مقالة منهجية

عزل وتوصيف الإكسوسومات المشتقة من أنسجة طحال الفأر

DOI:

10.3791/67234

⸱

سبتمبر 20, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 2Scientific Research Center, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University, 3Medical Interdisciplinary Science Research Center of Western Guangdong, the Second Affiliated Hospital of Guangdong Medical University, Guangdong Medical University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم بروتوكولا لعزل الإكسوسومات المشتقة من طحال الفأر باستخدام مزيج من الهضم مع الكولاجيناز من النوع الأول والطرد المركزي الفائق.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإكسوسومات (Exo) عبارة عن هياكل ثنائية الطبقة دهنية تفرزها خلايا مختلفة ، بما في ذلك خلايا والنباتات وبدائيات النوى. كشفت الدراسات السابقة أن Exo المشتقة من الخلط أو الخلايا الطافية هي أهداف واعدة للمؤشرات الحيوية التشخيصية أو النذيرية الجديدة ، مما يؤكد دورها المهم في التسبب في المرض. اجتذبت Exo المشتقة من الأنسجة (Ti-Exo) اهتماما متزايدا نظرا لقدرتها على عكس خصوصية الأنسجة والبيئة المكروية بدقة. يلعب Ti-Exo ، الموجود في الفضاء الخلالي ، أدوارا حاسمة في الاتصال بين الخلايا والإشارات عبر الأعضاء. على الرغم من قيمتها المعترف بها في توضيح آليات المرض ، إلا أن عزل Ti-Exo لا يزال يمثل تحديا بسبب تعقيد مصفوفات الأنسجة والتباين في طرق الاستخراج. في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول عملي لعزل الإكسوسومات من أنسجة طحال الفئران ، مما يوفر تقنية قابلة للتكرار لتحليل التعريف اللاحق والدراسات الوظيفية. استخدمنا هضم الكولاجيناز من النوع الأول جنبا إلى جنب مع الطرد المركزي الفائق التفاضلي لعزل Exo المشتق من الطحال. تم تحديد خصائص Exo المعزولة من خلال المجهر الإلكتروني ، ومقياس التدفق الخلوي النانوي ، واللطخة الغربية. عرضت Exo المعزولة المشتقة من الطحال التشكل النموذجي للحويصلات ثنائية الطبقة الدهنية ، بأحجام جسيمات تتراوح من 30 نانومتر إلى 150 نانومتر. بالإضافة إلى ذلك ، أكد ملف تعريف التعبير عن علامات الإكسوسوم وجود ونقاء الإكسوسوم. مجتمعة ، نجحنا في وضع بروتوكول عملي لعزل Exo المشتق من الطحال في الفئران.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإكسوسومات (Exo) هي مجموعة فرعية من الحويصلات خارج الخلية (EVs) ، يتراوح حجمها من 30 إلى 150 نانومتر ، وتغطي مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية والدهون1. هذه الجزيئات الحيوية مشتقة من الخلايا الأبوية ويتم إطلاقها في الفضاء خارج الخلية. يسهل Exo تبادل المعلومات الجزيئية الحيوية بين الخلايا والبيئة المكروية المحيطة بها ، ويلعب أدوارا في كل من الأنظمة بدائية النواة وحقيقيةالنواة 2. خصائص الإكسوسومات ، مثل المحتوى والحجم ومكونات الغشاء والأصل الخلوي ، متغيرة للغاية وتتأثر بنوع الخلية الأصلية والحالة الخلوية والظروف البيئية.

تصنف الإكسوسومات عادة إلى ثلاث فئات بناء على مصدرها: مشتقة من زراعة الخلايا ، ومشتقة من سوائل الجسم ، ومشتقة من الأنسجة (Ti-Exo). في حين أن الإكسوسومات المشتقة من زراعة الخلايا قد تمت دراستها على نطاق واسع نظرا لإمكانية الوصول إليها وإنتاجيتها المتسقة ، فإن استخدامها محدود بسبب التغيرات المحتملة في خصائص الخلية بعد الزراعة المطولة ، والتي قد تشوه وظائفهاالبيولوجية 3،4،5. علاوة على ذلك ، يتم الحفاظ على معظم مزارع الخلايا في بيئات ثنائية الأبعاد لا تحاكي التفاعلات بين الخلايا المعقدة في الجسم الحي ، مما قد يؤثر على تفسير البيانات6. على العكس من ذلك ، توفر الإكسوسومات المعزولة من السوائل البيولوجية خيارا طفيفا التوغل لمراقبة تطور المرض في الوقت الفعلي7. ومع ذلك ، غالبا ما تحتوي هذه العينات على مزيج من الإكسوسومات من أصول مختلفة ، مما يعقد التحديد الدقيق لمصدرهاالأساسي 8. بالنظر إلى هذه التحديات ، هناك اهتمام متزايد ب Ti-Exo ، التي توجد في الخلال خارج الخلية وهي وسطاء رئيسيون للإشارات بين الخلايا.

يلعب الطحال دورا مهما في وظيفة المناعة والحفاظ على التوازن الداخلي. على الرغم من البروتوكولات الحالية لعزل Ti-Exo عن أعضاء مثل الدماغ والكبد والأورام ، إلا أن الطرق العملية للإكسوسومات المشتقة من الطحال يتم الإبلاغ عنها بشكل محدود9،10. تهدف هذه الدراسة إلى وضع بروتوكول عملي لعزل الإكسوسومات من أنسجة الطحال في الفئران معدلة من تقرير سابق11. نحن نفصل طريقة تتضمن هضم الكولاجيناز متبوعا بالطرد المركزي الفائق ، مما يقلل من اضطراب غشاء الخلية ويضمن نقاء عاليا وإنتاجية Exo المشتق من الطحال. تم التحقق من صحة خصائص Exo المعزولة باستخدام هذا البروتوكول المعمول به من خلال المجهر الإلكتروني (TEM) ، ومقياس التدفق الخلوي النانوي (Nano-FCM) ، واللطخة الغربية ، مما يؤكد فعالية البروتوكول لمزيد من البحث التجريبي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الحصول على العينات من الفئران ، بموافقة أخلاقية منحتها لجنة الأخلاقيات بجامعة قوانغدونغ الطبية. يتم توفير أوصاف مفصلة للمواد والمعدات والبرامج المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. يتم توضيح تفاصيل المستحضر قبل الاستخراج في الشكل 1 ، بينما يتم وصف عملية استخراج وتخصيب الطحال في الشكل 2.

1. التحضير

  1. قم بالتبريد المسبق لأجهزة الطرد المركزي عالية السرعة وفائقة السرعة إلى 4 درجات مئوية واضبط درجة حرارة شاكر سطح المكتب على 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد أطباق زراعة الخلايا (figure-protocol-1100 مم) ، وأنابيب الطرد المركزي المعقمة سعة 50 مل ، والثلج ، ومصفاة الخلايا المعقمة (figure-protocol-270 ميكرومتر) كما هو موضح في الشكل 1 أ ، ب.
  3. تعقيم المقص والملقط باستخدام رذاذ كحول 75٪ ، متبوعا بالتعقيم بدرجة حرارة عالية. هذه الأدوات موضحة في الشكل 1C.
  4. ضع أنسجة الطحال في طبق بتري معقم figure-protocol-3مقاس 100 مم على الثلج ، واغسل الدم السطحي بمحلول ملحي معقم مثلج (PBS). جفف أنسجة الطحال بشاش معقم ووزنها بعد التجفيف.
    ملحوظة: إذا تم تجميد الأنسجة ، قم بإذابة الثلج في طبق لمدة 15 دقيقة على الثلج قبل المتابعة.
  5. رطب مصفاة الخلية (figure-protocol-470 ميكرومتر) عن طريق إسقاط 1 مل من PBS المعقم في المصفاة باستخدام ماصة نقل معقمة.
  6. قم بإعداد المخزن المؤقت للجهاز الهضمي (0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول) باستخدام 1x PBS مع خلاط دوامة.
    ملاحظة: استخدم 10 مل من العازلة الهضمية لكل 100 مجم من أنسجة الطحال. تم اختيار تركيز الكولاجيناز في هذه الدراسة بناء على تعليمات المنتج. بالنسبة لأنواع الأنسجة الأخرى ، قد يحتاج الباحثون إلى ضبط هذه المعلمات بناء على كثافة الأنسجة وتكوينها. يوصى بإجراء تجارب أولية بتركيزات متفاوتة وأوقات هضم لتحديد الظروف المثلى لكل نوع من أنواع الأنسجة.

2. هضم الأنسجة

  1. قم بتقطيع الأنسجة إلى قطع صغيرة موحدة بمقص في طبق ثقافة على الجليد (الشكل 3 أ) ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل باستخدام ماصة نقل معقمة.
  2. أضف عازلة الهضم إلى الأنبوب وفقا لوزن أنسجة الطحال كما هو موضح أعلاه (الشكل 3 ب) ، ثم هز الأنبوب بزاوية 45 درجة على شاكر أفقي عند 37 درجة مئوية. راقب تقدم الهضم وأوقف عملية الهضم عندما تتشتت قطع الأنسجة ، ويفقد معظمها شكلها. يجب أن يختلف وقت الهضم بين الأنسجة. في ظل الظروف التجريبية في هذه الدراسة ، يكون وقت الهضم حوالي 30 دقيقة.
  3. انقل الخليط المهضوم إلى مصفاة خلوية (Ф70 ميكرومتر) في درجة حرارة الغرفة (RT) لإزالة بقايا الأنسجة الليفية والأكبر.
    ملاحظة: الترشيح الكامل مباشرة بعد الهضم.
  4. اجمع المرشح في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 مل.

3. عزل الإكسوسوم عن طريق الطرد المركزي التفاضلي

  1. يتم ترشيح أجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. يمكن رؤية الحبيبات التي تحتوي على الخلايا المتبقية وحطام الخلايا والنوى بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3C.
  2. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن رؤية الحبيبات التي تحتوي على أجسام موت الخلايا المبرمج والميكروسومات بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3D.
  3. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وجهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية. يمكن رؤية الحبيبات التي تحتوي على الحويصلات الدقيقة وغشاء البلازما بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3E.
  4. الطرد المركزي الفائق الناتج عند 120,000 × غرام لمدة 2 ساعة عند 4 درجة مئوية. يمكن رؤية الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3F.
  5. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات باستخدام PBS ، وجهاز الطرد المركزي الفائق مرة أخرى عند 120,000 × جم لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية للحصول على الإكسوسومات. يمكن رؤية الحبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب بعد الطرد المركزي ، كما هو موضح في الشكل 3G.
  6. قم بإذابة الإكسوسومات المعزولة باستخدام PBS معقم (200 ميكرولتر لكل طحال) وتخزين الإكسوسومات المعزولة في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 2 مل عند -80 درجة مئوية.

4. توصيف الإكسوسوم عن طريق المجهر الإلكتروني (TEM)

ملاحظة: تم استخدام TEM لتحديد ما إذا كان Exo المستخرج يعرض خصائص الحويصلة. يجب أن تكون عينات Exo التي تم تحديدها بواسطة المجهر الإلكتروني عينات جديدة أو مخزنة لفترة وجيزة عند 4 درجات مئوية لفترة قصيرة.

  1. إصلاح الإكسوسومات (2-6 ميكروغرام / ميكرولتر) مع 2٪ من المجهر الإلكتروني (EM) درجة بارافورمالدهيد في RT لمدة ساعتين.
  2. ضع 10 ميكرولتر من محلول الإكسوسوم على شبكة نحاسية ، واحتضنه في RT لمدة 10 دقائق ، واشطفه بالماء المقطر المعقم ، وامسح السائل الزائد بورق ماص.
  3. قم بتلطيخ الشبكة النحاسية بخلات اليورانيل بنسبة 2٪ لمدة دقيقة واحدة ، وامسح السوائل الزائدة بورق الترشيح ، وجففها تحت مصباح متوهج لمدة دقيقتين.
  4. راقب العينة المحضرة تحت المجهر الإلكتروني الناقل عند 80 كيلو فولت.

5. توزيع الحجم وقياس تركيز الجسيمات للإكسوسومات

  1. قم بتحميل جزيئات البوليسترين النانوية القياسية (250 نانومتر) إلى مقياس التدفق الخلوي النانوي.
  2. قم بقياس تركيز البروتين في عينات Exo باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA. قم بتخفيف عينة Exo باستخدام PBS وفقا لنتائج فحص البروتين BCA (قم بتخفيف الإكسوسومات إلى 1-10 نانوغرام / ميكرولتر) ، ثم قم بتحميل عينات Exo إلى التدفق النانوي لقياس شدة التشتت الجانبي (SSI).
  3. احسب تركيز Exo وفقا لنسبة SSI إلى تركيز الجسيمات في جزيئات البوليسترين النانوية القياسية.
    ملاحظة: لقياس الحجم ، يتم إنشاء منحنى قياسي عن طريق تحميل جزيئات السيليكا النانوية القياسية بأحجام التدرج (68 نانومتر ، 91 نانومتر ، 113 نانومتر ، 155 نانومتر) إلى مقياس التدفق الخلوي النانوي. يتبع تحميل عينة Exo. تم حساب توزيع حجم Exo وفقا للعلاج القياسي.

6. تأكيد التحلل واللطخة المناعية لبروتينات الإكسوسوم

  1. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل مقايسة الترسيب المناعي الراديوي (RIPA) إلى حبيبات الإكسوسوم لتحليل البروتين.
  2. دوامة بقوة ، قم بتغطيتها مع parafilm ، صخرة لمدة 20 دقيقة في RT ، ثم دوامة مرة أخرى.
  3. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة عند 1000 × جم لمدة 30-60 ثانية لجمع العينة ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل ، وتخزينه عند -20 درجة مئوية إلى -80 درجة مئوية حتى التحليل.
  4. بالنسبة للبقعة المناعية ، امزج العينات مع مخزن مؤقت للتحميل 5x لتحقيق تركيز 1x والاستعداد للرحلان الكهربائي للهلام.
  5. إذا كانت أدوات التحكم في تجانس الأنسجة الكاملة مطلوبة ، فاستخدم عازلة تحلل قوية مع مثبط للبروتياز لتحلل الأنسجة ، كما هو مفصل أعلاه. بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق وتخلص من المصفوفة خارج الخلية المتبقية أو الخلايا الكاملة أو الحطام الخلوي السليم.
  6. قم بغلي المخزن المؤقت للعينة الذي يحتوي على الإكسوسومات أو تجانس الأنسجة عند 95 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق. قم بتحميل بروتين متساو لكل حارة في جل SDS-PAGE بنسبة 10٪. تحميل بروتين متساو من تجانس الأنسجة كمراقبة.
  7. استمر في الرحلان الكهربائي للهلام تحت جهد 80 فولت لمدة 2 ساعة تقريبا باستخدام المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي التقليدي. قم بإجراء تحليل اللطخة الغربية لتأكيد تعبير بروتين Exo في المحللات المنقاة ومقارنة وفرة Exo النسبية في الكسور.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عزل وتنقية الإكسوسومات المشتقة من الطحال
لعزل الإكسوسومات من أنسجة طحال الفأر ، استخدمنا مزيجا من هضم الكولاجيناز والطرد المركزي التفاضلي (الشكل 2). تضمنت الخطوات الأولية المعالجة المسبقة لأنسجة الطحال لإزالة الدم السطحي ، متبوعا بالهضم باستخدام الكولاجيناز من النوع الأول. سهل هذا العلاج الأنزيمي انهيار مكونات المصفوفة خارج الخلية ، وبالتالي تحرير الإكسوسومات مع الحفاظ على سلامتها. بعد الهضم ، تم استخدام سلسلة من خطوات الطرد المركزي لإزالة الحطام الخلوي ، والأجسام موت الخلايا المبرمج ، والحويصلات الأكبر حجما ، وبلغت ذروتها في الطرد المركزي الفائق للطافي عند 120،000 × جم لتكبيل الإكسوسومات. أسفرت إجراءات العزل اللاحقة عن كريات قابلة للذوبان في PBS مخصبة ب Exo المشتق من الطحال ، كما هو موضح في الشكل 3G.

نتائج TEM
تم فحص مورفولوجيا الإكسوسومات المعزولة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل ، وهي طريقة قياسية ذهبية لدراسة توصيف الإكسوسومات. يستخدم TEM بشكل شائع للتحقق من صحة وجود الإكسوسومات ، وتقييم جودة الإكسوسومات ، ومراقبة مورفولوجيا الإكسوسوم. كشفت صور TEM (الشكل 4 أ) عن وجود حويصلات على شكل كوب ، والتي تتميز بالإكسوسومات. أظهرت هذه الحويصلات بنية ثنائية الطبقة الدهنية الواضحة ، مما يؤكد العزلة الناجحة للإكسوسومات من أنسجة الطحال.

توزيع حجم الطحال Exo
تم تحديد حجم التوزيع وتركيز الإكسوسومات باستخدام مقياس التدفق الخلوي النانوي. أشارت النتائج (الشكل 4 ب) إلى أن قطر الإكسوسومات المعزولة تراوح بين 30-150 نانومتر ، مع تركيز ذروة عند حوالي 60 نانومتر. كان قطر الجسيمات المعزولة في الغالب من 50-80 نانومتر ، بمتوسط تركيز جسيمات 4.6 × 109 جسيمات / مل. يتوافق نطاق الحجم هذا مع الخصائص المبلغ عنها سابقا للإكسوسومات ، مما يزيد من صحة بروتوكول العزل.

تحليل اللطخة الغربية
لتأكيد وجود علامات خارجية ، أجرينا تحليل اللطخة الغربية. تم الكشف عن العلامات الخارجية TSG101 و CD9 في عينات Spleen-Exo ، بينما لم يتم اكتشاف GM130 ، وهو بروتين مصفوفة جولجي المستخدم كعنصر تحكم سلبي (الشكل 4C). بالمقارنة ، تم التعبير عن بروتين هذه العلامات في أنسجة طحال الفأر (Spleen-T). يشير هذا إلى النقاء العالي للإكسوسومات المعزولة ، لأنها كانت خالية من الملوثات الخلوية.

figure-results-1
الشكل 1: إعداد الإمداد. (أ) تم وضع أنابيب الطرد المركزي سعة 50 مل وأطباق الاستزراع والثلج وأدوات الجراحة في خزانة السلامة البيولوجية. (ب) مصفاة خلية معقمة (figure-results-270 ميكرومتر). (ج) أدوات الجراحة المعقمة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 2: إجراء عزل الطحال-Exo. تحضير أنسجة الطحال وتقطيعها إلى قطع صغيرة في PBS مثلج ، متبوعا بالهضم باستخدام الكولاجيناز من النوع الأول والطرد المركزي كما هو موضح. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 3: صور تمثيلية لعزل الطحال-Exo. (أ) كتل الطحال الصغيرة جاهزة للهضم اللاحق. (ب) كتل أنسجة الطحال مع عازلة الهضم. (ج) الكريات بعد الطرد المركزي 500 × غرام . (د) الكريات بعد الطرد المركزي 3,000 × غرام . (ه) الكريات بعد الطرد المركزي 10,000 × غرام . (و) الكريات بعد الطرد المركزي 000 × 120 غ. (ز) كريات الإكسوسوم بعد الطرد المركزي 120,000 × غرام . الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 4: تحديد الطحال Exo. (أ) تظهر نتائج TEM الجسيمات المعزولة على شكل حويصلات غشائية مستديرة أو بيضاوية مع مورفولوجيا على شكل كوب. شريط المقياس = 200 نانومتر و 50 نانومتر ، على التوالي. (ب) أظهر تحليل توزيع الحجم بواسطة Flow Nano Analyzer أن قطر Spleen-Exo يتراوح بشكل سائد من 50 نانومتر إلى 80 نانومتر ، بمتوسط تركيز جسيمات يبلغ 4.6 × 109 جسيمات / مل. (ج) تحليل اللطخة الغربية الذي يظهر التعبير عن بروتينات العلامات الخاصة بالإكسوسوم (TSG101 و CD9) في Spleen-Exo ، مع التعبير السلبي عن GM130. كانت هذه العلامات قابلة للاكتشاف في عينات البروتين المستخرجة من طحال الفأر (مجموعة الطحال-T). تم عرض صور اللطخة الغربية التمثيلية (ن = 6 أنسجة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أفادت الأبحاث الحديثة أن الإكسوسومات المشتقة من الطحال (Spleen-Exo) تلعب دورا مهما في علاج سرطانالمعدة 12. لتوضيح وظائف Spleen-Exo بشكل أكبر ، من الضروري إنشاء طريقة قابلة للتكرار ومثالية لاستخراجها من أنسجة الطحال. في حين أن البروتوكولات موجودة لعزل الإكسوسومات من سرطان الدماغ والكبد13،14 ، فإن طرق الأنسجة الأخرى لا تزال متخلفة وتتطلب مزيدا من التحقق من الصحة. في هذه الدراسة ، حددنا طريقة عملية لعزل Exo عن أنسجة الطحال.

على مدى السنوات الماضية ، تم استخدام طرق مختلفة لاستخراج Exo في البحث العلمي والتطبيقات ، بما في ذلك الطرد المركزي الفائق ، والطرد المركزي المتدرج للكثافة ، والامتزاز المناعي للحبة المغناطيسية ، والترشيح الفائق ، وهطول الأمطار البوليمر15. يظل الطرد المركزي الفائق هو الطريقة القياسية الذهبية لاستخراج Exo من مصادر مختلفة. ركزت الدراسات السابقة على تعطيل هياكل الأنسجة للحصول على تركيزات أعلى من Exo ، والتي تتكون من مصادر داخل الخلايا وخارجها من Exo16. يقلل الكولاجيناز من التأثير على سلامة غشاء الخلية ، مما يضمن نقاء Ti-Exo3. تم استخدام الكولاجيناز لاستخراج الحويصلات خارج الخلية من الورم الميلانيني النقيلي البشري ، والدهون ، وسرطان القولون ، وأنسجة سرطان الكبد5،10،13،17. ومع ذلك ، يختلف تركيز الكولاجيناز ووقت هضمه بين الأنسجة المختلفة.

أنشأنا بروتوكولا محددا لعزل الطحال Exo باستخدام الكولاجيناز من النوع الأول للهضم ، متبوعا بالترشيح من خلال الطرد المركزي الفائق التفاضلي ، لإنتاج Spleen-Exo عالي الجودة. يمكن للطرد المركزي الفائق إزالة الخلايا المتبقية والحويصلات الكبيرة وحطام الخلايا والأجسام موت الخلايا المبرمج بشكل فعال من العينات16. Crescitelli et al. استخدم الكولاجيناز D والطرد المركزي الفائق المتدرج لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية بمتوسط حجم 75 نانومتر في القطر5. بالمقارنة مع بروتوكولهم ، استخدم بروتوكولنا النوع الأول من الكولاجيناز وخطوة طرد مركزي إضافية عند 120,000 × جم لتحقيق النقاء الأمثل للإكسوسوم. على عكس التقارير السابقة التي تستخدم تجانس الأنسجة للحصول على تعليق الأنسجة14،18 ، يحافظ نهجنا على سلامة غشاء الخلايا في الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك ، Vella et al. طبق الطرد المركزي المتدرج الكثافة (تدرج ثلاثي السكروز) لتوليد ثلاث مجموعات من الجسيمات ، الأمر الذي تطلب وقتا إضافيا للعملية10. أنتج هذا النهج حويصلات كبيرة يزيد حجمها عن 200 نانومتر ، ومجموعة غير متجانسة من الحويصلات بأحجام تتراوح من 50 نانومتر إلى 200 نانومتر ، وحويصلات صغيرة يبلغ حجمها حوالي 20 نانومتر. يتضمن البروتوكول الموصوف في بروتوكول الدراسة هذا سلسلة من خطوات الطرد المركزي الفائق للتخلص بشكل منهجي من الخلايا المتبقية ، وبقايا الخلايا ، والأجسام موت الخلايا المبرمج ، والحويصلات الأكبر حجما ، وبالتالي تعزيز نقاء Exo الذي تم الحصول عليه. نؤكد على التعامل الدقيق أثناء جمع المواد الطافية لتجنب إزعاج الكريات المترسبة.

نقوم بتقييم مورفولوجيا ونقاء الطحال المعزول من خلال تحليل تتبع TEM والجسيمات النانوية. كشفت كلتا المقايسين أن الجسيمات المشتقة من الطحال المعزولة بواسطة هذا البروتوكول أظهرت طبقة ثنائية دهنية وحويصلات على شكل كوب بأحجام تتراوح من 30 نانومتر إلى 150 نانومتر ، وهي الخصائص النموذجية للإكسوسومات19. CD9 و TSG101 هي علامات الإكسوسوم19 ، و GM130 ، بروتين جولجي ، يستخدم كعلامة سلبية لتحديد الإكسوسوم20. أظهرت النتائج أن Spleen-Exo كان إيجابيا ل CD9 و TSG101 ، بينما لم يتم اكتشاف GM130 ، مما يؤكد العزل الناجح ل Exo عالي الجودة المشتق من الأنسجة من الطحال.

في تحقيق Ti-Exo عالي الجودة ، يعد اختيار نوع الإنزيم المناسب والتركيز ومدة الهضم ، بالإضافة إلى التخزين المناسب للأنسجة ، أمرا ضروريا. لم نلاحظ فرقا كبيرا في تركيزات البروتين بين Exo المشتقة من أنسجة الطحال الطازجة مقابل أنسجة الطحال المجمدة (البيانات غير معروضة) ، مما يشير إلى جدوى معالجة كميات كبيرة من الأنسجة المجمدة لتقليل سير العمل. يتطلب عزل Ti-Exo وقتا طويلا للطرد المركزي الفائق ، مما يجعل من غير العملي إكمال البروتوكول بأكمله خلال فترة مناسبة عند استخدام الأنسجة الطازجة في التطبيقات السريرية. وبالتالي ، فإن استخدام الأنسجة المجمدة لعزل الإكسوسوم سيكون خيارا أفضل. الذوبان عند 37 درجة مئوية غير مناسب للأنسجة المجمدة بسبب عدم اكتمال تغلغل عوامل الحماية بالتبريد في الأنسجة. تم الإبلاغ عن أنه عند إجراء عزل الإكسوسوم باستخدام الأنسجة المجمدة الذوبان على الجليد ، لم يظهر محصول الإكسوسومات أي أهمية في المحتوى مقارنة بالأنسجة الطازجة21. وهكذا ، قمنا بإذابة أنسجة الطحال المجمدة على الجليد لإجراء عزل الإكسوسوم عند استخدام عينات التخزين عند -80 درجة مئوية.

ومع ذلك ، فإن البروتوكول الموصوف في هذه الدراسة له العديد من القيود. تستغرق الخطوات الواسعة النطاق المتضمنة في الاستخراج وتحديد الهوية وقتا طويلا. بالنظر إلى الهدف النهائي المتمثل في تطبيق أبحاث Exo على علاج الأمراض السريرية ، أصبحت الأساليب الأسرع والأكثر فعالية من حيث التكلفة أمرا بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن النتائج تستند إلى عينات أنسجة الفئران ، إلا أنه لا يزال يتعين تحديد قابلية التطبيق على الأنسجة البشرية.

في الختام ، يوفر البروتوكول طريقة لاستخراج Exo عالي النقاء من أنسجة الطحال ، ومناسبة للتحليل التفصيلي للمصب يعكس Exo المشتق من الأنسجة البيئة المكروية الأصلية بشكل أكثر دقة ويحمل إمكانات كبيرة لتوضيح العمليات الفسيولوجية والمرضية في الكائنات الحية. يمكن للدراسات المستقبلية تكييف هذا البروتوكول مع الأنسجة البشرية ، مما يتيح استخراج الإكسوسومات ذات الصلة سريريا لأغراض التشخيص والعلاج. يمكن أن تكون هذه التقنية مفيدة بشكل خاص في دراسة دور الإكسوسومات في الاستجابات المناعية ، نظرا للوظيفة الحرجة للطحال في جهاز المناعة. علاوة على ذلك ، يمكن تعديل البروتوكول لعزل الإكسوسومات من الأنسجة الأخرى ، مما قد يساعد في تطوير المؤشرات الحيوية الخاصة بالأنسجة والعلاجات المستهدفة. من خلال تحسين فهمنا لبيولوجيا الإكسوسوم ، يمكن أن يساهم هذا البروتوكول في التقدم في الطب الدقيق وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (82370281 ، 81870222) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية لمقاطعة قوانغدونغ (2022A1515012103) ، ومشروع التخصيص التنافسي للصندوق الخاص لتطوير التكنولوجيا في مدينة تشانجيانغ (2021A05086) ، ومؤسسة بدء التشغيل من المستشفى الثاني التابع لجامعة قوانغدونغ الطبية (23H03).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
70 وميكرو ؛ م مصفاة الخليةBiologix Group Co.، Ltd.USA15-1070
Anti CD9Anti Anti CD9 Cell Signaling Technology، Inc (CST) ، الولايات المتحدة الأمريكية983275
الأجسام المضادة GM130Proteintech Group، Inc.China & nbsp ؛66662-1-lg
المضادة TSG101 الأجسام المضادةAbcam Plc ، المملكةالمتحدة 125011
طبق ثقافة الخليةWuxi NEST التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، الصين704001
أنبوب الطرد المركزيWuxi NEST التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، الصين788211
كولاجيناز النوع الأولSigma-Aldrich Corp. ، الولايات المتحدة الأمريكيةC2674
شاكرترموستاتي سطح المكتبشنغهاي bluepard instruments Co., Ltd., ChinaTHZ-100
Electrophoresis bufferWuhan Servicebio Technology Co., Ltd., China G2081-1L
مجموعة فحص البروتين BCA المحسنShanghai Beyotime Biotechnology Co.، Ltd. ، الصين   ؛P0010S
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc. ، الصينN30E
نظام التصوير الفلوري / التلألؤ الكيميائي   ؛قوانغتشو Biolight التكنولوجيا الحيوية المحدودة ، الصينGelView 6000Plus
HRP الماعز المضادة للفأر IgGProteintech Group، Inc.China  ؛15014
HRP الماعز المضادة للأرانب IgGProteintech Group, Inc.China 15015
قارئ صفيحة صغيرةالأجهزة الجزيئية ، الولايات المتحدة الأمريكيةCMax Plus
Microscissorsشنغهاي   ؛ طبية  الأدوات (المجموعة)   ؛ المحدودة ، الصينWA1010
ملاقط مجهريةشنغهاي   ؛ طبية  الأدوات (المجموعة)   ؛ المحدودة ، الصينWA3010
Multifuge X1R Pro جهاز الطرد المركزيThermo Fisher Scientific ، الولايات المتحدة الأمريكية75009750
مقص العيونشنغهاي   ؛ طبية  الأدوات (المجموعة)   ؛ المحدودة ، الصينY00030
ملاقط العيونشنغهاي   ؛ طبية  الأدوات (المجموعة)   ؛ Co., Ltd. ، الصين   ؛JD1060
Optima XPN-100 جهاز طرد مركزي فائق الترشيحبيكمان كولتر ، الولايات المتحدة الأمريكيةA94469
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Beijing Solarbio Science & شركة التكنولوجيا المحدودة ، الصينP1003
RIPA تحلل المخزن المؤقت (قوي ، بدون مثبطات)شنغهاي Beyotime Biotechnology Co.، Ltd. ، الصين   ؛P0013K
مسطرةأطعمة لذيذة  التصنيع  الشركة ، الصين
SDS-PAGE عينة تحميل العازلة ، 5xShanghai Beyotime Biotechnology Co.، Ltd. ، الصين   ؛P0015
Transfer PipetBiologix Group Co.، Ltd.USA30-0238A1
مجهر إلكتروني ناقلهيتاشي ، اليابانH-7650
أنبوب الطرد المركزي الفائقبيكمان كولتر ، الولايات المتحدة الأمريكية355618
Western Transfer Buffer   ؛ووهان Servicebio Technology Co., Ltd., China G2028-1L
محلول الحركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Meldolesi, J. Exosomes and Ectosomes in Intercellular Communication. Curr Biol. 28 (8), R435-R444 (2018).
  2. Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17 (6), 816-826 (2015).
  3. Crescitelli, R., Lasser, C., Lotvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nat Protoc. 16 (3), 1548-1580 (2021).
  4. de Jong, B., Barros, E. R., Hoenderop, J. G. J., Rigalli, J. P. Recent advances in extracellular vesicles as drug delivery systems and their potential in precision medicine. Pharmaceutics. 12 (11), 1006(2020).
  5. Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. J Extracell Vesicles. 9 (1), 1722433(2020).
  6. Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  7. Leung, L. L., Riaz, M. K., Qu, X., Chan, J., Meehan, K. Profiling of extracellular vesicles in oral cancer, from transcriptomics to proteomics. Semin Cancer Biol. 74, 3-23 (2021).
  8. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. N Engl J Med. 379 (10), 958-966 (2018).
  9. Wang, X., et al. An enrichment method for small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue. J Vis Exp. (192), e64499(2023).
  10. Vella, L. J., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  11. Hoshino, A., et al. Extracellular vesicle and particle biomarkers define multiple human cancers. Cell. 182 (4), 1044-1061.e18 (2020).
  12. Chen, Y., et al. Yiwei decoction promotes apoptosis of gastric cancer cells through spleen-derived exosomes. Front Pharmacol. 14, 1144955(2023).
  13. Useckaite, Z., et al. Proteomic profiling of paired human liver homogenate and tissue-derived extracellular vesicles. Proteomics. 24 (11), e2300025(2023).
  14. Hurwitz, S. N., et al. An optimized method for enrichment of whole brain-derived extracellular vesicles reveals insight into neurodegenerative processes in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurosci Methods. 307, 210-220 (2018).
  15. Lai, J. J., et al. Exosome processing and characterization approaches for research and technology development. Adv Sci (Weinh). 9 (15), e2103222(2022).
  16. Zhang, Y., et al. Exosome: A review of its classification, isolation techniques, storage, diagnostic and targeted therapy applications. Int J Nanomedicine. 15, 6917-6934 (2020).
  17. Roh, Y. J., et al. Adipose tissue-derived exosomes alleviate particulate matter-induced inflammatory response and skin barrier damage in atopic dermatitis-like triple-cell model. PLoS One. 19 (1), e0292050(2024).
  18. Gallart-Palau, X., Serra, A., Sze, S. K. Enrichment of extracellular vesicles from tissues of the central nervous system by PROSPR. Mol Neurodegener. 11 (1), 41(2016).
  19. Kurian, T. K., Banik, S., Gopal, D., Chakrabarti, S., Mazumder, N. Elucidating methods for isolation and quantification of exosomes: A review. Mol Biotechnol. 63 (4), 249-266 (2021).
  20. Menu, E., Vanderkerken, K. Exosomes in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood. 140 (23), 2429-2442 (2022).
  21. Shen, S., et al. Effects of lysate/tissue storage at -80 degrees C on subsequently extracted EVs of epithelial ovarian cancer tissue origins. iScience. 26 (4), 106521(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Spleen ExosomesExosome IsolationTissue Derived ExosomesDifferential UltracentrifugationType I CollagenaseTransmission Electron MicroscopyNano Flow CytometryExosome MarkersImmune ResponseMouse Spleen Tissue

مقالات ذات صلة