مقالة منهجية

القياس الكمي ذبابة الفاكهة الظلانية للأنماط الظاهرية للعين: نهج حسابي يدمج الأحجار المرنة و Flynotyper

DOI:

10.3791/67219

⸱

أكتوبر 4, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy Practice and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Minnesota

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة هو نظام العين أداة مفيدة لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة ، وخاصة الأمراض التنكسية العصبية البشرية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون القياس الكمي اليدوي للأنماط الظاهرية للعين الخشنة منحازا وغير موثوق به. نصف هنا طريقة يتم من خلالها استخدام ilastik و Flynotyper لتحديد النمط الظاهري للعين بطريقة غير متحيزة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ذبابة الفاكهة السوداء العين المركبة عبارة عن مجموعة جيدة التنظيم وشاملة من حوالي 800 ommatidia ، تظهر نمطا متماثلا وسداسيا. هذا الانتظام وسهولة الملاحظة يجعلان نظام العين ذبابة الفاكهة أداة قوية لنمذجة الأمراض التنكسية العصبية البشرية المختلفة. ومع ذلك ، فإن طرق تحديد الأنماط الظاهرية غير الطبيعية ، مثل الترتيب اليدوي لدرجات شدة العين ، لها قيود ، خاصة عند ترتيب التغيرات الضعيفة في مورفولوجيا العين. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير مناهج حسابية مثل Flynotyper. يسمح استخدام الضوء الدائري بالحصول على صور نوعية أفضل للوصول إلى سلامة ommatidia الفردية. ومع ذلك ، لا يمكن تحليل هذه الصور بواسطة Flynotyper مباشرة بسبب الظلال على ommatidia التي أدخلها ضوء الحلقة. هنا ، نصف طريقة غير متحيزة لتحديد الأنماط الظاهرية للعين الخشنة التي لوحظت في نماذج مرض ذبابة الفاكهة من خلال الجمع بين برنامجين ، ilastik و Flynotyper. من خلال المعالجة المسبقة للصور باستخدام المرونة ، يمكن تحقيق القياس الكمي الناجح للنمط الظاهري للعين الخام باستخدام Flynotyper.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحتوي جينوم ذبابة الفاكهة السوداء على ~ 75٪ من أخصائيي تقويم العظام الجيني المرتبطين بالأمراض البشرية. بالإضافة إلى ذلك ، أثناء تطور ذبابة الفاكهة ، يتم التعبير عن ما يقرب من ثلثي الجينات الموجودة في الجينوم ، مما يجعل ذبابة الفاكهة العين نظاما وراثيا متميزا للتحقيق في الوظائف الجزيئية والخلوية المختلفة ، والتطور ، ونماذج المرض1،2. وبالتالي ، فإن ذبابة الفاكهة هو نظام العين أداة تجريبية مفيدة لدراسة العمليات البيولوجية المختلفة.

ذبابة الفاكهة العين المركبة عبارة عن مجموعة جيدة التنظيم وشاملة من ~ 800 ommatidia التي تظهر نمطا متماثلا وسداسيا3. يمكن استخدام انتظام هذا النمط السداسي لتقدير تأثير إدخال الطفرات وتغيرات التعبير الجيني في مورفولوجيا العين4. اعتمدت الدراسات السابقة التي تتطلب تقييم مورفولوجيا العين بشكل كبير على الترتيب اليدوي لشدة الأنماط الظاهرية للعين التي اكتشفتها العين المجردة. لترتيب الأنماط الظاهرية للعين ، يتم التقاط صور مورفولوجيا العين الخارجية بواسطة مجهر مجسم5،6. يتم تقييم النمط الظاهري للعين لكل مجموعة عن طريق تقسيم العين الخارجية إلى أربع مناطق وحساب نسبة التنكس في كل منطقة5،6. بعد ذلك ، يتم استخدام القيم لحساب المتوسطات التي تتم مقارنتها بالقيم التي تم الحصول عليها من ذباب التحكم7. يعتمد التسجيل على مدى الاندماج وفقدان الأوماتيديا وتنظيم الشعر الخشن7،8. يتم الحصول على صور عين الذبابة التي تم التقاطها باستخدام مجهر مجسم من قبل باحث واحد ، ويتم إجراء تحليل النمط الظاهري للعين بواسطة باحث آخر بمجموعات التحقق الثلاثية7،8.

عندما يتعلق الأمر بترتيب التغيرات الضعيفة في مورفولوجيا العين بالعين المجردة ، فهناك قيود4. للتغلب على هذه القيود ، تم تطوير مناهج حسابية مثل FLEYE و Flynotyper1،9. Flynotyper هي طريقة حسابية جديدة لتقدير التغيرات المورفولوجية كميا في ذبابة الفاكهة نظام العين1. يكتشف تلقائيا ذبابة الفاكهة العين والأوماتيديوم الفردي ، ويحسب الدرجات المظهرية (P-Scores) بناء على عدم انتظامالعين1. تشير درجة P الأعلى إلى أن عين الذبابة أكثر تدهورا. تم استخدام هذا البرنامج بنجاح في تحديد شذوذ ذبابة الفاكهة عيون10. على الرغم من أن Flynotyper يضمن عملية آلية ، إلا أنه لا يزال من غير الممكن تطبيقه بنجاح على بعض صور العين التي تم التقاطها بواسطة طرق الفحص المجهري الضوئي المختلفة.

من الناحية النوعية ، نفضل مصدر الضوء الحلقي مقارنة بمصدر الضوء أحادي النقطة ، لأنه يوفر تمثيلا أكثر دقة لكل أوماتيديوم. ومع ذلك ، عند استخدام الضوء الدائري ، فإنه يولد ظلا على شكل حلقة في الجزء العلوي من كل أوماتيديوم بسبب الشكل نصف الكروي للأوماتيديوم. يمنع هذا الظل على شكل حلقة الكشف الدقيق عن البصيرة بواسطة Flynotyper ، مما يؤدي إلى حساب غير صحيح لدرجات P.

للتغلب على هذه المشكلات ، قمنا بتنفيذ ilastik ، وهي أداة قائمة على التعلم الآلي لتحليلات مختلفة ، لتصنيف ommatidia في صور عينالذبابة 11. ثم قمنا بتغذية الصور التي تم إنشاؤها بواسطة المرونة في Flynotyper لحساب P-Scores. هذا يسمح لنا بتحديد العيوب المورفولوجية للعين ذبابة الفاكهة بشكل غير متحيز1.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التحضير للقياس الكمي

  1. قم بتنزيل وتثبيت ilastik11 و ImageJ و ImageJ المكون الإضافي Flynotyper1. انظر جدول المواد للحصول على روابط موقع الويب للتثبيت. قم بتنزيل الحزم المناسبة وفقا لنظام تشغيل الكمبيوتر (Mac ، Windows ، Linux ، إلخ). اتبع تعليمات التثبيت تماما كما هو مذكور.
    ملاحظة: من الضروري اتباع التوجيهات تماما كما هو مذكور في الروابط المتوفرة. يحتاج الكمبيوتر المستخدم إلى نظام تشغيل 64 بت. خلاف ذلك ، لا توجد مواصفات أخرى مطلوبة. راجع جدول المواد لمعرفة مواصفات الكمبيوتر للنظام المستخدم لهذا البروتوكول.
  2. استخدم صورة قياسية لتدريب نموذج التعلم الآلي. التقط صورة لعين ذبابة صحية باستخدام مجهر ضوئي مزود بضوء حلقي (مثل w1118 x GMR-GAL4) ، باستخدام مركز العين كنقطة محورية. تحليل الذكور والإناث بشكل منفصل ؛ لذلك ، احصل على صورة قياسية للذكور والإناث.
    ملاحظة: ستختلف الإعدادات بشكل كبير حسب المجهر والكاميرا. انظر الفقرة الثانية في المناقشة لمزيد من المعلومات العامة حول إعداد الذبابة والحصول على الصور.
  3. التقط صورا لعيون الذبابة التجريبية باستخدام نفس الإعدادات المستخدمة للحصول على الصور القياسية.
    ملاحظة: التوجيه الجيد أمر بالغ الأهمية للقياس الكمي الدقيق. انظر الشكل 4 كمثال للتوجيه الصحيح.

2. استخدام المرونة للكشف عن ommatidia من صور عين الذبابة

  1. قبل بدء التحليل ، تأكد من أن جميع المجموعات التجريبية ، بغض النظر عن الحالة التجريبية ، موجودة في نفس مجلد الملف لتسهيل العمليات التالية. تأكد من تسمية الملفات بشكل مناسب لتحديد المجموعات التجريبية والتمييز بين الذكور والإناث.
    ملاحظة: نوصي بطباعة البروتوكول واستخدام الكمبيوتر لتكبير الأشكال ، حيث يتم اتباع هذا البروتوكول بسهولة مرئية.
  2. افتح البرنامج.
    ملاحظة: ينصح بعدم فتح تطبيقات أخرى أثناء تشغيل البرنامج ؛ خلاف ذلك ، قد يعمل الكمبيوتر ببطء شديد ، خاصة في الأنظمة القديمة أو الأقل قوة.
  3. انقر فوق إنشاء مشروع جديد | مهام سير العمل الأخرى، اختر عد كثافة الخلية، وحدد موقعا لحفظ ملف المشروع (الشكل 1 أ).
  4. انقر فوق 1. بيانات الإدخال | إضافة جديد | أضف صورة (صور) منفصلة. اختر الصورة القياسية (الشكل 1 ب).
  5. انقر فوق 2. تحديد الميزات وتحديد الميزات المراد استخدامها. حدد الميزات الموضحة في الشكل 1C ؛ اختر المزيد من قيم سيجما لزيادة الحساسية (على سبيل المثال ، 10 ، 15 ، 20 ، إلخ).
    ملاحظة: إذا تم تحديد عدد كبير جدا من المربعات ، فقد يعمل البرنامج لفترة طويلة.
  6. انقر فوق 3. العد وتعيين قيمة سيجما المقدمة إلى 5.00. ضع علامة على 50 أو أكثر من الأوماتيديوم الفردي باستخدام أداة Foreground على الصورة القياسية.
    ملاحظة: عادة ما تكون خمسون علامة كافية للتحليل. ومع ذلك ، كلما زادت علامات ommatidia ، زادت دقة النتائج (الشكل 1 د).
  7. انقر فوق 3. العد واستخدام أداة الخلفية لتمييز الجزء الخارجي من ommatidia (الشكل 1E). ارسم خطوطا خضراء في شكل شبكي حول ommatidia.
    ملاحظة: على غرار المزيد من العلامات على ommatidia ، كلما زاد رسم الخطوط الخضراء ، زادت دقة النتائج.
  8. انقر فوق 4. تصدير الكثافة | اختر تصدير إعدادات الصورة لتعيين إعدادات الصورة (الشكل 1F). انقر فوق معلومات ملف الإخراج | حدد التنسيق و tif لمزيد من التحليل في Flynotyper.
  9. انقر فوق 5. معالجة الدفعات | حدد ملفات البيانات الأولية وحدد جميع صور الذباب التجريبية المراد تحليلها (الشكل 1G). تظهر قائمة الصور المستوردة المراد تحليلها ضمن تحديد ملفات البيانات الأولية (الشكل 1H). انقر فوق معالجة جميع الملفات في الجزء السفلي من 5. قسم معالجة الدفعات .
    ملاحظة: للتذكير، يجب إجراء تحليلات الذكور والإناث بشكل منفصل. اعتمادا على الكمبيوتر المستخدم ، يمكن أن تستغرق هذه الخطوة 10 دقائق أو أكثر ، خاصة إذا كان هناك العديد من الصور المستوردة.
  10. بعد انتهاء البرنامج ، تحقق من نفس مجلد الملفات الذي يحتوي على صور عين الذبابة التجريبية ؛ ستكون هناك صور سوداء تسمى "YourSampleName_Probabilities" (الشكل 1I).

3. استخدام ImageJ لإعداد الصور ل Flynotyper

  1. افتح ملف .tif الذي تم إنشاؤه بواسطة ilastik (المربعات السوداء) في ImageJ.
    ملاحظة: يجب التعامل مع كل ملف .tif تم إنشاؤه من المرونة بشكل منفصل.
  2. استخدم أداة تحديد المستطيل لعمل مستطيل حول العين فقط. بعد رسم المستطيل، قم بقص المنطقة إما عن طريق اختيار Ctrl + X أو Ctrl + C (الشكل 2 أ). انتظر حتى يظهر مربع أسود على شكل مخطط مستطيل.
    ملاحظة: سيحدد نظام تشغيل الكمبيوتر ما إذا كان سيتم استخدام "Ctrl + X" أو "Ctrl + C". عادة ما يكون "Ctrl + X" مخصصا لنظام التشغيل Windows و "Ctrl + C" لنظام التشغيل Mac.
  3. افتح عين الذبابة المقطوعة الآن باستخدام ImageJ ؛ انقر فوق ملف | جديد | الحافظة الداخلية (الشكل 2 ب).
  4. احفظ عين الذبابة المقطوعة بتنسيق JPEG بالنقر فوق ملف | حفظ باسم | بتنسيق JPEG. الصور المقطوعة موجودة الآن في نفس مجلد الملفات مثل الصور التجريبية الأصلية.
    ملاحظة: لتسهيل الخطوة التالية ، يوصى بإنشاء مجلد ملف جديد يسمى "قص" ووضع جميع الصور المقطوعة في هذا المجلد.

4. استخدام Flynotyper لحساب درجات النمط الظاهري

  1. افتح Flynotyper كمكون إضافي ل ImageJ بالنقر فوق الإضافات | فلينوتايبر.
  2. حدد إضافة الأنماط الجينية وافتح المجلد الذي يحتوي على صور عين الذبابة المقطوعة (مجلد ملف القص). سيظهر اسم المجلد ضمن الأنماط الجينية (الشكل 2 ج).
  3. تحقق من المجهر الضوئي والمربعات عموديا ولكن اضبطها وفقا لذلك إذا لزم الأمر. حدد المربعات الثبات والمسافة إلى المركز ضمن رتبة Ommatidia من خلال: (الشكل 2C).
  4. بالنسبة لعدد الأوماتيديا المصنفة التي تم النظر فيها ، أدخل 200.
    ملاحظة: بشكل عام ، 200 هو رقم جيد ولكن قم بتعديله وفقا للتفضيلات.
  5. انقر فوق تشغيل وانتظر حتى تظهر نتائج التحليل (الشكل 2 د).
    ملاحظة: قد تستغرق هذه الخطوة 5 دقائق أو أكثر (أو أقصر) اعتمادا على قوة معالجة الكمبيوتر المستخدم.
  6. انسخ والصق ملف العينة و P-Score في برنامج إحصائي لمزيد من التحليل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في دراسة سابقة ، استخدمنا هذا البروتوكول لتحديد المعدلات الجينية لبروتين VCP المتحور المرتبط بالتصلب الجانبي الضموري مع الخرف الجبهي الصدغي (ALS-FTD) 12. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام هذه الطريقة أيضا في ورقة أخرى لتقييم سمية CHCHD10 ALS-FTD بوساطةS59L ، حتى عند استخدام مجهر مجسمةقديم 13. لمزيد من التحقق من صحة هذه النتائج ، استخدمنا ilastik و Flynotyper في نفس طفرة مرض ALS-FTD مثل Baek et al.13. ومع ذلك ، أجرى موظفو المختبر غير المدربين التجربة وحصلوا على نتائج مماثلة. وبالتالي ، فإن الجمع بين المرونة و Flynotyper هو طريقة قوية لتسجيل تنكس ذبابة الفاكهة بشكل غير متحيز.

نحن نفضل استخدام الضوء الحلقي لأنه يسمح بتقييمات نوعية أفضل (الشكل 3). ومع ذلك ، فإن استخدام الضوء الحلقي يسبب ظلا لا يمكن ل Flynotyper تحليله مباشرة. للتغلب على هذا ، قمنا بمعالجة الصور مسبقا في ilastik قبل تحديد P-Scores باستخدام Flynotyper. بشكل عام ، كانت P-Scores للعين الذبابة غير المتدهورة (GMR-GAL4) أقل بكثير مقارنة بالعين المتدهورة بشكل معتدل (2x_S81L) والعين المتدهورة بشدة (3x_S81L) (الشكل 4 أ ، ب والجدول 1). هذه هي النتيجة المتوقعة ، حيث تشير درجات P الأعلى التي تم إنشاؤها من Flynotyper إلى وجود عين أكثر تدهورا1. عندما لم يتم استخدام المرونة ، كانت هناك اختلافات ضئيلة في P-Scores بين العين غير المتدهورة والعين المتدهورة بشكل معتدل (الشكل 4C والجدول 1). يشير هذا إلى أن Flynotyper يكافح لتحديد أنماط ommatidia بدقة في ظل ظروف الإضاءة الحلقية دون استخدام المرونة. وذلك لأن Flynotyper مصمم لاستخدام الصور الملتقطة بضوء ثنائي النقطة يتم تحويله إلى تدرج الرمادي مع تعديلات إضافية لتحديد مركز ommatidial1. يقوم Ilastik بتكرار هذه العملية من خلال دمج نقطة في وسط كل ommatidium ، مما يتيح القياس الكمي داخل Flynotyper.

figure-results-1
الشكل 1: مثال على سير عمل المرونة. (أ) إنشاء مشروع جديد في المرونة. (ب) اختيار الصورة القياسية. (ج) تحديد قيم سيجما ضمن تحديد الميزة. (د) وضع علامة على مقدمة ommatidia للحساسية. (ه) وضع علامات على خلفية ommatidia للحساسية. (و) تحديد كيفية تصدير البرنامج للملفات المعالجة. (ز) اختيار الصور التجريبية لعين الذبابة المراد تحليلها. (ح) إظهار الصور التجريبية التي سيتم تحليلها لعين الذبابة. (ط) المنتج النهائي بعد تشغيل البرنامج. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مثال على سير عمل Flynotyper. (أ) اختيار عين الذبابة فقط لمزيد من التحليل. (ب) فتح صورة العين المقطوعة في نافذة جديدة. (ج) اختيار الصور المقطوعة التي سيتم تحليلها والمعلمات التي سيتم فحصها لتحليلها. (د) أمثلة على النتائج. يتم تقديم درجات النمط الظاهري في أقصى اليمين. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: ذبابة الفاكهة النوعية صور العين. نفس عين الذبابة المأخوذة بضوء حلقي (يسار) وتم التقاطها بضوء ثنائي النقطة (يمين) في ظروف غير متدهورة (أعلى) ومتدهورة (أسفل). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: استخدام المرونة قبل Flynotyper لتقدير دقيق للنمط الظاهري للعين الخشنة في ذبابة الفاكهة. (أ) صور عين ذبابة الفاكهة التمثيلية للعين غير المتدهورة (GMR-GAL4) ، وعين متدهورة بشكل معتدل (2x_S81L) ، وعين شديدة الانحطاط (3x_S81L). (ب) نتائج القياس الكمي من Flynotyper بعد استخدام المرونة. تم حساب قيم P لاختبار t التقليب على الوجهين للمساعدة في تسهيل تفسير النتائج (GMR-GAL4 مقابل 2x_S81L: p = 0 ، GMR-GAL4 مقابل 3x_S81L: p = 0) (C) نتائج القياس الكمي من Flynotyper دون استخدام اللاستيك. تم حساب قيم P لاختبار t التقليب على الوجهين للمساعدة في تسهيل تفسير النتائج (GMR-GAL4 مقابل 2x_S81L: p = 0.597 ، GMR-GAL4 مقابل 3x_S81L: p = 0.687). N = 3 لكل مجموعة. يتم ارتعاش نقاط البيانات أو تكديسها على المحور x لتحقيق الوضوح البصري. يمثل الخط الأفقي الصلب المتوسط. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

جي ام آر - جال 42x_S81L3x_S81L
مع المرونةبدون المرونةمع المرونةبدون المرونةمع المرونةبدون المرونة
26.755.752.551.259.955.6
17.453.55054.960.752
22.855.556.855.260.155.1

الجدول 1: P-Scores عند استخدام Flynotyper مع ilastik وعند استخدام Flynotyper وحده.

الشكل التكميلي S1: تم إعداد حامل رأس الذبابة للحصول على الصور. هذا مثال على كيفية الإعداد للحصول على الصور باستخدام أوراق متعددة. ومع ذلك ، يمكن استخدام أي طريقة تضمن التوجيه الصحيح للرأس وعين الذبابة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S2: النتائج الكمية ل ilastik و Flynotyper عند استخدام قيمة سيجما 2.5 تحت اختيار الميزة. يمكن أن يؤدي استخدام قيمة سيجما بخلاف 5.0 ضمن تحديد الميزة في ilastik إلى تقدير غير دقيق. على وجه التحديد ، تؤدي قيمة سيجما البالغة 2.5 إلى فقدان الحساسية. تم حساب قيم P لاختبار t التقليب على الوجهين للمساعدة في تسهيل تفسير النتائج (GMR-GAL4 مقابل 2x_S81L: p = 0.192 ، GMR-GAL4 مقابل 3x_S81L: p = 0). N = 3 لكل مجموعة. يتم ارتعاش نقاط البيانات أو تكديسها على المحور x لتحقيق الوضوح البصري. يمثل الخط الأفقي الصلب المتوسط. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الشكل التكميلي S3: فقدان الحساسية ودرجات P غير الدقيقة بسبب البقع النخرية. تشير الأسهم البيضاء إلى أجزاء من البقع النخرية. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي S1: P-Scores عند استخدام قيمة سيجما 2.5 ضمن اختيار الميزة. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشتمل أوماتيديا ذبابة الفاكهة على نظام مفيد لدراسة الوظائف البيولوجية المختلفة والأمراض الوراثية. يعد انتظام ommatidia مقياسا جيدا لفحص تأثير الطفرات الجينية4. على الرغم من وجود عدة طرق لحساب انتظام الطب ، مثل الترتيب اليدوي ، إلا أن هذه الطرق يمكن أن تكون متحيزة بشدة. للتغلب على هذا النهج المتحيز ، تم تطوير أدوات شبه آلية1،11.

من أجل القياس الكمي الدقيق للعين ، يجب تحسين إعداد الذبابة وإعدادها. بينما نتفهم أن كل مختبر سيكون له إعداده ، فإننا نقدم الإعداد التالي في مختبرنا لإعطاء القراء فكرة عن كيفية تحضير الذباب للحصول على الصور. يتم تجميد الذباب وتخزينه عند -80 درجة مئوية. استخدمنا حجم عينة 3 لأنه ، في تجربتنا ، عندما يتم دمج GMR-GAL4 مع طفرة S81L ، يكون هناك تباين ضئيل جدا بين السكان. ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أنه يجب تعديل حجم العينة لإجراء اختبار أهمية الفرضية الصفراوية. لتركيب الذباب للحصول على الصورة ، يقع رأس الذبابة على ورقة صغيرة جدا تعمل كوسادة بحيث يكون مركز العين هو المستوى البؤري تقريبا (الشكل التكميلي S1). يستخدم مختبرنا مجهر Z-stack وكاميرا (انظر جدول المواد) حيث ينتج عن ذلك صورا أكثر وضوحا بشكل عام ، مما يسمح بأفضل تصور للعين بأكملها لأن عين الذبابة على شكل قبة. ومع ذلك ، فإن وظيفة Z-stack ليست مطلبا لهذا البروتوكول حيث استخدمنا هذه الطريقة بنجاح مع مجهر مجسم قديم بدون وظيفة Z-stack13. لا يتم تشغيل قرص الضوء الدائري للسطوع أكثر من 1/4 من الطريق لتجنب التعرض المفرط. يتراوح السماكة الإجمالية لعيناتنا بين 300 و 450 ميكرون.

في هذه الدراسة ، أظهرنا أن تحليل عيون الذبابة باستخدام المرونة و Flynotyper يولد نتائج قياس كمية غير متحيزة وموثوقة للommatidia. قمنا بتحليل ذبابة الفاكهة ommatidia أنماط باستخدام ilastik ، وهي أداة لتحليل الصور الحيوية القائمة على التعلم الآلي ، لتمييز ommatidia ، ثم Flynotyper ، وهي طريقة حسابية تستخدم لقياس انتظام ommatidia1،11. نفضل استخدام ضوء دائري للحصول على صور لتقييم نوعي أفضل. ومع ذلك ، فإن هذا النهج لا يسمح ل Flynotyper بإنتاج نتائج كمية باستخدام هذه الصور. لذلك ، يتم تنفيذ ilastik للمعالجة المسبقة لهذه الصور ، وتم استخدام هذه الصور المعالجة بنجاح مع Flynotyper لإنتاج نتائج كمية. عندما لم تتم معالجة الصور مسبقا باستخدام ilastik قبل Flynotyper ، كانت درجات P الإجمالية متشابهة بين العيون غير التنكسية والتنكسية. هذا يسلط الضوء على أهمية استخدام المرونة أولا عند تنفيذ ضوء دائري للحصول على نتائج كمية.

هناك بعض القيود في أساليبنا. يمكن أن تختلف الإعدادات في ilastik اختلافا كبيرا ويمكن أن تؤدي إلى بيانات غير مهمة. على سبيل المثال ، أجرينا مجموعة أخرى من التحليلات باستخدام نفس الصور ولكننا قمنا بتعديل قيمة سيجما المقدمة في المرونة إلى 2.5 بدلا من 5. أدى ذلك إلى فقدان الحساسية في الأنماط الظاهرية التنكسية المعتدلة (الشكل التكميلي S2 والجدول التكميلي S1). قيد آخر هو فقدان الحساسية في العينين مع الكثير من التنكس. بالمقارنة مع العين 3x_S81L ، فإن العين ذات البقع النخرية أكثر تدهورا من الناحية النوعية. ومع ذلك ، كان متوسط درجة P للعيون 3x_S81L 60.2 ، بينما كان متوسط درجة P للعيون ذات البقع النخرية 60.9. وبالتالي ، يمكن أن تؤدي العيون المصابة بالكثير من التنكس ، مثل البقع النخرية ، إلى فقدان الحساسية (الشكل التكميلي S3).

تتمثل إحدى الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول في اختيار صورة قياسية مناسبة ، والتي تستخدم لتدريب المرونة. ستؤدي الصورة القياسية غير المتدهورة ذات التباين الواضح بين ommatidia والخلايا الصبغية المحيطة ، مثل العيون الحمراء أو البرتقالية ، إلى تقدير كمي أكثر دقة في Flynotyper. خطوة أخرى مهمة هي تحديد الميزة في المرونة حيث يتم تحديد الحساسية ، الممثلة كقيم سيجما ، لضبط برنامج التعلم الآلي (الشكل 1 د). يمكن أن يؤدي اختيار عدد قليل جدا من الميزات إلى تقليل حساسية المرونة ، مما يؤدي إلى وضع علامات غير دقيقة على الأوماتيديا. سيؤدي اختيار العديد من الميزات إلى زيادة طول الوقت وقوة المعالجة المطلوبة لتحقيق النتائج ، مما يقلل من كفاءة الإجراء. بدلا من ذلك ، إذا كان هناك تنكس نوعي ملحوظ للعين ، ولكن نتائج التحليل ليست ذات دلالة إحصائية ، فإن زيادة قيمة سيجما للميزات المختارة ستكون إصلاحا محتملا. ومع ذلك ، فإن تحديدات الميزات المتوفرة في هذا البروتوكول تؤدي بانتظام إلى نتائج دقيقة. سيساعد اتباع الخطوات الحاسمة كما هو مكتوب في التخفيف من المشكلات الأكثر شيوعا واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في المستقبل.

باختصار ، توفر هذه الطريقة صورا نوعية أفضل مع إنتاج تقدير كمي غير متحيز وموثوق لنظام ذبابة الفاكهة للعين. وبالتالي ، يمكن أن تعزز هذه الطريقة فائدة تنكس العين كأداة قوية لنمذجة الأمراض التنكسية في المستقبل.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر بيدرو فرنانديز فونيز على استخدام المجهر والكاميرا المستخدمة في هذا البروتوكول. نود أيضا أن نشكر آفا شابمان على تقديم ملاحظات حول وضوح البروتوكول. تم تقديم الدعم المالي من قبل صندوق Wallin Neuroscience Discovery Fund إلى Nam Chul Kim.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مواصفاتRyzen 5 ، 16 جيجابايت من ذاكرة الوصول العشوائي ، Nvidia RTX 3070 Super ، Windows 10
FlynotyperIyer ، J. et al. (2016)قم بتنزيل البرنامج هنا: https://flynotyper.sourceforge.net/imageJ.htmlبرنامج مفتوح المصدر. لا تستخدم Flynotyper 2.0. في وقت النشر ، كان 2.0 جديدا إلى حد ما وتم تحسين هذا البروتوكول للإصدار الأصلي من Flynotyper.
ilastikBerg، S. et al. (2019)قم بتنزيل البرنامج هنا: https://www.ilastik.org/download.htmlبرنامج مفتوح المصدر. قم بتنزيل الإصدار 1.4.0.post1 ضمن الإصدارات العادية المقابلة لنظام تشغيل جهاز الكمبيوتر الخاص بك.
ImageJقم بتنزيل البرنامج هنا: https://imagej.net/ij/download.htmlبرنامج مفتوح المصدر. تم استخدام الإصدارين 1.53 و 1.54. 1.54 هو الإصدار المحدث وهو التنزيل الافتراضي.
مجموعة تطبيقات Leica (LAS X)Leica MicrosystemsLASX Office 1.4.6 28433النظام والبرامج المستخدمة للحصول على z-stack.
مجهر Leica Z16 APO مع كاميرا DMC2900Leica Microsystems10 447 173 ، 12 730 466يشار إليه باسم مجهر Z-stack والكاميرا في النص. هذا المنتج مؤرشف الآن.
الكمبيوتر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Iyer, J., et al. Quantitative assessment of eye phenotypes for functional genetic studies using Drosophila melanogaster. G3. 6 (5), 1427-1437 (2016).
  2. Thomas, B. J., Wassarman, D. A. A fly's eye view of biology. Trends Genet. 15 (5), 184-190 (1999).
  3. Roignant, J. -Y., Treisman, J. E. Pattern formation in the Drosophila eye disc. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 795-804 (2009).
  4. Diez-Hermano, S., Ganfornina, M. D., Vegas, E., Sanchez, D. Machine learning representation of loss of eye regularity in a Drosophila neurodegenerative model. Front Neurosci. 14 (1), 1-14 (2020).
  5. Appocher, C., Klima, R., Feiguin, F. Functional screening in Drosophila reveals the conserved role of REEP1 in promoting stress resistance and preventing the formation of Tau aggregates. Hum Mol Genet. 23 (25), 6762-6772 (2014).
  6. Pandey, U. B., et al. HDAC6 rescues neurodegeneration and provides an essential link between autophagy and the UPS. Nature. 447 (7146), 860-864 (2007).
  7. Outa, A. A., et al. Validation of a Drosophila model of wild-type and T315I mutated BCR-ABL1 in chronic myeloid leukemia: an effective platform for treatment screening. Haematologica. 105 (2), 387-397 (2019).
  8. Shirinian, M., et al. A transgenic Drosophila melanogaster model to study human T-lymphotropic virus oncoprotein Tax-1-driven transformation in vivo. J Virol. 89 (15), 8092-8095 (2015).
  9. Diez-Hermano, S., Valero, J., Rueda, C., Ganfornina, M. D., Sanchez, D. An automated image analysis method to measure regularity in biological patterns: a case study in a Drosophila neurodegenerative model. Mol Neurodegener. 10 (1), 1-10 (2015).
  10. Yusuff, T., et al. Drosophila models of pathogenic copy-number variant genes show global and non-neuronal defects during development. PLoS Genet. 16 (6), e1008792-e1008792 (2020).
  11. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16, 1226-1232 (2019).
  12. Chalmers, M. R., Kim, J., Kim, N. C. Eip74EF is a dominant modifier for ALS-FTD-linked VCPR152H phenotypes in the Drosophila eye model. BMC Res Notes. 16 (1), 1-5 (2023).
  13. Baek, M., et al. TDP-43 and PINK1 mediate CHCHD10S59L mutation-induced defects in Drosophila and in vitro. Nat Commun. 12 (1), 1-20 (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila Eye PhenotypesRough Eye QuantificationFlynotyper AnalysisIlastik Image ProcessingOmmatidial PatternDisease Model QuantificationEye Morphology ScoringCell Density CountingRing Light ImagingImage J Analysis

مقالات ذات صلة