مقالة منهجية

سير عمل التصنيع الحيوي القابل للتطوير لإنتاج وعزل العلاجات الحيوية للسرطان المشتقة من الخلايا القاتلة الطبيعية المشتقة من الحويصلة الخلوية

1.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67227

⸱

أغسطس 16, 2024

 ,  ,  , 
1Biologic and Radiopharmaceutical Drugs Directorate, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology Institute, University of Ottawa, 3Centre for Infection, Immunity and Inflammation Institute, University of Ottawa, 4Regenerative Medicine Program, Ottawa Hospital Research Institute

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تتمتع الحويصلات خارج الخلية الطبيعية المشتقة من الخلايا القاتلة (NK-EVs) بإمكانيات واعدة كعلاجات حيوية للسرطان. تقدم هذه الدراسة القائمة على المنهجية سير عمل تصنيع حيوي ذو حلقة مغلقة قابل للتطوير مصمم لإنتاج وعزل كميات كبيرة من NK-EVs عالية النقاء باستمرار. يتم إجراء اختبار التحكم أثناء العملية طوال سير عمل التصنيع الحيوي ، مما يضمن تلبية المركبات الكهربائية لمعايير الجودة لإصدار المنتج.

الملخص

يتم التحقيق في الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK-EVs) كعلاجات حيوية للسرطان. لديهم خصائص فريدة مثل الحويصلات النانوية السامة للخلايا التي تستهدف الخلايا السرطانية وكأجهزة موصلة للمناعة. يتيح سير عمل التصنيع الحيوي القابل للتطوير إنتاج كميات كبيرة من NK-EVs عالية النقاء لتلبية المتطلبات قبل السريرية والسريرية. يستخدم سير العمل مفاعلا حيويا من الألياف المجوفة ذات الحلقة المغلقة ، مما يتيح الإنتاج المستمر ل NK-EVs من خط خلايا NK92-MI في ظل ظروف خالية من المصل وخالية من xeno وخالية من المغذيات والمضادات الحيوية وفقا لمعايير ممارسات التصنيع الجيدة. تحدد هذه الدراسة المستندة إلى البروتوكول سير عمل التصنيع الحيوي لعزل NK-EVs باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم والترشيح الفائق والتعقيم القائم على المرشح. يتم إجراء توصيف منتج NK-EV الأساسي عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، ويتم تقييم وظائفها من خلال اختبار فاعلية قائم على بقاء الخلية تم التحقق من صحته ضد الخلايا السرطانية. وتحمل عملية التصنيع الحيوي القابلة للتطوير هذه إمكانات كبيرة للنهوض بالترجمة السريرية للعلاجات الحيوية للسرطان القائمة على NK-EV من خلال الالتزام بأفضل الممارسات وضمان التكاثر.

المقدمة

فيالقرن الحادي والعشرين ، تم تحقيق تقدم ملحوظ في المعركة ضد السرطان. ويرجع ذلك أساسا إلى ظهور العلاجات المناعية للسرطان ، وهي فئة من الأدوية التي تسخر جهاز المناعة لمحاربة السرطان. تمثل الحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK-EVs) منافسين واعدين في مجال العلاج المناعي الآخذ في التوسع. تلعب الخلايا القاتلة الطبيعية ، التي تتكامل مع المناعة الفطرية والتكيفية ، دورا مهما في دفاع الجسم ضد الخلايا المصابة بالفيروسات والمجهدة والخبيثة. يستخدمون ترسانة شاملة من الآلات المضادة للسرطان للقضاء على الخلايا غير الطبيعية من خلال الوسائل السامةللخلايا 1،2،3. من بين هذه الآليات إنتاج وإفراز المركبات الكهربائية ، وهي هياكل ثنائية الطبقة نانوية تحتوي على جزيئات حيوية مختلفة ، مثل البروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي ، وهي ضرورية لتسهيل الاتصال بين الخلايا4،5،6. تظهر NK-EVs كعلاجات واعدة خالية من الخلايا نظرا لخصائصها الحاملة الفريدة. وتشمل هذه صغر حجمها ، مما يسمح بالتعقيم القائم على المرشح ، والتوافق الحيوي العالي ، والتراكم التفضيلي داخل الأورام ، وطيف توصيل البضائع الواسع ، والقدرة على التغلب على الحواجز البيولوجية مثل الحاجز الدموي الدماغي ، والحد الأدنى من سمية. لعدة أسباب ، تلغي NK-EVs الحاجة إلى استنفاد اللمفاويات للمريض عن طريق العلاج الكيميائي قبل الإعطاء: 1) تقليديا ، يتم استخدام استنفاد اللمفاويات لخلق بيئة أكثر ملاءمة للعلاج القائم على الخلايا ، مما يمكن الخلايا المنقوعة من التكاثر وممارسة آثارها العلاجية ؛ 2) على عكس الخلايا ، تفتقر المركبات الكهربائية إلى قدرة النسخ المتماثل وهي أصغر بكثير في الحجم ؛ 3) تعمل المركبات الكهربائية من خلال آليات مميزة وتظهر مناعة متناقصة مقارنة بالخلايا5،6،7. علاوة على ذلك ، أظهرت NK-EVs باستمرار فعالية في المختبر ضد نماذج السرطان المختلفة وأظهرت أيضا تأثيرات مناعية على الخلايا المناعية التي تعزز الاستجابات المضادةللسرطان 8،9. تؤكد النتائج في الجسم الحي هذه النتائج ، وتظهر انحدار السرطان بعد علاج NK-EV والسمية الضئيلة10،11،12. لذلك ، فإن العلاجات القائمة على NK-EV تحمل وعدا كبيرا لمواجهة تحديات علاج الأورام الصلبة الباردة الخاملة مناعية13،14،15،16،17.

تتناول دراستنا الحديثة عنق الزجاجة الكبير في الترجمة السريرية للمركبات الكهربائية النيترولية من خلال التصنيع الحيوي7. تقدم المقالة إثباتا للمفهوم لسير عمل التصنيع الحيوي الفعال من حيث التكلفة والقابل للتطوير لمركبات NK-EVs المصممة بدقة لضمان اختبار مراقبة الجودة أثناء العملية. أنتج هذا النهج باستمرار كميات كبيرة من العلاجات الحيوية للسرطان عالية النقاء القائمة على NK-EV ، مع توصيف شامل للمنتج يتم إجراؤه وفقا لإرشادات MISEV201818. يمكن تحقيق قابلية التوسع في سير عمل التصنيع الحيوي عن طريق زيادة حجم الخرطوشة أو تشغيل العديد من المفاعلات الحيوية بالتوازي. وبالمثل ، يمكن تحقيق قابلية التوسع لسير عمل عزل EV بسهولة باستخدام تقنيات مثل كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) القائمة على الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع (FPLC) ، والترشيح الفائق (UF) ، والتعقيم القائم على المرشح. قام نظام المفاعل الحيوي ذو الألياف المجوفة ذات الحلقة المغلقة (HFB) بتطوير خط خلايا IL-2 المكتفية ذاتيا من NK (خلايا NK92-MI) دون الحاجة إلى مكملات مصل الدم ونظام تغذية ومضادات حيوية. تم تحقيق ذلك باستخدام وسيط محدد كيميائيا متاح تجاريا وخالي من xeno (إصدار GMP متاح الآن تجاريا). ونتيجة لذلك، نجحت كميات كبيرة من الخلايا القاتلة الطبيعية (109 خلايا قابلة للحياة) والخلايا القاتلة الطبيعية (1012 EVs) في غضون 5-7 أيام باستخدام خرطوشة مفاعل حيوي واحدة متوسطة الحجم، مع توصيف كلا المنتجين على نطاق واسع. طوال عملية التصنيع الحيوي ، تمت مراقبة صحة الخلية يوميا باستخدام مقاييس قابلة للقياس الكمي مثل مستويات الأس الهيدروجيني والجلوكوز واللاكتات ، جنبا إلى جنب مع المؤشرات المرئية مثل لون الوسائط وأي علامة على التلوث ، والتي تعد تنبؤات أساسية لجودة الخلية والمركبات الكهربائية. كشف تقييم ما بعد الحصاد لصلاحية الخلايا القاتلة الطبيعية ووظائفها المتولدة في نظام HFB ، وخاصة السمية الخلوية ، عن تحسن كبير مقارنة بالثقافات القائمة علىالقارورة 7. وبالمثل ، أظهرت NK-EVs المنقاة مظهرا عاليا نقاء ، خاليا من البكتيريا والميكوبلازما والكيانات الفيروسية الشائعة والمكونات الخلوية ، وبمستويات ضئيلة من السموم الداخلية. الأهم من ذلك ، شكلت NK-EVs المنقاة أكثر من 99.9٪ من جميع الجسيمات النانوية الموجودة في المنتجالنهائي 7. أخيرا ، احتفظت NK-EVs المنقاة بخصائص NK الرئيسية ، بما في ذلك علامات السطح (CD2 ، CD45 ، CD56) ، حمولة السيتوكين (GzmB ، PFN ، IFN-g) ، وأظهرت سمية خلوية قوية ضد خلايا K562 اللوكيميا ، الخط القياسي الذهبي لتقييم السمية الخلوية للخلايا NK7.

يوضح البروتوكول الحالي تفاصيل سير عمل التصنيع الحيوي القابل للتطوير الذي تمت مناقشته أعلاه. يوضح منهجية عزل NK-EVs المنتجة باستخدام FPLC-SEC إلى جانب التعقيم القائم على UF والمرشح. بالإضافة إلى ذلك ، يصف البروتوكول الخطوات المحورية ، بما في ذلك توصيف المنتج باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، وتقييم الجودة باستخدام أدوات مختلفة (القياس الكمي للبروتين / dsDNA والاختبار الميكروبي) ، والتحقق الوظيفي لمنتج NK-EV المنقى ضد الخلايا السرطانية عن طريق مقايسة بقاء الخلية. عادة ما ينتج عن سير العمل هذا 1.0 - 1.5 مل من منتج NK-EV بمتوسط تركيز 1.18 × 1012 EVs/مل7، بإجمالي 1 × 1012 EVs كحد أدنى بناء على ما يقرب من 40 مل من CM الغني بالمركبات الكهربائية الكهربائية. تسمح هذه العملية بإطلاق المنتج لمختلف التطبيقات النهائية ، مثل الدراسات الاستقصائية ، وما قبل السريرية ، والمتعددة الأوميك (البروتينات ، والنسخ ، وعلم الجينوم ، والتمثيل الغذائي ، والدهون ، وعلم الجينوم) التي تتطلب كميات عالية من المركبات الكهربائية عالية الجودة مع الاحتفاظ بإمكانية الترجمة السريرية ، مع قابلية التكاثر المثبتة.

البروتوكول

1. التصنيع الحيوي NK-EV من خلايا NK92-MI باستخدام مفاعل حيوي مغلق الحلقة

ملاحظة: يتم تصنيع NK-EVs باستخدام سير عمل التصنيع الحيوي القابل للتطوير الذي يلتزم بممارسات التصنيع الجيدة (GMP) ويستخدم خلايا NK92-MI (انظر الشكل 1). يحتوي منشورنا الأخير على رؤى مفصلة حول إجراءات التصنيع الحيوي وملامح هوية منتجات NK-EVوسلامتها 7.

figure-protocol-1
الشكل 1: التصنيع الحيوي للحويصلات خارج الخلية المشتقة من الخلايا القاتلة الطبيعية (NK-EVs) في مفاعل حيوي مغلق الحلقة من الألياف المجوفة (HFB) مع سير عمل عزل قابل للتطوير. تمثيل تخطيطي لسير عمل التصنيع الحيوي لتوليد كميات كبيرة من منتجات NK-EV عالية النقاء. يتم زرع خلايا IL-2 المكتفية ذاتيا NK92-MI في خرطوشة HFB مغلقة الحلقة ويتم زراعتها في ظروف خالية من المصل (SF) ، وخالية من xeno (XF) ، وخالية من المغذيات ، وخالية من المضادات الحيوية ، حيث يتم زراعتها من أجل مجموعة متوسطة مكيفة غنية بالمركبات الكهربائية بشكل مستمر. يتم إجراء عزل NK-EV عن CM الغني بالمركبات الكهربائية بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المستندة إلى الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع (FPLC-SEC) إلى جانب الترشيح الفائق (UF). يتم تمييز NK-EVs وتقييمها من خلال فحوصات متعددة ، ويتم تقييم وظائفها ضد خلايا سرطان الدم K562 باستخدام مقايسة فاعلية البقاء. تم تعديل هذا الرقم من7 (تم إنشاؤه باستخدام Biorender.com). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. بدءا من 1 - 5 × 106 خلايا NK92-MI والحفاظ على كثافة خلية بين 3 - 8 × 105 خلايا / مل ، قم بزراعة الخلايا في قوارير T25 - T175 باستخدام وسط استزراع مسبق التسخين. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 (انظر جدول المواد). استبدل الوسط كل 2-3 أيام حتى يتم إنتاج 1 × 108 خلايا NK92-MI ذات صلاحية لا تقل عن 70٪.
    ملاحظة: احتفظ ب 1/5-1/3rd من الوسط المكيف (سم) عند إعادة زرع الخلايا ، لأنه يحتوي على عوامل نمو مواتية.
  2. قم بإجراء تحضير خرطوشة HFB متوسطة وتلقيح الخلايا القاتلة الطبيعية كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يجب إجراء جميع عمليات التلاعب داخل خزانة السلامة الحيوية من الفئة الثانية لضمان العقم والحفاظ عليه. قبل نقل نظام الخرطوشة إلى خزانة السلامة الحيوية ، قم بالرش بسخاء بنسبة 70٪ من الإيثانول ، مع إيلاء اهتمام خاص لعنق الزجاجة في الخزان ووصلات المحقنة.
    1. قم بإعداد خرطوشة HFB وفقا لتعليمات الشركة المصنعة19 (انظر جدول المواد ؛ انظر الشكل 2) كما هو موضح أدناه.
      1. لف وصلات Luer Lock بغشاء شمع واضبط معدل تدفق المضخة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة19. قم بتكييف خرطوشة HFB عن طريق السماح ل 150 مل من محلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS ؛ انظر جدول المواد) بالدوران لمدة خمسة أيام على الأقل.
      2. لإزالة الهواء من الفضاء الشعري خارج الخلية (ECS ؛ الحجم حوالي 29 مل) ، قم بحقن ما يقرب من 40 مل من PBS من خلال منفذ ECS الأيسر واسمح للهواء بالهروب عبر منفذ ECS الأيمن. أثناء القيام بذلك ، أغلق مشابك المنفذ الأيسر والأيمن. تأكد من توصيل المحقنة دائما بمنفذي ECS الأيمن والأيسر.
      3. بمجرد الانتهاء ، ضع الخرطوشة على مضخة التدفق (انظر جدول المواد) داخل الحاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. تأكد من عدم وجود تسريبات بعد بضعة أيام من التداول.
    2. استبدل PBS ب 150 مل من وسط الاستزراع في زجاجة الخزان و ECS قبل يومين من زرع الخلايا في الخرطوشة. كرر خطوات التكييف السابقة (الخطوة 1.2.1) باستخدام وسط الثقافة ولكن لمدة يومين من الدورة الدموية.
    3. قبل بذر الخلايا ، استبدل المحتويات الموجودة في زجاجة الخزان و ECS ب 250 مل من وسط الاستزراع الطازج.
    4. احصل على قارورة الثقافة من الحاضنة وانقل الخلايا إلى أنبوب سعة 50 مل. تدور في 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية باستخدام 21 مل من وسط الاستزراع.
    5. قم بإعداد حصتين من 20.5 ميكرولتر لكل منهما من تعليق الخلية لعد الخلايا على عداد خلية آلي (انظر جدول المواد). لكل 20.5 ميكرولتر من معلق الخلية ، أضف كمية متساوية من صبغة AO / PI (انظر جدول المواد) واخلطها لأعلى ولأسفل 10x على الأقل.
      ملاحظة: لا نوصي باستخدام Trypan Blue لعد الخلايا NK بدقة. بدلا من ذلك ، استخدم مقياس كثافة الدم للعد اليدوي.
    6. قم بتحميل 20 ميكرولتر في كل غرفة عد في شريحة العد وقم بإجراء عد الخلايا الآلي باستخدام البرنامج المناسب. احسب متوسط تركيز الخلايا الحية ولاحظ قابلية البقاء.
    7. امزج محلول الخلايا القاتلة الطبيعية عدة مرات قبل شفطه باستخدام حقنة 20 مل وإبرة 18 جم للحفاظ على العقم. يجب أن يحتوي هذا المحلول على ما يقرب من 1 × 108 خلايا NK حية في حوالي 20 مل أو حوالي 5 × 106 خلايا / مل.
    8. بعد إزالة الإبرة من المحقنة ، قم بحقن خلايا NK برفق في الخرطوشة من خلال منفذ ECS الأيسر. لضمان تشتت الخلايا بشكل موحد في جميع أنحاء الخرطوشة ، قم بالرد برفق على محلول الخلية 10x على الأقل باستخدام المحاقن المتصلة بمنافذ ECS اليمنى واليسرى.
      ملاحظة: يجب أن يكون للمحلول تعكر متساو عبر كلا المحاقن، مع إغلاق المنفذين الطرفيين الأيمن والأيسر.
    9. افتح منفذ الطرف الأيسر والأيمن وحقن ما تبقى داخل المحاقن. أغلق منفذي ECS الأيمن والأيسر باستخدام المشابك.
    10. انقل الخرطوشة إلى الحاضنة واتركها لمدة 30 دقيقة قبل تثبيتها بشكل صحيح على مضخة التدفق. اترك الخرطوشة للتصنيع الحيوي. اضبط معدل التدفق وفقا للشركة المصنعة.
    11. لمراقبة مقاييس صحة الخلية ، احصل على 0.5 مل من المتوسط يوميا من الوسط المختلط جيدا في زجاجة الخزان وقم بتخزينه عند -20 درجة مئوية بعد التحقق من مستويات الجلوكوز والأس الهيدروجيني. يمكن التحقق من مستويات L-lactate لاحقا (انظر جدول المواد).
    12. استبدل الوسط الموجود في الخزان (250-500 مل) كل 1-2 يوم للحفاظ على محتوى الجلوكوز أعلى من 50٪ من المستويات الأولية الموجودة في الوسط ودرجة الحموضة أعلى من 7.0 (تتراوح من 7.0 - 8.0).
  3. قم بإجراء مجموعة CM الغنية ب NK-EV يوميا بعد يوم واحد من الراحة عند بذر الخرطوشة لأول مرة كما هو موضح أدناه.
    1. انقل نظام الخرطوشة إلى خزانة السلامة الحيوية. قم بحقن ما يقرب من 21 مل من وسط الثقافة برفق من خلال منفذ ECS الأيسر لدفع حجم مكافئ من CM الغني بالمركبات الكهربائية عبر ECS الأيمن - لا تخلط (انظر الشكل 3).
      ملاحظة: استخدم دائما الأواني البلاستيكية الجديدة لمنع التلوث.
    2. انقل محلول CM الغني بالمركبات الكهربائية إلى أنبوب سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي بمعدل 300 × جم لمدة 5 دقائق. وفي الوقت نفسه ، انقل نظام الخرطوشة مرة أخرى إلى الحاضنة على مضخة التدفق.
    3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق. مرة أخرى ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. بعد ذلك ، قم بتقسيم CM الغني بالمركبات الكهربائية بالتساوي عبر 3 ، 50 مل من الأنابيب (~ 7 مل / أنبوب) وتخزينها عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
      ملاحظة: يتم تجميع CM الغني بالمركبات الكهربائية الذي يتم حصاده بالتتابع عبر هذه الأنابيب الثلاثة ، مما ينتج عنه ثلاثة أنابيب عينات تقنية مكررة.
  4. قم بإجراء حصاد خلايا HFB-NK لمواصلة إنتاج CM الغني بالمركبات الكهربائية باستخدام نفس خرطوشة HFB كما هو موضح أدناه.
    ملاحظة: يمكن حصاد الخلايا القاتلة الطبيعية من ECS الخاص ب HFB عن طريق تنفيذ بروتوكول حصاد الخلايا HFB-NK "بمجرد وصول الخرطوشة إلى التقاء (بحد أقصى 1 × 109 خلايا). يحدث هذا بعد 5-7 أيام لكل دفعة أو عندما يتبين أن محتوى الجلوكوز أقل من حد الكشف عن مقياس الجلوكوز (على سبيل المثال ، لا توجد قراءة أو قراءات ~ 0) لمدة يومين متتاليين. إذا كان هذا هو الحصاد النهائي للخلية ، فيمكن استبدال الوسيط ب PBS لشطف الخرطوشة واسترداد الخلايا.
    1. حصاد CM الغني بالمركبات الكهربائية تماما كما هو مفصل أعلاه في الخطوة 1.3.
    2. حقن ما يقرب من 50 مل من الوسط من خلال منفذ ECS الأيسر. لضمان تشتت الخلايا المتجانسة في جميع أنحاء الخرطوشة ، ادفع محلول الخلية برفق ذهابا وإيابا باستخدام المحاقن المتصلة بمنافذ ECS اليمنى واليسرى بمقدار 10 مرات على الأقل لفك الخلايا قبل دفعها وتجميعها في النهاية باستخدام حقنة من خلال منفذ ECS الأيمن. انقل CM الغني بالمركبات الكهربائية المحصودة إلى أنبوب سعة 50 مل. توضع جانبا عند 37 درجة مئوية (حمام مائي أو حاضنة) في الوقت الحالي.
      ملاحظة: يساعد إجراء الدفع للخلف على إخراج الخلايا قبل طردها بالكامل وتجميعها بواسطة حقنة من خلال منفذ ECS الأيمن. يجب أن يكون للمحلول تعكر متساو عبر كلا المحاقن ، مع إغلاق المنفذين الطرفيين الأيمن والأيسر. يمكن أن يساعد النقر على خرطوشة المفاعل الحيوي (الاضطراب المادي) في إزاحة مجموعة الخلايا في الجزء السفلي من الخرطوشة بشكل استباقي. يمكن أن يؤثر الخلط العدواني ذهابا وإيابا لتعليق الخلية سلبا على صلاحية الخلايا المستردة. يجب تطبيق العناية والصبر لتحقيق أقصى قدر من الجدوى.
    3. كرر الخطوة الأخيرة 2x. في المجموع ، يجب استرداد 150 مل من تعليق الخلية. جهاز طرد مركزي بوزن 300 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. أعد تعليق كل من الكريات الخلية في 20 مل من الوسط الطازج لكل منهما واجمعهما. اجمع حصتين من 20.5 ميكرولتر لكل من معلق الخلية لعد الخلايا على عداد خلوي آلي (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: عادة ما تكون هناك حاجة إلى العديد من تخفيفات الخلايا التي تستخدم PBS كمخفف لتقع ضمن النطاق الديناميكي لعداد الخلية.
    5. إلى حصة تعليق الخلية 20.5 ميكرولتر ، أضف كمية متساوية من صبغة AO / PI (انظر جدول المواد) واخلطها لأعلى ولأسفل 10x على الأقل. قم بتحميل 20 ميكرولتر في كل غرفة عد في شريحة العد وقم بإجراء عد الخلايا الآلي باستخدام البرنامج المناسب.
    6. متوسط تركيز الخلايا الحية لجميع الأعداد المصححة بالتخفيف ، وتحديد الكمية الإجمالية للخلايا الحية ، وتسجيل الجدوى. كما هو مفصل أعلاه ، لإنتاج CM غني بالمركبات الكهربائية باستمرار باستخدام نفس خرطوشة المفاعل الحيوي ، قم بإعادة زرع 1 × 108 خلايا NK المنتجة بواسطة HFB.
      ملاحظة: إذا رغبت في ذلك ، يمكن تخزين الخلايا القاتلة الطبيعية المنتجة بواسطة HFB باستخدام وسيط تجميد للحفظ بالتبريد وحاوية تجميد للتحكم في معدل التجميد (انظر جدول المواد).

figure-protocol-2
الشكل 2: مكون نظام المفاعل الحيوي للألياف المجوفة (HFB) وإعداده. تحتوي زجاجة الخزان (1) على الوسط الكامل الذي يدور عبر خرطوشة المفاعل الحيوي (2) بعمل مضخة تمعجية (غير معروضة) تعمل على أنبوب المضخة (3). يتم إدخال الخلايا في الفضاء الشعري خارج الخلية (ECS) من خلال منافذ ECS الجانبية اليسرى (4) واليمنى (5). بمجرد إغلاق المشابك المنزلقة ECS ، يتم فتح المنافذ الجانبية الطرفية اليسرى (6) واليمنى (7) للسماح للوسيط بالدوران في جميع أنحاء النظام. لاحظ إضافة فيلم الشمع على وصلة Luer Lock بالقرب من غطاء الخزان للزجاجة المتوسطة لمنع التلوث المحتمل. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-protocol-3
الشكل 3: التمثيل التخطيطي لعملية عزل NK-EV. بعد الجمع اليومي للوسط المكيف الغني بالمركبات الكهربائية (CM) ، تم الطرد المركزي للمحلول بشكل تفاضلي لإزالة الخلايا (الدوران الأول عند 300 × جم لمدة 5 دقائق) والحطام الخلوي (الدوران الثاني عند 2000 × جم لمدة 10 دقائق). تم تخزين CM الغني بالمركبات الكهربائية الذي تم تطهيره عند -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة. بمجرد أن يصبح جاهزا لعزل NK-EV ، يتم إذابة CM الغني بالمركبات الكهربائية المجمد وطرده مرة أخرى لضمان إزالة الحطام الخلوي (الدوران الثالث عند 10,000 × جم لمدة 30 دقيقة). بعد ذلك ، تتم معالجة CM الغني بالمركبات الكهربائية لمدة 2-4 ساعات عند 37 درجة مئوية باستخدام نوكلياز داخلي لهضم الأحماض النووية التي تعتبر ملوثات للخلايا المضيفة. بعد ذلك ، تتم معالجة CM الغني بالمركبات الكهربائية بواسطة كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المستندة إلى الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع (FPLC-SEC) لتنقية EV باستخدام راتنج ثنائي النمط. يتم دمج الكسور المملوءة التي تتراوح من 10 إلى 15 مل تقريبا وتصفيتها باستخدام مرشحات 0.22 ميكرومتر لضمان عقم منتج NK-EV النهائي. يسمح الترشيح الفائق بتركيز المنتج بمعامل حوالي 35 - 50X ، مما ينتج عنه تركيز مضمون يزيد عن 1 × 1012 EVs / مل ، بإجمالي 1.0 - 1.5 مل. تم تعديل هذا الرقم من7 (تم إنشاؤه باستخدام Biorender.com). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. تنقية NK-EV بواسطة FPLC-SEC إلى جانب التعقيم القائم على UF والفلتر

  1. قم بإعداد المحاليل التالية وقم بتصفيتها مرتين باستخدام مرشح 0.1 ميكرومتر (انظر جدول المواد): ماء (موصلية 0 مللي ثانية / سم) ، PBS: 50 مل من 10x PBS + 450 مل من الماء (الموصلية حوالي 14.7 مللي ثانية / سم) ، 20٪ إيثانول ، محلول تنظيف (0.5 متر هيدروكسيد الصوديوم و 30٪ كحول الأيزوبروبيل في الماء).
  2. قم بإجراء بدء نظام FPLC وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). قم بتنفيذ خطوات التنظيف في المكان (CIP) قبل وبعد التشغيل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اغسل جميع الخطوط وراتنج العمود واشطفها باستخدام ماء مزدوج الترشيح (DF) ومحلول تنظيف وماء DF و DF-PBS.
    ملاحظة: تجدر الإشارة إلى أنه يمكن إجراء CIP في يوم آخر إذا لزم الأمر.
  3. استخدم عمودا كروماتوغرافيا معبأا براتنج ثنائي النمط (انظر جدول المواد) بارتفاع سرير 20 سم. قم بإجراء التوصيلات باستخدام طريقة التنقيط إلى التنقيط لضمان عدم إدخال أي هواء داخل العمود.
  4. قم بإعداد مجمع الكسور باستخدام أنابيب التجميع المناسبة وقم بتغيير إعدادات التجزئة إلى حجم التجميع المطلوب (على سبيل المثال ، 15 مل). ضع أنبوبا كافيا وأبوبين إضافيين لجمع حجم العينة بالكامل.
  5. قم بإعداد العينة كما هو موضح أدناه.
    1. خذ 40-80 مل من CM الغني بالمركبات الكهربائية من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج بسرعة عند 37 درجة مئوية. قم بتحميل العينة في جهاز الطرد المركزي الفائق وتدور عند 10,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يجب موازنة الأنابيب بدقة حسب الوزن وليس الحجم.
    2. بعد الغزل ، اجمع المادة الطافية وانقله إلى أنبوب جديد. لتقليل مستويات dsDNA ، عالج CM الغني ب EV ب 50 U / مل من نوكلياز داخلي و 1.5 ملي من MgCl2 (انظر جدول المواد). احتضان لمدة 2-4 ساعات في حاضنة (37 درجة مئوية) ، مما يسمح بالخلط المعتدل.
  6. بمجرد أن يصبح النظام (الخطوط والأعمدة) جاهزا لعزل EV ، قم بتحميل CM الغني بالمركبات الكهربائية في حقنة سعة 60 مل وقم بتوصيله بخط العينة. ابدأ تشغيل النظام بالنقر فوق التشغيل اليدوي واضبط معدل التدفق على 0. اتبع مطالبات البرنامج لحفظ التشغيل بشكل استباقي، ثم انقر فوق ابدأ.
  7. حدد الخط B (DF-PBS) وقم بتشغيل بسرعة تدفق تبلغ 150 سم / ساعة (معدل تدفق 2.0 مل / دقيقة). تأكد من أن الحل يمر عبر العمود.
  8. بمجرد استقرار الموصلية ، اضغط على Auto Zero UV. قم بتغيير مسار التدفق لتوجيه العينة إلى زجاجة النفايات قبل العمود. تأكد من عدم إدخال أي فقاعات في النظام.
  9. بعد 5 - 20 ثانية كحد أقصى ، قم بتوجيه العينة إلى العمود. انقر فوق التجزئة بمجرد أن تصل قراءات الأشعة فوق البنفسجية إلى 230 مللي أمبير تقريبا.
  10. بمجرد حقن العينة بالكامل من خلال النظام ، قم بتبديل نظام العازلة إلى DF-PBS (عند صمام العينة) لمواصلة التنقية. انقر فوق التجزئة مرة أخرى عندما تصل قيمة الأشعة فوق البنفسجية إلى 1600 مللي أمبير تقريبا.
    ملاحظة: هذا يتوافق مع التقاطع بين قراءات الأشعة فوق البنفسجية وقراءات الموصلية. يؤدي التجزئة الأطول إلى تخفيف الاحتباس فقط دون زيادة إنتاجية EV.
  11. اجمع جميع الكسور (NK-EVs المخففة) وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للتعقيم والترشيح الفائق (UF).
  12. استمر في تشغيل DF-PBS حتى تصل قيمة الأشعة فوق البنفسجية إلى 1000 مللي أمبير تقريبا. بعد ذلك ، توقف عن التشغيل واحفظ الكروماتوجرام كمستند PDF.

3. التعقيم والتركيز القائم على مرشح المنتج NK-EV بواسطة UF

  1. قم بتبريد جهاز الطرد المركزي إلى 10 درجات مئوية. قم بتعقيم كل مكون من مكونات جهاز UF (انظر جدول المواد) عن طريق الشطف ب 20-30 مل من 90٪ من الإيثانول. تدور في 4000 × جم لمدة 5 - 10 دقائق.
    ملاحظة: الفلتر مصنوع من السليلوز المتجدد 10 كيلو دالتون MWCO.
  2. تخلص من التدفق ثم كرر الشطف باستخدام PBS معقم لموازنة الجهاز. كرر 2x في المجموع.
  3. لزيادة العقم إلى أقصى حد، قم بتصفية محلول NK-EV المخفف باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر مبلل مسبقا باستخدام DF-PBS (انظر جدول المواد). اجمع المرشح مباشرة في جهاز التركيز المعقم.
  4. تدور عند 4000 × جم لمدة 15-40 دقيقة (يعتمد وقت الدوران على العينة). امزج المحلول داخل حجرة الفلتر العلوية باستخدام ماصة مصلية بعد الدوران. تدور عند 4000 × جم لمدة 10 دقائق إضافية.
    ملاحظة: خطوة الخلط اختيارية لأنها ببساطة تخفف من خطوة التركيز عن طريق منع انسداد الغشاء بواسطة المركبات الكهربائية.
  5. ضع التدفق جانبا مؤقتا واجمع عينة NK-EV عن طريق قلب جهاز الترشيح وإرفاقه بجهاز التجميع.
  6. تدور في 2000 × جم لمدة 2 دقيقة. انقل منتج NK-EV المنقى إلى أنبوب سعة 2 مل. قم بتخزين منتج NK-EV المنقى عند 4 درجات مئوية للاستخدام قصير المدى (≤ 7 أيام) أو مجمد عند -20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد.

4. توصيف NK-EV بواسطة تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)

  1. قم بإعداد المحلول وتصفيته مرتين عند 0.1 ميكرومتر (انظر جدول المواد): الماء ، PBS ، محلول التنظيف (10٪ مبيض (تنبيه) في الماء).
  2. بدء نظام NTA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. وبالمثل، قم بتنفيذ خطوات التنظيف في المكان (CIP) قبل التشغيل وبعده. اغسل جميع الخطوط واشطفها باستخدام ماء مزدوج الترشيح (DF) ومحلول تنظيف وماء DF. موازنة الخطوط باستخدام DF-PBS.
  3. تحقق من خلية التدفق وتحقق من وجود فقاعات هواء. قم بإزالة الفقاعات إن وجدت. بمجرد أن يتم المسح ، أعد إدخال خلية التدفق بعناية في أداة NTA.
    ملاحظة: على الرغم من عدم توصية الشركة المصنعة ، إلا أنه يمكن بسهولة إزالة فقاعات الهواء التي يصعب إزالتها عن طريق الشطف بنسبة 20٪ من الإيثانول ثم ماء DF.
  4. بمجرد وضع خلية التدفق في مكانها وإغلاق الباب، انقر فوق بدء تشغيل الكاميرا. مع الخطوط المملوءة ب DF-PBS ، يجب أن تظهر الشاشة حدا أدنى مطلقا لعدد الجسيمات.
  5. قم بتغيير إعدادات الالتقاط إلى كسب شاشة 2 ومستوى كاميرا 14. أيضا ، قم بتشغيل السخان لتثبيت درجة حرارة خلية التدفق.
  6. انقر فوق القياس القياسي لإنشاء برنامج نصي ضمن علامة التبويب إجراءات التشغيل القياسية لجمع التقاط واحد على مدى دقيقة واحدة بمعدل تدفق قدره 30 جسيما/إطار و23 درجة مئوية.
  7. أدناه مباشرة ، أضف المجلد واسم الملف إلى اسم المسار لحفظ البيانات.
  8. قم بإعداد تخفيفات منتج NK-EV المنقى باستخدام DF-PBS مسبقا. عند تشغيل NTA ، يتطلب القياس الكمي الدقيق 30-80 جسيما / إطار.
  9. قم بتدوير العينة قبل تحميلها في المحقنة (انظر جدول المواد).
  10. قم بتوصيل حقنة الاستحواذ سعة 1 مل بعناية بخط تحميل الأداة. يجب ألا يكون هناك هواء لأنه سيؤثر سلبا على الاستحواذ والتحليل. ادفع نصف العينة ببطء ، مع ترك حوالي 0.5 مل في المحقنة.
  11. بمجرد ظهور الجسيمات على الشاشة ، قم بتركيز الكاميرا بحيث يكون لهالة واحدة كحد أقصى حول كل جسيم. انقر فوق Infuse ضمن علامة التبويب Hardware بمعدل 1000 لمدة 5 ثوان. ثم قم بخفضه إلى معدل 30.
  12. اضغط على تشغيل البرنامج النصي واتبع التعليمات. سيضمن البرنامج ضبط درجة الحرارة ويسأل عما إذا كانت الإعدادات صحيحة. انقر فوق نعم واتبع مطالبات البرنامج.
  13. بعد الانتهاء من الالتقاط ، انقر فوق إلغاء عندما يطلب البرنامج معالجة الملفات أو تصديرها. انقر فوق Infuse ضمن علامة التبويب Hardware بمعدل 1000 لمدة 10 - 15 ثانية. في غضون ذلك ، أعد تشغيل السخان والكاميرا. ثم اخفض المعدل إلى 30 حتى تتحرك الجسيمات.
  14. اجمع أربع لقطات أخرى بتكرار الخطوات السابقة. بمجرد تسجيل ما مجموعه خمس لقطات لكل تخفيفات ، قم بإجراء التحليل بعد استيراد جميع اللقطات الخمسة.
  15. حدد الملفات المراد معالجتها عن طريق تمييزها. انقر فوق معالجة الملفات المحددة. ضمن علامة التبويب "معالجة"، اضبط إعدادات التحليل على كسب شاشة قدره 2 وعتبة اكتشاف تبلغ 15.
    الإعدادات تعتمد على العينة. تأكد من أن 30-80 جسيما لكل إطار مرئية.
  16. تحقق وانقر فوق موافق للتحليل.
  17. بمجرد معالجة الملفات ، سيطلب البرنامج تصديرها. انقر فوق نعم دون النقر فوق مربعات إضافية أو انقر فوق تصدير.
  18. كرر ذلك مع جميع عمليات تخفيف أو عينات EV. قم بإيقاف تشغيل أداة NTA بعد اكتمال جميع العينات وإجراء CIP.

5. اختبار ضمان الجودة

  1. قم بإجراء الاختبارات الميكروبية باستخدام اختبارين: 1) يتم رفع كمية صغيرة من NK-EVs المنقاة في وسط مرق LB المعقم ، و 2) يتم استخدام كمية صغيرة من NK-EVs المنقاة للكشف عن الميكوبلازما PCR (انظر جدول المواد).
    1. الاختبار 1: زراعة وسط LB عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 5 أيام مع تضمين عناصر تحكم إيجابية وسلبية. سجل OD600 ، إذا لزم الأمر.
    2. الاختبار 2: قم بإجراء الكشف عن الميكوبلازما PCR وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  2. قم بتحديد البروتين و dsDNA على تخفيفات NK-EV المنقاة باستخدام المقايسات القائمة على مقياس الفلور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).

6. تقييم فاعلية الخلايا السرطانية المعالجة ب NK-EV باستخدام مقايسة جدوى الخلية القائمة على الريزازورين عالية الحساسية 20

  1. استزراع خلايا ابيضاض الدم البشرية K562 باستخدام RPMI-1640 مع FBS المعطلة بالحرارة بنسبة 10٪ لبضعة أيام قبل إجراء مقايسة الفاعلية (انظر جدول المواد). حافظ على الكثافة بين 2 - 8 × 105 خلايا / مل واستبدل الوسائط كل 2-3 أيام.
  2. احصل على لوحة مسطحة القاع ذات 96 بئرا (انظر جدول المواد) وأضف بشكل استباقي حجم وسيط الفحص (مكمل بنسبة 5٪ FBS المستنفد من EV) المطلوب لأغراض التطبيع (انظر جدول المواد). الحجم النهائي هو 150 ميكرولتر / بئر.
    ملاحظة: استخدم ماصة مكرر لتقليل التباين من البئر إلى البئر.
  3. احصل على ثقافة الخلية وانقل الخلايا إلى أنبوب. تدور في 300 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في محلول أحادي الخلية باستخدام 2-5 مل من وسط الفحص.
  4. اجمع حصة 20.5 ميكرولتر من تعليق الخلية لعد الخلايا على عداد خلوي آلي (انظر جدول المواد).
  5. إلى حصة تعليق الخلية 20.5 ميكرولتر ، أضف كمية متساوية من صبغة AO / PI (انظر جدول المواد) واخلطها لأعلى ولأسفل 10x على الأقل.
    ملاحظة: نوصي باستخدام AO / PI لعد الخلايا بدقة. بدلا من ذلك ، استخدم مقياس كثافة الدم للعد اليدوي.
  6. قم بتحميل 20 ميكرولتر في كل غرفة عد في شريحة العد وقم بإجراء عد الخلايا الآلي باستخدام البرنامج المناسب. متوسط تركيز الخلايا الحية وسجل الجدوى.
  7. نقل ما يقرب من 1 × 106 خلايا إلى أنبوب ثانوي. خفف الخلايا إلى 7 مل بدقة من وسط الفحص وكرر عد الخلايا. يجب أن يكون التركيز حوالي 1.2 - 1.5 × 105خلايا حية / مل.
  8. كما هو مفصل أعلاه ، اضبط تركيز التعليق أحادي الخلية إلى 1 × 105 خلايا حية / مل وكرر عد الخلايا إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: ينبغي أن يكون معامل التباين بين عدد التكرارات التقنية أقل من ٪25؛ عادة ما يكون أقل من 5٪ مع عد AO / PI.
  9. بمجرد تحقيق التركيز المطلوب ، انقل 50 ميكرولتر (± 1 ميكرولتر) من هذا المحلول إلى كل بئر ليقترب قدر الإمكان من 5000 خلية / بئر (4900 - 5100 خلية / بئر). قم بإعداد ثلاث نسخ فنية لكل حالة فحص واستخدم ماصة مكرر لتقليل التباين من البئر إلى البئر.
  10. انقل اللوحة إلى شاكر مداري (350-500 دورة في الدقيقة) لمدة دقيقتين. انقل الخلايا مرة أخرى إلى الحاضنة حتى تصبح جاهزة لمتابعة علاج NK-EV.
  11. قم بإعداد التخفيفات المطلوبة NK-EV (1: 5 و 1:10 و 1: 100) باستخدام وسيط فحص.
  12. من هذه التخفيفات ، اختبر تركيزات EV التالية: 1 × 108 ، 5 × 108 ، 1 × 109 ، 5 × 109 ، 1 × 1010 ، 5 × 1010 10 و 1 ×10 11 جسيم / مل. يقتصر حجم الجرعات على 20٪ من إجمالي حجم الفحص.
  13. بمجرد أن تصبح جاهزا ، انقل الحجم المطلوب من تخفيف معين إلى الآبار التي تتطلب تركيز EV المطلوب للمعالجة. أضف 15 ميكرولتر من 10x Triton-X إلى بئر التحكم الإيجابي (انظر جدول المواد). يجب تطبيع حجم البئر النهائي إلى 150 ميكرولتر.
  14. أضف اللوحة إلى شاكر مداري (350 - 500 دورة في الدقيقة) لمدة دقيقتين. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون5٪ 2 لمدة 3 ساعات.
  15. قم بتسخين قارئ اللوحة مسبقا (انظر جدول المواد) عند 37 درجة مئوية وقم بتحميل البرنامج النصي التالي: 37 درجة مئوية (يقلل من التباين المرتبط بدرجة الحرارة) ، وخلط 450 دورة في الدقيقة لمدة دقيقة واحدة (يضمن تجانس العينة) ، واقرأ.
  16. أضف 15 ميكرولتر من الكاشف القائم على الريزازورين إلى كل بئر (انظر جدول المواد). قم بحماية الكاشف من الضوء واستخدم ماصة مكرر لتقليل التباين من البئر إلى البئر.
  17. أضف اللوحة إلى شاكر مداري (350 - 500 دورة في الدقيقة) لمدة دقيقتين. انقل الطبق إلى الحاضنة واحتضنه لمدة 60 دقيقة. قم بإزالة فقاعات الهواء باستخدام طرف ماصة مغموسة بالإيثانول. قراءة اللوحة باستخدام إثارة 560 نانومتر وانبعاث 590 نانومتر.
  18. تحليل البيانات: تم حساب متوسط التكرارات الفنية وتصحيحها للخلفية قبل إجراء تحليل الجرعة والاستجابة باستخدام انحدار غير خطي لتأثير التثبيط الذي يظهر السجل (المثبط) مقابل منحدر متغير الاستجابة الطبيعي دون قيود. سجل قيم Hillslope و EC50 .

النتائج

تمتلك NK-EVs وظائف سامة للخلايا متأصلة وقد أظهرت فعالية عالية ضد نماذج السرطان المختلفة. ومع ذلك ، يجب أن يكون هناك المزيد من التوحيد بين الدراسات الحالية فيما يتعلق بسير عمل التصنيع الحيوي المناسب للإنتاج على نطاق واسع ل NK-EVs6،21. وصفت دراستنا السابقة جدوى نظام مفاعل حيوي من الألياف المجوفة مغلقة الحلقة (HFB) لإنتاج كميات كبيرة من منتجات NK-EV عالية النقاء7. كمتابعة ، توضح هذه الدراسة القائمة على البروتوكول بالتفصيل سير عمل التصنيع الحيوي وتوضح قابليته للتكرار من خلال إنتاج وعزل منتج NK-EV (الشكل 1). علاوة على ذلك ، يلزم توصيف المنتج الأساسي والتحقق من صحته قبل إصدار المنتج ، حيث يتم تقديم بيانات جديدة ومبتكرة في هذه الدراسة.

تم اختيار نظام HFB لإنتاج NK-EV نظرا لسهولة استخدامه وموثوقيته وقابليته للتوسع والامتثال لنظام GMP7. بالإشارة إلى إعداد نظام HFB ، يتم حقن الخلايا القاتلة الطبيعية من خلال منفذ ECS الأيسر ويتم زرعها في خرطوشة المفاعل الحيوي (الشكل 2). في الوقت نفسه ، يتم توصيل زجاجة الوسائط ب HFB من خلال المنافذ الجانبية ، ويسمح للوسائط بالتدفق في جميع أنحاء النظام. يتم زراعة الخلايا القاتلة الطبيعية في وسط خال من المصل وخالي من xeno وخالي من المغذيات والمضادات الحيوية ، حيث يتم استبدال الوسائط عندما ينخفض محتوى الجلوكوز إلى أقل من 50٪ للحفاظ على صحة الخلية وتعظيمها بمرور الوقت. يتم جمع CM يوميا ، ومعالجتها من خلال أجهزة الطرد المركزي التفاضلية ، والاحتفاظ بها مجمدة (-80 درجة مئوية) حتى تصبح جاهزة لمزيد من المعالجة. بعد ذلك ، يتم إجراء عزل EV من خلال مجموعة من أجهزة الطرد المركزي التفاضلية و FPLC-SEC إلى جانب UF والترشيح (الشكل 3). ينتج عن هذا منتج NK-EV مركز ومعقم بحجم نهائي يبلغ حوالي 1.0 - 1.5 مل. يتم توفير مخطط كروماتوغرامي تمثيلي لعزل FPLC-SEC ل NK-EVs (الشكل 4). قبل معالجة FPLC-SEC ، تتم معالجة CM الغني ب NK-EV باستخدام نوكلياز الإندونوكلياز ، مما يقلل بشكل كبير من مستويات dsDNA ، وهو ملوث خلية مضيف محتمل (NK)7. وبالتالي ، فإن سير عمل عزل EV الموصوف يزيل الحطام الخلوي وملوثات الحمض النووي الريبي / الحمض النووي الريبي من منتج NK-EV ، وهو أمر ضروري لضمان إمكانات مناعية منخفضة وغير مرغوب فيها وأن المنتج النهائي مناسب للدراسات النهائية.

figure-results-1
الشكل 4: كروماتوجرام عزل NK-EV الذي تم إنشاؤه أثناء استبعاد حجم الكروماتوغرافيا السائلة للبروتين السريع. يمثل الخط الأزرق الامتصاص (mAU ؛ الحد الأقصى للقراءة 2000 مللي أمبيرو ) ، ويمثل الخط الأحمر الموصلية ، ويمثل النص الأحمر سجل التشغيل ، وتمثل المنطقة المظللة الرمادية NK-EVs المجزأة (يشار إليها بكسور T2 - T7). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

بعد العزل ، يتم استخدام توصيف NK-EV الأساسي واختبار ضمان الجودة لتقييم ما إذا كان يمكن إطلاق منتج NK-EV لمزيد من التجارب النهائية. يتم قياس نطاق حجم وتركيز جسيمات منتج NK-EV باستخدام تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA) ، بأحجام تتراوح من 76.30 - 174.30 نانومتر في القطر (D10 من 78.38 ± 2.07 نانومتر ، D50 من 106.72 ± 2.43 نانومتر ، و D90 من 169.80 ± 4.17 نانومتر) ومتوسط تركيز 1.39 × 1012 EVs / مل (الشكل 5A-B). بالإضافة إلى ذلك ، أظهر القياس الكمي لمقياس الفلور تركيز البروتين و dsDNA ± 66.62 مجم / مل و 225.60 ± 37.7 نانوغرام / مل للمنتج النهائي ، على التوالي (الشكل 5C-D). هذا يتوافق مع متوسط نسبة 5.06 × 106 EV / ميكروغرام من البروتين و 6.16 × 1012 EV / ميكروغرام من الحمض النووي. أظهر كل من اختبار الميكروبات والميكوبلازما نتائج سلبية (البيانات غير معروضة). تتوافق هذه النتائج مع توصيف NK-EVs من العمل السابق7. يوفر المنشورالسابق 7 أيضا توصيفا متعمقا إضافيا لمنتجات NK-EV باتباع إرشادات MISEV (على سبيل المثال ، TEM ، اللطخة الغربية ، مستوى السموم الداخلية ، الكيانات الفيروسية ، وقياس التدفق الخلوي للمستضدات السطحية والسيتوكينات).

أخيرا ، تم تقييم وظائف منتج NK-EV (أي السمية الخلوية ضد الخلايا السرطانية) باستخدام مقايسة جدوى الخلية المستندة إلى الريزازورين عالية الحساسية التي تم التحقق من صحتها بعد علاج NK-EV ضد خط خلايا سرطان الدم K5627،20. أنتج علاج الخلايا K562 باستخدام NK-EVs لمدة 3 ساعات تأثيرا يعتمد على الجرعة على بقاء الخلية ، وهو ما يتوافق مع EC50 من 9.33 × 109 EVs / مل (أي الجرعة التي تتوافق مع قتل 50٪ من سكان الخلايا ؛ الشكل 6 أ - ب). وبالتالي ، وفقا لمعايير إصدار المنتج الموضحة ، يعتبر منتج NK-EV مناسبا لمزيد من التجارب.

figure-results-2
الشكل 5: توصيف منتج NK-EV المنقى. (أ) توزيع حجم منتج NK-EV الذي تم قياسه بواسطة NTA ، كما هو موضح كمتوسط من 5 تجارب مستقلة ، لكل منها 10 تكرارات تقنية (5 لقطات فيديو × 2 تخفيف). (ب) تركيز ناتج الجسيمات NK-EV (الجسيمات / مل) الذي تم قياسه بواسطة NTA ، تم تقديمه كمتوسط ± SD من 5 تجارب مستقلة ، لكل منها نسخ تقنية. (ج) تم قياس تركيز بروتين منتج NK-EV (ملغم / مل) باستخدام مقياس الفلور ، تم تقديمه كمتوسط ± SD من 5 تجارب مستقلة ، لكل منها ثلاث نسخ تقنية. (د) تركيز dsDNA لمنتج NK-EV (نانوغرام / مل) يقاس باستخدام مقياس فلوري ، يتم تقديمه كمتوسط ± SD من 5 تجارب مستقلة ، لكل منها ثلاث نسخ تقنية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 6: التحقق من صحة المنتج NK-EV المنقى. تظهر NK-EVs سمية خلوية تعتمد على الجرعة ضد خلايا سرطان الدم البشرية K562 المعالجة بتركيزات مختلفة من NK-EV لمدة 3 ساعات باستخدام مقايسة جدوى الخلية عالية الحساسية القائمة على الريزازورين. (أ) قراءات الفحص الطبيعية (يمثل الخط الأخضر التحكم في خلايا سرطان الدم K562 غير المعالجة ، ويمثل الخط الأسود المتقطع التحكم في الخلايا الميتة لسرطان الدم K562 المحلل ؛ معالج بالمنظفات). يتم عرض البيانات كمتوسط ± SEM من 11 تجربة مستقلة مع ثلاث نسخ تقنية. (ب) تحليل منحنى EC50 مع ميل متغير لمعالجة NK-EV مع فاصل الثقة / نطاقات التنبؤ بنسبة 95٪ (يمثل الخط الأحمر المتقطع استجابة بنسبة 50٪). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

تشير العديد من الدراسات إلى أن NK-EVs تمتلك إمكانات هائلة كعلاج مضاد للسرطان4،5،7،9،16،22،23،24،25،26،27،28،29،30. ومع ذلك ، فإن نظام التصنيع الحيوي القابل للتطوير والمتوافق مع GMP قادر على إنتاج كميات كبيرة من NK-EVs عالية النقاء مطلوب لمزيد من الاختبارات قبل السريرية والتطبيقات السريرية المستقبلية. لمعالجة هذه المشكلة ، استخدمت دراسة سابقة نظام HFB مغلق الحلقة لإنتاج خلايا NK باستمرار و NK-EV-CM الغني ب NK-EV المناسب للتجارب النهائية. نظرا لتصميمها ثلاثي الأبعاد ، تعكس أنظمة HFB عن كثب ظروف نظام الأوعية الدموية وتمتلك نسبة عالية بشكل لا يصدق من مساحة السطح إلى الحجم ، مما يسمح لما يزيد عن مليار خلية بالبقاء في الثقافة ، مما يؤدي في النهاية إلى تحسين إنتاج المركبات الكهربائية7،31،32. الأهم من ذلك ، كان هذا العمل هو الأول الذي أبلغ عن استخدام نظام HFB لزراعة الخلايا القاتلة الطبيعية ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى خط الخلية IL-2 الاكتفاء الذاتي7.

يجب اتخاذ خطوات إضافية لضمان عقم نظام HFB وإنتاج NK-EVs عالية النقاء. هذه الاحتياطات مهمة بشكل خاص في حالة عدم وجود غرفة معقمة ونظيفة ، وهو ما قد يكون هو الحال بالنسبة للعديد من مرافق البحث. قبل الدخول إلى خزانة السلامة الحيوية ، يتم رش نظام HFB بدقة بنسبة 70٪ من الإيثانول لتطهير جميع الأسطح الخارجية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم لف فيلم الشمع حول جميع وصلات Luer Lock لتقليل مخاطر التلوث. هذا مهم بشكل خاص لأن سير عمل التصنيع الحيوي هذا لا يستخدم المضادات الحيوية ، والتي من المعروف أنها تؤثر على الملف الكيميائي الحيوي للخلايا والمنتجات المشتقة منالخلايا 33. تم استخدام مقاييس مختلفة لتقييم صحة الخلية أثناء التصنيع الحيوي لمنتجات الخلية. على سبيل المثال ، تم إجراء تقييمات يومية لمستويات الأس الهيدروجيني والجلوكوز واللاكتات في وسائط الخزان لأنها بدائل حيوية لصحة الخلية للمراقبة. بالإضافة إلى التقييمات الكمية ، فإن الملاحظات النوعية لنظام HFB (على سبيل المثال ، لون الوسائط والعلامات المرئية للتلوث مثل التعكر) مفيدة أيضا في مراقبة صحة الخلايا. لم يتم العثور على عدد الخلايا على CM المسترجع يوميا ليكون مقياسا تمثيليا للجدوى لصحة الثقافة (البيانات غير معروضة). من المحتمل أن يكون هذا نتيجة للخلايا الميتة التي تم استردادها أثناء أخذ عينات CM والتي تم العثور عليها داخل الأنبوب حيث لم يسمح للوسائط بالدوران (القسم الصغير بين ECS ومنفذ حقنة ECS) ، وبالتالي التقليل من قيمة جدوى ثقافة الخلية الشاملة. يمكن فقط لخلايا NK المحصودة التي ينتجها HFB في نهاية دفعة الإنتاج أن توفر مقياسا موثوقا به لصحة المزرعة. أظهرت هذه الخلايا باستمرار قيم جدوى أعلى من 70٪ عبر قطع الإنتاج7. تضمن طرق تقييم الجودة هذه معا الإنتاج المستمر لمركبات NK-EV عالية النقاء.

تم تطوير العديد من تقنيات العزل لتنقية وعزل المركبات الكهربائية34. تستخدم إحدى الطرق ، SEC ، عمودا معبأا بمادة مسامية - راتنج - مما يسمح بفصل الجزيئات بناء على تمييز الحجم. هنا ، يتم مسح المركبات الكهربائية الأكبر حجما من خلال العمود بشكل أسرع. تعرف هذه الطريقة باسم تنقية التدفق بناء على استبعاد الحجم. في الوقت نفسه ، يتم ترك الملوثات الأصغر (dsDNA ، والبروتينات العائمة الحرة مثل اندونولياز ، والأملاح ، والفينول الأحمر ، وما إلى ذلك) والاحتفاظ بها داخل الراتنج بواسطة القوى الكهروستاتيكية (أي تم استخدام راتنج ثنائي النمط). تزيل المعالجة المستندة إلى SEC البروتينات غير المرتبطة بالمركبات الكهربائية مع الحفاظ على هيكل EV الأصليووظائفه 35،36. علاوة على ذلك ، يمكن التنقية القائمة على SEC قابلية للتطوير بسهولة دون المساس بالإنتاجية العالية والنقاء ، مما يجعلها خيارا مناسبا لعزل NK-EVs للاستخدامات العلاجية الحيوية. على الرغم من هذه المزايا ، فإن SEC لها بعض العيوب ، مثل التدفق المخفف نسبيا (المزاء). وبالتالي ، فإن UF مطلوب لتركيز المنتج ، ولكنه يسمح أيضا بالتبادل العازل. يتم شطف جهاز UF غير المعقم بنسبة 70٪ من الإيثانول و PBS وحفظه في خزانة السلامة الحيوية قبل الاستخدام لضمان العقم. عادة ، يمكن تركيز التدفق إلى 35x-50x من الحجم الأولي مع إزالة الجزيئات الصغيرة التي كان من الممكن أن تشق طريقها إلى مادة الشطف. يتم إجراء الطرد المركزي التفاضلي ومعالجة نوكلياز الداخلي قبل FPLC-SEC إلى جانب UF لإزالة الخلايا المتبقية والحطام الخلوي والخيوط الطويلة من dsDNAالمستضد 7.

بعد عزل منتج NK-EV ، يتم إجراء التوصيف والتحقق الوظيفي وفقا للإرشادات الواردة في MISEV2018 و MISEV2023 لتحديد مدى ملاءمة المنتج للاستخدامالإضافي 6،18. تنتج كل عزلة 1.0 - 1.5 مل من منتج NK-EV عالي النقاء بتركيز لا يقل عن 1 × 1012 EVs / مل ، بمتوسط تركيز 1.39 × 1012 جسيم / مل. في السابق ، Gupta et al. قرر أن متوسط جرعة EV في الجسم الحي هو 3.37 × 108 EVs / كجم من وزن جسمالفئران 37. سيتطلب العلاج بالجرعة المتوسطة 8.43 × 106 EVs / فأر بوزن جسم 25 جم ، وهي قيمة أقل بكثير من الحد الأدنى المضمون (1 × 1012 جسيم / مل) الذي تم الحصول عليه من خلال سير العمل هذا. وبالتالي ، يمكن أن ينتج سير عمل التصنيع الحيوي الموصوف أكثر من عدد كاف من NK-EVs للتجارب قبل السريرية أو لتحقيق أهداف الجرعات. يتم اختبار كل عزل بحثا عن الميكوبلازما ووجود الميكروبات كجزء من تقييم مراقبة جودة المنتج. بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت دراسة سابقة عدم وجود كيانات فيروسية مشتركة وسم داخلي في المنتج النهائي وغياب المكونات الخلوية التي تعتبر ملوثات للخلايا المضيفة (عن طريق تحليل اللطخة الغربية)7،34. أخيرا ، تم إجراء التقييم الوظيفي باستخدام مقايسة جدوى الخلية المستندة إلى الريزازورين عالية الحساسية التي تم التحقق من صحتها لتقييم وظائف NK-EVs20. يعمل مقايسة الجدوى الموصوفة عن طريق تقليل الريزازورين (الفلورسنت الضعيف) إلى ريسوروفين (عالي الفلورسنت) بواسطة الخلايا النشطة الأيضية ، مما يسمح بتقييم صلاحية الخلية بعد علاج NK-EV. بالمقارنة مع فحوصات جدوى الخلية البديلة الأخرى ، فإن الاختبار القائم على الريزازورين المستخدم في الدراسة حساس للغاية للتغيرات في بقاء الخلية (ضوضاء خلفية منخفضة جدا) ويسمح بوقت حضانة قصير لمراقبة النتائج (أقل من 30 دقيقة للحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية)20. بشكل عام ، تظهر NK-EVs تأثيرا يعتمد على الجرعة على قابلية K562 للبقاءة. تمثل النتائج المقدمة معا منتجا NK-EV استوفى معايير إصدار المنتج للتقييم قبل السريري وهو مناسب للتطبيقات النهائية.

في الختام ، تصف هذه الدراسة القائمة على البروتوكول التصنيع الحيوي ل NK-EVs ذات الإمكانات السريرية. كما تمت مناقشته ، يتم إنتاج NK-EVs باستخدام نظام HFB ذو حلقة مغلقة في ظل ظروف خالية من المصل وخالية من xeno وخالية من المغذيات وخالية من المضاداتالحيوية 7. مزيج من FPLC-SEC / UF يعزل وينقي منتج NK-EV. قبل إطلاق المنتجات للتطبيق النهائي ، يجب توصيف NK-EVs والتحقق من صحتها وظيفيا للتأكد من أنها مناسبة للاستخدام. كما هو موضح ، يمكن أن يؤدي اتباع بروتوكول التصنيع الحيوي هذا إلى توليد كمية كبيرة من NK-EVs عالية النقاء التي تظهر سمية خلوية على الهدف ضد الخلايا السرطانية. لذلك ، قد يكون بروتوكول التصنيع الحيوي الموصوف أحد الأصول للدراسات المستقبلية التي تتطلب إنتاج NK-EVs من الدرجة السريرية.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح أو الإفصاح.

شكر وتقدير

يود المؤلفون أن يقدروا الدكتورين سيمون ساوفي وروجر تام وشو تشانغ على مراجعة المخطوطات النقدية. تم دعم هذا العمل من خلال المنح التشغيلية من المرحلة السابعة من مبادرة البحث والتطوير في علم الجينوم (GRDI) المرحلة السابعة (2019-2025) من حكومة كندا التي حصلت عليها JRL ، LW ، بالإضافة إلى المنح التشغيلية من مجلس أبحاث العلوم الطبيعية والهندسة RGPIN-2019-05220 ، جمعية أبحاث السرطان / جامعة أوتاوا 24064 ، 175177 منحة تشغيل أبحاث المعاهد الكندية للصحة (CIHR) حصلت عليها LW ، منحة CIHR MSc التي حصل عليها MK ، ومنح الملكة إليزابيث الثانية في العلوم والتكنولوجيا (QEII-GSST) التي حصل عليها FSDB.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.1 وميكرو ؛ م وحدة الترشيح الفراغي Filtropur V50 & nbsp ؛Sarstedt83,3941,002
0.22 & micro; م مرشح حقنة Acrodisc شركة PallPN4612
حقنة 1 مل  Thermo Fisher ScientificMB9204560TF-LAB
10 kDa Centricon Plus-70 مرشح الطرد المركزيSigmaUFC701008
60 مل حقنة   ؛Biosciences309653
96 بئر مسطحة شفافة قاع البوليسترين الأسود معالج TC الصفائح الدقيقة  كوستار3603
Agarose Thermo Fisher ScientificR0491
AKTA كروماتوجراف سائل سريع البروتين  جنرال إلكتريك لعلوم الحياة29022094
BD PrecisionGlide Needle - 18GBD Biosciences305196
Benzonase Nuclease   ؛قارئ SigmaE1014-25KU
BioTek Synergy H1 متعدد الأوضاعBioTek   ؛SH1M2G-SN
العازلة تحميل جل العصير الأزرق  Invitrogen10816015
راتنج CaptoCore 700  Cytiva17548102
Cellometer Auto 2000 Viability Counter Nexcelom BioScience LLC
CryoStor CS10 وسط تجميد  SigmaC2874
DPBS−/−  فيشرBP399-1
الصمام المزدوج أزرق / أبيض ضوء Transilluminator التدفق InvitrogenLB0100
Duet P3202  أنظمة
الضوئية Dulbecco المحلول الملحي المخزن بالفوسفاتGibco14190250
الإيثانول  الكحوليات التجاريةP006EAAN
FBS المستنفدة من الإكسوسوم ؛جيبكوA2720803
فلوروبريت DMEM GibcoA18967-01
مقياس الجلوكوزAccuCheckموديل 930
عمود الكروماتوغرافيا HiScale 10/40 Cytiva29360550
ImmunoCult-XF (بديل متوسط GMP)StemCell Technologies100-0956
ImmunoCult-XF T Cell Expansion Medium تقنيات الخلايا الجذعية10981
كحول الأيزوبروبيل EMDPX1834-1
K562 خلاياATCCCCL-243
LB وسائط  BioBasicSD7002
L-Lactate Assay Kit  Abcamab65331
خرطوشة ألياف مجوفة متوسطة  أنظمة FiberCellC2011
MgCl2 & nbsp ؛من SigmaM1028
 أبكامab289834
NanoSight NS300 Malvern
NaOH SupelcoSX0607N-6
NK92-MI cells ATCCCRL-2408
شرائط الأس الهيدروجيني-Mquant Sigma1,09533
PrestoBlue HS Cell Vivability Reagent Assay InvitrogenP50200
Qubit 4 Fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ33262
Qubit dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ33231  
أنبوب فحص Qubit Flex InvitrogenQ33252
Qubit Flex Fluorometer InvitrogenQ33327
كيوبيت بروتين BR فحص كيت  InvitrogenA50669
تحميل سريع 1Kb Plus سلم الحمض النووي  NEBN0469S
SYBRSafe DNA Gel Stain InvitrogenInvitrogenS33102
مضخة حقنة   ؛جهاز هارفارد984730
Triton-X 100 سيجماT-9284
UltraPure TAE Buffer  Invitrogen15558042
عن طريق محلول تلطيخ البرتقال الأكريدين وبروبيديوم يوديد (AO / PI)  ESBE العلميCS2-0106
BD مضخة التحكم في الأليافمجموعة الكشف عن الميكوبلازما PCR شرائط

المراجع

  1. Cheng, M., Chen, Y., Xiao, W., Sun, R., Tian, Z. NK cell-based immunotherapy for malignant diseases. Cell Mol Immunol. 10 (3), 230-252 (2013).
  2. Sheridan, C. Industry appetite for natural killer cells intensifies. Nat Biotechnol. 41 (2), 159-161 (2023).
  3. Shimasaki, N., Coustan-Smith, E., Kamiya, T., Campana, D. Expanded and armed natural killer cells for cancer treatment. Cytotherapy. 18 (11), 1422-1434 (2016).
  4. Elsharkasy, O. M., et al. Extracellular vesicles as drug delivery systems: Why and how. Adv Drug Deliv Rev. 159, 332-343 (2020).
  5. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Applications of extracellular vesicles in triple-negative breast cancer. Cancers. 14 (2), 451(2022).
  6. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  7. St-Denis-Bissonnette, F., et al. A clinically relevant large-scale biomanufacturing workflow to produce natural killer cells and natural killer cell-derived extracellular vesicles for cancer immunotherapy. J Extracell Vesicles. 12 (12), e12387(2023).
  8. Federici, C., et al. Natural-killer-derived extracellular vesicles: Immune sensors and interactors. Front Immunol. 11, 262(2020).
  9. Lugini, L., et al. Immune surveillance properties of human NK cell-derived exosomes. J Immunol. 189 (6), 2833-2842 (2012).
  10. Zhu, L., et al. Novel alternatives to extracellular vesicle-based immunotherapy - exosome mimetics derived from natural killer cells. Artif Cells Nanomed Biotechnol. 46 (sup3), S166-S179 (2018).
  11. Cochran, A. M., Kornbluth, J. Extracellular vesicles from the human natural killer cell line NK3.3 have broad and potent anti-tumor activity. Front Cell Dev Biol. 9, 698639(2021).
  12. Kim, H. Y., et al. Delivery of human natural killer cell-derived exosomes for liver cancer therapy: an in vivo study in subcutaneous and orthotopic animal models. Drug Deliv. 29 (1), 2897-2911 (2022).
  13. Alvarez-Erviti, L., et al. Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes. Nat Biotechnol. 29 (4), 341-345 (2011).
  14. El-Sahli, S., et al. A triple-drug nanotherapy to target breast cancer cells, cancer stem cells, and tumor vasculature. Cell Death Dis. 12 (1), 8(2021).
  15. Sulaiman, A., et al. Co-targeting bulk tumor and CSCs in clinically translatable TNBC patient-derived xenografts via combination nanotherapy. Mol Cancer Ther. 18 (10), 1755-1764 (2019).
  16. Farcas, M., Inngjerdingen, M. Natural killer cell-derived extracellular vesicles in cancer therapy. Scand J Immunol. 92 (4), e12938(2020).
  17. Murphy, D. E., et al. Extracellular vesicle-based therapeutics: natural versus engineered targeting and trafficking. Exp Mol Med. 51, 1-12 (2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. FiberCell-Systems. FiberCell systems user manual & quick start guide. , https://www.fibercellsystems.com/wp-content/uploads/2024/03/FiberCell-Systems-User-Manual-Quick-Start-Guide.pdf (2024).
  20. St-Denis-Bissonnette, F., et al. Evaluation of resazurin phenoxazine dye as a highly sensitive cell viability potency assay for natural killer cell-derived extracellular vesicle-based cancer biotherapeutics. J Extracell Biology. 3 (7), e166(2024).
  21. Herrmann, I. K., Wood, M. J. A., Fuhrmann, G. Extracellular vesicles as a next-generation drug delivery platform. Nat Nanotechnol. 16 (7), 748-759 (2021).
  22. Andaloussi, E. L. A., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nat Rev Drug Discov. 12 (5), 347-357 (2013).
  23. Federici, C., et al. Exosome release and low pH belong to a framework of resistance of human melanoma cells to cisplatin. PLoS One. 9 (2), e88193(2014).
  24. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066(2015).
  25. Neviani, P., et al. Natural killer-derived exosomal miR-186 inhibits neuroblastoma growth and immune escape mechanisms. Cancer Res. 79 (6), 1151-1164 (2019).
  26. Sun, H., et al. Natural killer cell-derived exosomal miR-3607-3p inhibits pancreatic cancer progression by targeting IL-26. Front Immunol. 10, 2819(2019).
  27. Jiang, Y., et al. Engineered exosomes: a promising drug delivery strategy for brain disease. Curr Med Chem. 29 (17), 3111-3124 (2022).
  28. Dosil, S. G., et al. Natural killer (NK) cell-derived extracellular-vesicle shuttled microRNAs control T cell responses. Elife. 11, e76319(2022).
  29. Geeurickx, E., et al. The generation and use of recombinant extracellular vesicles as biological reference material. Nat Commun. 10 (1), 3288(2019).
  30. Nathani, A., et al. Combined role of interleukin-15 stimulated natural killer cell-derived extracellular vesicles and carboplatin in osimertinib-resistant H1975 lung cancer cells with EGFR mutations. Pharmaceutics. 16 (1), 83(2024).
  31. Gobin, J., et al. Hollow-fiber bioreactor production of extracellular vesicles from human bone marrow mesenchymal stromal cells yields nanovesicles that mirrors the immuno-modulatory antigenic signature of the producer cell. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 127(2021).
  32. Sun, L., et al. A 3D culture system improves the yield of MSCs-derived extracellular vesicles and enhances their therapeutic efficacy for heart repair. Biomed Pharmacother. 161, 114557(2023).
  33. Ryu, A. H., Eckalbar, W. L., Kreimer, A., Yosef, N., Ahituv, N. Use antibiotics in cell culture with caution: genome-wide identification of antibiotic-induced changes in gene expression and regulation. Sci Rep. 7 (1), 7533(2017).
  34. Meng, W., et al. Prospects and challenges of extracellular vesicle-based drug delivery system: considering cell source. Drug Deliv. 27 (1), 585-598 (2020).
  35. Yang, Y., et al. Extracellular vesicles isolated by size-exclusion chromatography present suitability for RNomics analysis in plasma. J Transl Med. 19 (1), 104(2021).
  36. Gamez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Sci Rep. 6, 33641(2016).
  37. Gupta, D., Zickler, A. M., El Andaloussi, S. Dosing extracellular vesicles. Adv Drug Deliv Rev. 178, 178(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NK92 MI

مقالات ذات صلة