مراقبة التغيرات الناجمة عن التثقيب الكهربائي في توليد جهد الفعل في خلايا ارتفاع HEK المعدلة وراثيا

Summary

لدراسة استجابات الخلايا القابلة للإثارة في المختبر ، يصف البروتوكول المراقبة البصرية للتغيرات في توليد جهد الفعل بسبب التثقيب الكهربائي على نموذج خلوي بسيط قابل للإثارة لخلايا HEK المعدلة وراثيا بالإضافة إلى التغيرات في جهد الغشاء مع الاستخراج الآلي للمعلمات ذات الصلة.

Abstract

يمكن أن تكون الخلايا المثيرة مثل الخلايا العصبية والعضلية أهدافا أساسية في العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي الناشئة بسرعة. ومع ذلك ، يمكن أن تتأثر بالنبضات الكهربائية حتى في العلاجات التي لا تكون فيها الأهداف الأساسية ، وهذا يمكن أن يسبب آثارا جانبية ضارة. لذلك ، لتحسين العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي للأنسجة القابلة للاستثارة وغير القابلة للاستثارة ، هناك حاجة لدراسة تأثيرات النبضات الكهربائية على الخلايا القابلة للاستثارة ، وقنواتها الأيونية ، والاستثارة في المختبر. لهذا الغرض ، تم تطوير بروتوكول للمراقبة البصرية للتغيرات في توليد جهد الفعل بسبب التثقيب الكهربائي على نموذج خلوي بسيط قابل للإثارة لخلايا HEK المعدلة وراثيا. باستخدام صبغة قياس الجهد الفلورية ، تمت مراقبة التغيرات في جهد الغشاء تحت المجهر الفلوري ، وتم استخراج المعلمات ذات الصلة لاستجابات الخلية تلقائيا باستخدام تطبيق MATLAB. بهذه الطريقة ، يمكن تقييم استجابات الخلية القابلة للإثارة للنبضات الكهربائية المختلفة والتفاعل بين الإثارة والتثقيب الكهربائي بكفاءة.

Introduction

في التثقيب الكهربائي ، تتسبب النبضات الكهربائية عالية الجهد في زيادة نفاذية غشاء البلازما للجزيئات التي تكون ضعيفة^{النفاذ 1}. تستخدم التقنيات القائمة على التثقيب الكهربائي في الوقت الحاضر على نطاق واسع في التطبيقات في الطب² ، والتكنولوجيا الحيوية³ ، وتكنولوجيا الأغذية⁴.

تعد الخلايا القابلة للإثارة مثل الخلايا العصبية والعضلية من بين الأهداف الأساسية في العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي الناشئة بسرعة في القلب والدماغ وعضلات الهيكل^{العظمي 5}. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتأثر بالنبضات الكهربائية حتى في العلاجات التي لا تكون فيها الأهداف الأساسية ، ويمكن أن يسبب ذلك آثارا جانبية ضارة مثل الألم وارتعاش العضلات وتلف الأعصاب⁶. وبالتحديد ، يمكن أن تسبب النبضات الكهربائية تحفيزا كهربائيا للخلايا القابلة للاستثارة: فهي تنشط القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي وتثير إمكانات العمل (AP). ومع ذلك ، في المجالات الكهربائية الأعلى ، يصبح غشاء بلازما الخلايا منفذا ، ويحدث تيار أيوني إضافي من خلال المسام /^{العيوب 7}. يؤثر هذا التيار الأيوني الإضافي على استثارة الخلية في تفاعل معقد بين الإثارة والتثقيب الكهربائي. لذلك ، لتحسين العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي للأنسجة القابلة للاستثارة وغير القابلة للاستثارة ، هناك حاجة لدراسة تأثيرات النبضات الكهربائية على الخلايا القابلة للاستثارة ، وقنواتها الأيونية ، والاستثارة في المختبر.

في دراسة حديثة⁸ ، استكشفنا خلايا الكلى الجنينية البشرية المعدلة وراثيا (HEK) التي طورها Cohen et ^al.9،10 ، كأداة قيمة لدراسة التثقيب الكهربائي في الخلايا القابلة للاستثارة. في هذه الخلايا غير القابلة للإثارة ، يتم التعبير عن الحد الأدنى من قنوات الصوديوم والبوتاسيوم (Na_V1.5 و K_ir2.1) اللازمة للاستثارة. يتم التحكم في التعبير عن K_ir2.1 في هذه الخلايا بواسطة نظام tet-on الناجم عن الدوكسيسيكلين والذي يسمح بإنشاء نوعين مختلفين من الخلايا: S-HEK المرتفع المثير (الذي يحتوي على Na_V1.5 و K_ir2.1) وخلايا NS-HEK غير القابلة للإثارة (تحتوي فقط على قنوات Na_V1.5). هذا يسمح لنا بمقارنة تأثيرات النبضات الكهربائية على المتغيرات القابلة للإثارة وغير القابلة للإثارة من نفس النوع من الخلايا. بالمقارنة مع الخلايا الأولية القابلة للاستثارة المعزولة ، والخلايا القابلة للاستثارة المتمايزة عن الخلايا الجذعية الجنينية أو المستحثة متعددة القدرات ، وخطوط الخلايا المشتقة من الأنسجة القابلة للإثارة ، تتمتع خلايا S-HEK بالعديد من المزايا: فهي سهلة التعامل معها وزراعتها وتكاثرها ، ولها قنوات صوديوم وبوتاسيوم محددة جيدا ، وتولد نقاط وصول قوية⁸.

لقد صممنا بروتوكولا لمراقبة التغيرات في جهد الغشاء (TMV) الناتجة عن نبضات كهربائية ذات سعات مختلفة باستخدام صبغة جهدية فلورية. بهذه الطريقة ، يمكننا دراسة كيفية تأثير التثقيب الكهربائي على توليد AP في خلايا S-HEK والتغيرات الأخرى في TMV في كل من خلايا S-HEK و NS-HEK. باختصار ، تتعرض خلايا S-HEK أو NS-HEK لنبضة كهربائية واحدة 100 ميكرو ثانية كل دقيقتين ، ويتم تسجيل التغيرات النسبية في التألق لمدة 3 ثوان تقريبا حول كل تطبيق نبض. النبضات المطبقة ذات جهد متزايد ، مما يؤدي أولا إلى تشغيل نقاط الوصول في الخلايا ، وفي مجال كهربائي أعلى ، التثقيب الكهربائي. تم اختيار الفاصل الزمني لمدة دقيقتين بين تطبيق النبض لتقليل التأثيرات التراكمية المحتملة للنبضات المتتالية مع إبقاء التجارب قصيرة بما يكفي لعدم تدهور الخلايا. تمت أتمتة معالجة الصور باستخدام تطبيق MATLAB مخصص لاستخراج المعلمات ذات الصلة لاستجابات التألق للصبغة الجهدية ، وبالتالي تقييم التغييرات في TMV (APs وإزالة الاستقطاب المستمر بسبب التثقيب الكهربائي) في خلايا S-HEK و NS-HEK.

Protocol

1. تحضير الكواشف وزراعة الخلايا

1. تحضير وسط زراعة الخلايا عن طريق استكمال الجلوكوز المتوسط إلى العالي من النسر المعدل من Dulbecco مع مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ ، و 2 ملي مولار الجلوتامين ، والبنسلين - الستربتومايسين (البنسلين 100 وحدة / مل ، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل) ، 2 ميكروغرام / مل بورومايسين ، 5 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين ، و 200 ميكروغرام / مل جينيتين.
2. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 137 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 10 ملي مولار ،_{و 2}HPO₄ ، و 1.8 ملي مولار KH₂PO₄ ، درجة الحموضة 7.4. قم بتصفيته من خلال مرشح غشاء معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
3. تحضير محلول Tyrode مع 2 ملي كلوريد كلوريد ، 125 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 1 ملي ملي كلوريد₂ ، 10 ملي هيبس ، 30 ملي جلوكوز ، درجة الحموضة 7.3. تحضير محلول تيرود منخفض البوتاسيوم مع 0.5 ملي كلوريد كلوريد ، 126.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 1 ملي ملي كلوريد₂ ، 10 ملي هيبس ، 30 ملي جلوكوز ، درجة الحموضة 7.3. قم بتصفية كلا المحاللين من خلال مرشح غشاء معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
4. تحضير 1 مجم / مل محلول مخزون بولي إل ليسين عن طريق إضافة 5 مل من PBS في قارورة تحتوي على 5 ملغ من بولي إل ليسين.
5. قم بإعداد محلول مخزون الدوكسيسيكلين 2 مجم / مل في الماء المقطر وقم بتصفيته من خلال مرشح غشاء معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
6. قم بإعداد محلول مخزون صبغة قياس الجهد 4 ملي مولار ElectroFluor630 في الإيثانول النقي (أضف 25 ميكرولتر من الإيثانول النقي إلى الأنبوب الذي يحتوي على 100 نانومتر - 73 ميكروغرام من الصبغة).
7. زراعة خلايا HEK المعدلة وراثيا في قارورة T25 في 6 مل من وسط زراعة الخلية كما هو موضح^{سابقا 8}. مكونات وسط الثقافة حساسة للضوء. وبالتالي ، حافظ على الوسيط محميا من الضوء (لف القارورة المتوسطة بورق الألمنيوم) وقم بالمرور في ظروف الإضاءة المنخفضة.
8. قم بتمرير الخلايا كل 3-4 أيام عن طريق زرع 3 × 10⁵ أو 5 × 10⁵ خلايا إلى قارورة T25 جديدة. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. حافظ على الخلايا في قارورة رئيسية كخلايا NS-HEK غير قابلة للاستثارة دون إضافة دوكسيسيكلين لأنها لا تتسامح مع تعبير K_ir2.1 المستمر. استخدم خلايا من ممرات أقل من 14 في التجارب.

2. إعداد العينة

1. طلاء بولي L-lysine لشرائح الغرفة الزجاجية للغطاء
   1. ماصة 1 مل من PBS إلى بئر واحد من شرائح الغرفة الزجاجية ذات الغطاء المكون من 2 بئر ، أضف 10 ميكرولتر من محلول بولي ليسين معقم 1 مجم / مل واخلطه جيدا مع ماصة.
   2. احتضان لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في ظروف معقمة في غطاء التدفق الرقائقي. قم بإزالة PBS باستخدام poly-L-lysine دون مزيد من الغسيل.
2. بذر الخلايا
   1. قم بإعداد تخفيف 1:10 من محلول مخزون الدوكسيسيكلين في وسط استزراع في أنبوب 1.5 مل. لكل بئر هناك حاجة إلى 30 ميكرولتر من تخفيف الدوكسيسيكلين 1:10 (3 ميكرولتر من محلول مخزون الدوكسيسيكلين و 27 ميكرولتر من وسط الاستزراع) ، قم بإعداد الحجم النهائي اعتمادا على العدد الإجمالي للآبار التجريبية.
   2. قم بإزالة وسط المزرعة من قارورة T25 وقم بالتربسين بالخلايا باستخدام 2.5 مل من محلول Trypsin-EDTA في حاضنة CO₂ عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
   3. أضف 2.5 مل من وسط الاستزراع الطازج ، وعن طريق سحب العينة اللطيف ، افصل الخلايا عن السطح. امزج تعليق الخلية جيدا.
   4. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وتحديد كثافة الخلايا المعلقة.
   5. احسب حجم معلق الخلية التربسينية اللازم لإنشاء الثقافة. للثقافة لمدة يومين ، قم بالبذور 2.5 × 10⁵ خلايا ، وللزراعة لمدة 3 أيام ، البذور 1 × 10⁵ خلايا لكل بئر. اضبط العدد الدقيق للخلايا إذا لزم الأمر.
   6. احسب حجم وسط الاستزراع عن طريق طرح حجم تعليق الخلية المحسوب مسبقا من 1470 ميكرولتر. يمثل ال 30 ميكرولتر المتبقية حجم تخفيف الدوكسيسيكلين 1:10. سيكون الحجم الإجمالي في كل بئر 1500 ميكرولتر (الخلايا ، الدوكسيسيكلين ، ووسط الاستزراع).
   7. لتحضير العينات بخلايا S-HEK القابلة للاستثارة، قم بعمل ماصة الحجم المحسوب لوسط الاستزراع وتعليق الخلية التربسينية في بئر واحد وأضف 30 ميكرولتر من تخفيف الدوكسيسيكلين 1:10. استخدم بئر واحد فقط من الغرفتين المكونتين لأن التجربة تستغرق وقتا طويلا (حوالي 40 دقيقة). تخلط جيدا عن طريق سحب العينة اللطيف قبل وضع الغرف في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ .
   8. لتحضير عينات بخلايا NS-HEK غير قابلة للاستثارة، قم بتقطيع الحجم المحسوب لوسط المزرعة في بئر وأضف 90٪ من الحجم المحسوب لتعليق الخلية لخلايا S-HEK بدون الدوكسيسيكلين. تنمو خلايا NS-HEK بشكل أسرع قليلا من خلايا S-HEK.
   9. احتضان الغرف في حاضنة ثاني أكسيد الكربون_{بنسبة 5} ٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام قبل التجربة. بالنسبة للعينات التي تحتوي على الدوكسيسيكلين ، فإن وقت الحضانة هذا كاف لجعل الخلايا قابلة للاستثارة.
3. تسمية الخلايا
   1. قبل التجربة ، قم بإخراج 3 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة الجهدية إلى أنبوب سعة 1.5 مل وترك الأنبوب المفتوح في درجة حرارة الغرفة في غطاء تدفق رقائقي للسماح للإيثانول بالتبخر وتجفيف الصبغة الجهدية (حوالي 15 دقيقة). أضف 997 ميكرولتر من وسط الاستزراع البارد (من الثلاجة عند 4 درجات مئوية) إلى الأنبوب وقم بإذابة الصبغة إلى تركيز نهائي يبلغ 12 ميكرومتر.
   2. قم بإزالة وسط الثقافة من البئر وأضف 1 مل من محلول صبغة قياس الجهد إلى الخلايا. ضعيها في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية واحتضنها لمدة 20 دقيقة.
   3. قم بإزالة محلول صبغة قياس الجهد واحتفظ به في الأنبوب لإعادة استخدامه مرة أخرى (لما يصل إلى ست تجارب متسلسلة في يوم واحد).
   4. اغسل الخلايا برفق 3 مرات بمحلول Tyrode ، وبعد الغسيل الأخير ، قم بإدخال 1 مل من محلول Tyrode منخفض البوتاسيوم في البئر.

3. التحفيز الكهربائي والتثقيب الكهربائي

1. قم بتكوين مزامنة توصيل النبضة مع الحصول على الصور باستخدام إشارة TTL من نظام المجهر الذي يقوم بتشغيل مولد النبض. لتوليد نبضات عالية الجهد ، استخدم مولد نبض^{مخصص 11} أو أي مولد نبض يمكن تشغيله خارجيا باستخدام إشارة TTL.
   ملاحظة: في التكوين التجريبي المقدم، يتم إستخدام برنامج LAS X للحصول على الصور، والتي يمكن تهيئتها لإرسال إشارة TTL في وقت محدد مسبقا أثناء الحصول على اللقطات المتتابعة.
2. ضع قطبين متوازيين من الأسلاك Pt / Ir ، بقطر 0.8 مم ومسافة 5 مم بين الحواف الداخلية ، في الجزء السفلي من الغرفة وقم بتثبيت الغرفة تحت المجهر.
3. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد النبض. قم بتوصيل خرج مولد النبض براسم الذبذبات باستخدام جهد ومسبار تيار لتمكين التحقق من أن النبضات قد تم تسليمها بشكل صحيح أثناء التجربة.
4. ركز الخلايا في المجال الساطع. قم بتصوير الخلايا الموجودة في المنتصف تقريبا بين الأقطاب الكهربائية.
5. ابدأ أول عملية استحواذ على صور مضان في وضع الفاصل الزمني بهدف 40x ، وتسجيل إشارة التألق في مجال الرؤية بأكمله. يجب أن تكون الكاميرا سريعة بما يكفي للحصول على مسار زمني واضح لإمكانات الفعل (من الناحية المثالية أعلى من 25 إطارا / ثانية).
   1. احصل على 80 صورة في وضع اللقطات المتتابعة، مع ما لا يقل عن 25 إطارا/ثانية لحل مسار جهد الإجراء في الوقت الفعلي. ينتج عن المدة الإجمالية للحصول على الصور حوالي 3 ثوان. أثناء الحصول على الصورة ، قم بإضاءة الخلايا بطول موجي للإثارة يبلغ 635 نانومتر ، ووقت التعرض 10 مللي ثانية ، واكتشف الانبعاث عند حوالي 700 نانومتر. في هذا الاستحواذ الأول ، لا تطبق أي نبض - سيتم استخدام هذا الاستحواذ لتصحيح عمليات الاستحواذ اللاحقة للتبييض الضوئي للصبغة. بعد هذا الاستحواذ ، انتظر لمدة 2 دقيقة.
      ملاحظة: تستخدم هذه التجربة 27.8 إطارا/ثانية، أي فترة 36 مللي ثانية، وهي الفترة من بداية الحصول على الصورة الأولى إلى بداية الحصول على الصورة التالية في تسجيل اللقطات المتتابعة).
6. كل دقيقتين، سجل فاصلا زمنيا بنفس الطريقة كما في الخطوة 3.5. بالنسبة لعمليات الاستحواذ هذه ، قم بتطبيق نبضة واحدة 100 ميكرو ثانية في وقت الحصول على الصورة العاشرة (عند 324 مللي ثانية). احصل على صور بجهد النبض التالي: 63 فولت ، 75 فولت ، 88 فولت ، 100 فولت ، 125 فولت ، 150 فولت ، 175 فولت ، 200 فولت ، تقدير المجال الكهربائي الذي تتعرض له الخلايا كنسبة الجهد إلى المسافة المطبقة (E = 126 ، 150 ، 176 ، 200 ، 250 ، 300 ، 350 ، و 400 فولت / سم).
   ملاحظة: في المجالات الكهربائية المنخفضة ، ستؤدي النبضات إلى تشغيل إمكانات الفعل. في المجالات الكهربائية الأعلى ، ستؤدي إلى التثقيب الكهربائي ، والذي يتجلى في إزالة الاستقطاب لفترات طويلة. تبلغ مدة التجربة على كل عينة من الخلايا حوالي 40 دقيقة (20 دقيقة لوضع العلامات و 20 دقيقة للفحص المجهري).

4. تحليل البيانات

1. قم بتصدير تسجيلات اللقطات المتتابعة إلى تنسيق tiff.
2. ضع تسجيلات الفاصل الزمني لجميع الفولتية المطبقة أثناء تجربة فردية (عينة واحدة من الخلايا) في مجلد واحد. أعد تسمية تسجيلات اللقطات المتتابعة في شكل يمكن التعرف على المجال الكهربائي E بواسطة تطبيق MATLAB: Vcm (على سبيل المثال ، 126 فولت سم ل 126 فولت / سم). يمكن أن تكون الأجزاء المتبقية من الاسم تعسفية. للاستحواذ في بداية التجربة حيث لا يتم تطبيق النبض ، أعد التسمية باستخدام العبارة 000Vcm. مثال على أسماء تسجيل الفاصل الزمني: 2022_1_20 1DOX 000Vcm ، 2022_1_20 1DOX 126Vcm ، 2022_1_20 1DOX 150Vcm ، إلخ.
3. افتح التطبيق ، والذي يمكن تنزيله من
   https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. انقر فوق تحديد مجلد البيانات لاختيار المجلد الذي يحتوي على تسجيلات اللقطات المتتابعة لتجربة واحدة.
4. حدد وحدات البكسل المراد استخدامها لمزيد من تحليل البيانات. للقيام بذلك ، استخدم منزلكين لتحديد العتبة المنخفضة لصورة واضحة للأغشية (باللون الأرجواني) والعتبة العالية للتخلص من الحطام (البقع الكبيرة ذات التألق العالي) من التحليل (باللون الأخضر).
5. حدد تحليل البيانات. في علامة التبويب تحليل، يظهر جدول يحتوي على معلمات مستخرجة. على الجانب الأيمن من الجدول ، تظهر رسوم بيانية للمضان النسبي في الوقت المناسب لكل E مستخدم. حدد الرسوم البيانية ل E معين من القائمة المنسدلة على الجانب الأيسر أعلى الجدول.
6. افحص جميع الرسوم البيانية وقم بإجراء التصحيح اليدوي في حالة اكتشاف الذروة الخاطئ. حدد مسح القمم التلقائية في الجزء السفلي في علامة التبويب تحليل، ويتم مسح القمم التي تم اكتشافها تلقائيا. انقر فوق الرسم البياني لتحديد نقطة وقت الذروة الجديدة يدويا.
7. حدد إعادة تشغيل اكتشاف الذروة التلقائي في الجزء السفلي في علامة التبويب تحليل لإجراء اكتشاف الذروة التلقائي مرة أخرى. سيتم الآن تعديل المعلمات المستخرجة إلى الذروة الجديدة.
8. حدد تصدير البيانات في أسفل يسار علامة التبويب تحليل لتصدير البيانات إلى نفس المجلد في شكل ملف .mat وملف جدول بيانات وصور PNG لكل E مستخدم.

Results

يمكن مراقبة التغييرات في TMV في الخلايا القابلة للإثارة في المختبر الناتجة عن النبضات الكهربائية بصريا باستخدام هذا البروتوكول ، ويمكن تحليل إشارات التألق لاستخراج المعلمات ذات الصلة.

يظهر الإعداد التجريبي في الشكل 1 أ. تظهر إشارة نموذجية من 100 ميكرو ثانية نبضة كهربائية مستخدمة في التجارب في الشكل 1 ب. عادة ما تبدو الخلايا الموجودة في الغرف الموضوعة تحت المجهر مثل الخلايا الموجودة في الشكل 1 ج (صورة المجال الساطع) والشكل 1 د (صورة الفلورة). نجري تجربة حيث يتم تطبيق نبضة كهربائية ذات جهد متزايد كل دقيقتين على نفس الخلايا. لاحظ أن وقت النبضة البالغ 2 دقيقة قد لا يكون طويلا بما يكفي للسماح بإعادة الإغلاق الكامل واستعادة أغشية الخلايا ، خاصة عند استخدام نبضات ذات أعلى سعة ، والتي ترتبط بالتثقيب الكهربائي البارز. وبالتالي ، يمكن توقع بعض التأثيرات التراكمية للنبضات. لتجنب هذه التأثيرات التراكمية ، يمكن تمديد تأخير النبضات ، ولكن على حساب تقليل عدد اتساع النبض المختبر وتجنب إبقاء الخلايا على المجهر لفترة طويلة جدا.

بعد التقاط صور مضان في التجارب ، قم بتحليلها باستخدام تطبيق MATLAB المخصص. أولا ، حدد عتبات البكسل (الشكل 2 أ) ؛ من خلال ضبط العتبة المنخفضة ، نحصل على صورة واضحة للأغشية حول الخلايا (باللون الأرجواني) ، ومن خلال ضبط العتبة العالية ، نزيل إشارة الحطام (الأخضر). يحدد التطبيق بعد ذلك متوسط شدة التألق لجميع وحدات البكسل العتبة لكل نبضة متتالية يتم تسليمها للحصول على إشارة تعتمد على الوقت للتغير النسبي في التألق F / F0. يتم تصحيح هذه الإشارة للتبييض الضوئي للصبغة عن طريق طرح ميل الانخفاض الخطي ل F المحدد من تسجيل الفاصل الزمني للتحكم الذي لم يتم فيه تطبيق نبضة (الشكل 2 ب). بعد تصحيح الإشارة ، يتم استخراج معلمات الاستجابات في شكل جدول داخل التطبيق ورسم بياني لإشارة التألق المصححة (الشكل 2C). في حالات نادرة ، لا تكتشف الخوارزمية ذروة واضحة أو تكتشف إشارات الضوضاء الزائفة كإيجابيات خاطئة. في هذه الحالات ، يكون لدى المستخدم خيار تحديد النقطة المقابلة يدويا في إشارة التألق كذروة أو لإزالة الذروة الكاذبة المكتشفة (الشكل 2D - إزالة ذروة صغيرة تم اكتشافها بشكل غير طبيعي قبل تطبيق النبضة الكهربائية).

باستخدام تطبيق MATLAB ، يمكننا الحصول على صور لاستجابات TMV للنبضات الكهربائية في كل من S-HEK القابل للإثارة (الشكل 3 أ) وخلايا NS-HEK غير القابلة للإثارة (الشكل 3 ب). يتم استخراج معلمات الاستجابة التالية (الجدول 1): عدد القمم (NoPeaks) ، ومتوسط وقت الذروة إلى الذروة (عند اكتشاف أكثر من ذروة واحدة ، MPPT) ، والاستجابة القصوى (MR) ، والوقت حتى الذروة الأولى (TtFP) ، والوقت من الذروة إلى 25٪ و 50٪ و 75٪ و 90٪ الانتعاش (T25 و T50 و T75 و T90 ، على التوالي). تتيح هذه المعلمات تقييم الاستجابات للنبضات الكهربائية المختلفة (على سبيل المثال ، تحديد عدد القمم التي تسببها نبضات كهربائية مختلفة E ، الشكل 3C) والتفاعل بين الإثارة والتثقيب الكهربائي.

الشكل 1: الإعداد وشكل الموجة وخلايا S-HEK. (أ) صورة الغرفة على مرحلة المجهر. (ب) مثال على شكل موجة النبضة المستخدمة في الدراسة (الجهد (U) بمرور الوقت). (ج، د) صورة خلايا S-HEK ((C): المجال الساطع ، (D): الفلورة) ، شريط المقياس: 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: تطبيق تحليل البيانات. (أ) صورة السطح البيني للتطبيق - العتبة. (ب) الرسم البياني للإشارة الأولية والمصححة لتغير التألق. (ج) صورة السطح البيني للتطبيق - البيانات المستخرجة. (د) التصحيح اليدوي لاكتشاف الذروة (إزالة ذروة صغيرة تم اكتشافها بشكل شاذ قبل تطبيق النبضة الكهربائية، وتحمل علامة بسهم أحمر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: النتائج التمثيلية. (أ ، ب) إحداث تغييرات في TMV في (أ) S-HEK القابل للإثارة و (ب) NS-HEK غير القابل للإثارة مع نبضات كهربائية 100 ميكرو ثانية ذات سعات مختلفة ، نتائج التجارب التمثيلية. من أجل الوضوح ، يتم عرض الاستجابات للنبضات المحددة في تسلسل النبض المطبق فقط. (ج) معلمات استجابات TMV الناتجة عن نبضات 100 ميكرو ثانية ذات السعات المختلفة: يوضح المثال عدد القمم. يتم التعبير عن النتائج كمتوسط ± SE ، عدد التجارب: N = 13. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فهرس	القوة الإلكترونية (حجم / سم)	لا قمم (-)	MPPT (مللي ثانية)	السيد (-)	تي تي إف بي (مللي ثانية)	تي 25 (مللي ثانية)	تي 50 (مللي ثانية)	تي 75 (مللي ثانية)	تي 90 (مللي ثانية)
1	0
2	126	9	224	0.104	360	72	108	144	180
3	150	6	354	0.097	108	72	108	144	180
4	176	2	144	0.089	36	72	108	144	180
5	200	1		0.075	0	108	144	180	252
6	250	2	396	0.064	0	108	216	432	2052
7	300	1		0.059	0	180	1188	2448
8	350	1		0.053	0	1008	2340
9	400	1		0.047	0	1512

الجدول 1: معلمات استجابات TMV الناتجة عن نبضات 100 ميكرو ثانية ذات سعات مختلفة.

Discussion

خلايا S-HEK هي نموذج خلوي بسيط قابل للإثارة مع قنوات صوديوم وبوتاسيوم محددة جيدا ، Na_V1.5 و K_ir2.1⁹. يمكننا هذا من إجراء دراسات متعمقة حول كيفية استجابة الخلايا القابلة للإثارة للنبضات الكهربائية المطبقة وربط البيانات التجريبية بالنماذج الرياضية بناء على الخصائص النظرية المعروفة للقنوات المعبر عنها في خلايا S-HEK. في دراستنا السابقة⁸ ، وصفنا استجابات هذه الخلايا لنبضات 100 ميكرو ثانية لزيادة E تجريبيا ونظريا. في E السفلي ، تستجيب خلايا S-HEK بإمكانات عمل مفردة أو متعددة ، بينما في E الأعلى ، تصبح نقاط الوصول مطولة وتتحول إلى إزالة استقطاب مستمر. نظرا لأن إزالة الاستقطاب المستمر مرئية بوضوح أيضا في نسخة غير قابلة للإثارة من هذه الخلايا (NS-HEK) ، فإنه يعزى إلى التثقيب الكهربائي والزيادة المرتبطة به في التيار الأيوني غير الانتقائي.

أثبت استخدام صبغة قياس الجهد الفلورية أنه طريقة فعالة للغاية لدراسة APs والتثقيب الكهربائي في الخلايا القابلة للاستثارة. بالمقارنة مع طرق الفيزيولوجيا الكهربية الكلاسيكية ، مثل مشبك التصحيح ، فإن القياسات البصرية أكثر ملاءمة وكفاءة من حيث الوقت ولا تتطلب مهارات فنية خاصة. علاوة على ذلك ، فإن استخدام النبضات الكهربائية عالية الجهد لا يتداخل مع القياسات ، والتي يمكن أن تصبح مشكلة في قياسات مشبك التصحيح¹². ومع ذلك ، فإن العيوب الرئيسية لهذا البروتوكول مرتبطة بطبيعة الصبغة. بسبب التبييض الضوئي ، تحتاج إشارة التألق الملتقطة إلى تصحيح. تنتشر الصبغة تلقائيا في الخلية ، وبالتالي تقل الإشارة من الأغشية بمرور الوقت. لهذا السبب ، فإن الصبغة مناسبة لمراقبة إمكانات العمل والتغيرات الأخرى قصيرة المدى في TMV (~ 3 ثوان في هذه التجارب). نظرا لأن الصبغة تتيح التصوير النسبي¹³ ، فإن مثل هذا التصوير يمكن أن يتجنب بعض المشاكل المتعلقة بانتشار الصبغة ، ولكن على حساب سرعة تصوير أقل يمكن تحقيقها. في هذا التكوين التجريبي ، سيكون التصوير النسبي بطيئا جدا لالتقاط شكل إمكانات الفعل بشكل صحيح. علاوة على ذلك ، توفر التغييرات المقاسة في مضان الصبغة معلومات نوعية عن التغيير في TMV. ومع ذلك ، يمكن معايرة الصبغة لتمكين القياسات الكمية.

يتيح لنا التحليل الآلي للصور باستخدام تطبيق MATLAB المخصص تحليل كمية كبيرة من البيانات واستخراج الخصائص القيمة لاستجابات TMV بكفاءة في فترة زمنية قصيرة. تم تكوين التطبيق لالتقاط إشارة التألق من أغشية جميع الخلايا في مجال الرؤية. هذا يحسن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ولكن على حساب فقدان المعلومات حول كيفية تغير TMV على مستوى الخلية الفردية. في التكوين التجريبي المحدد ، كانت الإشارة من الخلايا الفردية صاخبة للغاية لتمكين القياسات المفيدة. علاوة على ذلك ، كان من الصعب التمييز بين أغشية الخلايا المجاورة. ومع ذلك ، فإن خلايا HEK تعبر داخليا عن تقاطعات الفجوة التي يتم من خلالها توصيلها كهربائيا. أظهرت النمذجة الرياضية ، المقدمة في الدراسة السابقة⁸ ، أنه نظرا لتوصيلها الكهربائي ، فإن الخلايا الموجودة في مجال الرؤية قريبة بما يكفي لتشغيل AP في وقت واحد. علاوة على ذلك ، يتم نشر AP على طول الطبقة الأحادية للخلية بسرعة عالية (حوالي 34 مم / ثانية ، تقدر بناء على التصوير بتكبير موضوعي ^5x)⁸،⁹. بالنظر إلى الطول الجانبي لمجال الرؤية (~ 0.33 مم) ، فإن نقطة الوصول ستقطع هذا الطول في حوالي 10 مللي ثانية ، وهي أقصر من فترة الحصول على الصور. وبالتالي ، لا يمكن رؤية تأثير انتشار AP مع سرعة التكبير والتسجيل هذه. ومع ذلك ، فإن انتشار AP من الأقطاب الكهربائية إلى مجال الرؤية يمكن أن يتسبب في تأخير بين النبضة المطبقة و AP⁸ الملتقطة.

في الدراسة السابقة⁸ ، وكذلك في هذا المنشور ، تم وصف تأثيرات النبضات التي تبلغ مدتها 100 ميكرو ثانية على التفاعل بين الإثارة والتثقيب الكهربائي. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذا البروتوكول لدراسة النبضات الكهربائية مع معلمات أخرى (ذات مدة مختلفة أو الجهد أو العدد أو معدل التكرار أو الشكل) أو الخلايا الأخرى القابلة للاستثارة.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 مل أنبوب	Ratiolab   ؛	5615000
2-well Nunc Lab-Tek II Chambered # 1.5 نظام الغطاء الألماني	Thermo Fisher Scientific	155379
ADP305 مسبار الجهد التفاضلي	Teledyne LeCroy
AP015 المسبار الحالي	Teledyne LeCroy
Blasticidin   ؛	ثيرمو فيشر العلمية	A1113903
حاضنة CO2	PHCbi	MCO -230AICUV
دوكسيسيكلين   ;	سيجما ألدريتش / ميرك	D9891
Dulbecco s تعديل النسر s متوسط نمو الجلوكوز العالي	Sigma-Aldrich / Merck	D5671
ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ (F) PTEA)	مجسات قياس الجهد	31795
مصل الأبقار الجنيني	Sigma-Aldrich / Merck	F2442
Geneticin	Thermo Fisher Scientific   ؛	10131035
الجلوتامين	سيجما ألدريتش / ميرك	G7513
غطاء التدفق الصفحي	Iskra Pio & nbsp ؛	MC 15-2
MATLAB	Mathworks
Penicillin & ndash ؛ الستربتومايسين	سيجما ألدريتش / ميرك	P07681
بولي إل ليسين هيدروبروميد   ؛	سيجما ألدريتش / ميرك	P9155-5MG
مولد النبض	حسب الطلب		انظر المرجع11
Puromycin	Thermo Fisher Scientific	A1113803
T25 25 سم & sup2 ؛ قارورة زراعة الأنسجة	TPP	90026
Tet-on Spiking خلايا HEK	مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC	CRL-3479
نظام الخلية الحية لجهاز التصوير الرعدي للفحص المجهري الفلوري	Leica Microsystems
حل التربسين-EDTA	سيجما ألدريتش / ميرك	T3924
WavePro 7300A راسم الذبذبات	Teledyne LeCroy