مقالة منهجية
* These authors contributed equally
البروتينات هي تقييم عالي الإنتاجية لتفاعلات البروتينات ووظيفتها وتكوينها وهياكلها وأنشطتها الخلوية. نقدم هنا بروتوكولا لتقييم التغيرات البروتينية الإجمالية في العينات الحيوية المختلفة ، بما في ذلك البلازما والأنسجة. المنهجية الواردة هنا قابلة للتطبيق على جميع العينات الحيوية التي تحتوي على بروتينات.
البروتينات هي دراسة واسعة النطاق للبروتينات المعبر عنها ، مع التركيز على هيكلها ووظيفتها وتفاعلاتها ووفرتها وتعديلات ما بعد الترجمة داخل النظام البيولوجي. على سبيل المثال ، علم الفوسفورات ، وهو مجموعة فرعية حيوية من البروتينات الكلية ، هو دراسة أنماط الفسفرة والتغيرات على البروتينات. توضح المنهجية الموضحة هنا نهجا شاملا للبروتينات لتوضيح التغيرات في ملامح التعبير عن البروتين الشاملة ، بما في ذلك أنماط الفسفرة ، في أنسجة البلازما والدماغ والرئة والطحال والكبد التي تم جمعها من النماذج الحيوانية البحثية (مثل القوارض والفئران). هذه التقنية قابلة للتطبيق على أنواع الأنسجة الأخرى ، بالإضافة إلى أي عينة حيوية تحتوي على بروتينات تقريبا (على سبيل المثال ، الخلايا المزروعة). بعد التشريح ، تم تجميد الأنسجة ذات الأهمية وتخزينها عند -80 درجة مئوية. ثم تم تجانس الأنسجة باستخدام ملاط ومدقة بالنيتروجين السائل للحفاظ على سلامة البروتين وتغيرات الفسفرة. تم استخراج البروتين الكلي من تجانسات الأنسجة باستخدام مخزن مؤقت للتحلل مع نوكلياز عالمي ومثبطات البروتياز / الفوسفاتيز. تم تحويل البروتينات المستخرجة من الأنسجة والبلازما المكافئة إلى ببتيدات إجمالية عن طريق التحكم في هضم البروتياز باستخدام مجموعة تحضير عينة مطياف الكتلة التجارية. تم تحليل الببتيدات مباشرة باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء / قياس الطيف الكتلي الترادفي Orbitrap-tribrid. تمت إعادة بناء هويات البروتينات المكونة من البيانات الطيفية لكتلة الببتيد ، باستخدام برنامج المعلوماتية الحيوية للبروتينات ، كما هو مطابق لمكتبة تسلسل الأحماض الأمينية الخاصة بالأنواع. بعد ذلك ، يجب أن يتضمن التحليل معايير قطع صارمة ، خاصة باستخدام تعريفات البروتين عالية الثقة فقط. يمكن تحديد الفروق البروتينية ذات الدلالة الإحصائية (>تغيير 2 ضعف ؛ ص < 0.05) بين المجموعات الضابطة والتجريبية.
تركز البروتينات ، كمزيج من تجارب البروتينات وتحليل البيانات ، على تحديد البروتينات وقياسها كميا ، وتوصيفها بناء على التركيب والتفاعل والتعديلات قبل الترجمة وما بعد الترجمة (مثل الفسفرة) ، والتوطين الخلوي الفرعي ، والبنية في ظل الظروف الفسيولوجية1. تتعامل البروتينات التعبيرية مع المقارنات الكمية للبروتينات التي تختلف في ظل الظروف البيولوجية المتغيرة2. كما أنه يحمل أهمية كبيرة في تحديد ملامح خريطة للمسارات والشبكات والأنظمة الجزيئية المعقدة والمترابطة ، والتي تتحكم بشكل مباشر في الوظائف البيولوجية الرئيسية مثل تكاثر الخلايا والتمايز والشيخوخة وآليات موت الخلايا. مع التقدم الكبير للتكنولوجي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم إجراء البحث بموجب بروتوكول استخدام المعتمد من IACUC في منشأة معتمدة من AAALAC International مع ضمان رعاية لخدمات الصحة العامة وبما يتوافق مع قانون رعاية والقوانين واللوائح الفيدرالية الأخرى المتعلقة بحيوانات المختبر. جميع المستلزمات المطلوبة لهذا الإجراء مدرجة في جدول المواد. ينقسم الإجراء إلى سبعة مكونات.
أنذر. تأكد من اتباع بروتوكولات السلامة المناسبة عند العمل مع النيتروجين السائل لتجانس الأنسجة. ارتدى موظفو المختبر قفازات الفريزر ، ومئزر الفريزر ، وقناع الوجه الجراحي ، ودرع الوجه أثناء تجانس الأنسجة المجمدة. يمكن استخدام تقنية التجانس هذه لأي نوع من الأنسجة ، بما في ذلك المواد شديدة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تصور نتائج البروتين الإجمالية عن طريق المعالجة الاختيارية في مخططات البركانية
يمكن البحث بسهولة عن إجمالي نتائج البروتين لكل عينة عن طريق الانضمام # أو الوصف لبروتينات معينة ذات أهمية بحثية ويتم حساب متوسط الوفرة النسبية المرتبطة بها ثم مقارنتها بين مجموعات العلاج بحثا عن اختلافات كبيرة (على سبيل المثال ، كما هو الحال عن طريق قيم p المشتقة من اختبار t). بدلا من ذلك ، قد يكون من المفيد استكشافي كبير البحث عن التغييرات العالمية عبر البروتينات بأكملها ، بما في ذلك أي بروتينات فوسفو ، يتم مشاركتها بالكامل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
استخدمت الطريقة المذكورة أعلاه الأنسجة التي تم تجميدها في النيتروجين السائل لوقف جميع الأنشطة البيولوجية على الفور قبل نقلها إلى -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. بمجرد جمع جميع العينات ، حدث تجانس الأنسجة. أثناء التجانس ، من الأهمية بمكان الحفاظ على برودة جميع الأنسجة والأدوات لمنع إعادة تنشيط البروتينات أو تدهورها. أيضا ، أثناء الاستخراج الأولي للبروتين من الأنسجة المتجانسة ، يتم الاحتفاظ بالعينات باردة لمنع فقدان نشاط البروتين أو تدهور البروتين. استخدمنا هذه المنهجية لتوضيح التغيرات .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
تم دعم هذا المشروع جزئيا من خلال التعيين في برنامج الزمالة التابع للمجلس الوطني للبحوث الذي يديره مكتب الزمالات التابع للأكاديميات الوطنية للعلوم والهندسة والطب ، وبرنامج معهد أوك ريدج للعلوم والتعليم في معهد والتر ريد للبحوث العسكرية.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| طقم فحص البروتين 660 نانومتر | بيرس / ثيرمو ساينتفيك | 22662 | بالنسبة ل BCA لتحديد تركيزات البروتين في العينات ، يحتوي على كاشف فحص البروتين Pierce 660nm ومعايير فحص البروتين المخفف مسبقا |
| أسيتونيتريل ، درجة Optima LC / MS | ثيرمو فيشر العلمي | 047138.K2 | أسيتونيتريل فائق النقاء يستخدم في الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي |
| رقائق الألومنيوم لوحة الختم | بيكمان كولتر | 538619 | الختم المستخدم أثناء تطوير لوحة فحص البروتين |
| BioTek Synergy Neo2 قارئ متعدد الأوضاع / مطياف UV-Vis | أجيلينت | https://www.agilent.com/en/product/microplate-instrumentation/microplate-readers/multimode-microplate-readers/biotek-synergy-neo2-hybrid-multimode-reader-1623195 | أداة قارئ لوحة الطيف الضوئي / المقايسة المستخدمة لإكمال قراءات الامتصاص 660 نانومتر لتحديد تركيزات البروتين ؛ |
| حل تدفق أداة ChromaCare LC-MS | ثيرمو فيشر العلمي | T111101000 | محلول يحتوي على 25٪ من كل من الأسيتونيتريل والأيزوبروبرانول والميثانول واستخدام المياه للمساعدة في تنظيف نظام LC بعد تشغيل العينات |
| أنبوب CK28 Precellys | بيرتين كورب / تكنولوجيز | P000911LYSK0A.0 | يتم وضع الأنسجة المتجانسة في هذه الأنابيب لتحلل الأنسجة وعزل البروتين باستخدام أداة Precellyis. هذه هي الأنابيب التي يستخدمها مختبرنا والمشار إليها في البروتوكول باسم "أنابيب التجانس". |
| برجد الأرجل | بروكس / أزينتا لايف ساينسز | https://www.azenta.com/products/cryopod-carrier | الحاوية المستخدمة لحمل النيتروجين السائل لتبريد الملاط أثناء تجانس تيسوس |
| مجموعة إعدادية عينة EasyPep Mini MS | ثيرمو فيشر العلمي | أ40006 | يمكن لمجموعة واحدة معالجة 20 عينة ، وتشمل المحتويات محلول التحلل لاستخراج البروتين ، ونوكلياز عالمي مكمل في محلول الاستخراج ، والمواد اللازمة للخطوتين 1.4 و 1.5 |
| عمود EASY-Spray C18 LC (15 سم لتر ، 50 µ ؛ م ضياء, و 2 µ حجم الجسيمات M) | ثيرمو فيشر العلمي | طراز ES901 | عمود LC الكهربائي المستخدم لفصل الببتيدات قبل اكتشاف مرض التصلب العصبي المتعدد |
| حل معايرة FlexMix | بيرس / ثيرمو ساينتفيك | أ39239 | مزيج من 16 جزيئا قياسيا يستخدم لمعايرة دقة الكاشف وحساسية جهاز MS قبل تشغيل العينة |
| حمض الفورميك ، درجة LC / MS | ثيرمو فيشر العلمي | 85178 | حمض الفورميك فائق النقاء يستخدم لتصفية جميع محاليل وعينات LC بتركيز نهائي قدره 0.1٪ (حجم/حجم) |
| أوقف البروتياز & كوكتيل مثبط الفوسفوتاز للاستخدام مرة واحدة (100x) | ثيرمو فيشر العلمي | 78442 | مكمل في المخزن المؤقت للاستخراج لمنع تدهور البروتينات والبروتينات الفوسفوية في العينة |
| الميثانول ، درجة Optima LC / MS | ثيرمو فيشر العلمي | 047192.K2 | ميثانول فائق النقاء يستخدم في الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي |
| ملاط بورسلين، 150 مل | ثيرمو فيشر العلمي | FB961 ج | سعة 150 مل ، تستخدم لتجانس أنسجة النمس الأصغر (أي الدماغ) |
| ملاط البورسلين، 275 مل | ثيرمو فيشر العلمي | FB961D | سعة 275 مل ، تستخدم لتجانس أنسجة النمس الكبيرة (مثل الكبد) |
| ملاط بورسلين، 50 مل | ثيرمو فيشر العلمي | إف بي 961 أ | سعة 50 مل ، تستخدم لتجانس أنسجة الفئران |
| بورسلين بيستل، 50 مل | ثيرمو فيشر العلمي | إف بي 961ك | للاستخدام مع ملاط 50 مل |
| مدقة بورسلين، 150 مل | ثيرمو فيشر العلمي | إف بي 961م | للاستخدام مع ملاط 150 مل |
| مدقة بورسلين، 275 مل | ثيرمو فيشر العلمي | إف بي 961 ن | للاستخدام مع ملاط 275 مل |
| بريسيليس | بيرتين كورب / تكنولوجيز | https://www.bertin-technologies.com/product/sample-preparation-homogenizers/precellys-evolution-homogenizer/ | أداة تستخدم لتجانس عينات الأنسجة. تم استخدام الإعدادات التالية: 4500 دورة في الدقيقة ، 2 × 30 ثانية لكل دورة ، 30 ثانية وقفة. |
| كاشف فحص البروتين | بيرس / ثيرمو ساينتفيك | 22662 | كاشف فحص البروتين المستخدم في الخطوات 3.4 – 3.8 |
| مكتشف البروتين | ثيرمو فيشر العلمي | CSW0064764 | برنامج المعلوماتية الحيوية لتحليل بيانات البروتينات / الفوسفوبروتيوميات |
| قوارير حقن LC ذات غطاء لولبي SureSTART MSCERT (0.02 – سعة 1.5 مل) | ثيرمو فيشر العلمي | 6PMCK39TR | قوارير زجاجية عالية الغطاء اللولبي (PTFE ، الحاجز المسبق للشق) المستخدمة لاحتواء عينات للحقن على أداة LC / MS ؛ |
| نظام Ultimate 3000 UHPLC / Orbitrap Fusion Lumos Tribrid MS (LC / MS) | ثيرمو فيشر العلمي | خطاب الاعتماد: مخفضة / MS: FETD2-10002 ، بناء على طلب خاص | أداة الكروماتوغرافيا السائلة / مطياف الكتلة (LC / MS) عالية الضبط تستخدم لفصل ثم اكتشاف الببتيدات في العينات بالوزن الجزيئي |
| نوكلياز عالمي لتحلل الخلايا ، 100 كيلو وحدة ، 400 وميكرو ؛ L | بيرس / ثيرمو ساينتفيك | 88702 | تم شراء نوكلياز عالمي إضافي ؛ |
| Vacufuge Plus | إيبندورف | https://www.eppendorf.com/us-en/Products/Centrifugation/Concentrator/Vacufuge-plus-p-PF-25748 | مكنسة كهربائية تستخدم لتجفيف عينات الببتيد قبل إعادة التكوين. |
| ماء ، درجة Optima LC / MS | ثيرمو فيشر العلمي | 047146.K2 | مياه فائقة النقاء تستخدم في الكروماتوغرافيا السائلة / قياس الطيف الكتلي |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن