مقالة منهجية

توضيح التغيرات البروتينية الخاصة بالأنسجة والبلازما في الصحة والمرض

693 مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67240

⸱

سبتمبر 23, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1NRC Fellow, 2Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 3ORISE Fellow, 4The Geneva Foundation, 5AEOP Fellow, 6Culmen International, LLC

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

البروتينات هي تقييم عالي الإنتاجية لتفاعلات البروتينات ووظيفتها وتكوينها وهياكلها وأنشطتها الخلوية. نقدم هنا بروتوكولا لتقييم التغيرات البروتينية الإجمالية في العينات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك البلازما والأنسجة. المنهجية الواردة هنا قابلة للتطبيق على جميع العينات الحيوية التي تحتوي على بروتينات.

الملخص

البروتينات هي دراسة واسعة النطاق للبروتينات المعبر عنها ، مع التركيز على هيكلها ووظيفتها وتفاعلاتها ووفرتها وتعديلات ما بعد الترجمة داخل النظام البيولوجي. على سبيل المثال ، علم الفوسفورات ، وهو مجموعة فرعية حيوية من البروتينات الكلية ، هو دراسة أنماط الفسفرة والتغيرات على البروتينات. توضح المنهجية الموضحة هنا نهجا شاملا للبروتينات لتوضيح التغيرات في ملامح التعبير عن البروتين الشاملة ، بما في ذلك أنماط الفسفرة ، في أنسجة البلازما والدماغ والرئة والطحال والكبد التي تم جمعها من النماذج الحيوانية البحثية (مثل القوارض والفئران). هذه التقنية قابلة للتطبيق على أنواع الأنسجة الأخرى ، بالإضافة إلى أي عينة حيوية تحتوي على بروتينات تقريبا (على سبيل المثال ، الخلايا المزروعة). بعد التشريح ، تم تجميد الأنسجة ذات الأهمية وتخزينها عند -80 درجة مئوية. ثم تم تجانس الأنسجة باستخدام ملاط ومدقة بالنيتروجين السائل للحفاظ على سلامة البروتين وتغيرات الفسفرة. تم استخراج البروتين الكلي من تجانسات الأنسجة باستخدام مخزن مؤقت للتحلل مع نوكلياز عالمي ومثبطات البروتياز / الفوسفاتيز. تم تحويل البروتينات المستخرجة من الأنسجة والبلازما المكافئة إلى ببتيدات إجمالية عن طريق التحكم في هضم البروتياز باستخدام مجموعة تحضير عينة مطياف الكتلة التجارية. تم تحليل الببتيدات مباشرة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء / قياس الطيف الكتلي الترادفي Orbitrap-tribrid. تمت إعادة بناء هويات البروتينات المكونة من البيانات الطيفية لكتلة الببتيد ، باستخدام برنامج المعلوماتية الحيوية للبروتينات ، كما هو مطابق لمكتبة تسلسل الأحماض الأمينية الخاصة بالأنواع. بعد ذلك ، يجب أن يتضمن التحليل معايير قطع صارمة ، خاصة باستخدام تعريفات البروتين عالية الثقة فقط. يمكن تحديد الفروق البروتينية ذات الدلالة الإحصائية (>تغيير 2 ضعف ؛ ص < 0.05) بين المجموعات الضابطة والتجريبية.

المقدمة

تركز البروتينات ، كمزيج من تجارب البروتينات وتحليل البيانات ، على تحديد البروتينات وقياسها كميا ، وتوصيفها بناء على التركيب والتفاعل والتعديلات قبل الترجمة وما بعد الترجمة (مثل الفسفرة) ، والتوطين الخلوي الفرعي ، والبنية في ظل الظروف الفسيولوجية1. تتعامل البروتينات التعبيرية مع المقارنات الكمية للبروتينات التي تختلف في ظل الظروف البيولوجية المتغيرة2. كما أنه يحمل أهمية كبيرة في تحديد ملامح خريطة للمسارات والشبكات والأنظمة الجزيئية المعقدة والمترابطة ، والتي تتحكم بشكل مباشر في الوظائف البيولوجية الرئيسية مثل تكاثر الخلايا والتمايز والشيخوخة وآليات موت الخلايا. مع التقدم الكبير للتكنولوجيا التجريبية في السنوات الأخيرة ، تطورت طرق البروتينات من الأساليب التقليدية - بما في ذلك الكيمياء المناعية ومقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم - إلى تقنيات عالية الإنتاجية مثل الكروماتوغرافيا السائلة3،4. تكتسب الأساليب القائمة على البروتينات زخما في تحديد الأنماط الظاهرية والأنواع الفرعية الفريدة للأمراض ، بالإضافة إلى تحديد التفاعلات المستهدفة الجديدة للأدوية العلاجية (علم الدوائية). على سبيل المثال ، ركز التقسيم الطبقي للمريض بشكل أساسي على الأساليب الجينومية لتحديد المجموعات المتجانسة وتوجيه أنظمة العلاج. ومع ذلك ، فإن حالة النسخ وحدها لا تتنبأ بمصير البروتينات المترجمة بعد ذلك (على سبيل المثال ، الاستقرار أو التعديل). وبالتالي ، تساهم الآليات غير الجينومية بشكل أكبر في تطور المرض وتطوره وشدته ومقاومته للعلاجات5،6،7.

أحد هذه المجالات البحثية التي استفادت بشكل كبير من المقارنات الكمية لتعبير البروتين ونشاطه هو اكتشاف المؤشرات الحيوية في مجال الأمراض التنكسية العصبية وإصابات الدماغ الرضحية (TBI). أساس اكتشاف المؤشرات الحيوية هو تطوير تقنيات التشخيص التي تسهل الكشف المبكر والأهداف المحتملة للتدخل. ساعدت البروتينات الكمية القائمة على LC / MS-MS إلى جانب المعلوماتية الحيوية في اكتشاف المؤشرات الحيوية للبروتين الرئيسية ، بما في ذلك البروتين الحمضي الليفي الدبقي (GFAP) و ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1 (UCH-L1) ، مع تأثير شديد أو اختراق TBI8،9. على سبيل المثال ، غالبا ما يعاني الأفراد العسكريون من حوادث إصابات الدماغ الرضية أثناء مهامهم ، بسبب التعرض لانفجارات القنابل (أي انفجار إصابات الرضية). ومع ذلك ، فإن البيولوجيا المرضية الأساسية للعجز العصبي الناجم عن إصابات الدماغ الرضية الخفيفة الناجمة عن الانفجار لا تزال غير واضحة. ومن ثم ، فإن فهم الآليات الجزيئية والفوقية لإصابة الدماغ الناجمة عن الانفجار يتطلب تحديدا أفضل لبدائل المؤشرات الحيوية المحددة. مع ملاحظة التغيرات البروتينية ، أثبتت الدراسات أن الآليات المحتملة للإجهاد التأكسدي الناجم عن الانفجار في الدماغ مرتبطة بخلل وظيفي في الميتوكوندريا ، بما في ذلك ضعف ديناميكيات الاندماج والاندماج ، وانخفاض الفسفرة المؤكسدة ، وأنشطة الإنزيم ذات الصلة بالتنفس التعويضية10. يمكن أن توفر الرؤى حول التسبب المبكر في اختلال التنظيم الناجم عن الانفجار لتعديلات ما بعد الترجمة مثل الأستلة ، والارتباط بالنيتروسيل ، ونزع الأمين ، والفسفرة مزيدا من التوصيف لآثاره على وظيفة البروتين المتورطة في تلف المحوري ، والالتهاب ، واضطراب الحاجز الدموي الدماغي11،12. مع تقدم مناهج بيولوجيا الأنظمة ، أصبح رسم خرائط إجمالي معلومات البروتينات من الدماغ والأنسجة الطرفية في أنواع المختلفة ، بما في ذلك القوارض والقوارض ، إجراء رئيسيا في أبحاث إصابات الانفجار.

في هذه المقالة ، نركز على سير عمل المنهجية لتقييم الجوانب الكمية لبروتينات التعبير وتعديلاتها بعد الترجمة بدءا من الأنسجة أو البلازما ، والتي تم استخدامها على نطاق واسع لمراقبة كل من الظواهر الفسيولوجية والظروف المرضية. يسمح استخدام المنهجية أدناه بالاتساق والموثوقية في إعداد العينات والحصول على البيانات. من خلال وجود هذه المنهجية الموحدة ، يمكن إجراء مقارنات لتحديد أنماط البروتين المحفوظة عبر أنواع الأنسجة وأنماط الفسفرة الفريدة لأنسجة معينة. إلى جانب ذلك ، يمكن إجراء التحليل عبر العديد من النماذج الحيوانية قبل السريرية والعينات السريرية البشرية للحصول على أنماط الفسفرة المحفوظة التي يمكن أن تكون بمثابة مؤشرات حيوية وتصميم أنظمة العلاج الدوائي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم إجراء البحث بموجب بروتوكول استخدام المعتمد من IACUC في منشأة معتمدة من AAALAC International مع ضمان رعاية لخدمات الصحة العامة وبما يتوافق مع قانون رعاية والقوانين واللوائح الفيدرالية الأخرى المتعلقة بحيوانات المختبر. جميع المستلزمات المطلوبة لهذا الإجراء مدرجة في جدول المواد. ينقسم الإجراء إلى سبعة مكونات.

أنذر. تأكد من اتباع بروتوكولات السلامة المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل لتجانس الأنسجة. ارتدى موظفو المختبر قفازات الفريزر ، ومئزر الفريزر ، وقناع الوجه الجراحي ، ودرع الوجه أثناء تجانس الأنسجة المجمدة. يمكن استخدام تقنية التجانس هذه لأي نوع من الأنسجة ، بما في ذلك المواد شديدة الصلابة مثل العظام ، ببساطة عن طريق ضبط حجم الملاط والمدقة وفقا لذلك. راجع الشكل 1 أ للإعداد الأولي لطاولة العمل. ارجع إلى جدول المواد لمعرفة الأحجام المستخدمة عند تجانس أنسجة الفئران والنمس.

1. طحن الأنسجة المبردة بالهاون والمدقة

  1. خذ وزن أنبوب التجميع الفارغ وقم بتسجيله. أثناء وجودك في أنبوب التجميع ، قم بوزن الأنسجة باستخدام ميزان تحليلي وسجل الوزن في دفتر ملاحظات المختبر. اطرح وزن أنبوب فارغ من الأنسجة بالإضافة إلى وزن الأنبوب للحصول على ملغ من الأنسجة المستخدمة.
    ملاحظة: تشمل الأنسجة التي تم تقييمها للدراسات البروتينية الدماغ والرئة والكبد والطحال. تم طحن الأنسجة بأكملها بالتبريد إلى شكل مسحوق باستخدام ملاط ومدقة.
  2. صب النيتروجين السائل في الرجل المبرد ، لكن تأكد من ملؤه أقل من نصف الطريق.
  3. انقل الأنبوب الذي يحتوي على العينة وأنبوب (أنبوب) الطرد المركزي الدقيق الفارغ الذي تم تعقيمه مسبقا سعة 1.5 مل إلى رف الأنبوب الموجود في الأرجل بالتبريد. يضمن ذلك بقاء العينة مجمدة أثناء تبريد الملاط والمدقة ، مما يمنع العينة من الذوبان عند نقل الأنسجة المتجانسة إلى أنبوب (أنبوب) الطرد المركزي الدقيق الفارغ سعة 1.5 مل.
  4. صب النيتروجين السائل على الهاون والمدقة لتبريد هذه الأدوات قبل الاستخدام. يقع الهاون والمدقة خارج الرجل المبرد (الشكل 1 أ ، ب).
  5. انقل الأنسجة إلى الملاط المبرد الذي يحتوي على النيتروجين السائل (الشكل 1 ب).
  6. اضغط بشكل متكرر على الأنسجة المجمدة باستخدام المدقة وقم بحركة دوارة وطحن مع المدقة على الأنسجة حتى يتم طحن الأنسجة إلى مسحوق ناعم (الشكل 1 ج).
    1. تأكد من عدم استخدام القوة المفرطة ، مما يعرض خطر انسكاب العينات من الهاون. تأكد من التحكم القوي في المدقة.
    2. أضف نيتروجين سائل إضافي إلى الملاط أثناء تجانس الأنسجة الكبيرة لتقليل فرصة ذوبان العينة أثناء الطحن.
    3. أثناء طحن الأنسجة ، تحقق للتأكد من عدم ذوبانها. إذا كان يذوب ، ضع نيتروجين سائل إضافي في الهاون.
  7. اغمس أطراف الملاعق المعدنية في النيتروجين السائل لتبريدها. يساعد ذلك على نقل الأنسجة المتجانسة بسهولة إلى أنبوب 1.5 مل. هذا يمنع الأنسجة من الذوبان والالتصاق بالملعقة أثناء النقل.
  8. بمجرد تجانس الأنسجة إلى مسحوق ناعم وتبريد الملاعق المعدنية ، انقل مسحوق الأنسجة المتجانسة بعناية إلى الأنابيب الجديدة سعة 1.5 مل.
    1. قسم العينة إلى علامات الاقتباس اعتمادا على عدد المقايسات المراد إكمالها.
      ملاحظة: على سبيل المثال ، كان من المقرر إكمال أربعة فحوصات للعينات في هذه الدراسة ، لذلك تم تصنيف الأنسجة المتجانسة بالتساوي إلى أربعة أنابيب 1.5 مل.
    2. قم بتخزين أي منديل متجانس إضافي في أنبوب تجميع معقم سعة 5 مل.
  9. قم بتخزين الأنسجة المقتبسة في ثلاجة -80 درجة مئوية حتى التحليل المستقبلي ، مع استخدام واقعي في غضون عام واحد لتقليل الهواء وكذلك أكسدة البروتينات الخفيفة.
  10. وزن أنبوب التجميع الفارغ.
  11. اطرح وزن أنبوب التجميع الفارغ من القياس الأولي (أنبوب التجميع بالإضافة إلى العينة) للحصول على وزن عينة الأنسجة.

2. تحلل الأنسجة لعزل البروتين

  1. اغرف الثلج الجاف في وعاء قدر الثلج.
  2. ضع رفا أنبوبيا في الثلج الجاف واتركه ليبرد.
  3. قم بإزالة عينات الأنسجة المتجانسة من الفريزر -80 درجة مئوية وضعها في رف الأنبوب المبرد. هذا يمنع العينات من الذوبان، مما قد يتسبب في تدهور البروتين و/أو تغيرات الفسفرة أثناء عملية الوزن.
    1. تأكد من بقاء الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على العينة مجمدة على رف الأنبوب في الثلج الجاف.
  4. ضع أنبوبا أساسيا جديدا سعة 50 مل في الثلج الجاف.
  5. قم بإزالة الغطاء من الأنبوب الكنسي سعة 50 مل وضع ملاعق بلاستيكية يمكن التخلص منها في الأنبوب الأساسي سعة 50 مل لإبقائها باردة. هذا يمنع العينة من الالتصاق بالملاعق أثناء نقلها إلى أنابيب التجانس.
  6. لتحلل الأنسجة وعزل البروتين ، استخدم أنبوبا سعة 2 مل تحتوي على خمس حبات خزفية مقاس 2.8 مم (يشار إليها باسم الأنابيب المتجانسة في هذا البروتوكول).
  7. قم بتسمية الغطاء وجانب أنبوب التجانس بمعرف العينة باستخدام قلم تعليم الحبر الدائم.
  8. ضع الأنابيب المتجانسة ذات العلامات في رف الأنبوب الموجود في الثلج الجاف للحفاظ على برودة الأنابيب ومنع ذوبان العينة.
  9. ضع أنبوبا متجانسا واحدا على ميزان تحليلي وقم بتفريغ الميزان.
  10. أعد الأنبوب المتجانس إلى رف الأنبوب على الثلج الجاف.
  11. قم بإزالة الغطاء من أنبوب التجانس الذي يحتوي على الخرزات ، وباستخدام إحدى الملاعق البلاستيكية المبردة ، انقل 5 مجم إلى 10 مجم من عينة الأنسجة المسحوقة إلى أنبوب التجانس المعني.
  12. ضع الغطاء مرة أخرى على أنبوب التجانس.
  13. قم بوزن الأنبوب المتجانس على الميزان التحليلي وسجل كمية العينة في أنبوب التجانس.
    1. استخدم هذا الوزن لتحديد كمية المخزن المؤقت للتحلل المطلوبة لاستخراج البروتين الكلي الفعال.
  14. بمجرد تسجيل الوزن ، ضع أنبوب التجانس الذي يحتوي على العينة مرة أخرى في رف الأنبوب على الثلج الجاف لإبقائها باردة.
  15. تخلص من الملعقة البلاستيكية المستخدمة.
  16. استخدم ملعقة بلاستيكية جديدة ونظيفة لكل عينة يتم نقلها ووزنها لمنع انتقال التلوث. كرر الخطوات من 2.9 إلى 2.15 لجميع العينات.
  17. بعد نقل جميع العينات إلى أنابيب التجانس الفردية ، احسب كمية المزيج الرئيسي لتحلل البروتين المطلوب.
    1. قم بإعداد الحجم المطلوب من Protein Lysis Master Mix ، والذي يتم حسابه بناء على عدد العينات التي تحتاج إلى معالجة ووزن كل عينة مسحوق. أضف 100 ميكرولتر من مزيج تحلل البروتين الرئيسي لكل 5 مجم من الأنسجة إلى كل أنبوب.
    2. راجع إرشادات الشركة لأحجام الكاشف لصنع مزيج تحلل البروتين الرئيسي (راجع جدول المواد).
  18. ضع الأنابيب المتجانسة التي تحتوي على عينات مسحوق متجانسة في كتلة باردة 4 درجات مئوية. لم يعد بإمكان أنابيب التجانس البقاء على الثلج الجاف. وضع أنابيب التجانس على الكتلة الباردة يمنع محلول التحلل من التجمد.
  19. قم بإزالة الغطاء من أنابيب التجانس وانقل الكمية المحسوبة من مزيج تحلل البروتين الرئيسي المطلوب إلى أنبوب التجانس المعني باستخدام ماصة السعة المناسبة.
    1. ضع الغطاء مرة أخرى على أنابيب التجانس وقم بتدوير الأغطية حتى تصبح مشدودة.
  20. ضع أنابيب العينة في الخالط وضعها على برنامج الأنسجة الرخوة (السرعة 4500 دورة في الدقيقة ، 2 × 30 ثانية لكل دورة ، توقف 30 ثانية) عند 4 درجات مئوية للتجانس.
  21. بمجرد اكتمال دورة التجانس ، قم بإزالة الأنابيب من الجهاز ووضعها مرة أخرى في الكتلة الباردة 4 درجات مئوية.
    1. افحص بصريا أنابيب العينة. تأكد من عدم وجود عينة مسحوق لا تزال مرئية. إذا كانت العينة لا تزال مرئية في جميع أنحاء Protein Lysis Master Mix ، فقم بتحليل الأنسجة بالكامل مرة أخرى على الأداة.
    2. تحسين الإعدادات لنوع الأنسجة المستخدمة. على سبيل المثال ، قد تحتاج الأنسجة المسحوقة المشتقة من الأعضاء الليفية (مثل القلب) إلى دورات إضافية أو عدد دورات أعلى في الدقيقة.
  22. انقل الأنابيب المتجانسة إلى جهاز طرد مركزي. أدخل الإعدادات التالية على جهاز الطرد المركزي: 16,000 جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، واضغط على ابدأ على جهاز الطرد المركزي.
  23. بمجرد اكتمال الطرد المركزي ، انقل أنابيب التجانس بعناية مرة أخرى في الكتلة الباردة 4 درجات مئوية.
  24. قم بتسمية أنابيب جديدة سعة 1.5 مل على الغطاء والجانب مع معرف العينة وأي معلومات أخرى ذات صلة. بمجرد وضع العلامات ، ضع هذه الأنابيب سعة 1.5 مل في كتلة باردة 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تم تصنيف الأنابيب بما يلي على الأقل: معرف ، والنقطة الزمنية للدراسة ، ونوع ، ونوع الأنسجة.
  25. انقل محلول البروتين المقابل من الأنابيب المتجانسة إلى الأنابيب ذات التصنيف 1.5 مل المحفوظة على كتلة باردة 4 درجات مئوية.
  26. قم بتخزين العينات في درجة حرارة -80 درجة مئوية لمزيد من التحليل. هذه نقطة توقف آمنة.

3. القياس الكلي للبروتين

  1. قم بإزالة العينات من الفريزر -80 درجة مئوية وقم بإذابة العينات على الثلج الرطب في دلو ثلج.
  2. بمجرد إذابة الجليد ، قم بتدوير جميع العينات والمعايير من مجموعة قياس كمية البروتين لمدة 3 ثوان على الأقل.
  3. أضف 10 ميكرولتر من كل نسخة مكررة من العينات القياسية والفراغات المناسبة في لوحة ميكروتيتر ذات 96 بئرا بناء على التخطيط التخطيطي (الشكل 2 أ).
    ملاحظة: لكل عينة من الأنسجة ، يتم استخدام تخفيف 1: 100 من محللة البروتين إلى محلول ملحي مخزن بالفوسفات ويفضل أن يكون في تحليل مقايسة البروتين. يمكن تغيير التخطيط التخطيطي اعتمادا على عدد العينات المستخدمة في فحص البروتين. يتم تحميل العينات والمعايير والفراغات المناسبة في لوحة ميكروتيتر 96 بئرا في ثلاث نسخ لتقييم دقة تركيز البروتين ، ولكن إذا احتاجت العديد من العينات إلى وضعها على طبق ، فإن التكرارات مقبولة.
    1. بالنسبة للعينات التي تحتوي على كمية منخفضة من أنسجة البداية (أي أقل من 5 مجم) ، استخدم نسخة مكررة واحدة فقط أو نسخ مكررة لمقايسة البروتين لزيادة كمية البروتين المحلل المتاحة لهضم البروتين اللاحق.
    2. تأكد من استخدام ماصات السحب الدقيقة والماصات المعايرة.
  4. اقلب زجاجة كاشف مقايسة البروتين عدة مرات لخلطها جيدا ، ثم اسكبها في خزان كاشف سعة 10 مل.
  5. باستخدام ماصة متعددة القنوات ذات سعة قصوى تبلغ 200 ميكرولتر ، أضف 150 ميكرولتر من كاشف مقايسة البروتين إلى العمود 1.
  6. قم بإزالة الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لخلط كاشف مقايسة البروتين مع 10 ميكرولتر من المحتوى الموجود بالفعل في البئر للمساعدة في تقليل الترسيب في الآبار.
  7. تخلص من أطراف الماصة وضع أطراف جديدة على الماصة متعددة القنوات ذات السعة القصوى 200 ميكرولتر.
  8. كرر الخطوات 3.5-3.7 حتى تتم إضافة كاشف فحص البروتين إلى اللوحة المكونة من 96 بئرا بأكملها.
    1. استخدم أطراف ماصة جديدة لكل عمود من الآبار لمنع التلوث المتبادل.
    2. تأكد من ترك بئر واحد على الأقل فارغا بدون كواشف أو عينة مضافة لاستخدامها كقيمة امتصاص فارغة لقياس كمية البروتين.
  9. بمجرد إضافة كاشف مقايسة البروتين إلى جميع الآبار الضرورية ، قم بتغطية اللوحة المكونة من 96 بئرا بختم صفيحة من رقائق الألومنيوم.
  10. قم بتدوير اللوحة ذات 96 بئرا على أداة دوامة لمدة 1 دقيقة بسرعة متوسطة ، ثم احتضنها في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 5 دقائق قبل قراءة اللوحة.
  11. افحص لوحة 96 بئرا وختم رقائق الألومنيوم. إذا ظل الكاشف عالقا بختم رقائق الألومنيوم ، فضعه بتوازن مناسب داخل جهاز طرد مركزي.
    1. اضغط مع الاستمرار على الدوران السريع حتى يصل إلى حوالي 200 جم.
    2. أخرج اللوحة المكونة من 96 بئرا وافحص بصريا ختم رقائق الألومنيوم للتأكد من عدم بقاء سائل على الرقاقة.
  12. قم بإزالة ختم رقائق الألومنيوم ببطء وضع الغطاء الشفاف مرة أخرى على لوحة 96 بئرا (الشكل 2 ب).
  13. اقرأ لوحة 96 بئرا على مقياس الطيف الضوئي عند 660 نانومتر ، بعد السماح للتفاعل اللوني بالتطور لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: يتم قياس قراءات الامتصاص باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية / المرئية في درجة حرارة الغرفة. يعتمد اختبار البروتين 660 نانومتر على ارتباط مركب معدني صبغي خاص بالبروتين في الظروف الحمضية التي تسبب تحولا في الحد الأقصى لامتصاص الصبغة ، والذي يتم قياسه عند 660 نانومتر.
  14. استخدم قراءات الامتصاص للمعايير المعروفة لإنشاء المنحنى القياسي باستخدام برنامج الرسوم البيانية (الشكل 2C-E) ، والذي يتم تطبيقه بشكل أكبر لحساب تركيزات البروتين لجميع العينات.

4. هضم البروتين

أنذر. تأكد من اتباع بروتوكولات السلامة المناسبة عند العمل مع المواد الكيميائية الخطرة المستخدمة في البروتوكول أدناه. ارتدى موظفو المختبر معدات الحماية الشخصية (PPE) وأكملوا هذه الخطوات في غطاء دخان كيميائي. راجع جميع أوراق بيانات السلامة قبل العمل مع هذه المواد الكيميائية.

  1. قم بتسمية مجموعة جديدة من أنابيب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل مع معرفات العينات على غطاء الأنابيب وجانبها بالحبر الدائم. قم بتضمين أي معلومات أخرى ذات صلة.
    1. بناء على معادلة المنحنى القياسية ، وقراءات امتصاص العينة ، وعامل التخفيف ، تحسب تركيز البروتين لكل عينة بالميكروغرام لكل ميكرولتر (ميكروغرام / ميكرولتر). استخدم هذه القيمة لحساب الحجم المطلوب من محللة العينة التي تحتوي على 100 ميكروغرام من البروتين (الشكل 2C-E). انقل هذا الحجم المحسوب من محللة العينة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
  2. اصنع الحجم النهائي إلى 100 ميكرولتر باستخدام المخزن المؤقت للتحلل ؛ هذا هو حجم البداية المطلوب لبروتوكول الهضم.
    ملاحظة: يجب أن يساوي الحجم النهائي لعينة البروتين بالإضافة إلى المخزن المؤقت للتحلل 100 ميكرولتر.
  3. وفقا للأدبيات المنشورة سابقا ، استخدم 1.5 ميكرولتر من البلازما للهضم ، وهو ما يساوي تقريبا 100 ميكروغرام من البروتين.
  4. أضف 50 ميكرولتر من محلول الاختزال (10 ملي مولار ديثيوثريتول) إلى كل أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، وأغلق القمم ، وقم بالدوامة لفترة وجيزة لمدة 3 ثوان. ثم أضف 50 ميكرولتر من محلول الألكلة (30 ملي مولار يودو أسيتاميد) إلى كل عينة ، وأغلق القمم ، والدوامة لمدة 3 ثوان.
  5. احتضان العينات عند 95 درجة مئوية باستخدام كتلة حرارية لمدة 11 دقيقة لتقليل عينة البروتين وألكيلتها على التوالي. يؤدي هذا إلى شق جميع جسور ثاني كبريتيد وتغطيتها بمجموعة أسيتاميد ، مما يمنع إصلاحها ، وبالتالي يفسد البروتين إلى حالة مكشوفة بالكامل ويزيد من التعرض لمواقع هضم الببتيد.
  6. بعد الحضانة ، قم بإزالة العينات من كتلة الحرارة واتركها لتبرد حتى تصل إلى RT.
  7. أثناء انتظار تبرد العينات ، أعد تكوين مزيج البروتياز Trypsin / Lys-C المجفف بالتجميد (نسبة 1: 1 ، 50 ميكروغرام لكل منهما) باستخدام محلول إعادة تكوين الإنزيم عن طريق إضافة 515 ميكرولتر من السائل إلى قارورة واحدة من الكاشف الصلب ، أي 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر لكل منهما. تجنب ملامسة الجلد مباشرة لمحلول البروتياز وجميع الخطوات بعد ذلك ، لأن التربسين يمكن أن يكون مهيجا شديدا ومسببا للحساسية.
  8. بمجرد تبريد العينات إلى RT ، أضف 50 ميكرولتر من مزيج البروتياز التربسين / Lys-C المعاد تكوينه (2.5 ميكروغرام لكل منهما) إلى محلول عينة البروتين المخفض والأكيلة والدوامة لفترة وجيزة.
  9. احتضان على خلاط حراري عند 37 درجة مئوية واضبطه على 1000 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعات لهضم عينة البروتين.
    ملاحظة: يتم تضمين بروتياز Lys-C للمساعدة في شق أي مواقع مقاومة للهضم بواسطة التربسين ، بسبب تسلسل الأحماض الأمينية أو القابلة للطي (على سبيل المثال ، روابط Lys-Pro). هذا لا يقلل فقط من كل بروتين إلى العديد من الببتيدات المعروفة ذات الحجم الصغير بشكل معقول والشحنة الإجمالية ، ولكنه أيضا قابل للتكرار بدرجة كبيرة إذا تم اتباع نفس ظروف الهضم عن كثب. وقت الحضانة البالغ 3 ساعات أثناء الهضم هو الحد الأدنى من الوقت الذي نوصي به لضمان الانقسام الكامل لجميع البروتينات.
  10. بعد 3 ساعات من الحضانة ، أخرجه من الخلاط الحراري باستخدام زوج من الملقط لتجنب حروق الأصابع.
  11. أضف 50 ميكرولتر من محلول إيقاف الهضم (6٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك أو حمض الفورميك في الماء) إلى العينة والدوامة لفترة وجيزة.
    ملاحظة: هذا يمنع التفاعل ، لأن البروتياز لهما أقصى نشاط عند درجة حموضة محايدة 7-8.
  12. قم بتخزين العينات في ثلاجة -80 درجة مئوية لأن هذا يوقف أيضا أي نشاط متبقي للبروتياز هذه نقطة توقف آمنة.

5. تنظيف الببتيد وتجفيفه وإعادة التعليق

ملاحظة: يهدف هذا الإجراء بشكل أساسي إلى إزالة كواشف الهضم ، وخاصة الأملاح غير المتطايرة ، والتي يمكن أن تلحق الضرر بسهولة بأداة LC / MS-MS ، بالإضافة إلى المساعدة في عزل وتركيز الببتيدات المنتجة. يتم تنظيف الببتيد باستخدام أعمدة دوران تحلية مزودة بمجموعة ، والتي يتم تعبئتها مسبقا براتنج استبعاد الحجم (ترشيح الجل) الذي يلتقط الببتيدات في البداية ثم يسمح بغسل الأملاح بشكل خاص. النقل الكامل لكواشف المجموعة إلى أعمدة الدوران في غطاء الدخان الكيميائي ، لأنها تحتوي على مذيبات عضوية سامة.

أنذر. تأكد من اتباع إجراءات السلامة المناسبة ، بما في ذلك ارتداء معدات الوقاية الشخصية ولوائح احتواء النفايات الخطرة ، عند العمل مع المواد الكيميائية الخطرة في البروتوكول أدناه. أكمل هذه الخطوات في غطاء دخان كيميائي وراجع جميع أوراق بيانات السلامة قبل العمل مع هذه المواد الكيميائية.

  1. قم بإزالة العينات من الفريزر -80 درجة مئوية واترك العينات تأتي إلى RT.
  2. قم بإزالة الغطاء الأبيض الموجود أسفل عمود تنظيف الببتيد ، وفك الغطاء العلوي الأخضر ، وضعه في أنبوب تجميع سعة 2 مل.
  3. ضعها في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء ، واضغط على Start ، وجهاز الطرد المركزي عند 3000 جم لمدة دقيقتين لإزالة كل سائل التكييف قبل الشحن.
  4. تخلص من التدفق في حاوية نفايات خطرة وضع عمود تنظيف الببتيد في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل.
  5. قم بتسمية الأغطية الخضراء لعمود تنظيف الببتيد باستخدام معرفات العينات، باستخدام قلم تعليم الحبر الدائم.
  6. انقل برفق مستحضر هضم البروتين، الذي يبلغ حجمه حوالي 300 ميكرولتر، إلى عمود تنظيف الببتيد الجاف، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر (على سبيل المثال، 150 ميكرولتر مرتين).
    1. تأكد من عدم ملاحظة أي فقاعات في الجزء العلوي من راتنج عمود الدوران. إذا لوحظت فقاعات، فقم بإزالة الفقاعات عن طريق النقر برفق على العمود أو استخدام طرف ماصة نظيف سعة 10 ميكرولتر لتفريق الفقاعات (الفقاعات).
      ملاحظة: يمكن لفقاعات الهواء المحاصرة أن تعيق الانتقال السلس للعينة إلى الراتنج ، وبالتالي تؤثر سلبا على كفاءة تنظيف الببتيد وإنتاجه.
  7. ضعها في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء ، واضغط على Start وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة دقيقتين.
  8. تخلص من التدفق في حاوية نفايات خطرة وضع عمود تنظيف الببتيد في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل.
  9. أضف 300 ميكرولتر من محلول الغسيل A (ماء، 0.1٪ حمض ثلاثي فلورو أسيتيك / TFA) أعلى راتنج العمود، مرة أخرى باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    1. تأكد من عدم ملاحظة أي فقاعات في الجزء العلوي من راتنج عمود الدوران. إذا لوحظت فقاعات، فقم بإزالة الفقاعات عن طريق النقر برفق على العمود أو استخدم طرفا نظيفا من الماصة سعة 10 ميكرولتر لتفريق الفقاعات (الفقاعات).
  10. ضعها في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء ، واضغط على Start ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة دقيقتين.
  11. تخلص من التدفق في حاوية نفايات خطرة وضع عمود تنظيف الببتيد في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل.
  12. أضف 300 ميكرولتر من محلول الغسيل B (5٪ ميثانول ، 0.1٪ TFA) أعلى راتنج العمود ، مرة أخرى باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    1. تأكد من عدم ملاحظة أي فقاعات في الجزء العلوي من راتنج عمود الدوران. إذا لوحظت فقاعات، فقم بإزالة الفقاعات عن طريق النقر برفق على العمود أو استخدم طرف ماصة نظيف بسعة 10 ميكرولتر لتفريق الفقاعات (الفقاعات).
  13. ضعها في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء ، واضغط على Start وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة دقيقتين.
  14. تخلص من التدفق في حاوية نفايات خطرة وضع عمود تنظيف الببتيد في أنبوب تجميع جديد سعة 2 مل.
  15. كرر الخطوات 5.12-5.14 مرة أخرى حتى يتم غسل العمود مرتين باستخدام محلول الغسيل B.
  16. انقل عمود تنظيف الببتيد إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 2 مل.
    1. تأكد من أن أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل المستخدمة في هذه الخطوة هي أنابيب تجميع منخفضة ربط البروتين التي توفرها المجموعة.
    2. للحفاظ على الكمية المتاحة من أنابيب التجميع منخفضة البروتين ، استخدم الأنابيب المختبرية القياسية لخطوات الغسيل السابقة.
  17. أضف 300 ميكرولتر من محلول الشطف (50٪ أسيتونيتريل ، 0.1٪ TFA) أعلى راتنج العمود ، مرة أخرى باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
    1. تأكد من عدم ملاحظة أي فقاعات في الجزء العلوي من راتنج عمود الدوران. إذا لوحظت فقاعات، فقم بإزالة الفقاعات عن طريق النقر برفق على العمود أو استخدم طرفا نظيفا من الماصة سعة 10 ميكرولتر لتفريق الفقاعات (الفقاعات).
  18. ضعها في جهاز الطرد المركزي ، وأغلق الغطاء ، واضغط على Start ، وجهاز الطرد المركزي عند 1,500 جم لمدة 3 دقائق لجمع عينة الببتيد النظيفة في أنبوب التجميع الجديد منخفض البروتين 2 مل.
    1. إذا رغبت في ذلك ، انقل 125 ميكرولتر (حوالي النصف) من محلول الببتيد النظيف المملوء إلى قارورة زجاجية سعة 1 مل ، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر ، وقم بتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا الاختصار لاحقا لتحليل إضافي ، مثل وضع العلامات على علامة الكتلة الترادفية (TMT) للببتيدات ، كما هو الحال بواسطة مجموعة متوفرة تجاريا ، لقياس كمية أكثر دقة عبر العينات ، وخاصة المجموعات المعدة بشكل مستقل.
  19. قم بتخزين العينة المتبقية ، حوالي 175 ميكرولتر ، عند -30 درجة مئوية في أنابيب منخفضة البروتين 2 مل حتى تصبح جاهزة للمضي قدما في التجفيف وإعادة التكوين. هذه نقطة توقف آمنة.
  20. لتجفيف العينة ، قم بإذابة عينة الببتيد من -30 درجة مئوية إلى RT. إذا كنت تشرع في التجفيف وإعادة التكوين مباشرة بعد تنظيف الببتيد ، فتجاهل هذه الخطوة.
  21. افتح أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 2 مل وضعها في مكثف الطرد المركزي المفرغ.
    1. تأكد من موازنة مكثف الطرد المركزي الفراغي إذا تم تشغيل عدد غير متساو من العينات في نفس الوقت.
    2. أغلق غطاء مكثف جهاز الطرد المركزي الفراغي واضغط على Start.
    3. اسمح للعينات بالعمل على مكثف الطرد المركزي الفراغي لمدة 3 ساعات ، دون استخدام التدفئة.
    4. افحص الأنابيب بشكل دوري للتأكد من عدم وجود سائل متبقى بالداخل ، حيث يمكن أن يتداخل ذلك مع ارتباط الببتيدات بعمود الفصل لجهاز LC / MS-MS.
    5. إذا كان لا يزال السائل ملحوظا ، فاستمر في تدوير العينات لفترة إضافية.
    6. تحقق ما بين 30 دقيقة و 1 ساعة لمعرفة ما إذا كان السائل باقيا في الأنبوب.
      ملاحظة: تكون الببتيدات مستقرة للغاية أثناء هذه العملية لأنها في ظل ظروف فراغ ولن تتدهور بسبب فترة قصيرة من الجفاف أو الدفء المعتدل الناتج عن تشغيل مكثف الطرد المركزي الفراغي وحده.
  22. بمجرد أن تجف ، أعد تعليق العينة على الفور في 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ في ماء من الدرجة MS (على سبيل المثال ، 5 ميكرولتر من حمض الفورميك 100٪ في 5 مل من الماء).
    1. أضف 50 ميكرولتر من حمض الفورميك 0.1٪ إلى قاع أنبوب ربط البروتين منخفض البروتين 2 مل الذي يحتوي على عينة الببتيد المجفف ، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  23. أغلق الأغطية ، ثم دوامة لمدة 15 ثانية.
  24. انقل العينات المعاد تشكيلها إلى قوارير زجاجية سعة 1 مل ، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر.
  25. قم بتخزين القوارير الزجاجية التي تحتوي على العينات المعاد تشكيلها عند -30 درجة مئوية ، وقم بتحليلها من خلال النهج القائم على LC-MS / MS في أسرع وقت ممكن.
    ملاحظة: عينات الببتيد المجمدة مستقرة عند -30 درجة مئوية للتخزين قصير الأجل و -80 درجة مئوية للتخزين لفترة أطول.

6. الحصول على بيانات عينات الببتيد على جهاز UHPLC / MS-MS

أنذر. تأكد من اتباع بروتوكولات السلامة المناسبة عند العمل مع نظام مطياف الكتلة الترادفي الكروماتوغرافي السائل فائق الأداء / Orbitrap tribrid. ارتدى موظفو المختبر معدات الوقاية الشخصية وخضعوا لتدريب عملي رسمي على الأدوات التي قدمتها الشركة المصنعة UHPLC / MS-MS. التحذيرات الرئيسية هي التعامل السليم مع المراحل المتحركة للمذيبات الحمضية والعضوية ل UHPLC ومصدر التأين عالي الجهد ل MS.

  1. قم بإجراء عمليات فصل الببتيد باستخدام نظام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UHPLC). عمود LC عبارة عن مرحلة عكسية C18 قادرة على الرش الكهربائي ، تصميم الفصل السريع (RSLC) ، بأبعاد 2 ميكرومتر ، 100 Å ، 50 ميكرومتر × 15 سم ، كما يتم وضعه في الخط بعد عمود حماية مسبق من نفس المادة.
  2. استخدم المراحل المتنقلة التالية UHPLC: 0.1٪ حمض الفورميك في الماء (المذيب أ) ، 0.1٪ حمض الفورميك في الأسيتونيتريل (المذيب ب) ، و 0.1٪ حمض الفورميك في 90٪ ماء و 10٪ ميثانول (مذيب ج).
    ملاحظة: جميع المذيبات وكذلك حمض الفورميك المستخدمة لتحضير المراحل المتنقلة معتمدة من درجة LC / MS ويتم تصنيعها فقط حسب الحاجة. يحتوي UHPLC على وحدة ترشيح وتفريغ الغاز قبل المضخات ، لذلك لا يتم ترشيح المراحل المتحركة يدويا وتطهيرها من الهواء.
  3. قم بتعيين الحقن المبرمجة لإجمالي الببتيدات المحضرة لعينات البلازما والأنسجة عند 3 ميكرولتر في البداية ، وهو ما يعادل ~ 3 ميكروغرام من مادة الببتيد كما هو محدد من خلال كمية البروتين الأولية المستخدمة.
    ملاحظة: يجب أن ينتج عن ذلك شدة إشارة MS مثالية لتحديد البروتين القصوى. يمكن زيادة حجم الحقن إلى ما يصل إلى 15 ميكرولتر لتعزيز خرج الإشارة بشكل أكبر أو تقليله إلى أقل من 1 ميكرولتر إذا كان الحمل الزائد واضحا.
  4. حافظ على العمود وجهاز أخذ العينات التلقائي عند 40 درجة مئوية و 10 درجات مئوية على التوالي.
  5. اضبط معدل تدفق المذيبات للحصول على البروتينات عند ثابت 0.3 ميكرولتر / دقيقة ، باستخدام مضخات النانو UHPLC ، مع تدرج فصل خطي للماء (A) إلى أطوار متحركة من الأسيتونيتريل (B).
  6. قم بإجراء عمليات غسيل لحقنة الحقن وحلقة العينة (سعة 20 ميكرولتر) باستخدام المرحلة المتحركة للماء والميثانول (C) ، مع ضبط مضخة التحميل UHPLC في البداية على 5 ميكرولتر / دقيقة.
  7. أثناء فصل العينة لأكثر من 80 دقيقة إجمالا ، اضبط تدرج LC (المنحنيات الخطية) على النحو التالي: أولي - 5٪ ب ؛ 0-60 دقيقة - 32٪ ب ؛ 60-61 دقيقة - 95٪ ب ؛ 61-65 دقيقة - 95٪ ب ؛ 65-66 دقيقة - 2٪ ب ؛ و 66-80 دقيقة - 2٪ B. وبالمثل ، قم بتشغيل مضخة التحميل عند 100٪ ثابت من A ، ولكن اضبط معدل التدفق خطيا على النحو التالي: أولي - 5 ميكرولتر / دقيقة ؛ 0-5 دقيقة - 1 ميكرولتر / دقيقة ؛ 5-61 دقيقة - 5 ميكرولتر / دقيقة ؛ و 61-80 دقيقة - 5 ميكرولتر / دقيقة (الشكل 3 أ).
  8. حقن عينات الببتيد غير المعروفة كعمليات تشغيل مكررة متسلسلة.
  9. لمنع الترحيل ، قم بإجراء حقنتين فارغتين متسلسلتين على الأقل من حمض الفورميك 0.1٪ في الماء بين العينات باستخدام تدرج LC مقطوع (منحنيات خطية) على مدى 35 دقيقة إجمالا على النحو التالي: أولي - 5٪ B ؛ 0-23 دقيقة - 32٪ ب ؛ 23-24 دقيقة - 95٪ ب ؛ 24-30 دقيقة - 95٪ ب ؛ 30-31 دقيقة - 2٪ ب ؛ و 31-35 دقيقة - 2٪ ب (الشكل 3 ب).
    1. تأكد من بقاء إعدادات تدرج LC لمضخة التحميل دون تغيير.
    2. بالنسبة لعينات الببتيد التي تحتوي على مستويات عالية من الملوثات الداخلية ، مثل الكبد (مثل الأحماض الصفراوية) ، قم بتضمين فارغة ثالثة كل 3 إلى 5 عينات وفي نهاية المدى للمساعدة في تنظيف عمود LC. يتكون هذا من حقن 1 إلى 2 ميكرولتر من المحلول يحتوي على 25٪ من كل من الأسيتونيتريل والأيزوبروبانول والميثانول والماء.
    3. بدلا من ذلك ، أو بالاشتراك مع الخطوة المذكورة أعلاه ، قم بإجراء تغيير النسبة المئوية لتدرج LC المحسن (أي التأرجح) على مدى 35 دقيقة إجمالا كغسل للنظام على النحو التالي: الأولي - 2٪ B ؛ 0-3 دقائق - 2٪ ب ؛ 3-4 دقائق - 95٪ ب ؛ 4-10 دقائق - 95٪ ب ؛ 10-11 دقيقة - 2٪ ب ؛ و 11-15 دقيقة - 2٪ ب ؛ 15-16 دقيقة - 95٪ ب ؛ 16-20 دقيقة - 95٪ ب ؛ 20-21 دقيقة - 2٪ ب ؛ 21-25 دقيقة - 2٪ ب ؛ 25-26 دقيقة - 95٪ ب ؛ 26-30 دقيقة - 95٪ ب ؛ 30-31 دقيقة - 2٪ ب ؛ و 31-35 دقيقة - 2٪ ب (الشكل 3 ج).
  10. قم بإجراء الكشف عن الببتيدات ، أي الكتل الجزيئية المقابلة ، حيث يتم فصلها عن طريق عمود LC وإزالتها ، باستخدام نظام مطياف الكتلة رباعي الأقطاب الترادفي Orbitrap ومزيج من مصيدة الأيونات (MS-MS).
    1. قبل إجراء عمليات تشغيل العينة، قم بتوصيل عمود LC مباشرة بوجه مصدر تأين الرش النانوي (NSI) القابل للتبديل لأداة MS، والذي يقع في الزاوية الأمامية العلوية اليسرى من الجهاز.
      ملاحظة: يعرض هذا إبرة الرش الكهربائي المدمجة لعمود LC التي توفر الببتيدات ، كما هي معلقة داخل قطرات دقيقة مشحونة من مذيب الطور المتحرك LC ، في مدخل أنبوب نقل الأيونات الخاص بالكاشف.
    2. أيضا ، لتحسين كفاءة تطاير الرش الكهربائي ، قم بتشغيل وحدة التسخين المدمجة لمصدر NSI واضبطها على 40 درجة مئوية.
  11. أيضا ، قبل تشغيل العينة ، تحقق من وجود مدخلات خارجية مرضية من النيتروجين المضغوط وغاز الهيليوم في أداة MS. حقق ذلك باستخدام خزانات أسطوانة فولاذية بدرجة نقاء عالية للغاية ، بحجم 300 لكل غاز ، والتي تحتوي على مقاييس المنظم مضبوطة عند ضغوط تدفق ثابتة تبلغ 60 و 40 رطل لكل بوصة مربعة ، على التوالي.
  12. إذا أصدرت أداة MS تحذيرات حول عدم استقرار مدخلات غاز النيتروجين ، فقم برفع الضغط إلى 100 رطل لكل بوصة مربعة كحد أقصى. تأكد من أن الخزانات ممتلئة بنسبة 10-20٪ على الأقل ، وهي قراءة لمقياس الصمام العلوي ~ 250-500 رطل لكل بوصة مربعة ؛ وإذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتغييرها إلى أخرى جديدة. ينطوي الانخفاض إلى أقل من 10٪ من السعة الكاملة على خطر سحب الملوثات إلى أداة MS ، والتي يمكن أن تستقر في قاع خزانات الغاز.
  13. قم بعمل طريقة مطياف الكتلة مسبقا باستخدام قالب مقدم من برنامج التحكم مصمم للكشف الأمثل عن الببتيدات وتعديلاتها بعد الترجمة (الشكل 3D-H) ، وأدخل الشروط القياسية التالية:
    1. اضبط فترة الاكتشاف الإجمالية على 80 دقيقة.
    2. اضبط وضع الكشف العام على الببتيدات.
    3. اضبط مصدر NSI على الوضع الموجب (أي شحنة أيونات الببتيد).
    4. اضبط جهد إبرة الرش النانوي على 2000 فولت واحتفظ به ثابتا.
    5. اضبط مدخلات غاز النيتروجين على NSI واضبط أجهزة الكشف على ثابتة.
    6. اضبط درجة حرارة أنبوب نقل الأيونات على 275 درجة مئوية.
    7. الكشف عن كتل الببتيدات الكاملة (أي الأيونات الأم. MS1) عن طريق ضبط نطاق المسح الضوئي على 350-2000 م / ز ، وعدسة RF على 30٪ ، والحد الأقصى لوقت الحقن على تلقائي ، ومحلل كتلة orbitrap بدقة 120,000.
      ملاحظة: لا يتم استخدام قدرة المصيدة الأيونية البديلة للأداة هنا لفحص كتل الببتيد ، لأنها أقل حساسية لمراقبة هذا النوع من الجزيئات مقارنة بالمدار الكهربائي.
    8. اضبط المرشحات الأيونية للتمييز بين تلك الببتيدات التي لها حالات شحن متعددة في نطاق 2-7. يسمح هذا للأداة ، أثناء تسجيل البيانات ، بتحويل نسب الكتلة على الشحنة المكتشفة بطبيعتها (m / z) للجزيئات تلقائيا إلى كتلها الدقيقة. وبالمثل ، فإن الببتيد ذو حالة شحنة واحدة فقط (m / z = 1) لا يتطلب أي عامل تحويل للحصول على كتلته الدقيقة.
    9. اضبط بوابات الاستبعاد الديناميكي للأيونات على تمرير واحد لمدة 60 ثانية ، وتحمل كتلة ±10 جزء في المليون ، وإسقاط أي جزيئات بها ذرات نظائر طبيعية موجودة (على سبيل المثال ، 14درجة مئوية).
    10. الكشف عن كتل شظايا تأكيد الهوية التي تم إنشاؤها للببتيدات (أي أيونات الابنة. MS2) عن طريق ضبط الأداة على الاستحواذ المعتمد على البيانات (وضع DDA).
    11. التقط الببتيدات بأكملها (أي الأيونات الأصلية) عن طريق عزل رباعي الأقطاب ، باستخدام إعداد لنافذة تحمل التباين الكتلي ل m / z = 1.6.
    12. قم بإجراء تجزئة الببتيدات الملتقطة عن طريق ضبط وضع تأثير الإلكترون على HCD (أي التفكك التصادمي عالي الطاقة باستخدام غاز النيتروجين والهيليوم كعامل نقل الإلكترون) ، وطاقة التصادم إلى 30٪ ، ونطاق المسح إلى تلقائي ، والحد الأقصى لوقت الحقن إلى تلقائي ، ومحلل كتلة Orbitrap بدقة 30,000.
    13. احصل على البيانات النهائية (أيونات MS1 و MS2) عن طريق ضبط شكل ذروة الإشارة على تنسيق النقطة الوسطى.
  14. حافظ على تحديدات دقيقة للكتلة للببتيدات المكتشفة عن طريق معايرة الجهاز بشكل روتيني ، عادة قبل كل تشغيل دفعة عينة ، كما هو موضح أدناه.
    1. ضع جهاز MS في حالة إيقاف تشغيل مصدر الأيونات، باستخدام برنامج التحكم، وقم بإيقاف تشغيل مصدر NSI إلى مصدر تأين الرش الكهربائي (HESI) البديل للجهاز. هذا هو المصدر المستخدم للتطبيقات التي يمكن أن تتطلب أحجام كبيرة جدا من حقن العينات ومعدل تدفق مرتفع مقابل (1-2500 ميكرولتر / دقيقة) لمضخة LC ، على سبيل المثال ، تجارب التمثيل الغذائي والحركية الدوائية للأدوية.
    2. حدد خيار فحص المعايرة الكامل في برنامج التحكم.
    3. املأ حقنة زجاجية سعة 500 ميكرولتر تحتوي على مكبس مطلي بالتفلون وإبرة حادة من الفولاذ المقاوم للصدأ بمحلول قياسي MS متاح تجاريا ، ثم قم بتوصيل خط الأنبوب الشعري PTFE بمصدر HSEI (أثناء إيقاف التشغيل).
      ملاحظة: يحتوي المعيار المستخدم هنا على مزيج من الجزيئات الطبيعية والاصطناعية (إجمالي 16 ، على سبيل المثال ، الكافيين) التي تمتد على نطاق كتلي من m / z = 50-2800 وتغطي مجموعة واسعة من أنواع الروابط الكيميائية المحتملة ، خاصة تلك المرتبطة بالببتيدات (على سبيل المثال ، مجموعات الأميد).
    4. ابدأ ضخا ثابتا لمعيار MS في مصدر HSEI (أثناء التشغيل) ، باستخدام معدل 3-5 ميكرولتر / دقيقة كما هو الحال باستخدام مضخة حقنة. بمجرد ملاحظة نمط ثابت من القمم القياسية في نافذة العرض المباشر لبرنامج التحكم ، قم بتنشيط فحص المعايرة التلقائي.
      ملاحظة: إذا لم يتم العثور على مشكلات في حساسية ودقة تحديدات الكتلة للمعيار ، فإن المعايرة الكاملة الناجحة تستغرق عادة ما < 40 دقيقة. وبالمثل ، فقط إذا اجتاز الجهاز جميع معلمات أجهزة MS التي تم فحصها ، فإنه يعتبر موثوقا به لتشغيل العينات.
    5. تأكد من نجاح المعايرة عن طريق إعادة إعداد مصدر NSI وعمود LC ، ثم تشغيل محلول قياسي من الإنسان [Glu 1] -Fibrinopeptide B (Glu-Fib) بإجمالي كميات محقونة تغطي 1-10 نانوغرام (على سبيل المثال ، 1 و 2 و 6 و 10 نانوغرام). استخدم نفس طرق فصل LC واكتشاف MS مثل تلك الموضحة أعلاه للعينات غير المعروفة.
    6. تحقق من معيار Glu-Fib لوقت الاحتفاظ المناسب ل LC (~ 20 دقيقة) ، ووجود أيونات MS1 و MS2 (م / ز = 1285.54 ، 813.39 ، 785.84 ، 445.12 ، 333.19 ، و 175.12) ، وخطية زيادة مناطق الذروة مع الكمية المحقونة.
    7. ثم قم بإنشاء جداول تسلسل ، باستخدام برنامج التحكم والتقاط البيانات ، لتشغيل الببتيد غير المعروف والعينات الفارغة التي تحتوي على أعمدة لإدخال نوع العينة واسم الملف ومعرف العينة ومسار البيانات وطريقة أداة LC / MS وموضع القارورة وحجم الحقن (الشكل 3D-E).
    8. احفظ ملفات بيانات MS الناتجة (الامتداد: RAW ؛ 500 - 800 جيجابايت لكل منهما) في مجلد المسار المعين على القرص الصلب لجهاز الكمبيوتر ثم انقل هذه الملفات إلى كمبيوتر محطة عمل قوي بما يكفي لتشغيل برنامج المعلوماتية الحيوية ، كما هو موضح لاحقا ، والذي يحول البيانات الطيفية لكتلة الببتيد الواسعة والمعقدة للغاية (أي إشارات MS1 و MS2) إلى ملفات تعريف تكوين البروتين الإجمالية المقابلة.

7. تحويل بيانات التصلب العصبي المتعدد الخام إلى نتائج تمثيلية إجمالية للبروتين

ملاحظة: تتم معالجة بيانات التصلب العصبي المتعدد الخام التي تم التقاطها لعينات الببتيد في ملفات تعريف تكوين البروتين الكلي (البروتين) ، باستخدام برنامج المعلوماتية الحيوية. باختصار ، يعيد برنامج المعلوماتية الحيوية بناء البروتينات الأصلية في العينة عن طريق مطابقة بيانات التصلب العصبي المتعدد الخام مع أطياف الببتيد MS1 و MS2 المعروفة الموجودة في مكتبة مرجعية للبروتينات الخاصة بالأنواع المستندة إلى الويب ، من خلال تغطية واسعة وفريدة من نوعها لتسلسل الأحماض الأمينية للبروتين. يتم تحديد الوفرة النسبية لكل بروتين محدد بواسطة البرنامج باستخدام شدة إشارة MS1 للببتيدات الفريدة المتطابقة. يمكن مقارنة الوفرة المحددة بشكل موثوق عبر العينات ، ولكن فقط إذا تم تشغيلها ضمن نفس دفعة التحضير وباستخدام إعدادات LC و MS متطابقة. خلاف ذلك ، يجب استخدام التقنيات الكمية المطلقة المذكورة سابقا بناء على عمليات استرداد أيونات المعيار / المراسل الداخلية ، مثل وضع العلامات الانتقائية على TMT للببتيدات داخل كل عينة.

  1. قم بتنزيل الملف المرجعي للبروتين على القرص الصلب لكمبيوتر محطة العمل من المكتبة المستندة إلى الويب.
    1. ابحث عن هذا باستخدام قاعدة البيانات الموجودة على موقع Uniprot للأنواع النموذجية ذات الأهمية (على سبيل المثال ، القوارض / Mustela furo). وهذا ما يسمى ملف FASTA. استخدم أداة البحث Proteomes وطريقة عرض Table لتحديد موقع الملف المرجعي للبروتئوم ثم تنزيله.
    2. لزيادة العدد المحتمل لتعريفات البروتين التي تم إنشاؤها ، حدد كلا من إدخالات اللجنة التي تمت مراجعتها من قبل الأقران (Swiss-Prot) وغير المنقعة (TrEMBL) إلى قاعدة بيانات Uniprot عند إنشاء ملف FASTA. وبالمثل ، حدد خيار تضمين جميع الأشكال الإسوية التي تمت مراجعتها للبروتينات.
  2. افتح برنامج المعلوماتية الحيوية ، أي Proteome Discoverer ، إلى علامة التبويب صفحة البداية ، ثم حدد علامة التبويب الإدارة .
  3. انتقل إلى علامة التبويب الفرعية الحفاظ على ملفات FASTA ثم قم بتنزيل ملف FASTA الخاص بالأنواع أعلاه الذي تم إنشاؤه لتجاربك في البرنامج.
  4. ارجع إلى علامة التبويب صفحة البدء وانقر فوق دراسة / تحليل جديد ، وفي مربع الحوار ، اكتب اسم دراسة في حقل اسم الدراسة وحدد مجلد ملف لحفظ الدراسة في حقل دليل جذر الدراسة .
  5. اترك حقلي سير عمل المعالجة وسير عمل الإجماع فارغين في الوقت الحالي، حيث سيتم تحديدهما لاحقا.
  6. انقر فوق موافق للحفظ وترك مربع الحوار ، والذي سيظهر بعد ذلك صفحة تعريف الدراسة .
  7. انتقل إلى علامة التبويب تعريف الدراسة واكتب تفاصيل المشروع في مربع وصف الدراسة الموجود على الجانب الأوسط الأيسر.
  8. انتقل إلى ملف ملفات الإدخال علامة التبويب وانقر فوق إضافة ملفات.
    1. سيؤدي هذا إلى إظهار مربع حوار يمكن من خلاله تحديد نتائج ملفات البيانات الأولية المطلوبة المراد معالجتها في ملف تعريف تكوين البروتين الكلي (البروتين) وتنزيلها من القرص الصلب للكمبيوتر.
  9. انقر فوق ملفات بيانات MS الأولية المدرجة الآن ضمن علامة التبويب ملفات الإدخال ، والتي يمكن تحديدها وتمييزها بشكل فردي أو كلها مرة واحدة.
  10. اسحبها وأفلتها في قسم ملفات التحليل في مربع التحليل الموجود على الجانب الأوسط الأيمن كجزء من المربع الفرعي خطوة المعالجة .
  11. انتقل إلى علامة التبويب مهام سير العمل وانقر فوق تحرير ، والذي يوجد بجوار رأس خطوة المعالجة في مربع التحليل الموجود على الجانب الأوسط الأيمن.
  12. انقر فوق Open Common ومن مجلد ProcessingWF_Tribrid ، حدد ملف سير عمل المعالجة المخصص خصيصا للتعريفات الفرعية للبروتين الفوسفو ، كما تم الحصول عليه ضمن اكتشاف مرض التصلب العصبي المتعدد القائم على تجزئة HCD (الشكل 4 أ).
    ملاحظة: سيظهر مخطط خطوة معالجة يحتوي على عقد قابلة للتحرير في المربع شجرة سير العمل . ستكون هناك عقدتان، كما هو موضح أدناه، تم تمييزهما بعلامات تعجب تشير إلى وجود إدخال مطلوب للمعلومات الخاصة بالتجربة من قبل المستخدم.
  13. في الرسم التخطيطي لشجرة سير عمل المعالجة ، انقر فوق عقدة Spectrum Files RC وافتحها.
    1. في فئة معلمات ملفات الطيف RC ، ابحث عن ملف FASTA ، الذي تم إنشاؤه مسبقا باستخدام موقع Uniprot ، وحدد ضمن معلمة قاعدة بيانات البروتين ، للمكتبة المرجعية الخاصة بالأنواع لأطياف الببتيد MS التي سيتم البحث عنها لتحديد البروتينات ذات الأهمية التجريبية.
  14. انقر فوق عقدة Sequest HT وافتحها وقم بإجراء التغييرات الثلاثة التالية:
    1. ضمن المعلمة Protein Database ، حدد ملف FASTA نفسه، كما هو موضح أعلاه.
    2. ضمن معلمة اسم الإنزيم ، حدد التربسين (الكامل) أو بدلا من ذلك Lys-C ، وهي البروتياز الرئيسي والاحتياطي المستخدم لتحضير هضم الببتيد الأصلي.
    3. ضمن المعلمة التعديلات الديناميكية ، تأكد من تحديد Phospho / +79.966 Da (S، T، Y) على الأقل.
      1. استخدم الإعداد الأخير للكشف عن الببتيدات المرتبطة بالبروتينات التي يتم تعديلها بعد الترجمة عن طريق الفسفرة ، من خلال البحث عن خسائر أطياف التصلب العصبي المتعدد المقابلة لمجموعة (مجموعات) الفوسفات (م / ز = 79.97).
      2. ابحث عن مواقع الأحماض الأمينية التي يشغلها الفوسفات (مثل سيرين أو ثريونين أو تيروزين) من خلال التعديلات المتوقعة في أنماط تجزئة MS2.
      3. أضف تعديلات أخرى بعد الترجمة للبروتين ذات الاهتمام الروتيني بنفس الطريقة إلى عقدة Sequest HT في هذه المرحلة ، على سبيل المثال ، المثيلة ، الأستلة ، الغزل ، الغزل ، إذا كان فقدان الكتلة الدقيق للمجموعات ذات الصلة معروفا. وبالمثل ، قم بتوسيع البحث عن مواقع الفسفرة إلى الأحماض الأمينية الأخرى الأقل شيوعا ، على سبيل المثال ، الهيستيدين.
        ملاحظة: العقدتان Spectrum Files RC و Sequest HT لشجرة سير العمل لخطوة المعالجة هما العقدتان الوحيدتان اللتان يتطلبان ضبط أي معلمات.
    4. اترك الباقي كإعدادات افتراضية ، حيث تم تحسينها بالفعل من قبل الشركة المصنعة لإنتاج أكبر عدد من معرفات البروتين المعينة ذات الأهمية. وبالمثل، ينطبق هذا على كافة العقد الأخرى في شجرة سير العمل.
    5. تأكد من تضمين عقد Percolator وIMP-ptmRS في نهاية شجرة سير العمل.
      ملاحظة: يستخدم Percolator تركيبات تكرارية لتحسين النتائج النهائية بشكل كبير. يعد IMP-ptmRS ضروريا للإبلاغ عن التحديد المناسب وتوطين الموقع لجميع تعديلات البروتين بعد الترجمة ، بما في ذلك تعديلات الفسفرة.
  15. ارجع إلى علامة التبويب مهام سير العمل وانقر فوق تحرير موجود بجوار رأس خطوة الإجماع في مربع التحليل الموجود في الجانب العلوي الأيمن. سيؤدي هذا إلى إظهار الرسم التخطيطي لشجرة سير العمل لخطوة الإجماع.
  16. انقر فوق Open Common ومن مجلد ConsensusWF حدد ملف سير عمل الإجماع الذي سينتج تنسيق الإخراج المطلوب لنتائج ملف تعريف تكوين البروتين (البروتين) (الشكل 4 ب).
    ملاحظة: سيتم فتح مخطط خطوة الإجماع الذي يحتوي على عقد قابلة للتحرير في المربع شجرة سير العمل . يتم إنشاء الرسم البياني المستخدم لمعالجة البيانات عن طريق تعديل سير عمل الإجماع الأساسي، حيث تمت إضافة عقد مخطط الميزات وعقد قياس كمية أيونات السلائف المضمنة كفرع من عقدة ملفات MSF الأولية، لتسهيل القياس الكمي للوفرة النسبية للبروتين. في حين أن جميع العقد في سير العمل تحتوي بالفعل على معلمات محسنة تم إنشاؤها بواسطة الشركة المصنعة ، إلا أن بعضها يحتوي على إدخالات مهمة جدا للتحقق مرة أخرى من الاختيار الصحيح كما هو موضح أدناه.
  17. في الرسم التخطيطي لشجرة سير العمل ، انقر فوق عقدة Precursor Ions Quantifier وافتحها. هذه هي العقدة الضرورية لقياس الوفرة النسبية لكل بروتين محدد.
    1. ضمن فئة إعدادات القياس الكمي العامة ، ابحث عن خيار Unique + Razor وحدد ضمن المعلمة Peptides to Use.
      ملاحظة: الببتيدات الفريدة هي تلك التي تحتوي على تسلسل الأحماض الأمينية الحصرية لبروتين واحد. وبالتالي ، يتم استخدامها لتحديد مقدارها على وجه التحديد بناء على شدة إشارة MS. الببتيدات الحلاقة هي تلك المشتركة بين مجموعات البروتينات. وبالتالي ، تستخدم لسحب الوفرة النسبية المحسوبة إلى الاتفاق.
    2. ضمن فئة التسوية والتحجيم ، قم بتغيير كل من معلمات وضع التسوية ووضع التحجيم إلى خيار لا شيء ، حيث أن هذا النوع من الضبط مقيد للغاية للتطبيق الموثوق به عبر البروتين بأكمله.
      ملاحظة: يتم تنشيط هذه الإعدادات فقط عندما يكون مطلوبا تطبيع الوفرة النسبية المحسوبة للبروتينات المختارة ذات الأهمية مقابل تلك الجوهرية بشكل ثابت في الخلية ، على سبيل المثال ، جينات التدبير المنزلي ، ثم التعبير عن القيم الناتجة كنسبة متدرجة.
    3. بعد ذلك ، انقر فوق عقدة مرشح الببتيد والبروتين وافتحها وتحت فئة مرشحات الببتيد ، قم بتغيير ثقة الببتيد على الأقل وحافظ على معلمات PSM ذات الثقة المنخفضة إلى الخيارين المرتفع والخاطئ ، على التوالي. هذا يحدد تطابقات الببتيد المستخدمة في تحديد البروتين إلى أعلى مستوى من أهمية الملاءمة (أي ≥ 95٪).
      ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن ضبط المعلمة الأولى على Medium لتخفيف صرامة مباريات الببتيد وبالتالي زيادة إنتاج ضربات البروتين بشكل كبير. لكن هذا يؤدي على العكس من ذلك إلى خطر كبير جدا لتوليد العديد من التعريفات الخاطئة. وبالمثل ، لا ينبغي أبدا استخدام قيمة "منخفضة" كخيار مقبول لكلتا المعلمتين.
    4. هذه هي العقد الوحيدة لخطوة الإجماع التي تحتاج إلى تعديل المعلمات ، واترك الباقي باستخدام إعداداتها الافتراضية.
      ملاحظة: بشكل عام ، يتعامل سير عمل خطوة الإجماع مع جميع التحليلات اللاحقة ، أي تحديد الوفرة النسبية للبروتين ، وثقات تحديد الهوية (على سبيل المثال ، معدلات الاكتشاف الخاطئة ودرجات المطابقة الطيفية للببتيد) ، وتغطية الببتيد المعينة. وتقدم أيضا إحصاءات النتائج وتوزيعات البيانات كجداول نهائية.
  18. بمجرد وضع مهام سير عمل خطوة المعالجة والإجماع أعلاه ، احفظ الدراسة بأكملها ثم انقر فوق أيقونة التشغيل (التروس) الموجودة أعلى مربع التحليل . إذا تمت معالجة ملفات بيانات MS الأولية المتعددة في وقت واحد ، فقبل بدء تشغيل المعالجة ، انقر فوق وحدد أيقونة By File القريبة (مربع).
    ملاحظة: تستغرق معالجة ملف بيانات خام واحد من MS في ملف نتيجة إجمالي للبروتين عادة من 20 إلى 40 دقيقة ، ولكن يمكن أن تنتج قائمة قيد التشغيل تضم عدة آلاف من تعريفات البروتين التي تتراوح من تطابقات الثقة المنخفضة والمتوسطة إلى العالية (أي مع ترجيح نحو الضربات العالية) ، جنبا إلى جنب مع تعديلات الفوسفات الموجودة داخل كل كيان (الشكل 4 ج). معلمات إخراج النتيجة الرئيسية للبروتينات المحددة هي FDR (الثقة) ، Master (إذا تمت مراجعة ملف / مكتبة FASTA) ، والانضمام # ، والوصف ، والتغطية٪ ، وتغطية التسلسل ، والتطابقات الطيفية للببتيد (على سبيل المثال ، عدد الببتيدات الفريدة) ، والخصائص الفيزيائية (على سبيل المثال ، MW في kDa) ، والوفرة النسبية ، والتعديلات (أي مجموعات الفسفرة).
    1. يرتب العمود إجمالي نتائج البروتين بترتيب تصاعدي أو تنازلي أو تمت تصفيتها بالكامل ، باستخدام أيقونة القمع على شريط الأدوات (الشكل 4 ج) ، وفقا للاهتمامات البحثية ، على سبيل المثال ، إظهار فقط أولئك الذين لديهم تحديد ثقة عالية (بروتين FDR) أو درجة عالية من مطابقة الببتيد (على سبيل المثال ، حسب التغطية ٪ و / أو عدد الفريد الموجود).
    2. إذا كانت معلومات التعديل اللاحق مطلوبة على وجه التحديد ، فقم بتصفية البروتينات المحددة التي تحتوي على الفسفرة لمزيد من التحليل.
    3. احفظ النتائج التي تمت تصفيتها ، دون تغيير اسم الملف ، حيث يمكن استعادتها إلى الإخراج الأصلي ببساطة عن طريق إزالة المرشحات المطبقة وتحديث النافذة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تصور نتائج البروتين الإجمالية عن طريق المعالجة الاختيارية في مخططات البركانية
يمكن البحث بسهولة عن إجمالي نتائج البروتين لكل عينة عن طريق الانضمام # أو الوصف لبروتينات معينة ذات أهمية بحثية ويتم حساب متوسط الوفرة النسبية المرتبطة بها ثم مقارنتها بين مجموعات العلاج بحثا عن اختلافات كبيرة (على سبيل المثال ، كما هو الحال عن طريق قيم p المشتقة من اختبار t). بدلا من ذلك ، قد يكون من المفيد استكشافي كبير البحث عن التغييرات العالمية عبر البروتينات بأكملها ، بما في ذلك أي بروتينات فوسفو ، يتم مشاركتها بالكامل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

استخدمت الطريقة المذكورة أعلاه الأنسجة التي تم تجميدها في النيتروجين السائل لوقف جميع الأنشطة البيولوجية على الفور قبل نقلها إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. بمجرد جمع جميع العينات ، حدث تجانس الأنسجة. أثناء التجانس ، من الأهمية بمكان الحفاظ على برودة جميع الأنسجة والأدوات لمنع إعادة تنشيط البروتينات أو تدهورها. أيضا ، أثناء الاستخراج الأولي للبروتين من الأنسجة المتجانسة ، يتم الاحتفاظ بالعينات باردة لمنع فقدان نشاط البروتين أو تدهور البروتين. استخدمنا هذه المنهجية لتوضيح التغيرات ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا المشروع جزئيا من خلال التعيين في برنامج الزمالة التابع للمجلس الوطني للبحوث الذي يديره مكتب الزمالات التابع للأكاديميات الوطنية للعلوم والهندسة والطب ، وبرنامج معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم في معهد والتر ريد للبحوث العسكرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم فحص البروتين 660 نانومتربيرس / ثيرمو ساينتفيك22662بالنسبة ل BCA لتحديد تركيزات البروتين في العينات ، يحتوي على كاشف فحص البروتين Pierce 660nm ومعايير فحص البروتين المخفف مسبقا
أسيتونيتريل ، درجة Optima LC / MSثيرمو فيشر العلمي047138.K2أسيتونيتريل فائق النقاء يستخدم في الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي
رقائق الألومنيوم لوحة الختمبيكمان كولتر538619الختم المستخدم أثناء تطوير لوحة فحص البروتين
BioTek Synergy Neo2 قارئ متعدد الأوضاع / مطياف UV-Visأجيلينتhttps://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195أداة قارئ لوحة الطيف الضوئي / المقايسة المستخدمة لإكمال قراءات الامتصاص 660 نانومتر لتحديد تركيزات البروتين   ؛
حل تدفق أداة ChromaCare LC-MSثيرمو فيشر العلميT111101000محلول يحتوي على 25٪ من كل من الأسيتونيتريل والأيزوبروبرانول والميثانول واستخدام المياه للمساعدة في تنظيف نظام LC بعد تشغيل العينات
أنبوب CK28 Precellysبيرتين كورب / تكنولوجيزP000911LYSK0A.0يتم وضع الأنسجة المتجانسة في هذه الأنابيب لتحلل الأنسجة وعزل البروتين باستخدام أداة Precellyis. هذه هي الأنابيب التي يستخدمها مختبرنا والمشار إليها في البروتوكول باسم "أنابيب التجانس".
برجد الأرجلبروكس / أزينتا لايف ساينسزhttps://www.azenta.com/products/cryopod-carrierالحاوية المستخدمة لحمل النيتروجين السائل لتبريد الملاط أثناء تجانس تيسوس
مجموعة إعدادية عينة EasyPep Mini MSثيرمو فيشر العلميأ40006يمكن لمجموعة واحدة معالجة 20 عينة ، وتشمل المحتويات محلول التحلل لاستخراج البروتين ، ونوكلياز عالمي مكمل في محلول الاستخراج ، والمواد اللازمة للخطوتين 1.4 و 1.5
عمود EASY-Spray C18 LC (15 سم لتر ، 50 µ ؛ م ضياء, و 2 µ حجم الجسيمات M)ثيرمو فيشر العلميطراز ES901عمود LC الكهربائي المستخدم لفصل الببتيدات قبل اكتشاف مرض التصلب العصبي المتعدد
حل معايرة FlexMixبيرس / ثيرمو ساينتفيكأ39239مزيج من 16 جزيئا قياسيا يستخدم لمعايرة دقة الكاشف وحساسية جهاز MS قبل تشغيل العينة
حمض الفورميك ، درجة LC / MSثيرمو فيشر العلمي85178حمض الفورميك فائق النقاء يستخدم لتصفية جميع محاليل وعينات LC بتركيز نهائي قدره 0.1٪ (حجم/حجم)
أوقف البروتياز & كوكتيل مثبط الفوسفوتاز للاستخدام مرة واحدة (100x)ثيرمو فيشر العلمي78442مكمل في المخزن المؤقت للاستخراج لمنع تدهور البروتينات والبروتينات الفوسفوية في العينة
الميثانول ، درجة Optima LC / MSثيرمو فيشر العلمي047192.K2ميثانول فائق النقاء يستخدم في الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي
ملاط بورسلين، 150 ملثيرمو فيشر العلميFB961 جسعة 150 مل ، تستخدم لتجانس أنسجة النمس الأصغر (أي الدماغ)
ملاط البورسلين، 275 ملثيرمو فيشر العلميFB961Dسعة 275 مل ، تستخدم لتجانس أنسجة النمس الكبيرة (مثل الكبد)
ملاط بورسلين، 50 ملثيرمو فيشر العلميإف بي 961 أسعة 50 مل ، تستخدم لتجانس أنسجة الفئران
بورسلين بيستل، 50 ملثيرمو فيشر العلميإف بي 961كللاستخدام مع ملاط 50 مل
مدقة بورسلين، 150 ملثيرمو فيشر العلميإف بي 961مللاستخدام مع ملاط 150 مل
مدقة بورسلين، 275 ملثيرمو فيشر العلميإف بي 961 نللاستخدام مع ملاط 275 مل
بريسيليسبيرتين كورب / تكنولوجيزhttps://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/أداة تستخدم لتجانس عينات الأنسجة. تم استخدام الإعدادات التالية: 4500 دورة في الدقيقة ، 2 × 30 ثانية لكل دورة ، 30 ثانية وقفة.
كاشف فحص البروتينبيرس / ثيرمو ساينتفيك22662كاشف فحص البروتين المستخدم في الخطوات 3.4 – 3.8
مكتشف البروتينثيرمو فيشر العلميCSW0064764برنامج المعلوماتية الحيوية لتحليل بيانات البروتينات / الفوسفوبروتيوميات
قوارير حقن LC ذات غطاء لولبي SureSTART MSCERT (0.02 – سعة 1.5 مل)ثيرمو فيشر العلمي6PMCK39TRقوارير زجاجية عالية الغطاء اللولبي (PTFE ، الحاجز المسبق للشق) المستخدمة لاحتواء عينات للحقن على أداة LC / MS   ؛    
نظام Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC / MS)ثيرمو فيشر العلميخطاب الاعتماد: مخفضة / MS: FETD2-10002 ، بناء على طلب خاصأداة الكروماتوغرافيا السائلة / مطياف الكتلة (LC / MS) عالية الضبط تستخدم لفصل ثم اكتشاف الببتيدات في العينات بالوزن الجزيئي
نوكلياز عالمي لتحلل الخلايا ، 100 كيلو وحدة ، 400 وميكرو ؛ Lبيرس / ثيرمو ساينتفيك88702تم شراء نوكلياز عالمي إضافي   ؛
Vacufuge Plusإيبندورفhttps://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748مكنسة كهربائية تستخدم لتجفيف عينات الببتيد قبل إعادة التكوين. 
ماء ، درجة Optima LC / MSثيرمو فيشر العلمي047146.K2مياه فائقة النقاء تستخدم في الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي

المراجع

  1. Wilhelm, M., et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome. Nature. 509 (7502), 582-587 (2014).
  2. Souchelnytskyi, S. Bridging proteomics and systems biology: what are the roads to be traveled. Proteomics. 5 (16), 4123-4137 (2005).
  3. Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
  4. Aebersold, R., Mann, M. Mass-spectrometric exploration of proteome structure and function. Nature. 537 (7620), 347-355 (2016).
  5. Casado, P., et al. Integrative phosphoproteomics defines two biologically distinct groups of KMT2A rearranged acute myeloid leukaemia with different drug response phenotypes. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 80(2023).
  6. Fazakerley, D., et al. Phosphoproteomics reveals rewiring of the insulin signaling network and multi-nodal defects in insulin resistance. Nat Commun. 14 (1), 923(2023).
  7. Emdal, K. B., et al. Phosphoproteomics of primary AML patient samples reveals rationale for AKT combination therapy and p53 context to overcome selinexor resistance. Cell Rep. 40 (6), 111177(2022).
  8. Boutté, A. M., et al. Proteomic analysis and brain-specific systems biology in a rodent model of penetrating ballistic-like brain injury. Electrophoresis. 33 (24), 3693-3704 (2012).
  9. Peters, M. E., et al. Head injury serum markers for assessing response to trauma: Design of the HeadSMART study. Brain Inj. 31 (3), 370-378 (2017).
  10. Song, H., et al. Proteomic analysis and biochemical correlates of mitochondrial dysfunction after low-intensity primary blast exposure. J Neurotrauma. 36 (10), 1591-1605 (2019).
  11. Attilio, P. J., et al. The effects of blast exposure on protein deimination in the brain. Oxid Med Cell Longev. 2017, 8398072(2017).
  12. Zhao, Z., Zlokovic, B. V. Acetylated tau: A missing link between head injury and dementia. Med. 2 (6), 637-639 (2021).
  13. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. J Vis Exp. (168), e61941(2021).
  14. Blagoev, B., Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Temporal analysis of phosphotyrosine-dependent signaling networks by quantitative proteomics. Nat Biotechnol. 22 (9), 1139-1145 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة