مقالة منهجية

توليد عضيات الدماغ المتوسط ثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان

DOI:

10.3791/67228

⸱

فبراير 14, 2025

 ,  , 
1Department of Clinical Medicine (K1), University of Bergen, 2Centre for International Health, Department of Global Public Health and Primary Care, University of Bergen, 3Department of Neurosurgery, Xinhua Hospital Affiliated to Shanghai Jiaotong University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لإنشاء عضيات ثلاثية الأبعاد في الدماغ المتوسط من الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان ، وتوجيه تكوينها لتقليد أنسجة الدماغ المتوسط الأصلية ، وبالتالي المساعدة في دراسة التطور والاضطرابات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل تطوير عضيات الدماغ المتوسط (MOs) من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) تقدما كبيرا في فهم نمو الدماغ ، وتسهيل النمذجة الدقيقة للأمراض ، وتطوير البحوث العلاجية. يحدد هذا البروتوكول طريقة لتوليد عضيات خاصة بالدماغ الأوسط باستخدام الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، باستخدام نهج التمايز الاستراتيجي. وتشمل التقنيات الرئيسية تثبيط SMAD المزدوج لقمع إشارات SMAD, إدارة عامل نمو الخلايا الليفية 8 ب (FGF-8b), وتنشيط مسار القنفذ سونيك باستخدام بورمورفامين ناهض, توجيه iPSCs نحو مصير منتصف الدماغ.

تحقق العضيات التي تنتجها هذه الطريقة أقطار تصل إلى 2 مم وتتضمن مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا الظهارية العصبية ، مما يعكس التنوع الخلوي المتأصل في الدماغ المتوسط. يتضمن التحقق من صحة هذه العضيات كهياكل أصلية للدماغ المتوسط التعبير عن علامات خاصة بالدماغ الأوسط ، مما يؤكد هويتها. نتيجة ملحوظة لهذه المنهجية هو التمايز الفعال من iPSCs إلى الخلايا العصبية الدوبامينية, التي هي سمة من سمات الدماغ المتوسط.

تكمن أهمية هذا البروتوكول في قدرته على إنتاج عضيات ناضجة وظيفيا خاصة بالدماغ الأوسط تكرر عن كثب الجوانب الأساسية للدماغ المتوسط ، مما يوفر نموذجا قيما للاستكشاف المتعمق لعمليات نمو الدماغ الأوسط والفيزيولوجيا المرضية للاضطرابات ذات الصلة مثل مرض باركنسون. وبالتالي ، فإن هذا البروتوكول بمثابة مورد مهم للباحثين الذين يسعون إلى تعزيز فهمنا للدماغ البشري وتطوير علاجات جديدة للأمراض التنكسية العصبية ، مما يجعله أداة لا غنى عنها في مجال البحوث العصبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل الدماغ البشري ، بهندسته المعمارية المعقدة وتكوينه الخلوي والجزيئي المعقد ، تحديات هائلة في أبحاث علم الأعصاب ، لا سيما في سياق نمذجة الأمراض وتطوير العلاجالخلوي 1. تزداد هذه التحديات تعقيدا بسبب التوافر المحدود للنماذج المختبرية المتطورة التي تمثل حقا تعقيد الدماغ البشري. ومع ذلك ، فإن التطورات الحديثة في تقنية الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي تتيح التمايز الخاضع للرتحكم إلى أنواع فرعية من الخلايا العصبية المحددة ، قد فتحت طرقا واعدة لاستكشاف نمو الدماغ البشري ، والتسبب في المرض ، والاستراتيجيات العلاجية القائمة على الخلايا.

تقليديا, ثنائي الأبعاد (2D) الثقافات العصبية المشتقة من iPSCs كانت حجر الزاوية في الدراسات في المختبر التي تهدف إلى محاكاة فسيولوجيا الخلايا العصبية البشرية وعلم الأمراض. لعبت هذه الثقافات أحادية الطبقة دورا أساسيا في تعزيز فهمنا للأمراض العصبية وفي اكتشاف عوامل الحماية العصبية2،3،4،5،6،7. على الرغم من فائدتها ، فإن هذه الأنظمة ثنائية الأبعاد تقصر في محاكاة التنوع الخلوي الحقيقي والبنية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) للدماغ البشري.

يمثل ظهور التكنولوجيا العضوية للدماغ قفزة كبيرة في النمذجة المختبرية ، مما يوفر أداة تحاكي عن كثب البيولوجيا المعقدة للدماغ البشري ضمن إطار ذي صلة من الناحية الفسيولوجية8. التقنيات المبكرة في تطوير العضوية في الدماغ استفادت من الخصائص التنظيمية المتأصلة في iPSCs لتشكيل مشتقات الأديم الظاهر تلقائيا, وبالتالي محاكاة المراحل المبكرة من نموالدماغ 5,9,10,11,12. بالنظر إلى الشبكات المعقدة التي تشكلها الخلايا العصبية مع الخلايا العصبية وغير العصبية الأخرى ، تصبح النمذجة ثلاثية الأبعاد ضرورية لدراسة الأمراض التنكسية العصبية بدقة. توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد بيئة أكثر تمثيلا في الجسم الحي ، مما يسهل التمايز العصبي المتسارع وتكوين الشبكة12،13،14 ، وتعزز تعبيرا أوسع عن الجينات العصبية مقارنة بالثقافات ثنائية الأبعاد15. تحقق الخلايا العصبية التي تم تطويرها في سياقات ثلاثية الأبعاد مورفولوجيا وسمات فسيولوجية تذكرنا أكثر بنظيراتها في الجسم الحي 16.

كانت التطورات الحديثة في نماذج الدماغ ثلاثية الأبعاد محورية في التقاط التعقيد المكاني والوظيفي للدماغ البشري بشكل أكثر فعالية. على مدى العقد الماضي ، أثبت تقدم البروتوكولات المتنوعة لتوليد كل من عضيات الدماغ بالكامل ونماذج الدماغ الخاصةبالمنطقة 11،17،18،19،20،21،22 أنه لا يقدر بثمن في نمذجة الاضطرابات العصبية مثل صغر الرأس11 ، ومرض الزهايمر14،23 ، ومرض باركنسون24. الهدف من هذا البروتوكول هو تطوير وتحسين طريقة لإنشاء MOs بشرية ثلاثية الأبعاد مشتقة من iPSCs البشرية. يهدف هذا البروتوكول على وجه التحديد إلى توليد العضيات المخصبة بالخلايا العصبية الدوبامين والمنظمة مكانيا بطريقة تحاكي عن كثب الهيكل الطبيعي ووظائف الدماغ المتوسط البشري. الغرض الأساسي من هذه العضيات هو العمل كنماذج متقدمة في المختبر لدراسة مرض باركنسون ، مما يوفر نظاما أكثر دقة وذات صلة من الناحية الفسيولوجية لاستكشاف عمليات النمو العصبي والأمراض المرتبطة بهذه الحالة. من خلال الاستفادة من iPSCs المشتقة من المريض لتوليد هذه العضيات الخاصة بالدماغ المتوسط, يسعى البروتوكول إلى تعزيز فهم آليات مرض باركنسون, تسهيل اكتشاف الأهداف العلاجية المحتملة, وتحسين تطوير العلاجات القائمة على الخلايا. من خلال هذا النهج المبتكر ، يهدف البروتوكول إلى التغلب على قيود الثقافات العصبية التقليدية ثنائية الأبعاد والمساهمة بشكل كبير في مجال أبحاث الأمراض التنكسية العصبية من خلال تقديم أداة فعالة لنمذجة الأمراض في المختبر واستكشاف استراتيجيات علاج جديدة.

على مدى السنوات العشر الماضية ، طورت فرق بحثية مختلفة عضيات الدماغ المتوسط (MOs) 8،21،25،26،27،28 ، باستخدام المنهجيات التي تظهر العديد من أوجه التشابه الرئيسية. في سعينا لتعميق فهم مرض باركنسون ، قمنا بتطوير بروتوكول لإنشاء MOs بشرية ثلاثية الأبعاد مشتقة من iPSCs البشرية. تقدم هذه العضيات ، المخصبة بالخلايا العصبية الدوبامينية المرتبة مكانيا ، نموذجا مثاليا لدراسة مرض باركنسون. لقد أسفر تطويرنا وتحسيننا لبروتوكولات العضوية الخاصة بالدماغ الأوسط عن نماذج متقدمة في المختبر ساهمت بشكل كبير في فهمنا لعمليات النمو العصبي والأمراض التنكسية العصبية. أثبتت هذه النماذج ، خاصة عند تطبيقها على MOs المشتقة من المريض ، فعاليتها كأدوات قوية لنمذجة الأمراض في المختبر ، وتقدم وجهات نظر ومنهجيات جديدة في مجال زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد المتقدمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

iPSCs المتولدة من الخلايا الليفية البشرية الطبيعية ديترويت 551 والخلايا الجذعية الجنينية البشرية (ESCs) خط hESC 360 كما هو موضحسابقا 4. تم الحصول على iPSCs بموافقة لجنة غرب النرويج لبحوث الصحة الأخلاقية REK nr. 2012/919. تمت مراقبة جميع الخلايا بانتظام بحثا عن تلوث الميكوبلازما باستخدام مجموعة MycoAlert Mycoplasma Detect. يحتوي جدول المواد على معلومات حول جميع المواد والكواشف والمعدات المستخدمة في هذا البروتوكول. يصف الجدول 1 الوسائط وغيرها من المخزونات المستخدمة.

1. ذوبان iPSCs

  1. صفيحة مطلية بالمصفوفة وإعداد متوسط أساسي 8 (E8)
    1. قم بإذابة قارورة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد طوال الليل. خفف 1: 100 في وسط النسر المعدل المتقدم المتقدم البارد (DMEM) / Ham's F12 DMEM / F12 (تركيز نهائي 1٪) (انظر جدول المواد والجدول 1). قم بتخزين الحصص عند -20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد.
    2. قم بإذابة الغشاء القاعدي المخفف عند 4 درجات مئوية ؛ قم بتغطية صفيحة من 6 آبار ب 1 مل من المحلول لكل بئر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة واتركها تتوازن مع درجة حرارة الغرفة (RT).
      ملاحظة: يمكن تبريد الأطباق لمدة أقصاها أسبوعين (تأكد من التسخين إلى RT قبل الاستخدام). للتخزين المطول ، أضف 1 مل من E8 Medium (انظر جدول المواد والجدول 1) إلى اللوحة المطلية لتجنب جفاف الجل.
  2. إعداد E8 متوسط
    1. في بيئة معقمة ، امزج الوسط القاعدي E8 مع مكمل E8 (انظر جدول المواد والجدول 1).
      ملاحظة: يمكن تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوعين. قم بإذابة مكمل E8 المجمد طوال الليل عند 4 درجات مئوية قبل تحضير الوسط الكامل. لا تذوب عند 37 درجة مئوية ، فقد يضر ذلك باستقرارها. قبل الاستخدام، قم بتسخين الحجم المطلوب فقط من E8 من درجة حرارة الغرفة المتوسطة إلى الغرفة (RT) حتى يختفي من البرودة عند لمسها.

2. بذر iPSCs

  1. قم بتسخين الألواح المطلية بالمصفوفة و E8 Medium في RT أو الحاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. وسط ثقافة الشفط ؛ شطف iPSCs, التي هي في 60٪ -70٪ التقاء, مع Dulbecco's محلول ملحي مخزن الفوسفات بدون الكالسيوم والمغنيسيوم (DPBS Ca2+/Mg2+-free,4 مل لكل بئر في 6 آبار صفيحة).
  3. أضف حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA ، 0.5 ملي مولار ، 1 مل لكل بئر ، انظر جدول المواد والجدول 1) ؛ احتضن عند 37 درجة مئوية حتى تنفصل حواف المستعمرة (3-5 دقائق).
  4. استنشاق حل التفكك. لفصل المستعمرات ، قم بسحب ماصة E8 Medium الدافئة مسبقا بعناية (4 مل لكل بئر) مباشرة على المستعمرات بقوة أقوى من المعتاد من الماصة ، مما يولد حركة سائلة موضعية على سطح الخلية.
  5. قم بتقسيم الخلايا بنسبة 1: 2 عن طريق نقلها إلى بئرين جديدين من صفيحة 6 آبار مطلية بالمصفوفة ، مع إضافة 2 مل من الوسط لكل بئر. ثم احتضن عند 37 درجة مئوية.
  6. تبادل وسائل الإعلام يوميا حتى تصل المستعمرات إلى 80٪ من التقاء.
  7. باستخدام مجهر بتكبير 10 أضعاف ، راقب المستعمرات للتأكد من أنها ذات حجم مناسب ، وتتميز عادة بشكل دائري مميز يتراوح قطره من 0.5 إلى 1 مم. تأكد من أن المستعمرات عبارة عن هياكل كثيفة ومضغوطة تتميز بحدود محددة وناعمة.

