لدراسة استجابات الخلايا القابلة للإثارة في المختبر ، يصف البروتوكول المراقبة البصرية للتغيرات في توليد جهد الفعل بسبب التثقيب الكهربائي على نموذج خلوي بسيط قابل للإثارة لخلايا HEK المعدلة وراثيا بالإضافة إلى التغيرات في جهد الغشاء مع الاستخراج الآلي للمعلمات ذات الصلة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
مراقبة التغيرات الناجمة عن التثقيب الكهربائي في توليد جهد الفعل في خلايا ارتفاع HEK المعدلة وراثيا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمكن أن تكون الخلايا المثيرة مثل الخلايا العصبية والعضلية أهدافا أساسية في العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي الناشئة بسرعة. ومع ذلك ، يمكن أن تتأثر بالنبضات الكهربائية حتى في العلاجات التي لا تكون فيها الأهداف الأساسية ، وهذا يمكن أن يسبب آثارا جانبية ضارة. لذلك ، لتحسين العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي للأنسجة القابلة للاستثارة وغير القابلة للاستثارة ، هناك حاجة لدراسة تأثيرات النبضات الكهربائية على الخلايا القابلة للاستثارة ، وقنواتها الأيونية ، والاستثارة في المختبر. لهذا الغرض ، تم تطوير بروتوكول للمراقبة البصرية للتغيرات في توليد جهد الفعل بسبب التثقيب الكهربائي على نموذج خلوي بسيط قابل للإثارة لخلايا HEK المعدلة وراثيا. باستخدام صبغة قياس الجهد الفلورية ، تمت مراقبة التغيرات في جهد الغشاء تحت المجهر الفلوري ، وتم استخراج المعلمات ذات الصلة لاستجابات الخلية تلقائيا باستخدام تطبيق MATLAB. بهذه الطريقة ، يمكن تقييم استجابات الخلية القابلة للإثارة للنبضات الكهربائية المختلفة والتفاعل بين الإثارة والتثقيب الكهربائي بكفاءة.
المقدمة
في التثقيب الكهربائي ، تتسبب النبضات الكهربائية عالية الجهد في زيادة نفاذية غشاء البلازما للجزيئات التي تكون ضعيفةالنفاذ 1. تستخدم التقنيات القائمة على التثقيب الكهربائي في الوقت الحاضر على نطاق واسع في التطبيقات في الطب2 ، والتكنولوجيا الحيوية3 ، وتكنولوجيا الأغذية4.
تعد الخلايا القابلة للإثارة مثل الخلايا العصبية والعضلية من بين الأهداف الأساسية في العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي الناشئة بسرعة في القلب والدماغ وعضلات الهيكلالعظمي 5. علاوة على ذلك ، يمكن أن تتأثر بالنبضات الكهربائية حتى في العلاجات التي لا تكون فيها الأهداف الأساسية ، ويمكن أن يسبب ذلك آثارا جانبية ضارة مثل الألم وارتعاش العضلات وتلف الأعصاب6. وبالتحديد ، يمكن أن تسبب النبضات الكهربائية تحفيزا كهربائيا للخلايا القابلة للاستثارة: فهي تنشط القنوات الأيونية ذات الجهد الكهربائي وتثير إمكانات العمل (AP). ومع ذلك ، في المجالات الكهربائية الأعلى ، يصبح غشاء بلازما الخلايا منفذا ، ويحدث تيار أيوني إضافي من خلال المسام /العيوب 7. يؤثر هذا التيار الأيوني الإضافي على استثارة الخلية في تفاعل معقد بين الإثارة والتثقيب الكهربائي. لذلك ، لتحسين العلاجات القائمة على التثقيب الكهربائي للأنسجة القابلة للاستثارة وغير القابلة للاستثارة ، هناك حاجة لدراسة تأثيرات النبضات الكهربائية على الخلايا القابلة للاستثارة ، وقنواتها الأيونية ، والاستثارة في المختبر.
في دراسة حديثة8 ، استكشفنا خلايا الكلى الجنينية البشرية المعدلة وراثيا (HEK) التي طورها Cohen et al.9،10 ، كأداة قيمة لدراسة التثقيب الكهربائي في الخلايا القابلة للاستثارة. في هذه الخلايا غير القابلة للإثارة ، يتم التعبير عن الحد الأدنى من قنوات الصوديوم والبوتاسيوم (NaV1.5 و Kir2.1) اللازمة للاستثارة. يتم التحكم في التعبير عن Kir2.1 في هذه الخلايا بواسطة نظام tet-on الناجم عن الدوكسيسيكلين والذي يسمح بإنشاء نوعين مختلفين من الخلايا: S-HEK المرتفع المثير (الذي يحتوي على NaV1.5 و Kir2.1) وخلايا NS-HEK غير القابلة للإثارة (تحتوي فقط على قنوات NaV1.5). هذا يسمح لنا بمقارنة تأثيرات النبضات الكهربائية على المتغيرات القابلة للإثارة وغير القابلة للإثارة من نفس النوع من الخلايا. بالمقارنة مع الخلايا الأولية القابلة للاستثارة المعزولة ، والخلايا القابلة للاستثارة المتمايزة عن الخلايا الجذعية الجنينية أو المستحثة متعددة القدرات ، وخطوط الخلايا المشتقة من الأنسجة القابلة للإثارة ، تتمتع خلايا S-HEK بالعديد من المزايا: فهي سهلة التعامل معها وزراعتها وتكاثرها ، ولها قنوات صوديوم وبوتاسيوم محددة جيدا ، وتولد نقاط وصول قوية8.
لقد صممنا بروتوكولا لمراقبة التغيرات في جهد الغشاء (TMV) الناتجة عن نبضات كهربائية ذات سعات مختلفة باستخدام صبغة جهدية فلورية. بهذه الطريقة ، يمكننا دراسة كيفية تأثير التثقيب الكهربائي على توليد AP في خلايا S-HEK والتغيرات الأخرى في TMV في كل من خلايا S-HEK و NS-HEK. باختصار ، تتعرض خلايا S-HEK أو NS-HEK لنبضة كهربائية واحدة 100 ميكرو ثانية كل دقيقتين ، ويتم تسجيل التغيرات النسبية في التألق لمدة 3 ثوان تقريبا حول كل تطبيق نبض. النبضات المطبقة ذات جهد متزايد ، مما يؤدي أولا إلى تشغيل نقاط الوصول في الخلايا ، وفي مجال كهربائي أعلى ، التثقيب الكهربائي. تم اختيار الفاصل الزمني لمدة دقيقتين بين تطبيق النبض لتقليل التأثيرات التراكمية المحتملة للنبضات المتتالية مع إبقاء التجارب قصيرة بما يكفي لعدم تدهور الخلايا. تمت أتمتة معالجة الصور باستخدام تطبيق MATLAB مخصص لاستخراج المعلمات ذات الصلة لاستجابات التألق للصبغة الجهدية ، وبالتالي تقييم التغييرات في TMV (APs وإزالة الاستقطاب المستمر بسبب التثقيب الكهربائي) في خلايا S-HEK و NS-HEK.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تحضير الكواشف وزراعة الخلايا
- تحضير وسط زراعة الخلايا عن طريق استكمال الجلوكوز المتوسط إلى العالي من النسر المعدل من Dulbecco مع مصل الأبقار الجنيني بنسبة 10٪ ، و 2 ملي مولار الجلوتامين ، والبنسلين - الستربتومايسين (البنسلين 100 وحدة / مل ، الستربتومايسين 100 ميكروغرام / مل) ، 2 ميكروغرام / مل بورومايسين ، 5 ميكروغرام / مل بلاستيسيدين ، و 200 ميكروغرام / مل جينيتين.
- تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 137 ملي كلوريد الصوديوم ، و 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، و 10 ملي مولار ،و 2HPO4 ، و 1.8 ملي مولار KH2PO4 ، درجة الحموضة 7.4. قم بتصفيته من خلال مرشح غشاء معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
- تحضير محلول Tyrode مع 2 ملي كلوريد كلوريد ، 125 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 1 ملي ملي كلوريد2 ، 10 ملي هيبس ، 30 ملي جلوكوز ، درجة الحموضة 7.3. تحضير محلول تيرود منخفض البوتاسيوم مع 0.5 ملي كلوريد كلوريد ، 126.5 ملي كلوريد الصوديوم ، 2 ملي كلوريدالكالسيوم 2 ، 1 ملي ملي كلوريد2 ، 10 ملي هيبس ، 30 ملي جلوكوز ، درجة الحموضة 7.3. قم بتصفية كلا المحاللين من خلال مرشح غشاء معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
- تحضير 1 مجم / مل محلول مخزون بولي إل ليسين عن طريق إضافة 5 مل من PBS في قارورة تحتوي على 5 ملغ من بولي إل ليسين.
- قم بإعداد محلول مخزون الدوكسيسيكلين 2 مجم / مل في الماء المقطر وقم بتصفيته من خلال مرشح غشاء معقم بحجم مسام 0.22 ميكرومتر.
- قم بإعداد محلول مخزون صبغة قياس الجهد 4 ملي مولار ElectroFluor630 في الإيثانول النقي (أضف 25 ميكرولتر من الإيثانول النقي إلى الأنبوب الذي يحتوي على 100 نانومتر - 73 ميكروغرام من الصبغة).
- زراعة خلايا HEK المعدلة وراثيا في قارورة T25 في 6 مل من وسط زراعة الخلية كما هو موضحسابقا 8. مكونات وسط الثقافة حساسة للضوء. وبالتالي ، حافظ على الوسيط محميا من الضوء (لف القارورة المتوسطة بورق الألمنيوم) وقم بالمرور في ظروف الإضاءة المنخفضة.
- قم بتمرير الخلايا كل 3-4 أيام عن طريق زرع 3 × 105 أو 5 × 105 خلايا إلى قارورة T25 جديدة. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. حافظ على الخلايا في قارورة رئيسية كخلايا NS-HEK غير قابلة للاستثارة دون إضافة دوكسيسيكلين لأنها لا تتسامح مع تعبير Kir2.1 المستمر. استخدم خلايا من ممرات أقل من 14 في التجارب.
2. إعداد العينة
- طلاء بولي L-lysine لشرائح الغرفة الزجاجية للغطاء
- ماصة 1 مل من PBS إلى بئر واحد من شرائح الغرفة الزجاجية ذات الغطاء المكون من 2 بئر ، أضف 10 ميكرولتر من محلول بولي ليسين معقم 1 مجم / مل واخلطه جيدا مع ماصة.
- احتضان لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة في ظروف معقمة في غطاء التدفق الرقائقي. قم بإزالة PBS باستخدام poly-L-lysine دون مزيد من الغسيل.
- بذر الخلايا
- قم بإعداد تخفيف 1:10 من محلول مخزون الدوكسيسيكلين في وسط استزراع في أنبوب 1.5 مل. لكل بئر هناك حاجة إلى 30 ميكرولتر من تخفيف الدوكسيسيكلين 1:10 (3 ميكرولتر من محلول مخزون الدوكسيسيكلين و 27 ميكرولتر من وسط الاستزراع) ، قم بإعداد الحجم النهائي اعتمادا على العدد الإجمالي للآبار التجريبية.
- قم بإزالة وسط المزرعة من قارورة T25 وقم بالتربسين بالخلايا باستخدام 2.5 مل من محلول Trypsin-EDTA في حاضنة CO2 عند 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين.
- أضف 2.5 مل من وسط الاستزراع الطازج ، وعن طريق سحب العينة اللطيف ، افصل الخلايا عن السطح. امزج تعليق الخلية جيدا.
- عد الخلايا باستخدام مقياس الدم وتحديد كثافة الخلايا المعلقة.
- احسب حجم معلق الخلية التربسينية اللازم لإنشاء الثقافة. للثقافة لمدة يومين ، قم بالبذور 2.5 × 105 خلايا ، وللزراعة لمدة 3 أيام ، البذور 1 × 105 خلايا لكل بئر. اضبط العدد الدقيق للخلايا إذا لزم الأمر.
- احسب حجم وسط الاستزراع عن طريق طرح حجم تعليق الخلية المحسوب مسبقا من 1470 ميكرولتر. يمثل ال 30 ميكرولتر المتبقية حجم تخفيف الدوكسيسيكلين 1:10. سيكون الحجم الإجمالي في كل بئر 1500 ميكرولتر (الخلايا ، الدوكسيسيكلين ، ووسط الاستزراع).
- لتحضير العينات بخلايا S-HEK القابلة للاستثارة، قم بعمل ماصة الحجم المحسوب لوسط الاستزراع وتعليق الخلية التربسينية في بئر واحد وأضف 30 ميكرولتر من تخفيف الدوكسيسيكلين 1:10. استخدم بئر واحد فقط من الغرفتين المكونتين لأن التجربة تستغرق وقتا طويلا (حوالي 40 دقيقة). تخلط جيدا عن طريق سحب العينة اللطيف قبل وضع الغرف في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 .
- لتحضير عينات بخلايا NS-HEK غير قابلة للاستثارة، قم بتقطيع الحجم المحسوب لوسط المزرعة في بئر وأضف 90٪ من الحجم المحسوب لتعليق الخلية لخلايا S-HEK بدون الدوكسيسيكلين. تنمو خلايا NS-HEK بشكل أسرع قليلا من خلايا S-HEK.
- احتضان الغرف في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5 ٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام قبل التجربة. بالنسبة للعينات التي تحتوي على الدوكسيسيكلين ، فإن وقت الحضانة هذا كاف لجعل الخلايا قابلة للاستثارة.
- تسمية الخلايا
- قبل التجربة ، قم بإخراج 3 ميكرولتر من محلول مخزون الصبغة الجهدية إلى أنبوب سعة 1.5 مل وترك الأنبوب المفتوح في درجة حرارة الغرفة في غطاء تدفق رقائقي للسماح للإيثانول بالتبخر وتجفيف الصبغة الجهدية (حوالي 15 دقيقة). أضف 997 ميكرولتر من وسط الاستزراع البارد (من الثلاجة عند 4 درجات مئوية) إلى الأنبوب وقم بإذابة الصبغة إلى تركيز نهائي يبلغ 12 ميكرومتر.
- قم بإزالة وسط الثقافة من البئر وأضف 1 مل من محلول صبغة قياس الجهد إلى الخلايا. ضعيها في الثلاجة على حرارة 4 درجات مئوية واحتضنها لمدة 20 دقيقة.
- قم بإزالة محلول صبغة قياس الجهد واحتفظ به في الأنبوب لإعادة استخدامه مرة أخرى (لما يصل إلى ست تجارب متسلسلة في يوم واحد).
- اغسل الخلايا برفق 3 مرات بمحلول Tyrode ، وبعد الغسيل الأخير ، قم بإدخال 1 مل من محلول Tyrode منخفض البوتاسيوم في البئر.
3. التحفيز الكهربائي والتثقيب الكهربائي
- قم بتكوين مزامنة توصيل النبضة مع الحصول على الصور باستخدام إشارة TTL من نظام المجهر الذي يقوم بتشغيل مولد النبض. لتوليد نبضات عالية الجهد ، استخدم مولد نبضمخصص 11 أو أي مولد نبض يمكن تشغيله خارجيا باستخدام إشارة TTL.
ملاحظة: في التكوين التجريبي المقدم، يتم إستخدام برنامج LAS X للحصول على الصور، والتي يمكن تهيئتها لإرسال إشارة TTL في وقت محدد مسبقا أثناء الحصول على اللقطات المتتابعة. - ضع قطبين متوازيين من الأسلاك Pt / Ir ، بقطر 0.8 مم ومسافة 5 مم بين الحواف الداخلية ، في الجزء السفلي من الغرفة وقم بتثبيت الغرفة تحت المجهر.
- قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية بمولد النبض. قم بتوصيل خرج مولد النبض براسم الذبذبات باستخدام جهد ومسبار تيار لتمكين التحقق من أن النبضات قد تم تسليمها بشكل صحيح أثناء التجربة.
- ركز الخلايا في المجال الساطع. قم بتصوير الخلايا الموجودة في المنتصف تقريبا بين الأقطاب الكهربائية.
- ابدأ أول عملية استحواذ على صور مضان في وضع الفاصل الزمني بهدف 40x ، وتسجيل إشارة التألق في مجال الرؤية بأكمله. يجب أن تكون الكاميرا سريعة بما يكفي للحصول على مسار زمني واضح لإمكانات الفعل (من الناحية المثالية أعلى من 25 إطارا / ثانية).
- احصل على 80 صورة في وضع اللقطات المتتابعة، مع ما لا يقل عن 25 إطارا/ثانية لحل مسار جهد الإجراء في الوقت الفعلي. ينتج عن المدة الإجمالية للحصول على الصور حوالي 3 ثوان. أثناء الحصول على الصورة ، قم بإضاءة الخلايا بطول موجي للإثارة يبلغ 635 نانومتر ، ووقت التعرض 10 مللي ثانية ، واكتشف الانبعاث عند حوالي 700 نانومتر. في هذا الاستحواذ الأول ، لا تطبق أي نبض - سيتم استخدام هذا الاستحواذ لتصحيح عمليات الاستحواذ اللاحقة للتبييض الضوئي للصبغة. بعد هذا الاستحواذ ، انتظر لمدة 2 دقيقة.
ملاحظة: تستخدم هذه التجربة 27.8 إطارا/ثانية، أي فترة 36 مللي ثانية، وهي الفترة من بداية الحصول على الصورة الأولى إلى بداية الحصول على الصورة التالية في تسجيل اللقطات المتتابعة).
- احصل على 80 صورة في وضع اللقطات المتتابعة، مع ما لا يقل عن 25 إطارا/ثانية لحل مسار جهد الإجراء في الوقت الفعلي. ينتج عن المدة الإجمالية للحصول على الصور حوالي 3 ثوان. أثناء الحصول على الصورة ، قم بإضاءة الخلايا بطول موجي للإثارة يبلغ 635 نانومتر ، ووقت التعرض 10 مللي ثانية ، واكتشف الانبعاث عند حوالي 700 نانومتر. في هذا الاستحواذ الأول ، لا تطبق أي نبض - سيتم استخدام هذا الاستحواذ لتصحيح عمليات الاستحواذ اللاحقة للتبييض الضوئي للصبغة. بعد هذا الاستحواذ ، انتظر لمدة 2 دقيقة.
- كل دقيقتين، سجل فاصلا زمنيا بنفس الطريقة كما في الخطوة 3.5. بالنسبة لعمليات الاستحواذ هذه ، قم بتطبيق نبضة واحدة 100 ميكرو ثانية في وقت الحصول على الصورة العاشرة (عند 324 مللي ثانية). احصل على صور بجهد النبض التالي: 63 فولت ، 75 فولت ، 88 فولت ، 100 فولت ، 125 فولت ، 150 فولت ، 175 فولت ، 200 فولت ، تقدير المجال الكهربائي الذي تتعرض له الخلايا كنسبة الجهد إلى المسافة المطبقة (E = 126 ، 150 ، 176 ، 200 ، 250 ، 300 ، 350 ، و 400 فولت / سم).
ملاحظة: في المجالات الكهربائية المنخفضة ، ستؤدي النبضات إلى تشغيل إمكانات الفعل. في المجالات الكهربائية الأعلى ، ستؤدي إلى التثقيب الكهربائي ، والذي يتجلى في إزالة الاستقطاب لفترات طويلة. تبلغ مدة التجربة على كل عينة من الخلايا حوالي 40 دقيقة (20 دقيقة لوضع العلامات و 20 دقيقة للفحص المجهري).
4. تحليل البيانات
- قم بتصدير تسجيلات اللقطات المتتابعة إلى تنسيق tiff.
- ضع تسجيلات الفاصل الزمني لجميع الفولتية المطبقة أثناء تجربة فردية (عينة واحدة من الخلايا) في مجلد واحد. أعد تسمية تسجيلات اللقطات المتتابعة في شكل يمكن التعرف على المجال الكهربائي E بواسطة تطبيق MATLAB: Vcm (على سبيل المثال ، 126 فولت سم ل 126 فولت / سم). يمكن أن تكون الأجزاء المتبقية من الاسم تعسفية. للاستحواذ في بداية التجربة حيث لا يتم تطبيق النبض ، أعد التسمية باستخدام العبارة 000Vcm. مثال على أسماء تسجيل الفاصل الزمني: 2022_1_20 1DOX 000Vcm ، 2022_1_20 1DOX 126Vcm ، 2022_1_20 1DOX 150Vcm ، إلخ.
- افتح التطبيق ، والذي يمكن تنزيله من
https://github.com/bor-kos/fluorescenceActionPotential. انقر فوق تحديد مجلد البيانات لاختيار المجلد الذي يحتوي على تسجيلات اللقطات المتتابعة لتجربة واحدة. - حدد وحدات البكسل المراد استخدامها لمزيد من تحليل البيانات. للقيام بذلك ، استخدم منزلكين لتحديد العتبة المنخفضة لصورة واضحة للأغشية (باللون الأرجواني) والعتبة العالية للتخلص من الحطام (البقع الكبيرة ذات التألق العالي) من التحليل (باللون الأخضر).
- حدد تحليل البيانات. في علامة التبويب تحليل، يظهر جدول يحتوي على معلمات مستخرجة. على الجانب الأيمن من الجدول ، تظهر رسوم بيانية للمضان النسبي في الوقت المناسب لكل E مستخدم. حدد الرسوم البيانية ل E معين من القائمة المنسدلة على الجانب الأيسر أعلى الجدول.
- افحص جميع الرسوم البيانية وقم بإجراء التصحيح اليدوي في حالة اكتشاف الذروة الخاطئ. حدد مسح القمم التلقائية في الجزء السفلي في علامة التبويب تحليل، ويتم مسح القمم التي تم اكتشافها تلقائيا. انقر فوق الرسم البياني لتحديد نقطة وقت الذروة الجديدة يدويا.
- حدد إعادة تشغيل اكتشاف الذروة التلقائي في الجزء السفلي في علامة التبويب تحليل لإجراء اكتشاف الذروة التلقائي مرة أخرى. سيتم الآن تعديل المعلمات المستخرجة إلى الذروة الجديدة.
- حدد تصدير البيانات في أسفل يسار علامة التبويب تحليل لتصدير البيانات إلى نفس المجلد في شكل ملف .mat وملف جدول بيانات وصور PNG لكل E مستخدم.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يمكن مراقبة التغييرات في TMV في الخلايا القابلة للإثارة في المختبر الناتجة عن النبضات الكهربائية بصريا باستخدام هذا البروتوكول ، ويمكن تحليل إشارات التألق لاستخراج المعلمات ذات الصلة.
يظهر الإعداد التجريبي في الشكل 1 أ. تظهر إشارة نموذجية من 100 ميكرو ثانية نبضة كهربائية مستخدمة في التجارب في الشكل 1 ب. عادة ما تبدو الخلايا الموجودة في الغرف الموضوعة تحت المجهر مثل الخلايا الموجودة في الشكل 1 ج (...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
خلايا S-HEK هي نموذج خلوي بسيط قابل للإثارة مع قنوات صوديوم وبوتاسيوم محددة جيدا ، NaV1.5 و Kir2.19. يمكننا هذا من إجراء دراسات متعمقة حول كيفية استجابة الخلايا القابلة للإثارة للنبضات الكهربائية المطبقة وربط البيانات التجريبية بالنماذج الرياضية بناء على الخصائص النظرية المعروفة للقنوات المعبر عنها في خلايا S-HEK. في دراستنا السابقة8 ، وصفنا استجابات هذه الخلايا لنبضات 100 ميكرو ثانية لزيادة E تجريبيا ونظريا. في E السف...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل الوكالة السلوفينية للبحث والابتكار (ARIS) ضمن برنامج البحث P2-0249 ، وبرنامج البنية التحتية I0-0022 ، والمشروع البحثي J2-2503. تم دعم العمل جزئيا من قبل ARIS وجامعة ليوبليانا من خلال تمويل برامج البحث المبتدئة. تم دعم العمل جزئيا من قبل الاتحاد الأوروبي و ARIS من خلال تمويل NextGenerationEU و NOO ضمن المشروع MN-0023. تم دعم العمل جزئيا من قبل الاتحاد الأوروبي من خلال منحة ERC الابتدائية (رقم 101115323 - التناسخ) وزمالة ماري سكودوفسكا-كوري (رقم 893077 - EPmIC). ومع ذلك ، فإن الآراء والآراء المعبر عنها هي آراء المؤلف (المؤلفين) فقط ولا تعكس بالضرورة آراء الاتحاد الأوروبي أو مجلس البحوث الأوروبي. لا يمكن تحميل الاتحاد الأوروبي ولا السلطة المانحة المسؤولية عنها. يشكر المؤلفون مجموعة آدم إي كوهين من جامعة هارفارد على التفضل بتقديم خلايا HEK المتصاعدة وDuša Hodžić لمساعدتها في مختبر زراعة الخلايا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 1.5 مل أنبوب | Ratiolab ؛ | 5615000 | |
| 2-well Nunc Lab-Tek II Chambered # 1.5 نظام الغطاء الألماني | Thermo Fisher Scientific | 155379 | |
| ADP305 مسبار الجهد التفاضلي | Teledyne LeCroy | ||
| AP015 المسبار الحالي | Teledyne LeCroy | ||
| Blasticidin ؛ | ثيرمو فيشر العلمية | A1113903 | |
| حاضنة CO2 | PHCbi | MCO -230AICUV | |
| دوكسيسيكلين ; | سيجما ألدريتش / ميرك | D9891 | |
| Dulbecco s تعديل النسر s متوسط نمو الجلوكوز العالي | Sigma-Aldrich / Merck | D5671 | |
| ElectroFluor630 (Di-4-ANEQ (F) PTEA) | مجسات قياس الجهد | 31795 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma-Aldrich / Merck | F2442 | |
| Geneticin | Thermo Fisher Scientific ؛ | 10131035 | |
| الجلوتامين | سيجما ألدريتش / ميرك | G7513 | |
| غطاء التدفق الصفحي | Iskra Pio & nbsp ؛ | MC 15-2 | |
| MATLAB | Mathworks | ||
| Penicillin & ndash ؛ الستربتومايسين | سيجما ألدريتش / ميرك | P07681 | |
| بولي إل ليسين هيدروبروميد ؛ | سيجما ألدريتش / ميرك | P9155-5MG | |
| مولد النبض | حسب الطلب | انظر المرجع11 | |
| Puromycin | Thermo Fisher Scientific | A1113803 | |
| T25 25 سم & sup2 ؛ قارورة زراعة الأنسجة | TPP | 90026 | |
| Tet-on Spiking خلايا HEK | مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC | CRL-3479 | |
| نظام الخلية الحية لجهاز التصوير الرعدي للفحص المجهري الفلوري | Leica Microsystems | ||
| حل التربسين-EDTA | سيجما ألدريتش / ميرك | T3924 | |
| WavePro 7300A راسم الذبذبات | Teledyne LeCroy |
المراجع
- Kotnik, T., Rems, L., Tarek, M., Miklavčič, D. Membrane electroporation and electropermeabilization: Mechanisms and models. Ann Rev Biophys. 48 (1), 63-91 (2019).
- Yarmush, M. L., Golberg, A., Serša, G., Kotnik, T., Miklavčič, D. Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges. Ann Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).
- Kotnik, T., et al. Electroporation-based applications in biotechnology. Trend Biotechnol. 33 (8), 480-488 (2015).
- Mahnič-Kalamiza, S., Vorobiev, E., Miklavčič, D. Electroporation in food processing and biorefinery. J Memb Biol. 247 (12), 1279-1304 (2014).
- Reddy, V. Y., et al. Pulsed field or conventional thermal ablation for paroxysmal atrial fibrillation. New Engl J Med. 389 (18), 1660-1671 (2023).
- Cvetkoska, A., Maček-Lebar, A., Trdina, P., Miklavčič, D., Reberšek, M. Muscle contractions and pain sensation accompanying high-frequency electroporation pulses. Sci Rep. 12 (1), 8019(2022).
- Tung, L., Tovar, O., Neunlist, M., Jain, S. K., O'neill, R. J. Effects of strong electrical shock on cardiac muscle tissue. Ann New York Acad Sci. 720 (1), 160-175 (1994).
- Batista Napotnik, T., et al. Genetically engineered HEK cells as a valuable tool for studying electroporation in excitable cells. Sci Rep. 14 (1), 720(2024).
- McNamara, H. M., Zhang, H., Werley, C. A., Cohen, A. E. Optically controlled oscillators in an engineered bioelectric tissue. Phys Rev X. 6 (3), 031001(2016).
- Tian, H., et al. Video-based pooled screening yields improved far-red genetically encoded voltage indicators. Nat Methods. 20 (7), 1082-1094 (2023).
- Sweeney, D. C., et al. Quantification of cell membrane permeability induced by monopolar and high-frequency bipolar bursts of electrical pulses. Biochim Biophys Acta Biomembranes. 1858 (11), 2689-2698 (2016).
- Pakhomov, A. G., et al. Long-lasting plasma membrane permeabilization in mammalian cells by nanosecond pulsed electric field (nsPEF). Bioelectromagnetics. 28 (8), 655-663 (2007).
- Lee, P., et al. In vivo ratiometric optical mapping enables high-resolution cardiac electrophysiology in pig models. Cardiovasc Res. 115 (11), 1659-1671 (2019).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
