التوصيف الشامل لتمعدن الأنسجة في نموذج Ex Vivo

ملخص

يستلزم البروتوكول المقترح نهجا عالميا لتقييم تكوين العظام في سياق تجديد العظام باستخدام التحليلات متعددة الوسائط. يهدف إلى توفير معلومات نوعية وكمية حول تكوين العظام الجديدة ، وتعزيز صرامة وصلاحية الفحوصات الأساسية وقبل السريرية.

الملخص

يمثل التوصيف الشامل لتمعدن الأنسجة في سياق تجديد العظام تحديا كبيرا ، بالنظر إلى الطرائق العديدة المتاحة حاليا للتحليل. هنا ، نقترح سير عمل لتقييم شامل لتكوين العظام الجديدة باستخدام نبتة عظمية حيوانية كبيرة ذات صلة خارج الجسم الحي . يتم إنشاء عيب عظمي (القطر = 3.75 مم ؛ العمق = 5.0 مم) في رأس عظم الفخذ المزروع وحقنه ببديل عظمي كبير يسهل اختراقه محمل بعامل نمو مؤيد للعظم (بروتين مورفوجيني للعظام 2 - BMP2). بعد ذلك ، يتم الحفاظ على المصنع في الثقافة لمدة 28 يوما ، مما يسمح بالاستعمار الخلوي وتكوين العظام اللاحق. لتقييم جودة وهيكل الأنسجة المعدنية حديثا ، يتم إعداد الطرق المتتالية التالية: (ط) توصيف وصور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للمصنع بأكمله باستخدام التصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، متبوعا بتحليلات صور التعلم العميق لتعزيز التمييز بين الأنسجة المعدنية ؛ (ثانيا) المسافة البادئة النانوية لتحديد الخواص الميكانيكية للأنسجة المشكلة حديثا ؛ (ثالثا) الفحوصات النسيجية ، مثل الهيماتوكسيلين / الإيوسين / الزعفران (HES) ، وثلاثي الألوان في غولدنر ، وخماسي موفات لتوفير تقييم نوعي للأنسجة المعدنية ، لا سيما فيما يتعلق بتصور الحاجز العظمي ووجود الخلايا العظمية ؛ (4) رسم خرائط المجهر الإلكتروني الماسح المتناثر الخلفي (SEM) مع مرجع داخلي لتحديد درجة التمعدن وتقديم رؤى مفصلة حول مورفولوجيا السطح والتركيب المعدني وواجهة العظام والمواد الحيوية. (v) التحليل الطيفي رامان لتوصيف التركيب الجزيئي للمصفوفة المعدنية وتقديم رؤى حول ثبات BMP2 داخل الأسمنت من خلال الكشف عن روابط الببتيد. سيوفر هذا التحليل متعدد الوسائط تقييما فعالا للعظام المشكلة حديثا ورؤى نوعية وكمية شاملة للأنسجة المعدنية. من خلال توحيد هذه البروتوكولات ، نهدف إلى تسهيل المقارنات بين الدراسات وتحسين صحة وموثوقية نتائج البحث.

المقدمة

تمثل عيوب العظام ، سواء كانت ناجمة عن الصدمة أو استئصال الورم أو التشوهات الخلقية أو العدوى ، تحديا كبيرا للطب التجديدي. تضر هذه التعديلات بالسلامة الهيكلية للنظام الهيكلي ، مما يؤدي إلى عدم الراحة والضعف الوظيفي وانخفاض نوعية حياة المرضى.

للتغلب على هذه التحديات ، ظهرت استراتيجيات مبتكرة لإصلاح العظام ، مع التركيز على تعزيز تكوين العظم وتجديد أنسجة العظام. تشمل هذه الأساليب استخدام بدائل العظام القابلة للزرع أو الحقن أو القابلة للطباعة ثلاثية الأبعاد ، والتي يمكن أن تكون من أصل طبيعي (على سبيل المثال ، الجزيئات الكبيرة من مصادر حيوية ، هيدروكسيباتيت مشتق من) أو اصطناعية (على سبيل المثال ، النظارات الحيوية ، فوسفات الكالسيوم)¹. لتعزيز قدرتها المتأصلة المنخفضة على توجيه وتحفيز تجديد العظام ، يمكن تحميل بدائل العظام بعوامل تحريضية للعظم ، مثل البروتينات المورفولوجية للعظام (BMPs) ، لتعزيز التمايز العظمي للخلايا السلفية وتعزيز تكوين^{العظام 2}.

يعتمد تكوين العظام على التكوين الأولي لمصفوفة الكولاجين ، والتي يتم تمعدنها بعد ذلك بواسطة بلورات هيدروكسيباتيت ، وبالتالي تعزيز بنية^{العظام 3}. تمنح هذه العملية صلابة وقوة محددة للعظام. تخضع جودة الأنسجة المعدنية بشكل معقد لخصائصها المجهرية ودرجة التمعدن⁴. تلعب هذه الجودة دورا محوريا في التئام العظام ووظائف العظام المتجددة⁵. ومع ذلك ، يظل توصيف تمعدن العظام مهمة صعبة بسبب التباين المتأصل عبر الدراسات متعددة المتغيرات^6،7،8.

بالإضافة إلى ذلك ، عادة ما يتم إجراء التقييمات الأولية للتوافق الحيوي والتوافق الخلوي وإمكانية التمايز لبدائل ترقيع العظام في المختبر. ومع ذلك، فإن التفاوتات المنهجية تعوق المقارنة السلسة للنتائج. علاوة على ذلك ، لا تلتقط هذه الدراسات المختبرية بشكل كامل التفاعلات متعددة الخلايا والحوار المعقد بين مجموعات الخلايا ، بما في ذلك خلايا نخاع العظام ، والتي تعتبر ضرورية لتنظيم عملية تجديد^{العظام 9}. قد يؤدي هذا النقص في التمثيل الدقيق للبيئة المكروية للعظام إلى الإضرار بدقة الدراسات قبل السريرية^{اللاحقة 10}.

على الرغم من أن التقييمات في الجسم الحي توفر تمثيلا أكثر دقة للسياقات الفسيولوجية ، إلا أنها مقيدة بالاعتبارات الأخلاقية واللوجستية والمالية. وبالتالي ، تلعب التقييمات خارج الجسم الحي دورا محوريا كواجهة بين الدراسات في المختبر والدراسات في الجسم الحي ، حيث تعمل كخطوة وسيطة ضرورية قبل الانتقال إلى التجارب على الأشخاص الأحياء^11،12،13.

في هذا السياق ، هناك حاجة إلى تنفيذ منهجيات توصيف شاملة لتقييم جودة أنسجة العظام المتجددة والتأكد من ملاءمة الاستراتيجية قبل الانتقال إلى نموذج ما قبل السريري. وبالتالي ، نقترح بروتوكولا يعتمد على تحليل نموذج الزرع باستخدام أنسجة مفصل ركبة الأغنام. تتضمن هذه المنهجية المبتكرة زرع الأسمنت المحمل ب BMP2 في النماذج الخارجية وإجراء تحليل مفصل لتمعدن الأنسجة بعد 28 يوما من الاستزراع.

الأساليب التقنية المستخدمة في هذه الدراسة متنوعة ومتكاملة ، وتوفر مجتمعة نهجا شاملا لتقييم جودة أنسجة العظام المتجددة (الشكل 1). يتيح التصوير المصغر عالي الدقة تصورا ثلاثي الأبعاد مفصلا لبنية العظام ، مما يوفر رؤى قيمة حول كثافة المعادن ومورفولوجيا وسلامة الأنسجة المشكلة حديثا. هذه التقنية ضرورية لتقييم فعالية تجديد العظام ومراقبة تطور التمعدن بمرور الوقت. المسافة البادئة النانوية هي طريقة دقيقة لتحديد الخصائص الميكانيكية للأنسجة ، مثل صلابتها وقوتها. من خلال قياس استجابة المادة للقوة المطبقة على مقياس نانومتري ، تتيح هذه الطريقة تقييم متانة وجودة الأنسجة المعدنية. توفر الفحوصات النسيجية باستخدام تلطيخ شائع مثل الهيماتوكسيلين / اليوزين / الزعفران (HES) ، وثلاثي الألوان لجولدنر ، وخماسي موفات رؤى لا تقدر بثمن حول بنية الأنسجة وتكوينها. تسمح هذه البقع بالتمايز بين مكونات الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الخلايا والمصفوفة خارج الخلية والرواسب المعدنية ، مما يتيح تقييما نوعيا شاملا لعملية تجديد العظام. يوفر رسم خرائط المجهري الإلكتروني الماسح الخلفي (SEM) تصورا عالي الدقة لسطح العينات ، مما يسمح بتحليل مفصل لدرجة تمعدن مصفوفة العظام ، بالإضافة إلى الواجهات بين المادة المزروعة والأنسجة المضيفة. أخيرا ، يوفر التحليل الطيفي رامان معلومات تتعلق بالتركيب الجزيئي للأنسجة ، لا سيما من خلال تحديد مكونات معينة مثل البروتينات والدهون والمعادن. يتيح هذا النهج توصيف المصفوفة المعدنية والكشف عن عوامل النمو مثل BMP2 ، وبالتالي توفير معلومات مهمة حول استمرار المحفزات المؤيدة للعظم في وسط التجديد.

باستخدام نهج متعدد التخصصات ، يدمج تقنيات تحليلية مختلفة ، تهدف دراستنا إلى تقديم تقييم شامل وشامل لجودة أنسجة العظام المتجددة ، وبالتالي توفير أساس متين لتقييم بدائل ترقيع العظام وتطبيقها السريري المحتمل.

البروتوكول

تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل لجنة الأخلاقيات ورعاية والإدارة الوطنية الفرنسية للطب البيطري والأغذية تحت رقم G44171.

1. تحضير واستزراع النثرة العظمية الغضروفي

1. حصاد عينات مفاصل الأغنام من الرحيم الطازج في بيئة معقمة. ضع الأغنام في وضع ضعيف وحلق الطرف الخلفي الأيسر. تستعد عن طريق التطهير بالكحول حول مفصل الركبة. استخدم بضع المفاصل الرضفي الجانبي لكشف الأربطة الصليبية الأمامية والخلفية ، متبوعا بخلع الرضفة للكشف عن البكتيريا الفخذية.
   1. بعد حصاد الأنسجة ، قم بإنشاء عيب قطره 4.75 مم في اللقمة الجانبية باستخدام نظام نقل الطعم الذاتي العظمي الغضروفي.
2. باستخدام مطرقة العظام ، قم بإنشاء عيب بعمق 10 مم واسترجع المصباح الخارجي من اللقمة بعد ذلك ، قم بإجراء عيب ثان بقطر 8 مم ، يتمحور حول الأول ، باستخدام نظام نقل الطعم الذاتي العظمي الغضروفي ينتج عن هذا استنساخ عظمي غضروفي بقياس 8 مم × 10 مم ، يحتوي على عيب مركزي يبلغ 4.75 مم × 10.0 مم.
3. إذا لزم الأمر لأسباب لوجستية ، انقل المبتئات في محلول الملح المتوازن من هانك (hBSS) المكملة ب 1٪ بنسلين ستربتومايسين وتخزينها في 4 درجات مئوية.
4. اشطف النباتات الخارجية 3x بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، ثم قم بحقن عيب 4.75 مم × 10.0 مم بأسمنت فوسفات الكالسيوم المكمل ب 40 ميكروغرام / مل من BMP2. تحضير الأسمنت كما هو موضح أدناه.
   1. إنتاج فوسفات ثلاثي الكالسيوم α (α-TCP) عن طريق المعالجة الحرارية لقضبان فوسفات ثلاثي الكالسيوم القماشية (مكبس متساوي الساكن عند 120 ميجا باسكال) عند 1364 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 12 ساعة ، متبوعا بتبريد الهواء¹⁴.
   2. قم بطحن قضبان α-TCP في الإيثانول المطلق باستخدام كرة مطحنة كوكبية 2x لمدة 5 دقائق عند 500 دورة في الدقيقة لإنتاج مسحوق ناعم من 13.1 ± 1.7 ميكرومتر (يقاس باستخدام حيود الليزر ، كما هو موضح^{سابقا 14}).
   3. قم بتعقيم مسحوق α-TCP عن طريق تسخينه الجاف عند 180 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة. تحضير أسمنت فوسفات الكالسيوم عن طريق خلط مسحوق α-TCP مع محلول مفلتر 2.5٪ (وزن / حجم) Na₂HPO₄ 0.22 ميكرومتر (نسبة السائل / المسحوق 0.35) لمدة 1 دقيقة.
   4. قم بتحميل معجون الأسمنت في حقنة سعة 3 مل قبل الحقن باستخدام إبرة 18 جرام.
5. بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT) ، انقل النباتات إلى قارورة مساحتها 25 سم مربع وأضف برفق 10 مل من وسط الاستزراع الكامل الذي يتكون من Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) عالي الجلوكوز المكمل بمصل بقري جنيني 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
6. حافظ على المصانع الخارجية لمدة تصل إلى 28 يوما في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} وقم بتغيير وسط الاستزراع الكامل كل يومين تحت غطاء التدفق الرقائقي.
7. اشطف النباتات الخارجية 3x باستخدام PBS. انقلها إلى أنابيب سعة 50 مل ، وأضف 20 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) ، واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية لمدة 3 أيام. ثم اشطف النباتات الخارجية باستخدام PBS وقم بتخزينها في 70٪ من الإيثانول قبل التحليلات اللاحقة.

2. تحليل التصوير المقطعي المحوسب الدقيق

1. إجراء تحليلات التصوير المقطعي الدقيق باستخدام الأشعة السينية بالتصوير المقطعي المحوسب. احصل على إسقاطات الأشعة السينية بدقة 10.7 ميكرومتر ، مع وقت تعرض يبلغ 1200 مللي ثانية وفلتر ألومنيوم 1 مم (80 كيلو فولت و 125 ميكرو أمبير). متوسط ثلاث صور لكل زيادة دوران 0.45 درجة من أجل تحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
2. إعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد (3D) باستخدام برنامج إعادة الإعمار الخاص بالشركة المصنعة بعد محاذاة X / Y مع مسح مرجعي ، مع المعلمات التالية - التنعيم: 0 ، القطعة الأثرية الحلقية: 3 ، تصلب الحزمة: 35٪. قم بتنظيف مكدسات الصور باستخدام برنامج معالجة الصور وراقب باستخدام أدوات التصور ثنائية الأبعاد (2D) و 3D.

3. تحليل صور التعلم العميق

1. قم بإجراء تجزئة الصور باستخدام برامج متخصصة مخصصة. استخدم معالج التجزئة المتكامل لتدريب نموذج التعلم العميق للتمييز بين العظام والأسمنت.
2. حدد منطقة تمثيلية (أي إطار) تحتوي على العظام والأسمنت والخلفية من صور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة المعاد بناؤها. قم بتقسيم هذا الإطار الأول يدويا باستخدام أدوات بسيطة (على سبيل المثال ، العتبة) أو قوية (مثل الانتشار) التي يوفرها البرنامج.
3. قم بإنشاء نموذج التعلم الشامل في علامة التبويب النموذج وحدد 3D-Unet Routine في القائمة المنسدلة. تحديد معلماته التجريبية في المعادلة مع الصور لتحليلها بنقرة بزر الماوس الأيمن على النموذج الذي تم إنشاؤه ؛ هنا: عمق 5 ، حجم التصحيح 32 × 32 ، خوارزمية Adadetla ، نسبة خطوة 0.25 ، زيادة البيانات x10.
4. استخدم الإطار المجزأ لتدريب روتين التعلم العميق (انقر فوق زر القطار) ، والذي من المسلم به أنه مناسب لقدراته السريعة والدقيقة في تجزئة الصور ^3,15. بمجرد اكتمال التدريب ، حدد منطقة عمل ثانية (إطار) وقم بتقسيمها تلقائيا باستخدام وظيفة التنبؤ.
   1. قم بتطبيق التصحيح اليدوي إذا لزم الأمر لإنشاء بيانات تدريب أكثر دقة. روتين التدريب مرة أخرى. كرر العملية حتى يتم الحصول على نتيجة مرضية ؛ يتناقص عدد عمليات زيادة البيانات تدريجيا مع زيادة عدد أطر التدريب.
      ملاحظة: يعطي مؤشر النرد المقدم أثناء تدريب النموذج مؤشرا على دقة النموذج (مقارنة بمعلومات الإدخال) ولكنه غير كاف. يجب أن يتم تأكيد أهمية النموذج عن طريق التحقق من صحة البيانات المجزأة تلقائيا من قبل 3 باحثين متمرسين مستقلين.
5. انشر النموذج بالنقر فوق الزر تصدير وقم بتطبيقه على مجموعة بيانات micro -CT بأكملها بالنقر فوق مقطع > نموذج تصدير > شريحة مجموعة بيانات كاملة.

4. التضمين

1. قم بتجفيف التركيبات العظمية عن طريق وضعها في قارورة زجاجية سعة 40 مل تحتوي على 25 مل من محلول الجفاف المكون من 70٪ أسيتون و 30٪ زيلين. ضع القارورة الزجاجية على عجلة دوارة لمدة 1 ساعة في RT. كرر هذه الخطوة 3x.
2. استبدل محلول الجفاف ب 25 مل من الزيلين وضع القارورة الزجاجية على العجلة الدوارة لمدة 1 ساعة عند RT.
3. استبدل محلول الزيلين ب 25 مل من ميثيل ميثاكريلات المخصب (MMA) بنسبة 10٪ بنزويل بيروكسيد (BPO) و 10٪ ثنائي بوتيل فثالات (DBP). ضعه على العجلة الدوارة لمدة 1 ساعة في RT. كرر هذه الخطوة 2x.
4. استبدل محلول MMA ب 25 مل من MMA المخصب بنسبة 10٪ BPO و 10٪ DBP و 450 ميكرولتر من N و N dimethylaniline المخفف 1:20 في بروبان-2-ol. ضع القارورة الزجاجية على درجة حرارة -20 درجة مئوية طوال الليل. يصبح المحلول مصفرا.
5. ضع المصنع في قالب تضمين متوسط الحجم واسكب MMA-BPO-DBP-N ، N aniline في القالب. ضع القالب في صندوق بلاستيكي وقم بالتهوية بتدفق النيتروجين لمدة 5 دقائق. أغلق الصندوق بإحكام وضعه عند 4 درجات مئوية لمدة 48 ساعة لبلمرة MMA وتصلبها.
6. قم بإزالة الراتنج الذي يحتوي على المصنع المخرج من القالب واحتفظ به عند 4 درجات مئوية حتى تتم معالجته للتحليل اللاحق.

5. الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) - التصوير الإلكتروني الكمي المتناثر (qBEI)

1. قم بقص كتلة pMMA التي تحتوي على المصنع بمنشار ماسي على طول محورها الطويل. احتفظ بالنصف الأول من الكتلة للتحليل النسيجي. اقطع النصف الآخر أكثر لتوليد قسم بسمك 1.5 مم. قم بإجراء القطع بسرعة 3000 دورة في الدقيقة بسرعة 3 مم / دقيقة.
2. قم بطحن القسم بورق كربيد السيليكون بأرقام تصاعدية تتوافق مع حجم الحبوب المنخفض: SiC 320 لمدة 10 ثوان ، SiC 1000 لمدة 15 ثانية ، SiC 2000 لمدة 30 ثانية ، و SiC 4000 لمدة 30 ثانية.
3. قم بتلميع القسم بمعجون الماس والملابس المحددة: قطعة قماش تلميع بمحلول ماسي 3 ميكرومتر من Mol B3 لمدة دقيقة واحدة وقطعة قماش من الصوف بمحلول ماسي Nap B1 1 ميكرومتر لمدة 1 دقيقة.
4. اشطف القسم تحت الماء المقطر المزدوج ونظف جزيئات الماس بقطعة قطن. جفف القسم تحت غاز النيتروجين.
5. قم بتغطية القسم السميك من الكربون (سمك فيلم الكربون 10 نانومتر) وقم بتثبيته على كعب من الألومنيوم بطلاء فضي. اصنع جسرا للطلاء الفضي بين الجزء العلوي من القسم وكعب الروتين للسماح بإخلاء شحن الإلكترون إلى الأرض.
6. ضع كعب الروتين على مرحلة SEM. بجانب العينة ، أدخل كعب تحكم يتكون من كوب فاراداي بمعايير الكربون والألمنيوم والسيليكون في غرفة SEM. سيتم استخدام هذا لمعايرة شعاع الإلكترون وتحويل المستويات الرمادية إلى نسب مئوية من Ca. أغلق غرفة SEM والفراغ.
7. قم بتشغيل شعاع الإلكترون واضبط معلمات SEM لتشغيلها في وضع الإلكترون المتناثر الخلفي. في الصور المتناثرة ، المستوى الرمادي لمعيار الكربون هو 25 ، ومعيار الألومنيوم هو 225 ، ومعيار السيليكون هو 253. كمؤشر ، على النظام المستخدم ، تعمل معلمات SEM على تسريع الجهد 20 كيلو فولت ، وتيار المسبار المقاس بكوب فاراداي: 250 باسكال ، مسافة العمل: 15 مم ، الفتحة: 30 ميكرومتر ، دقة الصورة: 1024 × 768 بكسل ، الفراغ: < 4.10-4 باسكال ، وقت السكون 100 ميكرو ثانية / بكسل ، السطوع ~ 38 والتباين ~ 72.
8. عندما تتم معايرة SEM بالمعايير ، احصل على صور للعينة في وضع الإلكترون المتناثر خلفيا.
9. استخدم صورة الإلكترون المتناثرة للعينة لتحويل المستويات الرمادية إلى محتوى الكالسيوم ، كما هو موضح في Roschger et ^al.16. قم بذلك باستخدام أي برنامج لتحليل الصور.
10. ارسم توزيع محتوى الكالسيوم. يظهر توزيع محتوى الكالسيوم توزيعا غاوسيا. يتم حساب ثلاثة معلمات رئيسية ذات أهمية:_يعني Ca ، كمتوسط محتوى الكالسيوم في الصورة ،_وذروة الكالسيوم كأكثر تركيز الكالسيوم شيوعا في الصورة_وعرض الكالسيوم كعرض كامل عند نصف الحد الأقصى لتوزيع محتوى الكالسيوم.
    ملاحظة: تم فحص قابلية استنساخ qBEi من خلال تصوير نفس منطقة الاهتمام لمدة 5 أيام متتالية (عملية استحواذ واحدة في اليوم). هذا يعني أنه تم تشغيل حزمة الإلكترون وإيقاف تشغيلها بين الجلسات. تم تقدير نسبة الخطأ في_متوسط الكالسيوم_وذروة الكالسيوم والكابري بنسبة 0.5٪ و 0.7٪ و 1.2٪ على التوالي. تم التحقيق في محتوى الكالسيوم أيضا عن طريق تحليل الأشعة السينية المشتتة للطاقة (EDS). تم إنشاء علاقة خطية جيدة جدا بين_متوسط الكالسيوم ومحتوى الكالسيوم المقدر بواسطة EDS بقيمة R² تبلغ 0.99 ، على غرار البيانات التي حصل عليها Roschger et al. سابقا¹⁷.

6. علم الأنسجة

1. لكل عينة ، قم بقص أقسام 7 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم الأنسجة الصلبة بشفرة التنغستن ^18،19. أقسام البقع مع صبغة Goldner trichrome و HES و MOVAT باستخدام نظام تلطيخ أوتوماتيكي.
2. للاستخلاص ، انقع العينات على التوالي في الأسيتون لمدة 5 دقائق وكرر 2x. اشطف العينات بالماء المقطر لمدة 5 دقائق وكرر 2x.
3. قم بإجراء تلوين Goldner Trichrome كما هو موضح أدناه.
   1. ضع العينات في الهيماتوكسيلين الحديدي Weigert لمدة 20 دقيقة. يغسل بماء الصنبور. اغمر العينات في كحول حمضي بنسبة 0.5٪ لمدة 30 ثانية - 1 دقيقة. يغسل بماء الصنبور لمدة 20 دقيقة.
   2. ضع العينات في محلول بونسو / حمض الفوشين / آزوفلوكسين لمدة 5 دقائق. اغمر في حمض الأسيتيك 1٪ لمدة 1 دقيقة.
   3. وصمة عار بحمض الفوسفوروليبديك / محلول أورانج جي لمدة 20 دقيقة. اغمر في حمض الأسيتيك 1٪ لمدة 1 دقيقة.
   4. وصمة عار بمحلول أخضر سريع لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 8 دقائق عند 60 درجة مئوية. شطف جيدا بماء الصنبور. كرر 3 مرات.
4. قم بتلوين Movat Pentachrome كما هو موضح أدناه.
   1. تلطيخ ألكيان بلو: اغمر العينات في محلول ألسيان الأزرق لمدة 30 دقيقة. اشطف العينات بماء الصنبور لمدة 5 دقائق. ضع العينات في الإيثانول القلوي لمدة 60 دقيقة. اشطف العينات بماء الصنبور لمدة 10 دقائق. قم بإجراء شطف نهائي بالماء المقطر.
   2. تلطيخ Weigert Hematoxylin: ضع العينات في Hematoxylin الحديديك Weigert لمدة 20-30 دقيقة. اشطف العينات بماء الصنبور لمدة 15 دقيقة. شطف مرة أخرى بالماء المقطر.
   3. تلطيخ بحمض كروسين بريليانت / فوكسين: اغمر العينات في محلول كروسين بريليانت / حمض فوكسين لمدة 10 دقائق. اشطفه بحمض الأسيتيك 0.5٪. اغمر العينات في محلول حمض الفوسفوتونغستيك بنسبة 5٪ لمدة 20 دقيقة. اشطفه بحمض الأسيتيك 0.5٪ لمدة دقيقتين. قم بإجراء ثلاث عمليات شطف متتالية باستخدام الإيثانول بنسبة 100٪ ، كل منها لمدة 5 دقائق.
   4. تلطيخ مع Safran du Gatinais: ضع عينات في Safran du Gatinais لمدة 15 دقيقة. قم بشطف أخير بماء الصنبور.
5. قم بإجراء تلوين HES كما هو موضح أدناه.
   1. تلطيخ الهيماتوكسيلين من Weigert: اغمر العينات في Hematoxylin من Weigert لمدة 30 دقيقة. اشطفها بماء الصنبور لمدة 2 دقيقة.
   2. إزالة اللون: اغمس العينات في كحول حمض الهيدروكلوريك لمدة 10 ثوان. اشطفها بماء الصنبور لمدة 2 دقيقة.
   3. التحييد: اغمر العينات في محلول كربونات الليثيوم لمدة 1 دقيقة. اشطفها بماء الصنبور لمدة 2 دقيقة. قم بإجراء شطف نهائي بالماء المقطر لمدة 1 دقيقة.
   4. تلطيخ بالإيوزين - إريثروزين: ضع العينات في محلول إيوسين إريثروزين لمدة 3 دقائق. اشطفها بماء الصنبور لمدة 10 ثوان.
   5. الجفاف: اغمر العينات في 95٪ كحول لمدة 15 ثانية. انقله إلى كحول 100٪ لمدة 15 ثانية. كرر الغمر في الكحول بنسبة 100٪ لمدة 30 ثانية.
   6. التلوين النهائي بالسافرانين الكحولي: اغمر العينات في السافرانين الكحولي لمدة 10 دقائق. قم بشطف أخير بماء الصنبور.
6. قم بإجراء تركيب الشرائح كما هو موضح أدناه.
   1. اشطف العينات بنسبة 95٪ من الإيثانول ، ثم 100٪ من الإيثانول ، ثم ميثيل سيكلوهكسان وكرر هذا 3x لكل خطوة.
   2. قم بتركيب العينات باستخدام مجموعة أدوات التثبيت وأضف غطاء غطاء. امسح الصور ضوئيا باستخدام ماسح ضوئي رقمي للشرائح.

7. رامان التحليل الطيفي المجهري

1. استخدم نفس القسم المستخدم لتحليل رامان مثل SEM. قم بطحن القسم وتلميعه لفترة وجيزة كما هو موضح في الخطوات 5.2 - 5.3 لإزالة طبقة الكربون الرقيقة المضافة ل SEM التي تضعف تبديد الحرارة من العينة.
2. ضع القسم على مسرح مطياف رامان المجهري. معايرة الرقم الموجي لضمان الدقة ومحاذاة الليزر قبل القياس. وبما أن هذه الإجراءات خاصة بكل صك، فلن يتم وصفها في هذه المقالة.
3. حدد المناطق ذات الأهمية في الأنسجة التي تحتاج إلى تحليل. ضع المنطقة المراد تحليلها في وسط أداة الفيديو واجمع أطياف رامان بالمعلمات التالية: ليزر 785 نانومتر مستخدم عند 30 ميغاواط ، وقت التكامل: 20 ثانية متكررة 3 مرات ، النطاق الطيفي: 350-1800 سم ^-1 ، صريف 1200 خط / مم.
4. اجمع 10 أطياف من راتنج التضمين بنفس إعدادات Raman وقم بمتوسطها. استخدم هذا لطرح مساهمة الراتنج في الخطوة 7.6.
5. قم بمعالجة الأطياف مسبقا على النحو التالي لإزالة مساهمة التألق والضوضاء والراتنج: تصحيح خط الأساس مع تركيب متعدد الحدود من خمسة رتب ، ومرشح Savitzky-Golay بدرجة 4 ، وحجم نافذة يتألف بين 17 و 21 ، وطرح الراتنج الرقمي باستخدام ذروة ~ 812 سم ^-1 من الراتنج. يمكن إجراء هذه المعالجة المسبقة باستخدام برامج مختلفة مصممة لتحليل البيانات وتصورها.
6. قم بتحليل الأطياف المعالجة مسبقا لاستخراج معلمات قيمة عن طريق تقنين شدة ذروة الاهتزاز ذي الأهمية مع ذروة شدة الاهتزاز المرجعي. لتحليل العظام ، على سبيل المثال ، استخدم المعلمات التالية لحسابه.
   1. نسب المعادن إلى المصفوفة: اقسم شدة ذروة اهتزازات v1PO4 عند ~ 960 سم ^-1 على ذروة شدة Amide I (~ 1668 ^cm-1) ، أميد III (~ 1250 سم ^-1) ، CH2-wag (~ 1450 سم ^-1) أو مجموع البرولين (~ 854 سم ^-1) وهيدروكسي برولين (Hyp ، ~ 872 سم ^-1) أوضاع الاهتزاز. يمكن أيضا استخدام v2PO4 ، الموجود عند ~ 430 سم ^{-1 ،} أو v4PO4 ، الموجود عند ~ 600 سم ^-1 ، ونسبته مع اهتزاز Amide^{III 20}. تمثل هذه المعلمات درجة تمعدن المرحلة العضوية لمصفوفة العظام.
   2. كربونات / فوسفات: اقسم شدة الذروة ل v1CO₃ ، الموجود عند ~ 1070 سم ^-1 ، على v1PO4. يمثل هذا مقدار استبدال الكربونات من النوع B في شبكة الأباتيت. Hyp / Pro ، يمثل محتوى الهيدروكسي برولين ، ~ 1375 ^{سم -1} / أميد الثالث ، يمثل محتوى البروتيوغليكان ، ~ 1150 سم ^-1 / CH2-wag و ~ 1495 سم ^-1 / CH2-wag ، يمثل كمية المنتجات النهائية المتقدمة للجليكاسیون كربوكسي ميثيل يسين والبنتوسيدين ، 1670 سم ^-1/1690 سم ^-1 و 1670 سم ^-1 / 1640 سم ^-1 تمثل الهيكل الثانوي المضطرب للكولاجين ، المعروف أيضا باسم نضج الكولاجين ، والهياكل المرتبة في شكل حلزون α في النوع الأول من الكولاجين ، على التوالي.
7. تقييم قابلية تكرار قياسات رامان من خلال فحص نفس منطقة الاهتمام في 5 عمليات استحواذ متتالية (عملية استحواذ واحدة في اليوم). لكل معلمة تم تحليلها ، كان التباين أقل من 0.2٪ من قيمة المعلمة ، مما يدعم قابلية التكرار الجيدة. تمت مناقشة خصوصية كل ذروة تم التحقيق فيها على نطاق واسع في الميدان ، وتم تقديم نظرة عامة في المراجعة الأخيرة ل Unal²¹.

8. المسافة البادئة النانوية

ملاحظة: نظرا للطبيعة المدمرة للمسافة البادئة النانوية ، يتم إجراؤها عادة في نهاية روتين تحليل العينة. تم تجهيز نظام المسافة البادئة النانوية الذي نمتلكه بمسافة بادئة هرمية من الماس بيركوفيتش. ومع ذلك ، توجد العديد من أشكال المسافة البادئة ، ولم يتم تحديد أي إجماع في الأدبيات على عينات العظام أو المواد الحيوية.

1. قم بترطيب عينة العظام المضمنة في محلول ملحي لمدة 16 ساعة في RT قبل اختبار المسافة البادئة النانوية.
2. معايرة نظام المسافة البادئة النانوية باستخدام السيليكا المنصهرة وتسجيل معامل المسافة البادئة الناتجة. بالنسبة للسيليكا المنصهرة ، يبلغ معامل المسافة البادئة حوالي 72 جيجا باسكال باستخدام معامل بواسون 0.17.
3. بمجرد معايرة نظام المسافة البادئة النانوية ، ضع العينة المستخدمة في تحليلات رامان في النظام البصري لجهاز المسافة البادئة النانوية للإشارة إلى المواقع التي سيتم فيها إجراء المسافة البادئة النانوية.
   ملاحظة: تختلف هذه الطريقة من جهاز إلى آخر؛ نحن لا نفصل كيفية عمل نظام المسافة البادئة النانوية والبرامج ولكننا نقدم نصائح عامة حول الخطوات المختلفة التي يجب تنفيذها.
4. بمجرد اختيار موقع المسافة البادئة النانوية ، انقل العينة أسفل جهاز المسافة البادئة وقم بإجراء المسافة البادئة. قم بإجراء المسافة البادئة النانوية على عمق ثابت يبلغ 900 نانومتر ، مع سرعة تحميل / تفريغ تبلغ 40 مم / دقيقة وتوقف مؤقت لمدة 15 ثانية بين التحميل والتفريغ. اضبط معامل بواسون لأنسجة العظام على 0.3.
5. استرجع المعلمات المختلفة من منحنيات المسافة البادئة النانوية واحسبها وفقا لنظرية أوليفر وفار²².
   1. معامل المسافة البادئة (E_IT) مشتق من الخصائص المعروفة لطرف المسافة البادئة والمعامل المخفض ويجمع بين معامل المرونة المحلي للعينة. احسب المسافة البادئة على النحو التالي:
      
      مع v_s و v_i و E_i و E_r التي تمثل معامل بواسون للعينة ، يفترض أن تكون 0.3 للعظم ، يفترض معامل بواسون للمسافة البادئة الماسية ، المفترض أن يكون 0.07 ، معامل المرونة للمسافة البادئة الماسية ، الثابت عند 1140 جيجا باسكال والمعامل المخفض ، محسوبا على النحو التالي:
      
      مع S التي تمثل منحدر جزء التفريغ و Ap هي المنطقة المسقطة ويتم حسابها على النحو التالي:
      
   2. صلابة (H_IT): تتوافق مع مقاومة العظام لبدء وانتشار الشقوق. بمعنى آخر ، إنه مؤشر على صلابة العظام. احسب H_IT على النحو التالي:
      
   3. معدل زحف المسافة البادئة (C_IT): يعكس هذا تشوه العظام بمرور الوقت عند الحمل الثابت ، مما يدل على الخصائص اللزجة المرنة للعينة ، تحسب على النحو التالي:
      
   4. الحمولة القصوى (L_m): يتوافق هذا مع التحميل المعاكس الضروري لاختراق العمق المشار إليه في مصفوفة العظام المعدنية.
   5. عمل المسافة البادئة (W_plast): يتوافق هذا مع المنطقة الواقعة تحت منحنى تشوه التحميل / التفريغ. إنه انعكاس مباشر للطاقة المتبددة للحث على تشوه البلاستيك.
      ملاحظة: يصعب تقييم قابلية تكرار المسافة البادئة النانوية على عينات العظام بسبب الطبيعة المدمرة لهذه المنهجية. ومع ذلك ، قمنا بتقدير قابلية استنساخ عينة السيليكا المنصهرة القياسية والموحدة. بالنسبة لجميع المعلمات المذكورة أعلاه ، تم تقدير التباين بأقل من 0.26٪ (5 مقاييس متتالية في 5 أيام منفصلة) ، مما يدعم قابلية استنساخ جيدة جدا. من ناحية أخرى ، نظرا للطبيعة متباينة الخواص لعينات العظام ، يصعب تقدير قابليتها للتكاثر.

النتائج

تظهر صورة التصوير المقطعي المحوسب الصغير للنبتة في الشكل 2. لا يمكن أن يؤدي استخدام التجزئة اليدوية إلى فصل العظام عن الأسمنت الموجود في القناة المركزية على النحو الأمثل باستخدام العتبة العالمية. لتحسين التعرف على العظام التربيقية والأسمنت ، نقترح استخدام التعلم العميق. التعلم العميق قوي للتعرف على خصائص المواد الحيوية ويساعد على تحسين الفصل بين العظام والأسمنت ، مما يتيح تقييما أفضل لتفاعلات الأسمنت والعظام. هذا له أهمية قصوى من أجل تحديد كمية العظام المتكونة بدقة في الواجهة مع الأسمنت وعدم دمج وحدات البكسل الكاذبة في هذا الحساب.

ومع ذلك ، فإن مجرد تحديد العظام في الواجهة لا يكفي لتوصيف العظام المشكلة حديثا. مطلوب دراسة أكثر تعمقا لجودة مصفوفة العظام والتركيب الخلوي لفهم قوة العظام الجديدة والآليات الخلوية التي أدت إلى تكوين هذه المصفوفة الجديدة بشكل أفضل. يمكن توصيف المصفوفة العظمية باستخدام طريقتين متكاملتين: qBEI و Raman الطيفي المجهري. يتم تقديم مثال على صورة qBEI في الشكل 3. باستخدام qBEI ، يتم تحويل كل بكسل مشفر بتدرج الرمادي إلى تركيز الكالسيوم. هذا شرط أساسي لتقييم توزيع محتوى الكالسيوم في العظام التربيقية ولفهم (1) درجة تمعدن العظام المكونة حديثا عند الواجهة مع الأسمنت و (2) ما إذا كان وجود الأسمنت يعطل تمعدن العظام التربيقية. تتمثل ميزة qBEI في قدرته على الحصول على صورة عالية الدقة في وقت قصير جدا ، على عكس التحليل الطيفي المجهري رامان الذي يتطلب وقتا أطول للاستحواذ. يمكن بعد ذلك اشتقاق معلمات qBEI مثل_متوسط الكالسيوم_وذروة الكالسيوم_وعرض الكالسيوم من توزيع الكالسيوم واستخدامها لمقارنة الاستجابة بين اثنين من الأسمنت أو المواد الحيوية.

من ناحية أخرى ، لا يقدم qBEI أي معلومات عن جودة المرحلة العضوية لمصفوفة العظام في الواجهة مع المادة الحيوية. معلومات إضافية تتعلق بالخصائص المادية للمرحلة العضوية مشتقة من التحليل الطيفي المجهري رامان. يتم إجراء التحليل الطيفي المجهري رامان على نفس العينة المستخدمة في qBEI بعد طحن وتلميع السطح السريع من أجل إزالة طبقة الكربون الموصلة. في التحليل الطيفي المجهري رامان ، يتم الحصول على الأطياف في كل موقع بكسل. يتم توفير أمثلة على أطياف رامان الخام غير المعالجة والمعالجة في الشكل 4. يحتوي كل طيف على معلومات عن تكوين البكسل الذي تم تحليله ويتضمن القمم المتعلقة براتنج التضمين ، في هذه الحالة ، pMMA ، المرحلة المعدنية ، القمم v1PO4 و v1CO3 ، والمرحلة العضوية ، القمم Pro ، Hyp ، CML ، Amide III ، PG ، CH2 ، Pen. وأميد الأول. في المثال الوارد في الشكل 4 ، يظهر الطيف غير المعالج مساهمة راتنج الطلاء عند ~ 812 سم ^-1 وخط أساس منحني غير صفري بسبب التألق ، على الرغم من استخدام ليزر أحمر قريب من الأشعة تحت الحمراء. تعد معالجة الطيف شرطا أساسيا لضمان الحساب الدقيق لمعلمات رامان المختلفة ، ولا سيما القضاء على مضان الخلفية. عند الحصول على البيانات ، يجب على المستخدم التأكد من تحديد المواقع بدقة وتجنب تشبع الكاشف لتأكيد وجود ذروة v1PO4 الموجودة ~ 960 سم ^-1. بعد المعالجة اللاحقة ، يتم حساب نسب شدة الذروة وفقا لموقع الوضع الاهتزازي المميز.

ومع ذلك ، فمن المشكوك فيه ما إذا كانت التغييرات في تكوين المواد أدت إلى تغييرات في الاستجابة الميكانيكية الحيوية. لجمع المعلومات حول الميكانيكا الحيوية للعظام المشكلة حديثا ، نجري بشكل منهجي تحقيقات المسافة البادئة النانوية على نفس العينة المستخدمة في التحليل الطيفي المجهري رامان. يتم الحصول على المعلومات الميكانيكية للأنسجة من منحنيات المسافة البادئة النانوية التي تمثلها منحنيات الحمل مقابل العمق (الشكل 5). تجدر الإشارة إلى أن العمق لا يعود إلى الصفر في نهاية الاختبار ، مما يمثل التشوه البلاستيكي والضرر الدائم الناتج عن المادة. يتم اشتقاق معدل زحف المسافة البادئة من منحنى العمق مقابل الوقت.

أخيرا ، يتم استخدام التلوين النسيجي لتقييم استجابة الأنسجة للمادة الحيوية على المستوى الخلوي (الشكل 6). تسمح لنا البقع النسيجية المقترحة بتحديد وجود الأنسجة العظمية ، ولكن أيضا تحديد الخلايا (الضامة ، والخلايا العملاقة متعددة النوى ، وناقضات العظم ، بانيات العظم) والوجود المحتمل لكبسولة ليفية في الواجهة مع المادة الحيوية. هذا مهم جدا لفهم التوافق الحيوي للمادة الحيوية ، ولكن أيضا استمرار العظام الجديدة عندما تتحلل المادة الحيوية.

بشكل عام ، يتيح النهج متعدد الأساليب إجراء دراسة متعمقة لتكوين العظام وجودة العظام المشكلة حديثا والتركيب الخلوي. عند إجراؤها بالترتيب التسلسلي المقترح ، يمكن إجراء جميع الفحوصات على نفس العينة ، مما يقلل من التكلفة ووقت المعالجة.

الشكل 1: الملخص الرسومي. يتم توفير ملخص لخطوات البروتوكول هنا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: تحليلات التصوير المصغر والتعلم العميق. (أ) إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لصور التصوير المقطعي المحوسب الدقيقة. (ب) تجزئة العظام والأسمنت: مقارنة بين التجزئة اليدوية والتعلم العميق. شريط المقياس = 5 سم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: التصوير الإلكتروني الكمي المتناثر لتحديد محتوى الكالسيوم. (أ) يتم تحويل الصورة المتناثرة الخلفية المكونة من مستويات رمادية تم الحصول عليها في المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) بواسطة برنامج تحليل الصور إلى (ب) خريطة الكالسيوم توضح النقاط الساخنة لعينة العظام. (ج) يتم رسم توزيع محتوى الكالسيوم مقابل مساحة العظام ، ويتم حساب معلمات qBEI الرئيسية الثلاثة ، عرض Camean و Capeak و Capec. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مثال على أطياف رامان. (أ) طيف رامان الخام غير المعالج الذي تم الحصول عليه في النطاق الطيفي 800 - 1800 سم ^-1. تظهر الخلفية الفلورية بوضوح لأن الأطياف لا تبدأ من 0. يمكن رؤية مساهمة الراتنج (pMMA) بوضوح عند ~ 812 سم ^-1. (ب) الطيف المعالج. يشار إلى موضع أوضاع الاهتزاز المختلفة ذات الأهمية على الطيف. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: التحقيق في الخواص الميكانيكية للأنسجة عن طريق المسافة البادئة النانوية. (أ) يتكون جهاز المسافة البادئة النانوية من جزء بصري يستخدم لتحديد موقع المنطقة ذات الاهتمام على سطح كتلة العينة ، ثم تتم ترجمة الكتلة تحت جزء المسافة البادئة. (ب) يتم رسم الحمل مقابل الوقت والعمق مقابل الوقت أثناء اختبار المسافة البادئة وتستخدم لتوليد (C) الحمل مقابل منحنى العمق. في هذا المثال ، تم تثبيت العمق المختار عند 400 نانومتر. يتم اشتقاق الحمولة القصوى_{(L m}) ، والعمق في نهاية التحميل (h_l) ، والعمق بعد فترة التوقف المؤقت (h_m) ، وميل جزء التفريغ (S) والمنطقة الواقعة تحت مرحلة التحميل والتفريغ للاختبار (W_plast) من منحنى الحمل مقابل العمق وتستخدم لحساب معلمات المسافة البادئة النانوية المختلفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: التحليل النسيجي للنباتات العظمية الغضروفي المعالجة بالأسمنت بعد 28 يوما من الاستزراع. (أ) يوضح تلطيخ Movat بنية الأنسجة ، بما في ذلك العظام والأسمنت الذي يملأ العيب. (ب) يوضح تلطيخ HES تكامل الأنسجة والاستجابة الخلوية حول الأسمنت. شريط المقياس: 2.5 مم. (ج) تكبير المنطقة المميزة في (B) ، والتي توضح بالتفصيل الواجهة بين الأسمنت والأنسجة المحيطة به ، حيث يمكن ملاحظة الخلايا وهي تغزو الأسمنت. شريط المقياس: 500 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

يعد إصلاح عيوب العظام تحديا كبيرا في الطب التجديدي لاستعادة الحركة وتقليل الألم وتحسين نوعية حياة الأفراد المصابين. يوفر استخدام نماذج الاستخراج عددا من المزايا مقارنة بالدراسات في الجسم الحي للتحقيق في إصلاح عيوب العظام. بالإضافة إلى الاعتبارات الأخلاقية ، يسمح هذا النموذج بالتحكم الصارم في الظروف التجريبية وتقليل التباين البيولوجي ، وبالتالي تسهيل توليد نتائج أكثر دقة وقابلية للتكرار. علاوة على ذلك ، فإن الخصائص الميكانيكية والبيولوجية لعظام الأغنام تتماشى بشكل وثيق مع تلك الموجودة في عظام الإنسان مقارنة بالحيوانات الأخرى^23،24. هذا يجعل نموذج نثرة الأغنام خيارا مناسبا بشكل خاص للدراسات قبل السريرية ونموذجا تمثيليا للظروف السريرية البشرية.

إلى جانب تطوير منهجية التصوير وعلوم المواد ، يمثل نموذج الاستخراج الموصوف هنا نموذجا جيدا للتحقيق في آثار الطب التجديدي على أنسجة الهيكل العظمي في بيئة خاضعة للرقابة مما يقلل من التحيز التجريبي. تعتبر أبعاد ومورفولوجيا المصنع مثالية للتحليل التفصيلي لتكوين العظم الجديد وخصائص المواد ، مما يتيح التقييم والتوصيف^{الشاملين 25}. تؤكد هذه النتائج على إمكانات النموذج للترجمة السريرية ، مما يوفر إطارا قويا لتقييم بدائل ترقيع العظام وتعزيز احتمالية النتائج السريرية الناجحة في علاجات تجديد العظام. علاوة على ذلك ، يسهل النموذج التقييم الدقيق لتكامل عظم العظام وأداء المواد الحيوية ، وهما عاملان حاسمان في تطوير استراتيجيات فعالة لإصلاح العظام.

لضمان نجاح الدراسة ، من الأهمية بمكان اتباع الخطوات الرئيسية للبروتوكول بدقة. أحد أهم الجوانب هو التأكد من تجفيف العينة تماما أثناء عملية التضمين. يمكن أن تعيق أي رطوبة متبقية التضمين المناسب للراتينج ، مما يؤدي إلى راتينج غير واضح وغير شفاف ، مما قد يضر بوضوح ودقة النتائج ويمكن أن يؤدي أيضا إلى حدوث ثقوب أثناء التقسيم الأنسجي. هذا الاهتمام الدقيق بالتفاصيل ضروري لإنتاج نتائج موثوقة وقابلة للتكرار. من أجل ضمان التحويل الدقيق للمستويات الرمادية إلى خريطة محتوى الكالسيوم ، من الضروري استخدام المعايرة باستخدام كوب فاراداي ومعايير C و Al و Si لتحليل SEM. من الأهمية بمكان ضمان الاتساق في استخدام نفس المحرك SEM لجميع العينات ، حيث يمكن أن تؤدي الاختلافات في كاشفات الإلكترون المتناثرة إلى تباين في النتائج. في التحليل الطيفي رامان ، تعد معايرة الرقم الموجي والتصحيح الأساسي الشامل ضروريين لاستبعاد خلفية التألق والتمييز بين القمم من راتنج التضمين والعينة. بالنسبة للمسافة البادئة النانوية ، يعد تحقيق سطح أملس تماما أمرا بالغ الأهمية ، نظرا لحدود إزاحة المسافات البادئة ، والمعايرة بمعيار معروف ، مثل السيليكا المنصهرة ، ضرورية لضمان قياسات موثوقة.

غالبا ما تعالج التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذه التقنيات الطبيعة متباينة الخواص لمادة العظام ، والتي لديها القدرة على التأثير على اتساق القياس. لتوضيح ، في التحليل الطيفي رامان ، يمكن أن يكون لاستقطاب الليزر الساقط تأثير كبير على الشدة المسجلة. يمكن أن يساعد استخدام هدف 20x مع فتحة عددية منخفضة في التخفيف من هذه المشكلة. كما أنه من الأهمية بمكان ضمان ظروف المعايرة والقياس المتسقة عبر جميع العينات من أجل الحفاظ على سلامة البيانات. يمثل تباين الخواص المتأصل في العظام قيدا لهذه المنهجيات ، حيث يمكن أن يؤثر على توحيد القياسات ، لا سيما في تقنيات مثل التحليل الطيفي رامان. علاوة على ذلك ، فإن ضرورة المعايرة الدقيقة والرقابة البيئية قد تحد من قابلية التطبيق العام إذا لم تتم إدارة هذه الجوانب بدقة.

يمتد التطبيق المحتمل لهذه الأساليب بشكل كبير إلى تقييم المواد الحيوية الجديدة والاستراتيجيات العلاجية لإصلاح العظام. توفر قدرة النموذج على محاكاة فسيولوجيا العظام البشرية عن كثب منصة قوية للاختبارات قبل السريرية ، مما يتيح تقييما شاملا لسلامة وفعالية العلاجات الجديدة في بيئة خاضعة للرقابة. تعتبر فائدة هذا النموذج ذات صلة بشكل خاص بتسريع المسار الانتقالي من الأبحاث المختبرية إلى الممارسة السريرية ، مما يسهل التحديد المبكر للمرشحين الواعدين لعلاجات تجديد العظام. من خلال توفير طريقة موثوقة وقابلة للتكرار لتقييم مواد إصلاح العظام ، تدعم هذه التقنية تقدم الطب التجديدي وتطوير حلول قابلة للتطبيق سريريا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
0.20 مرشحات	VWR   ؛	28145-501
إبرة 18 جم (1،2 × 40 مم)	حقنة Sterican	4665120
3 مل	HENKE-JECT	8300005762
37٪ حمض الهيدروكلوريك   ؛	VWR	1.00317.1000
حمض الخليك (الجليدي)	سيجما	A6283
الأسيتون	VWR	20063-365
Alcian Blue 8GX	VWR	361186
هيدروكسيد الأمونيوم	VWR	318612
فوسفات ثلاثي الكالسيوم Apatitic	مركز الهندسة الطبية الحيوية والرعاية الصحية (مناجم سانت إتيان ، فرنسا)	TV26U
Azophloxine	Sigma	210633
البنزويل بيروكسيد	سيجما	8.01641.0250
BMP2	Medtronic	InductOs 1.5 مجم / مل
كروسين بريلانت   ؛	Aldrich	2107507
CTVox	Bruker-DataViewer
	Skyscan-Diamond
شفرة	Struers	MOD13
المنشار الماسي	Struers	Accutom-50
DiaPro Mol B3 محلول الماس	Struers	40600379
DiaPro Nap B1 محلول الماس	Struers	40600373
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na2HPO4)	Sigma & nbsp ؛	102404598
Dibutyl Phtalate	Chimie-Plus Laboratoires	28656
برنامج DragonFly	ORS	2022.1.0.1231.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) نسبة عالية من الجلوكوز ، GlutaMAX (TM) ، البيروفات	ThermoFisher Scientific	31966-021
Eosine Y- Surgipath	سيجما	1002830105
الإريثروسين ب	سيجما	102141057
الإيثانول	المطلق VWR	20820362
Eukitt	Dutscher	6.00.01.0003.06.01.01
Falcon 50 مل	Sarstedt	62.547.254
سداسي هيدرات كلوريد الحديديك (FeCl3 ، 6H2O)	Merck	1.03943.0250
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	Eurobio	CVFSVF00
حمض الفوشين	Merck	1.05231.0025
محلول الملح المتوازن من هانك (HBSS)	Biosera	MS01NG100J
Hematoxylin	Sigma	86.118.9
مكبس متساوي نوفا	سويس	Pmax 1500 بار
قياس حبيبات الحيود بالليزر	Malvern	Mastersizer 3000
أخضر فاتح	Prolabo	28947135
كربونات الليثيوم	سيجما	A13149
MD-Mol تلميع القماش	Struers	40500077
ميثيل سيكلوهكسان	VWR & nbsp ؛	8.06147.1000
ميثيل سيكلوهكسان	VWR	8.06147.1000
ميثيل سيكلوهكسان	VWR	8.06147.1000
ميثيل ميثاكريليت	سيجما	8.00590.2500
مايكرو CT ، ماسح ضوئي صغير   ؛	Bruker	Skyscan 1272
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NAH2PO4)	Sigma	71496
Mortar	Fritsch	Pulverisette 6
N,N, Dimethylanilin	Sigma	803060
محطة المسافة البادئة النانوية	Anton Paar	NHT2
ND-Nap	Struers	40500080
OATS طقم نظام نقل الطعم الذاتي للعظم الغضروفي ، 4,75 مم	Arthrex	AR-1981-04S
OATS مجموعة نظام النقل التلقائي للطعم العظمي الغضروفي ، 8 مم	Arthrex	AR-1981-08S
Orange G	Ral	M15
بارافورمالدهيد (PFA)	سيجما   ؛	P6148
قوالب التضمين التي يمكن التخلص منها Peel-a-way	Polysciences، Inc	18646C-1
Penicillin / Streptomycin (P / S) ThermoFisher	Scientific	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS) ThermoFisher	Scientific	10010023
Phosphomolybdic acid   ؛	سيجما	221856-100 جم
حمض الفوسفوتونغستيك	Aldrich   ؛	12863-5
آلة تلميع	Sturers	Dap V
Poupinel	MEMMERT	TV26U
رامان المطياف الدقيق	Renishaw	InVia Qontor
Safran du G & acirc ؛ تينايس	Labonord	11507737
المجهر الإلكتروني الماسح	كارل زايس	إيفو LS 10
SEM	زايس	كارل زايس إيفو LS10
رقائق SiC / أوراق طحن	سترورز	40400008 (# 320) ، 40400011 (# 1000) ، 40400122 (# 2000) ، 40400182 (# 4000) الطلاء
الفضي	علوم المجهر الإلكتروني	12686-15
كعب قياسي مع معايير كأس فاراداي والكربون والألمنيوم والسيليكون	Micro-Analysis Consultants Ltd	8602
T25 قارورة	Corning	430639
Xylene	VWR & nbsp ؛	28975.325
Xylidine Ponceau	Aldrich	19.976-1