3. الحث العصبي

  1. إعداد متوسط وإعداد اليوم 0
    1. قم بإعداد 500 مل لكل من وسط محدد كيميائيا (CDM) ، ووسط الحث العصبي (NIM) ، ووسط مصل الخلايا الجذعية العصبية (NSC SF) ، مع الإشارة إلى جدول المواد والجدول 1.
    2. اشطف الخلايا في طبق مكون من 6 آبار مع 4 مل من DPBS (1x) (Ca2 +/Mg2+- مجانا) لكل بئر ، متبوعا بإضافة 3 مل من NIM لكل بئر لإعداد اليوم 0.
    3. استبدال NIM (3 مل لكل بئر) في الأيام 1 و 3 و 5 ؛ راقب يوميا تحت المجهر.
    4. في اليوم 6 ، افصل الوريدات العصبية في ثقافة التعليق باستخدام الخطوات التالية.
      1. يغسل برفق مرة واحدة باستخدام DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + - مجانا) (4 مل لكل بئر في طبق 6 آبار). أضف الكولاجيناز الرابع (1 مل لكل بئر في طبق 6 آبار) واحتضنه لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة الكولاجيناز IV ، واشطفه برفق مرة واحدة باستخدام DPBS (1x) (Ca2 + / Mg2 + - مجاني) (4 مل لكل بئر في طبق من 6 آبار).
      2. أضف 2 مل من NSC SF Medium إلى كل بئر من صفيحة 6 آبار. افصل الخلايا عن طريق كشط قيعان الآبار ، وإنشاء شبكات بطرف ماصة 200 ميكرولتر.
      3. انقل معلق الخلية من اللوحة المكونة من 6 آبار إلى طبق غير ملتصق مقاس 10 سم. اضبط مستوى الصوت على 12 مل باستخدام NSC SF Medium.
      4. ضع الطبق غير اللاصق على شاكر (شاكر مداري صغير الحجم ssm1) عند 85 دورة في الدقيقة بزاوية 0 درجة في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2 لمنع التجميع.

4. زخرفة الدماغ المتوسط

  1. في اليوم 7 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة مع 100 نانوغرام / مل FGF-8b ؛ ضعها على حاضنة شاكر المدارية.
  2. في الأيام 8-13 ، قم بتغيير الوسيط كل يومين ؛ راقب تحت المجهر يوميا.
  3. في اليوم 14 ، أضف 12 مل من آلية التنمية النظيفة مع 100 نانوغرام / مل FGF-8b و 1 ميكرومتر بورمورفامين (PM) ؛ ضعها على شاكر مداري.
  4. في الأيام 15-20 ، قم بتغيير الوسيط كل يومين ؛ راقب تحت المجهر يوميا.

5. تضمين Matrigel وإنهاء MO والنضج

  1. قم بإذابة Matrigel على الجليد عند درجة حرارة تتراوح بين 2 درجة مئوية و 8 درجات مئوية لمدة 1-2 ساعة.
    ملاحظة: قم بإذابة كمية كافية من Matrigel لتوفير 15 ميكرولتر لكل جسم جنيني (EB). حافظ على Matrigel مبردا على الجليد لتجنب البلمرة المبكرة. قم بتبريد جميع الأواني البلاستيكية التي ستكون على اتصال ب Matrigel عند -20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل الاستخدام.
  2. ضع ورقة تضمين عضوية معقمة في طبق فارغ.
  3. باستخدام طرف ماصة عريض التجويف سعة 200 ميكرولتر، أخرج العضوي برفق من الطبق وانقله إلى سطح التضمين باستخدام عضو واحد لكل بئر. كرر هذه العملية حتى يتم جمع 12-16 EBs على سطح التضمين.
  4. قم بإزالة الوسط الزائد بعناية من كل EB ثم أضف 15 ميكرولتر من Matrigel البارد بالتنقيط على كل EB. بمساعدة ماصة، أعد وضع EB إلى مركز قطرة Matrigel.
  5. احتضان اللوحة في حاضنة مثبتة على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة للسماح ل Matrigel بالبلمرة.
  6. باستخدام ملقط معقم ، ارفع ورقة التضمين بقطرات Matrigel. أمسك الورقة مباشرة فوق بئر واحد في صفيحة ملتصقة منخفضة للغاية مكونة من 6 آبار. ماصة تصل إلى 3 مل من CDM مع 10 نانوغرام / مل من عامل التغذية العصبية المشتق من الدماغ (BDNF) و 10 نانوغرام / مل عامل التغذية العصبية المشتق من خط الخلايا الدبقية (GDNF) وشطف قطرات Matrigel برفق من الورقة في كل بئر. كرر هذه العملية حتى يتم نقل جميع قطرات Matrigel 6-8 إلى بئر واحد.
  7. ضع الألواح على شاكر مداري في حاضنة 37 درجة مئوية عند 85 دورة في الدقيقة وقم بتغيير آلية التنمية النظيفة ب 10 نانوغرام / مل BDNF و 10 نانوغرام / مل GDNF كل 3 أيام.
    ملاحظة: الحفاظ على الثقافات المميزة لمدة تصل إلى 3 أشهر. يظهر التشكل العصبي بعد أسبوعين من الإنهاء. BDNF و GDNF ليسا ضروريين للزراعة بعد 3 أشهر.

6. تلطيخ التألق المناعي

  1. استخدم ماصة سعة 1,000 ميكرولتر لاسترداد العضوية برفق من الوسط ووضعها برفق على شريحة مجهرية بأقل قدر من الوسط.
  2. اتركه يجف تماما في الهواء عند RT. أضف 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) (300 ميكرولتر لكل عينة) لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: PFA خطير وقد يكون له خصائص مسرطنة. تعامل معها بحذر ، وامتنع عن الاتصال المباشر بالجلد والعينين ، وتأكد من الاستخدام داخل غطاء الدخان الكيميائي.
  3. أضف 30٪ محلول سكروز (300 ميكرولتر لكل عينة) إلى الشرائح واتركها تحتضن طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. قم بحظر العضيات وتغلغلها عن طريق إضافة المخزن المؤقت المانع (BB) (300 ميكرولتر لكل عينة) ، والذي يتضمن PBS (مع Ca2 + / Mg2+) ، و 0.3٪ Triton X-100 ، و 10٪ مصل الماعز العادي ، لمدة ساعتين في RT (أو بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية). استخدم قلم حاجز كاره للماء لتحديد العضيات وحصر المخزن المؤقت على الشريحة.
  5. قم بتغطية العينات بحجم مناسب من الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت المانع (300 ميكرولتر لكل عينة) ، وبروتين الصندوق المضاد للرأس الشوكي G1 (FOXG1 ، 1: 200) ، وصندوق هوميوبوكس مضاد لتقويم الأسنان 2 (OTX2 ، 1: 100) ، وصندوق مضاد للرأس الشوكي A2 (FOXA2 ، 1: 100) ، ومضاد للتيروزين هيدروكسيلاز (TH ، 1: 100) ، ومضاد SRY (منطقة تحديد الجنس Y) - مربع 2 (SOX2 ، 1: 100) ، بروتين صندوق مضاد للاقتران (PAX6 ، 1: 100) ، والبروتين المرتبط بمضاد للأنابيب الدقيقة 2 (MAP2 1: 500) ، وتحتضن بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في الظلام (انظر جدول المواد).
  6. اغسل العينات في 1x PBS لمدة 3 ساعات مع تغييرين إلى ثلاثة تغييرات في المخزن المؤقت على منصة هزازة برفق.
  7. احتضن بالجسم المضاد الثانوي (300 ميكرولتر لكل عينة) ، ومضاد لأليكسا فلور 488 (1: 800) ، ومضاد أليكسا فلور 594 (1: 800) ، ومضاد أليكسا فلور 647 (1: 800) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة مظلمة رطبة. أضف وصمة عار نووية Hoechst 33342 (1: 5,000) في وقت واحد (انظر جدول المواد).
  8. قم بإزالة الجسم المضاد ، واشطفه بسرعة باستخدام PBS ، ثم أضف PBS الذي يحتوي على 0.01٪ أزيد الصوديوم لمدة 1-2 أيام عند 4 درجات مئوية لمنع التلوث.
  9. قم بشفط PBS ، وإزالة أي محلول زائد ، وتركيب العضيات باستخدام وسيط تركيب (راجع جدول المواد). ضع غطاء ، مع التأكد من منع تكوين فقاعة الهواء ، وقم بتخزينه في غرفة مظلمة في RT لمدة 12 ساعة على الأقل للسماح لوسط التركيب بالبلمرة بالكامل.
    ملاحظة: العينة جاهزة الآن للمراقبة باستخدام المجهر الفلوري.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة, نقدم بروتوكولا رائدا لاشتقاق MOs من iPSCs. من الأمور الأساسية في منهجيتنا الاستخدام المبتكر لتثبيط SMAD المزدوج ، جنبا إلى جنب بشكل تآزري مع FGF-8b ومسار القنفذ الصوتي (SHH) بورمورفامين (PM). تم تصوير هذا النهج في الشكل 1. تبدأ عملية التمايز بتوجيه iPSCs نحو سلالة الأديم الظاهر العصبي, تشكيل مستعمرات الوردة الظهارية العصبية أو العصبية. يتم تحقيق ذلك من خلال تثبيط إشارات SMAD المزدوج ، باستخدام SB2431542 كمركب رئيسي29. تتضمن المرحلة التالية زراعة المجال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا التحقيق, لقد طورنا منهجية للتمييز بين MO و iPSCs. يستخدم بروتوكولنا استراتيجية تثبيط SMAD المزدوجة المعززة بالعوامل المورفولوجية ، بما في ذلك FGF-8b و SHH ناهض PM. يحاكي هذا النهج عن كثب الإشارات التنموية الحاسمة لتطور الدماغ المتوسط. يدفع مسار التمايز الذي أنشأناه إلى تكوين هياكل ظهارية عصبية تذكرنا بالوريدات العصبية التي لوحظت أثناء نمو الدماغ الطبيعي. يشكل هذا التحول من الثقافات ثنائية الأبعاد إلى المجالات العصبية ثلاثية الأبعاد تقدما كبيرا في التكنولوجيا العضوية ، مما يوفر سيا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء الشكل 1 باستخدام BioRender.com. نشكر جامعة بيرغن ميلتزرز هويسكولفوندز (رقم المشروع: 103517133) ، وجيردا ماير نيكويست جولدبراندسون ، وجيردت ماير نيكويست (رقم المشروع: 103816102) على التمويل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CCD مجهر الكاميرا Leica DFC3000 GLeica Microsystems, ألمانيا
التركيز الدهني المحدد كيميائياThermo Fisher Scientific11905031CDM مكون
Collagenase  كاشف 17104019 الحراري الرابعThermo Fisherالعلمي للتفكك اللطيف من iPSCs البشرية
Corning  أطباق الثقافة غير المعالجةSigma-AldrichCLS430589Suspension culture 
DMEM / F-12 ، مكمل GlutaMAXThermo Fisher Scientific10565018تمايز الخلايا النجمية القاعدية المتوسطة
DPBSThermo FisherScientific 14190250تستخدم لمجموعة متنوعة من غسل ثقافة
الخلايا كاشف15575020Thermo Fisherالعلمي للتفكك اللطيف من iPSCs البشرية
الأساسية 8 القاعدية المتوسطةفيشر A1516901العلميالوسط القاعدي لثقافة iPSC
أساسي 8 ملحق (50x)A1517101العلمي Thermo Fisherلثقافة iPSC
FCCPAbcamab120081يزيل إمكانات غشاء الميتوكوندريا وتلوين TMRE
FGF-basicPeproTech100-18Bتمايز الخلايا النجمية المكون المتوسط
نظام شفط السوائل التحكم BVCVacuubrand, الفورمالديهايد الألماني
(PFA) 16٪ثيرمو فيشر العلمي28908تثبيت الخلية 
GDNFPeprotech450-10DA الخلايا العصبية المكون المتوسط
Geltrex (مصفوفة الغشاء القاعدي)A1413302 Thermo Fisher Scientificتستخدم لربط وصيانة iPSCs البشرية
مكمل GlutaMAXمكمل 35050061 علميلثقافة NSC
حاضنات Heracell 150i CO2فيشر ساينتفيك ، الولايات المتحدة الأمريكية
IMDMThermo Fisher Scientific21980032الوسط القاعدي ل CDM
InSolution AMPK مثبطسيجما ألدريتش171261الحث العصبي المكون المتوسط
الأنسولينروش1376497مكونات CDM
iPSCs المشتقة من ديترويت 551 fibroblats  ATCCCCL-110
Leica TCS SP8 STED مجهر متحد البؤرLeica Microsystems ، ألمانيا
MatrigelLife Science354230Matrigel تضمين
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM
مكون مصل الماعزالعادي Thermo Fisher ScientificPCN5000يستخدم لحجب العازلة
المدارية الهزازات - SSM1Stuart Equipment ، ورقة التضمين العضوية في المملكة المتحدة
STEMCELL Technologies8579Matrigel تضمين
ورقة التضمين العضويةSTEMCELL Technologies   ؛8579
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014يستخدم لمجموعة متنوعة من الغسالات
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في محلول
Poly-L-ornithineSigma-AldrichP4957يعزز ارتباط ونمو الخلايا العصبية في المختبر
ProLong Gold AntifadeMountant Thermo فيشر ScientificP36930تركيب الغطاء للصورة متحد البؤر
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204يعزز تمايز الخلايا العصبية DA
المؤتلف للإنسان / الفأر FGF-8b بروتين   ؛R & D Systems423-F8-025 / CFيعزز تمايز الخلايا العصبية DA   ؛
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPالحث العصبي المكون المتوسط
TRITON X-100VWR International9002-93-1تستخدم لنفاذية الخلايا في فحوصات التلوين المناعي
SSM1 شاكر مداري مضغوط   ؛Norrscope51901-10 SSM1 شاكر ، مداري ، دوار صغير 230 فولتللزراعة
حمام مائي أكاديمية Jb Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments ، الولايات المتحدة الأمريكية
< قوية > الأجسام المضادة المستخدمة في التلوين المناعي < / قوي >
قوي < > الجسم المضاد الأساسي < / قوي >
مضاد ل DATAbcamab128848 ، RRID: AB_2665470أرنب ؛ 1: 100 & nbsp ؛
مضاد FOXA2ProteinTech22474-1-AP ، RRID: AB_2879110أرنب ؛ 1: 100   ؛
anti-FOXG1Abcamab196868, RRID:AB_2892604أرنب; 1:200
anti-LMX1Abcamab139726, RRID:AB_2827684أرنب; 1:100 
مضاد ل MAP2Abcamab5392 ، RRID: AB_2138153دجاج ؛ 1: 500
مضاد ل OTX2ProteinTech13497-1-AP ، RRID: AB_2157176أرنب ؛ 1: 100 & nbsp ؛
مكافحة THAbcamab75875, RRID:AB_1310786أرنب; 1:100 
<قوي > جسم مضاد ثانوي < / قوي >< قوي > تخفيف (& mu ؛ L) < / قوي >
  ؛ Alexa Fluor  594 الماعز المضاد للأرانب IgGثيرمو فيشر العلميA-11012  ؛ 1:400
Alexa Fluor  488 الماعز المضاد للأرانب IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 الماعز المضاد للأرانب IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  488 الماعز المضاد للأرانب IgGThermo Fisher ScientificA- 11008  1:400
Alexa Fluor  594 الماعز المضاد للأرانب IgG ثيرمو فيشر العلميA-11012  1:400
Alexa Fluor  594 الماعز المضاد للأرانب IgG ثيرمو فيشر العلميA-11012  1:400
Alexa Fluor  647 الماعز المضاد للدجاج IgG ثيرمو فيشر العلميA-21469  1:400
: العلمي EDTA الحرارية مكمل في المختبر العضوية.

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Markram, H. Seven challenges for neuroscience. Funct Neurol. 28 (3), 145-151 (2013).
  2. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Exp Neurol. 33 (7), 113-536 (2021).
  3. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Front Cell Dev Biol. 9, 304-737 (2021).
  4. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Mol Med. 12 (10), 121-146 (2020).
  5. Xu, P., et al. Human midbrain dopaminergic neuronal differentiation markers predict cell therapy outcomes in a Parkinson's disease model. J Clin Invest. 132 (14), 156-768 (2022).
  6. Cooper, O., et al. Pharmacological rescue of mitochondrial deficits in iPSC-derived neural cells from patients with familial Parkinson's disease. Sci Transl Med. 4 (141), 141-190 (2012).
  7. Nguyen, H. N., et al. LRRK2 mutant iPSC-derived DA neurons demonstrate increased susceptibility to oxidative stress. Cell Stem Cell. 8 (3), 267-280 (2011).
  8. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 73-102 (2021).
  9. Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570 (7762), 523-527 (2019).
  10. Qian, X., Song, H., Ming, G. L. Brain organoids: advances, applications and challenges. Development. 146 (8), dev166074(2019).
  11. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
  12. Shariati, L., Esmaeili, Y., Haghjooy Javanmard, S., Bidram, E., Amini, A. Organoid technology: Current standing and future perspectives. Stem Cells. 39 (12), 1625-1649 (2021).
  13. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  14. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37 (10), 1139-1148 (2015).
  15. Sun, A. X., Ng, H. H., Tan, E. K. Translational potential of human brain organoids. Ann Clin Transl Neurol. 5 (2), 226-235 (2018).
  16. Del Dosso, A., Urenda, J. P., Nguyen, T., Quadrato, G. Upgrading the physiological relevance of human brain organoids. Neuron. 107 (6), 1014-1028 (2020).
  17. Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
  18. Asgrimsdottir, E. S., Arenas, E. Midbrain dopaminergic neuron development at the single cell level: In vivo and in stem cells. Front Cell Dev Biol. 8, 463(2020).
  19. Zagare, A., et al. Midbrain organoids mimic early embryonic neurodevelopment and recapitulate LRRK2-p.Gly2019Ser-associated gene expression. Am J Hum Genet. 109 (2), 311-327 (2022).
  20. Mohamed, N. V., et al. Midbrain organoids with an SNCA gene triplication model key features of synucleinopathy. Brain Commun. 3 (4), fcab223(2021).
  21. Jo, J., et al. Midbrain-like organoids from human pluripotent stem cells contain functional dopaminergic and neuromelanin-producing neurons. Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).
  22. Kwak, T. H., et al. Generation of homogeneous midbrain organoids with in vivo-like cellular composition facilitates neurotoxin-based Parkinson's disease modeling. Stem Cells. 38 (6), 727-740 (2020).
  23. Karmirian, K., et al. Modeling Alzheimer's disease using human brain organoids. Methods Mol Biol. 2561, 135-158 (2023).
  24. Smits, L. M., et al. Modeling Parkinson's disease in midbrain-like organoids. NPJ Parkinsons Dis. 5, 5(2019).
  25. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  26. Smits, L. M., et al. Single-cell transcriptomics reveals multiple neuronal cell types in human midbrain-specific organoids. Cell Tissue Res. 382 (3), 463-476 (2020).
  27. Sozzi, E., Nilsson, F., Kajtez, J., Parmar, M., Fiorenzano, A. Generation of human ventral midbrain organoids derived from pluripotent stem cells. Curr Protoc. 2 (9), 555(2022).
  28. Tieng, V., et al. Engineering of midbrain organoids containing long-lived dopaminergic neurons. Stem Cells Dev. 23 (13), 1535-1547 (2014).
  29. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  30. Mercurio, S., Serra, L., Pagin, M., Nicolis, S. K. Deconstructing Sox2 function in brain development and disease. Cells. 11 (10), 1604(2022).
  31. Hettige, N. C., Ernst, C. FOXG1 dose in brain development. Front Pediatr. 7, 482(2019).
  32. Cooper, O., et al. Differentiation of human ES and Parkinson's disease iPS cells into ventral midbrain dopaminergic neurons requires a high activity form of SHH, FGF8a and specific regionalization by retinoic acid. Mol Cell Neurosci. 45 (3), 258-266 (2010).
  33. Millet, S., Bloch-Gallego, E., Simeone, A., Alvarado-Mallart, R. M. The caudal limit of Otx2 gene expression as a marker of the midbrain/hindbrain boundary: a study using in situ hybridisation and chick/quail homotopic grafts. Development. 122 (12), 3785-3797 (1996).
  34. Surmeier, D. J. Determinants of dopaminergic neuron loss in Parkinson's disease. FEBS J. 285 (19), 3657-3668 (2018).
  35. Chen, A., Yangzom, T., Sullivan, G. J., Liang, K. X. Mitochondrial dysfunction and neuronal anomalies in POLG mutant midbrain organoids. bioRxiv. , (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SMAD
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة