مقالة منهجية

القياس الكمي المجهري في الوقت الفعلي وعالي الإنتاجية لإطلاق مصيدة العدلات البشرية خارج الخلية وتقييم علم الأدوية للمضادات

DOI:

10.3791/67258

⸱

أكتوبر 18, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Citryll B.V.

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول المحدد نهج الفحص المجهري عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي لتصور وتحديد إطلاق مصيدة العدلات البشرية خارج الخلية (NET) في المختبر. تسمح الطريقة القابلة للتكرار بالتحقيق في خصائص وحركية إطلاق NET عند التحفيز باستخدام محفزات NETosis المميزة وتمكن من تقييم علم الأدوية لمضادات NETosis.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب العدلات دورا مهما في الدفاع المناعي الفطري باستخدام عدة استراتيجيات ، بما في ذلك إطلاق مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) في عملية يشار إليها باسم NETosis. ومع ذلك ، في العقدين الماضيين ، أصبح من الواضح أن تراكم NETs في الأنسجة يساهم في الفيزيولوجيا المرضية للعديد من الأمراض الالتهابية وأمراض المناعة الذاتية. لذلك ، ارتفع الاهتمام بتطوير مضادات NETosis. تم تطوير طرق متغيرة وغير موحدة لاكتشاف وتحليل NETosis بشكل متزامن ، ولكل منها مزاياها وقيودها. هنا ، نصف طريقة الفحص المجهري في الوقت الفعلي لتقدير إفراز NET البشري ، مما يسمح بدراسة NETosis بالإضافة إلى تثبيط NET بطريقة عالية الإنتاجية. يتعرف التحليل شبه الآلي المستند إلى مساحة السطح على الشبكات الشبكية ويميزها عن العدلات المنشطة غير الشبكية. نوضح أن محفزات NETosis غير الفسيولوجية ، أيونوفور الكالسيوم و phorbol-12-myristate-13-acetate (PMA) ، تؤدي إلى إطلاق NETs ذات الخصائص الحركية المختلفة. علاوة على ذلك ، نوضح أن هذا النهج يسمح بدراسة إطلاق NET استجابة للمنبهات ذات الصلة بالأمراض ، بما في ذلك المجمعات المناعية ، N-Formylmethionine-leucyl-phenylalanine (fMLF) ، بلورات اليورات أحادية الصوديوم ، وبلورات بيروفوسفات الكالسيوم. لتوضيح فائدة هذه الطريقة لدراسة مضادات NETosis ، استخدمنا CIT-013 ، وهو مثبط للأجسام المضادة أحادية النسيلة الأول من نوعه لإطلاق NET. يستهدف CIT-013 هيستون H2A و H4 الرقائقي ويمنع بكفاءة إطلاق NET باستخدام IC50 من 4.6 نانومتر. تفتقر الأجسام المضادة الأخرى المضادة للهيستون التي تم اختبارها إلى هذه القدرة المثبطة للمتلازمة. إجمالا ، نوضح أن هذا البروتوكول يتيح القياس الكمي عالي الإنتاجية المحدد والموثوق به والقابل للتكرار ل NETs ، مما يعزز دراسة خصائص إطلاق NET ، والحركية ، وعلم الأدوية لمضادات NETosis.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توجد العدلات بكثرة في الدم وتهاجر إلى الأنسجة عند الإصابة أو الالتهاب. يلعبون دورا مهما في الدفاع المناعي الفطري باستخدام أسلحة واسعة لحماية المضيف من الميكروبات. تقتل العدلات مسببات الأمراض عن طريق البلعمة ، والتحلل ، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، وإطلاق الكروماتين غير المكثف المسمى مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) من خلال عملية تسمى NETosis1. NETs عبارة عن هياكل خارج الخلية من الكروماتين مزينة ، من بين أمور أخرى ، ببروتينات حبيبية وكالبروتكتين2،3 ، ويتم إطلاقها عند التحفيز مع مجموعة واسعة من الجزيئات4. يمكن تصنيف NETosis على نطاق واسع إلى مسارين رئيسيين: NADPH المعتمد على أوكسيديز NADPH أو مستقل5،6،7. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط سيترولين الأرجينين لذيول هيستون N-terminal بواسطة الببتيديل أرجينين ديميناز 4 (PAD4) ارتباطا وثيقا ب NETosis ويعزز إزالة تكثيف الكروماتين مما يؤدي في النهاية إلى طرد الكروماتين غير المكثف في البيئة خارج الخلية.

على الرغم من أن إطلاق NET يشارك في القضاء على مسببات الأمراض ، فقد أظهرت العديد من الدراسات أن إطلاق NET غير الطبيعي والمطول مرتبط بتطور الاضطرابات الالتهابية المختلفة ، بما في ذلك إصابة الرئة الحادة8 ، والتهاب المفاصل الروماتويدي (RA) 9 ، والتهاب الأوعيةالدموية 10 ، والتهاب الغدد العرقية القيحي11. الدور الضار ل NETs في المرض متعدد الأوجه لأن NETs مسببة للالتهابات ، وهي مصدر للمستضدات الذاتية ، وهي سامة للخلايا للأنسجة المحيطة ، وتؤدي إلى تجلط المناعة ، وتعزز تمايز ناقضات العظم وتآكل العظام9،12،13. يوضح التثبيط الدوائي لمسار NETosis بواسطة مثبطات PAD4 الجزيئية الصغيرة أن العلاجات التي تستهدف NETosis لها القدرة على أن تكون علاجات للأمراض التي يكون فيها تراكم NET محركا مهما للتسبب فيالمرض 14. بدلا من استهداف إنزيم PAD4 ، استخدمنا NETosis الأول من نوعه الذي يثبط الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد للهيستون المتوافق مع البشر ، CIT-013 ، والذي يرتبط على وجه التحديد بالهيستونات H2A و H415. CIT-013 لديه آلية عمل مزدوجة فريدة من نوعها عن طريق تثبيط إطلاق NET وتعزيز البلعمة الصافية بوساطة البلاعم16. أظهرت CIT-013 وجزيئات السلائف فعالية علاجية في نماذج الفئران المتعددة للالتهاب المرتبط ب NET17.

لدراسة إطلاق NET ، تم تطوير طرق مختلفة على مر السنين ، مثل على سبيل المثال لا الحصر 1) الكشف عن الحمض النووي باستخدام متتبع الحمض النووي غير منفذ لغشاء البلازما بالاشتراك مع قارئ الألواح المناعية الفلورية ، 2) الكشف القائم على مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للحمض النووي ومركب الحمض النووي المركب مع البروتينات الخاصة ب NET في المواد الطافية ، 3) التوطين المشترك للجزيئات المرتبطة ب NET مع الحمض النووي خارج الخلية عبر الكيمياء المناعية ، و 4) مناهج قياس التدفق الخلوي للكشف عن العدلات المعاوضة. كل هذه الأساليب لها مزاياها وقيودها. لقد طورنا نهجا عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي للقياس الكمي المجهري لإطلاق NET البشري ، والذي يستخدم صبغة الحمض النووي غير المنفذة لغشاء البلازما16،18. تسمح الطريقة الموصوفة بالتحقيق في حركية NETosis وخصائصها بطريقة سهلة وموثوقة وقابلة للتكرار وتمكن من تقييم علم الأدوية لمضادات NETosis مثل CIT-013.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعطى جميع المتبرعين بالدم موافقة مستنيرة وفقا لإعلان هلسنكي ، وتم إجراء الدراسة وفقا لإرشادات Citryll الأخلاقية للأبحاث البشرية.

ملاحظة: يجب إجراء جميع الأنشطة التي تحتوي على دم الإنسان والعدلات المعزولة في ظروف معقمة في خزانة التدفق الصفيحي. عندما لا يتم ذكر إعدادات الفرامل والتسارع للطرد المركزي في البروتوكول ، يمكن اعتبارها كحد أقصى.

1. عزل العدلات عن الدم

  1. اجمع الدم المحيطي من المتطوعين الأصحاء في أنابيب الليثيوم والهيبارين وانقل الدم إلى أنبوب جديد سعة 50 مل.
  2. اشطف أنابيب الليثيوم والهيبارين ب 1x DPBS وانقلها إلى نفس الأنبوب سعة 50 مل الذي تم نقل الدم إليه. تأكد من أن نسبة الدم إلى DPBS النهائية هي 1: 1. امزج الدم و DPBS عن طريق سحب العينة للحصول على محلول متجانس.
  3. أضف 13 مل من محلول تدرج الكثافة إلى أنبوب جديد آخر سعة 50 مل وأضف ببطء (مع ماصة 25 مل) الدم المخفف 1: 1 فوق محلول تدرج الكثافة بحد أقصى 50 مل.
  4. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم ودرجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 40 دقيقة مع الحد الأدنى من التسارع والفرامل.
    ملاحظة: يتم تشكيل الطبقات. الطبقات من أعلى إلى أسفل هي كما يلي: 1. البلازما. 2. خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) ؛ 3. حل تدرج الكثافة. 4. كريات الدم الحمراء / العدلات.
  5. أولا ، تخلص من البلازما باستخدام ماصة 10 مل ثم تخلص من PBMCs وطبقة محلول تدرج الكثافة باستخدام ماصة باستور بلاستيكية قدر الإمكان دون إزعاج طبقة كريات الدم الحمراء / العدلات.
  6. أعد تعليق طبقة كريات الدم الحمراء/العدلات برفق عن طريق الرج وإعادة التعليق باستخدام ماصة سعة 25 مل في 15 مل من 1x DPBS.
  7. أضف 25 مل من محلول 6٪ ديكستران / 0.9٪ كلوريد الصوديوم ، واخلطه بعشر مرات مع قلب الأنبوب ، واضبط الأنبوب في وضع مستقيم لمدة 25 دقيقة في RT.
    ملاحظة: يتم تشكيل الطبقات. الطبقات من أعلى إلى أسفل هي كما يلي: 1. العدلات. 2 كريات الدم الحمراء.
  8. انقل طبقة العدلات إلى أنبوب جديد سعة 50 مل باستخدام ماصة 10 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 500 × جم و RT.
    ملاحظة: كن حذرا لأن حبيبات العدلات لا تزال تحتوي على بعض كريات الدم الحمراء ولا ترتبط بإحكام بالأنبوب.
  9. تخلص من المادة الطافية عن طريق صب الحبيبات وإعادة تعليق حبيبات الخلية باستخدام ماصة 10 مل في 10 مل من محلول تحلل الأمونيوم وكلوريد البوتاسيوم (ACK) (155 ملي مولار NH4Cl و 10 ملي مولار KHCO3 و 0.1 ملي مولار Na2EDTA ؛ الرقم الهيدروجيني = 7.2) ثم أضف على الفور 40 مل من المخزن المؤقت لتحلل ACK.
  10. احتضن في RT مع عكس الأنبوب باستمرار حتى يصبح المحلول شفافا (يستغرق هذا من 1 إلى 5 دقائق وقد يختلف لكل متبرع) وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 350 × جم و RT.
  11. قم بإزالة المادة الطافية وأضف ببطء وبشكل متساقط 5 مل من وسط المزرعة الذي يحتوي على L-glutamine مكمل بنسبة 10٪ (حجم / حجم) مصل بقري جنيني معطل بالحرارة (FBS) ، و 50 U / مل من البنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (يشار إليه باسم وسط الاستزراع 10٪ فيما بعد) فوق حبيبات العدلات دون تعليق العدلات. سيؤدي ذلك إلى إزالة معظم كريات الدم الحمراء بكفاءة من حبيبات العدلات.
  12. قم بتدوير الأنبوب سعة 50 مل برفق حتى يتم تعليق معظم كريات الدم الحمراء الموجودة أعلى حبيبات العدلات في وسط الثقافة بنسبة 10٪. بعد ذلك ، قم بإزالة المادة الطافية عن طريق صب الأنبوب.
  13. أعد تعليق حبيبات العدلات في 10 مل من وسط المزرعة 10٪ ، وعند إعادة التعليق بالكامل ، أضف ما يصل إلى 50 مل من وسط المزرعة 10٪. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 350 × جم و RT.
  14. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 10 مل من وسط الثقافة 10٪.

2. تلطيخ العدلات للتحقق من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. لتحديد تركيز الخلية ، قم بتخفيف معلق العدلات في محلول تريبان الأزرق بنسبة 0.4٪ (نسبة 1: 1) واحسب العدلات باستخدام عداد خلية المجال الساطع.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام طرق عد أخرى.
  2. انقل 1 × 105 عدلات في وسط مزرعة 10٪ إلى آبار صفيحة V-bottom 96 بئر وجهاز طرد مركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × جم و RT.
  3. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من 1x DPBS مكملا بنسبة 1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل الأبقار (BSA) و 0.1٪ (حجم / حجم) NaN3 (يشار إليه فيما يلي باسم المخزن المؤقت لفرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) يحتوي على كتلة مستقبلات Fc (مخفف 50x).
  4. احتضن لمدة 15 دقيقة في RT وأضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على 50x مخفف APC-Cy7 الفأر المضاد للإنسان CD45 ، 600x المخفف PerCP-Cy5.5 الفأر المترافق المضاد للإنسان CD16 ، 133x المخفف FITC الفأر المترافق المضاد للإنسان CD66b ، و 500x مخفف من صبغة البقاء القابلة للإصلاح eFluor 506.
    ملاحظة: يتم التعبير عن CD45 على الكريات البيض يتم التعبير عن CD66b حصريا في الخلايا المحببة. يتم التعبير عن CD16 بشكل كبير في العدلات ، ويتم التعبير عنه بشكل منخفض في الحمضات ، ولا يتم التعبير عنه في الخلايا القاعدية.
  5. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام وجهاز الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × جم و RT.
  6. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق العدلات في 175 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 400 × جم و RT. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
  7. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق حبيبات العدلات في 175 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS. تحليل العينات باستخدام نظام قياس التدفق الخلوي والبرامج المرتبطة به.

3. تحليل نقاء العدلات باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي

ملاحظة: تم إجراء تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي كما هو موضح في جدول المواد.

  1. قم بإجراء البوابات وفقا للإجراء التالي خطوة بخطوة.
    1. قم بتعيين بوابة زمنية في المؤامرة FSC-A مقابل الوقت لتحديد منطقة ذات تدفق خلوي مناسب.
    2. قم بتعيين بوابة خلية في المؤامرة SSC-A مقابل FSC-A لتحديد الخلايا واستبعاد الحطام.
    3. قم بتعيين بوابة خلية قابلة للتطبيق في المؤامرة FSC-A مقابل AmCyan-A لتحديد الخلايا القابلة للحياة.
    4. قم بتعيين بوابة كريات البيض في المؤامرة FSC-A مقابل APC-Cy7 لتحديد خلايا CD45 +.
    5. قم بتعيين بوابة عدلات في المؤامرة FITC مقابل PerCP-Cy5.5 للتمييز بين CD66b + CD16 + (العدلات) و CD66b-CD16 + (الحمضات) و CD66b-CD16- (الخلايا القاعدية والخلايا الوحيدة والخلايا الليمفاوية).
    6. قم بتعيين بوابة خلية واحدة في المؤامرة FSC-H مقابل FSC-A لتحديد العدلات المفردة.
    7. تحديد نقاء العدلات عن طريق تقديم العدلات المفردة كتردد للخلايا (في بوابة الخلية).
      ملاحظة: للمضي قدما ، يجب أن يتجاوز نقاء العدلات 85٪.

4. الفحص المجهري للتصوير المباشر

ملاحظة: تم تحسين هذا الاختبار للوحات تصوير متعددة ذات 96 بئرا والعديد من محفزات NETosis وخصوماتها. يصف البروتوكول أدناه عرضا عاما للنهج ، والذي يمكن تحديده باستخدام الجداول المضمنة.

  1. تحضير محلول بولي ليسين 0.001٪ عن طريق تخفيف 0.01٪ بولي ليسين في H2O معقم بنسبة 1:10.
  2. أضف 0.001٪ محلول بولي إل ليسين إلى كل بئر واحتضان 1 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
    ملاحظة: يعتمد الحجم لكل بئر على لوحة التصوير المكونة من 96 بئرا (الجدول 1).
  3. اغسل الآبار 3 مرات ب 200 ميكرولتر من DPBS لإزالة البولي إل ليسين الزائد. قم بتنفيذ جميع الخطوات في خزانة التدفق الصفحي. قم بإزالة غطاء اللوحة وجفف الآبار بالهواء عن طريق فتح اللوحة في خزانة التدفق الصفحي حتى تجف (حوالي 1 ساعة).
  4. احسب عدد العدلات المطلوبة للتجربة وانقل الفائض إلى أنبوب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 350 × جم و RT.
    ملاحظة: تختلف كمية العدلات في كل بئر بناء على نوع لوحة التصوير المكونة من 96 بئرا (الجدول 1). تم تحسين كثافة الخلية للسماح بالفصل الجيد للخلايا الفردية ، وهو أمر مطلوب للتحليل المناسب. إذا كانت كثافة العدلات عالية جدا ، فسوف تتداخل الخلايا والشبكات مع الخلايا المجاورة والشبكات الشبكية ، مما يؤثر على جودة التحليل.
  5. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق العدلات في وسط مزرعة بدون فينول أحمر مكمل بنسبة 2٪ (v / v) FBS ، و 50 U / مل بنسلين ، و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 10 ملي مولار HEPES ، و 1 ملي مولار CaCl2 (يشار إليه فيما يلي باسم المخزن المؤقت لفحص NET فيما بعد).
  6. إعداد حلول العمل التالية.
    1. قم بإعداد صبغة الحمض النووي 80 نانومتر في المخزن المؤقت لفحص NET.
    2. قم بإعداد محفزات NETosis في المخزن المؤقت لمقايسة NET.
    3. تحضير مضادات NETosis في المخزن المؤقت لفحص NET.
      ملاحظة: اعلم أن تركيزات محاليل العمل الموصوفة أعلاه هي 4 أضعاف التركيز النهائي المطلوب في البئر. تختلف التركيزات الموصى بها من محفزات NETosis ومضادات NETosis (الجدول 2 والجدول 3).
  7. أضف صبغة الحمض النووي المركزة 4x في المخزن المؤقت لفحص NET لكل بئر.
  8. أضف 4x محفزات NETosis المركزة في المخزن المؤقت لفحص NET إلى الآبار المقابلة ، وأضف المخزن المؤقت لمقايسة NET فقط إلى الآبار التي لا تحتوي على محفز أو إلى الآبار التي تحتوي على مجمعات مناعية مغلفة (cIC ؛ بروتوكول في الجدول 2).
  9. أضف 4x مضادات NETosis المركزة في المخزن المؤقت لمقايسة NET إلى الآبار المقابلة. أضف المخزن المؤقت لمقايسة NET فقط إلى الآبار التي لا تحتوي على خصم.
  10. أضف تعليق العدلات إلى كل بئر.
    ملاحظة: يعتمد حجم صبغة الحمض النووي المركزة 4x ، ومنبهات NETosis المركزة 4x في المخزن المؤقت لفحص NET ، ومضاد NETosis المركز 4x في المخزن المؤقت لمقايسة NET ، وعدد العدلات ، وحجم تعليق العدلات لكل بئر على لوحة التصوير المكونة من 96 بئرا (الجدول 1). تجنب تكوين الفقاعات عند سحب العينات.
  11. قم بالطرد المركزي للوحة لمدة دقيقتين عند 100 × جم و RT وأدخل لوحة التصوير المكونة من 96 بئرا في نظام تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية الموضوعة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    ملاحظة: يمكن أن يتطور التكثيف في الجزء السفلي من لوحة التصوير المكونة من 96 بئرا خلال الدقيقة الأولى من الحضانة. يجب إزالة هذا بمنديل.

5. إعداد برنامج نظام تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية للاستحواذ

ملاحظة: تم الحصول على صور تباين الطور والتألق المناعي بواسطة نظام تحليل مجهر الخلايا الحية الذي يتحكم فيه برنامج التحليل الخاص به.

  1. افتح برنامج نظام تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية وانقر فوق الاتصال بالجهاز. أدخل اسم المستخدم وكلمة المرور. انقر فوق جدولة للحصول عليها وانقر فوق زر علامة الجمع (تشغيل إضافة سفينة). بعد ذلك، حدد مسح ضوئي عند الجدول الزمني وانقر فوق التالي.
  2. لإنشاء سفينة جديدة من البداية، حدد جديد في قسم إنشاء سفينة وانقر فوق التالي. حدد قياسي في قسم نوع المسح الضوئي وانقر فوق التالي.
  3. حدد إعدادات الفحص التالية وانقر فوق التالي: خلية تلو الأخرى: لا شيء; قنوات الصورة: تباين الطور والأخضر (وقت الاستحواذ 100 مللي ثانية) ؛ الهدف: 20x.
  4. حدد نوع الوعاء المناسب لمسحه ضوئيا في قسم تحديد الوعاء وانقر فوق التالي.
    1. إذا كنت تستخدم لوحة 96 بئرا # 1 ، فحدد Corning ، لوحة ، 96 ، N / A ، 3603 ، 96-well Corning (Blk / Wht) ، Microplates.
    2. إذا كنت تستخدم لوحة 96 بئرا # 2 ، فحدد Nunc ، Plate ، 96 ، N / A ، 152028 ، 96-well Nunc opt bottom (Blk / Wht) ، Microplates.
  5. حدد موقع الوعاء في الدرج وانقر فوق التالي. في قسم نمط المسح الضوئي ، حدد الآبار التي تحتاج إلى مسح ضوئي ، وحدد عدد الصور لكل بئر (امسح 4 صور لكل بئر للحصول على نظرة عامة تمثيلية) وانقر فوق التالي.
    ملاحظة: لا تحدد الآبار الفارغة لأنها ستؤثر على التركيز البؤري التلقائي.
  6. قم بتوفير معلومات حول الوعاء عن طريق إدراج اسم اللوحة في قسم دفتر ملاحظات السفينة والنقر فوق التالي. حدد تأجيل التحليل إلى وقت لاحق في قسم إعداد التحليل وانقر فوق التالي.
  7. حدد جدول الفحص للسفينة في قسم جدول الفحص . حدد إنشاء جدول جديد مع عمليات المسح الضوئي على فترات زمنية من 1 ساعة. حدد إيقاف المسح الضوئي و 00:05 ساعة بعد الفحص الأول. انقر فوق التالي وانقر فوق إضافة إلى الجدولة عندما تكون معلومات المسح الضوئي صحيحة.
    1. عندما يحتاج جدول المسح إلى التحرير ، انقر نقرا مزدوجا فوق جدول المسح أعلى الشاشة. انقر بزر الماوس الأيمن على جدول المسح الضوئي وقم بتحريره وضبطه حسب الرغبة. انقر فوق رمز القرص المرن لحفظ جدول المسح.
      ملاحظة: عند تصوير أوعية (صفائح) متعددة في نفس التجربة، يمكن إضافة أوعية إضافية إلى جدول الفحص الحالي بالنقر فوق زر علامة الجمع (تشغيل إضافة وعاء)، وتحديد المسح الضوئي حسب الجدول الزمني، والنقر فوق التالي. إما إنشاء وعاء جديد من البداية (انظر الخطوة 5.2 في هذا البروتوكول) ، أو نسخ وعاء موجود ، أو استخدام وعاء تم مسحه ضوئيا مسبقا. ينتج عن هذا مسح ضوئي متسلسل بنفس التردد والإعدادات مثل اللوحة السابقة.

