ثلثي الجينات الموجودة في الجينوم ، مما يجعل ذبابة الفاكهة العين نظاما وراثيا متميزا للتحقيق في الوظائف الجزيئية والخلوية المختلفة ، والتطور ، ونماذج المرض1،2. وبالتالي ، فإن ذبابة الفاكهة هو نظام العين أداة تجريبية مفيدة لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة.
ذبابة الفاكهة العين المركبة عبارة عن مجموعة جيدة التنظيم وشاملة من ~ 800 ommatidia التي تظهر نمطا متماثلا وسداسيا3. يمكن استخدام انتظام هذا النمط السداسي لتقدير تأثير إدخال الطفرات وتغيرات التعبير الجيني في مورفولوجيا العين4. اعتمدت الدراسات السابقة التي تتطلب تقييم مورفولوجيا العين بشكل كبير على الترتيب اليدوي لشدة الأنماط الظاهرية للعين التي اكتشفتها العين المجردة. لترتيب الأنماط الظاهرية للعين ، يتم التقاط صور مورفولوجيا العين الخارجية بواسطة مجهر مجسم5،6. يتم تقييم النمط الظاهري للعين لكل مجموعة عن طريق تقسيم العين الخارجية إلى أربع مناطق وحساب نسبة التنكس في كل منطقة5،6. بعد ذلك ، يتم استخدام القيم لحساب المتوسطات التي تتم مقارنتها بالقيم التي تم الحصول عليها من ذباب التحكم7. يعتمد التسجيل على مدى الاندماج وفقدان الأوماتيديا وتنظيم الشعر الخشن7،8. يتم الحصول على صور عين الذبابة التي تم التقاطها باستخدام مجهر مجسم من قبل باحث واحد ، ويتم إجراء تحليل النمط الظاهري للعين بواسطة باحث آخر بمجموعات التحقق الثلاثية7،8.
عندما يتعلق الأمر بترتيب التغيرات الضعيفة في مورفولوجيا العين بالعين المجردة ، فهناك قيود4. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير مناهج حسابية مثل FLEYE و Flynotyper1،9. Flynotyper هي طريقة حسابية جديدة لتقدير التغيرات المورفولوجية كميا في ذبابة الفاكهة نظام العين1. يكتشف تلقائيا ذبابة الفاكهة العين والأوماتيديوم الفردي ، ويحسب الدرجات المظهرية (P-Scores) بناء على عدم انتظامالعين1. تشير درجة P الأعلى إلى أن عين الذبابة أكثر تدهورا. تم استخدام هذا البرنامج بنجاح في تحديد شذوذ ذبابة الفاكهة عيون10. على الرغم من أن Flynotyper يضمن عملية آلية ، إلا أنه لا يزال من غير الممكن تطبيقه بنجاح على بعض صور العين التي تم التقاطها بواسطة طرق الفحص المجهري الضوئي المختلفة.
من الناحية النوعية ، نفضل مصدر الضوء الحلقي مقارنة بمصدر الضوء أحادي النقطة ، لأنه يوفر تمثيلا أكثر دقة لكل أوماتيديوم. ومع ذلك ، عند استخدام الضوء الدائري ، فإنه يولد ظلا على شكل حلقة في الجزء العلوي من كل أوماتيديوم بسبب الشكل نصف الكروي للأوماتيديوم. يمنع هذا الظل على شكل حلقة الكشف الدقيق عن البصيرة بواسطة Flynotyper ، مما يؤدي إلى حساب غير صحيح لدرجات P.
للتغلب على هذه المشكلات ، قمنا بتنفيذ ilastik ، وهي أداة قائمة على التعلم الآلي لتحليلات مختلفة ، لتصنيف ommatidia في صور عينالذبابة 11. ثم قمنا بتغذية الصور التي تم إنشاؤها بواسطة المرونة في Flynotyper لحساب P-Scores. هذا يسمح لنا بتحديد العيوب المورفولوجية للعين ذبابة الفاكهة بشكل غير متحيز1.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. التحضير للقياس الكمي
- قم بتنزيل وتثبيت ilastik11 و ImageJ و ImageJ المكون الإضافي Flynotyper1. انظر جدول المواد للحصول على روابط موقع الويب للتثبيت. قم بتنزيل الحزم المناسبة وفقا لنظام تشغيل الكمبيوتر (Mac ، Windows ، Linux ، إلخ). اتبع تعليمات التثبيت تماما كما هو مذكور.
ملاحظة: من الضروري اتباع التوجيهات تماما كما هو مذكور في الروابط المتوفرة. يحتاج الكمبيوتر المستخدم إلى نظام تشغيل 64 بت. خلاف ذلك ، لا توجد مواصفات أخرى مطلوبة. راجع جدول المواد لمعرفة مواصفات الكمبيوتر للنظام المستخدم لهذا البروتوكول. - استخدم صورة قياسية لتدريب نموذج التعلم الآلي. التقط صورة لعين ذبابة صحية باستخدام مجهر ضوئي مزود بضوء حلقي (مثل w1118 x GMR-GAL4) ، باستخدام مركز العين كنقطة محورية. تحليل الذكور والإناث بشكل منفصل ؛ لذلك ، احصل على صورة قياسية للذكور والإناث.
ملاحظة: ستختلف الإعدادات بشكل كبير حسب المجهر والكاميرا. انظر الفقرة الثانية في المناقشة لمزيد من المعلومات العامة حول إعداد الذبابة والحصول على الصور. - التقط صورا لعيون الذبابة التجريبية باستخدام نفس الإعدادات المستخدمة للحصول على الصور القياسية.
ملاحظة: التوجيه الجيد أمر بالغ الأهمية للقياس الكمي الدقيق. انظر الشكل 4 كمثال للتوجيه الصحيح.
2. استخدام المرونة للكشف عن ommatidia من صور عين الذبابة
- قبل بدء التحليل ، تأكد من أن جميع المجموعات التجريبية ، بغض النظر عن الحالة التجريبية ، موجودة في نفس مجلد الملف لتسهيل العمليات التالية. تأكد من تسمية الملفات بشكل مناسب لتحديد المجموعات التجريبية والتمييز بين الذكور والإناث.
ملاحظة: نوصي بطباعة البروتوكول واستخدام الكمبيوتر لتكبير الأشكال ، حيث يتم اتباع هذا البروتوكول بسهولة مرئية. - افتح البرنامج.
ملاحظة: ينصح بعدم فتح تطبيقات أخرى أثناء تشغيل البرنامج ؛ خلاف ذلك ، قد يعمل الكمبيوتر ببطء شديد ، خاصة في الأنظمة القديمة أو الأقل قوة. - انقر فوق إنشاء مشروع جديد | مهام سير العمل الأخرى، اختر عد كثافة الخلية، وحدد موقعا لحفظ ملف المشروع (الشكل 1 أ).
- انقر فوق 1. بيانات الإدخال | إضافة جديد | أضف صورة (صور) منفصلة. اختر الصورة القياسية (الشكل 1 ب).
- انقر فوق 2. تحديد الميزات وتحديد الميزات المراد استخدامها. حدد الميزات الموضحة في الشكل 1C ؛ اختر المزيد من قيم سيجما لزيادة الحساسية (على سبيل المثال ، 10 ، 15 ، 20 ، إلخ).
ملاحظة: إذا تم تحديد عدد كبير جدا من المربعات ، فقد يعمل البرنامج لفترة طويلة. - انقر فوق 3. العد وتعيين قيمة سيجما المقدمة إلى 5.00. ضع علامة على 50 أو أكثر من الأوماتيديوم الفردي باستخدام أداة Foreground على الصورة القياسية.
ملاحظة: عادة ما تكون خمسون علامة كافية للتحليل. ومع ذلك ، كلما زادت علامات ommatidia ، زادت دقة النتائج (الشكل 1 د). - انقر فوق 3. العد واستخدام أداة الخلفية لتمييز الجزء الخارجي من ommatidia (الشكل 1E). ارسم خطوطا خضراء في شكل شبكي حول ommatidia.
ملاحظة: على غرار المزيد من العلامات على ommatidia ، كلما زاد رسم الخطوط الخضراء ، زادت دقة النتائج. - انقر فوق 4. تصدير الكثافة | اختر تصدير إعدادات الصورة لتعيين إعدادات الصورة (الشكل 1F). انقر فوق معلومات ملف الإخراج | حدد التنسيق و tif لمزيد من التحليل في Flynotyper.
- انقر فوق 5. معالجة الدفعات | حدد ملفات البيانات الأولية وحدد جميع صور الذباب التجريبية المراد تحليلها (الشكل 1G). تظهر قائمة الصور المستوردة المراد تحليلها ضمن تحديد ملفات البيانات الأولية (الشكل 1H). انقر فوق معالجة جميع الملفات في الجزء السفلي من 5. قسم معالجة الدفعات .
ملاحظة: للتذكير، يجب إجراء تحليلات الذكور والإناث بشكل منفصل. اعتمادا على الكمبيوتر المستخدم ، يمكن أن تستغرق هذه الخطوة 10 دقائق أو أكثر ، خاصة إذا كان هناك العديد من الصور المستوردة. - بعد انتهاء البرنامج ، تحقق من نفس مجلد الملفات الذي يحتوي على صور عين الذبابة التجريبية ؛ ستكون هناك صور سوداء تسمى "YourSampleName_Probabilities" (الشكل 1I).
3. استخدام ImageJ لإعداد الصور ل Flynotyper
- افتح ملف .tif الذي تم إنشاؤه بواسطة ilastik (المربعات السوداء) في ImageJ.
ملاحظة: يجب التعامل مع كل ملف .tif تم إنشاؤه من المرونة بشكل منفصل. - استخدم أداة تحديد المستطيل لعمل مستطيل حول العين فقط. بعد رسم المستطيل، قم بقص المنطقة إما عن طريق اختيار Ctrl + X أو Ctrl + C (الشكل 2 أ). انتظر حتى يظهر مربع أسود على شكل مخطط مستطيل.
ملاحظة: سيحدد نظام تشغيل الكمبيوتر ما إذا كان سيتم استخدام "Ctrl + X" أو "Ctrl + C". عادة ما يكون "Ctrl + X" مخصصا لنظام التشغيل Windows و "Ctrl + C" لنظام التشغيل Mac. - افتح عين الذبابة المقطوعة الآن باستخدام ImageJ ؛ انقر فوق ملف | جديد | الحافظة الداخلية (الشكل 2 ب).
- احفظ عين الذبابة المقطوعة بتنسيق JPEG بالنقر فوق ملف | حفظ باسم | بتنسيق JPEG. الصور المقطوعة موجودة الآن في نفس مجلد الملفات مثل الصور التجريبية الأصلية.
ملاحظة: لتسهيل الخطوة التالية ، يوصى بإنشاء مجلد ملف جديد يسمى "قص" ووضع جميع الصور المقطوعة في هذا المجلد.
4. استخدام Flynotyper لحساب درجات النمط الظاهري
- افتح Flynotyper كمكون إضافي ل ImageJ بالنقر فوق الإضافات | فلينوتايبر.
- حدد إضافة الأنماط الجينية وافتح المجلد الذي يحتوي على صور عين الذبابة المقطوعة (مجلد ملف القص). سيظهر اسم المجلد ضمن الأنماط الجينية (الشكل 2 ج).
- تحقق من المجهر الضوئي والمربعات عموديا ولكن اضبطها وفقا لذلك إذا لزم الأمر. حدد المربعات الثبات والمسافة إلى المركز ضمن رتبة Ommatidia من خلال: (الشكل 2C).
- بالنسبة لعدد الأوماتيديا المصنفة التي تم النظر فيها ، أدخل 200.
ملاحظة: بشكل عام ، 200 هو رقم جيد ولكن قم بتعديله وفقا للتفضيلات. - انقر فوق تشغيل وانتظر حتى تظهر نتائج التحليل (الشكل 2 د).
ملاحظة: قد تستغرق هذه الخطوة 5 دقائق أو أكثر (أو أقصر) اعتمادا على قوة معالجة الكمبيوتر المستخدم. - انسخ والصق ملف العينة و P-Score في برنامج إحصائي لمزيد من التحليل.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في دراسة سابقة ، استخدمنا هذا البروتوكول لتحديد المعدلات الجينية لبروتين VCP المتحور المرتبط بالتصلب الجانبي الضموري مع الخرف الجبهي الصدغي (ALS-FTD) 12. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه الطريقة أيضا في ورقة أخرى لتقييم سمية CHCHD10 ALS-FTD بوساطةS59L ، حتى عند استخدام مجهر مجسمةقديم 13. لمزيد من التحقق من صحة هذه النتائج ، استخدمنا ilastik و Flynotyper في نفس طفرة مرض ALS-FTD مثل Baek et al.13. ومع ذلك ، أجرى موظفو المختبر غير المدربين ا...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تشتمل أوماتيديا ذبابة الفاكهة على نظام مفيد لدراسة الوظائف البيولوجية المختلفة والأمراض الوراثية. يعد انتظام ommatidia مقياسا جيدا لفحص تأثير الطفرات الجينية4. على الرغم من وجود عدة طرق لحساب انتظام الطب ، مثل الترتيب اليدوي ، إلا أن هذه الطرق يمكن أن تكون متحيزة بشدة. للتغلب على هذا النهج المتحيز ، تم تطوير أدوات شبه آلية1،11.
من أجل القياس الكمي الدقيق للعين ، يجب تحس...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.
شكر وتقدير
نشكر بيدرو فرنانديز فونيز على استخدام المجهر والكاميرا المستخدمة في هذا البروتوكول. نود أيضا أن نشكر آفا شابمان على تقديم ملاحظات حول وضوح البروتوكول. تم تقديم الدعم المالي من قبل صندوق Wallin Neuroscience Discovery Fund إلى Nam Chul Kim.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مواصفات | Ryzen 5 ، 16 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي ، Nvidia RTX 3070 Super ، Windows 10 | ||
| Flynotyper | Iyer ، J. et al. (2016) | قم بتنزيل البرنامج هنا: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.html | برنامج مفتوح المصدر. لا تستخدم Flynotyper 2.0. في وقت النشر ، كان 2.0 جديدا إلى حد ما وتم تحسين هذا البروتوكول للإصدار الأصلي من Flynotyper. |
| ilastik | Berg، S. et al. (2019) | قم بتنزيل البرنامج هنا: https://www.ilastik.org/download.html | برنامج مفتوح المصدر. قم بتنزيل الإصدار 1.4.0.post1 ضمن الإصدارات العادية المقابلة لنظام تشغيل جهاز الكمبيوتر الخاص بك. |
| ImageJ | قم بتنزيل البرنامج هنا: https://imagej.net/ij/download.html | برنامج مفتوح المصدر. تم استخدام الإصدارين 1.53 و 1.54. 1.54 هو الإصدار المحدث وهو التنزيل الافتراضي. | |
| مجموعة تطبيقات Leica (LAS X) | Leica Microsystems | LASX Office 1.4.6 28433 | النظام والبرامج المستخدمة للحصول على z-stack. |
| مجهر Leica Z16 APO مع كاميرا DMC2900 | Leica Microsystems | 10 447 173 ، 12 730 466 | يشار إليه باسم مجهر Z-stack والكاميرا في النص. هذا المنتج مؤرشف الآن. |
المراجع
- Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
- Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
- Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
- Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
- Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
- Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
- Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
- Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
- Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
- Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
- Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
- Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
- Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