6. تحليل مقايسة NET للفحص المجهري للتصوير الحي باستخدام برنامج تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية

ملاحظة: تم استخدام برنامج تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية لتحليل تباين الطور وصور التألق المناعي (جدول المواد). عند عدم استخدام هذا النظام ، يمكن إجراء تحليل NET مماثل باستخدام حزمة برمجيات الملك العام4 ، 18 ، 19 ، 20.

  1. افتح برنامج تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية وانقر فوق الاتصال بالجهاز. أدخل اسم المستخدم وكلمة المرور وانقر على عرض عمليات الفحص الأخيرة. افتح التجربة المختارة للتحليل بالنقر المزدوج فوق اسم وعاء التجربة.
  2. انقر فوق بدء التحليل وحدد إنشاء تعريف تحليل جديد. انقر فوق التالي.
  3. حدد محلل أساسي من قسم نوع التحليل وانقر فوق التالي. في قسم قناة الصورة ، حدد أخضر، وقم بإلغاء تحديد المرحلة، ثم انقر فوق التالي.
  4. افتح نافذة طبقات الصورة وحدد أخضر وقم بإلغاء تحديد المرحلة. قم بإيقاف تشغيل التحجيم التلقائي في القسم الأخضر وقم بتعيين الحد الأدنى والحد الأقصى للقناة الخضراء يدويا لتمييز NETs عن الخلفية.
    ملاحظة: يمكن تشغيل تباين الطور وإيقاف تشغيله عند الحاجة. على سبيل المثال ، لتحديد ما إذا كانت NETs طردت في البيئة خارج الخلية.
  5. افتح النافذة أوقات فحص السفينة وحدد وقت فحص السفينة المناسب الذي يجب أن تكون فيه NETs. حدد مجموعة من الصور التي تمثل التباين داخل التجربة (صور من آبار التحكم الإيجابية مع NETs وصور من آبار التحكم السلبية بدون NETs). سيتم استخدام هذه الصور لمعاينة التحليل وتحسينه. انقر فوق التالي.
  6. افتح نافذة إعدادات تعريف التحليل وابدأ في ضبط إعدادات التحليل للقناة الخضراء بطريقة يتم فيها تحديد هياكل NET دون إنشاء NETs موجبة أو سالبة خاطئة. استخدم الإعدادات التالية وانقر فوق Preview Current أو Preview All لتطبيق الإعدادات على الصور الحالية أو جميعها، على التوالي.
    1. بالنسبة لاسم الكائن، حدد NETs.
    2. للتجزئة، حدد No Background Subtraction - Adaptive.
    3. بالنسبة إلى الحد القياسي GCU، حدد بين 3 و5 (حسب التجربة).
    4. لتقسيم الحواف، حدد ON (بين -10 و0).
    5. للتنظيف، حدد تعبئة الفتحة: 100 ميكرومتر2 وضبط الحجم: -1 بكسل.
    6. بالنسبة للمرشحات ، حدد اعتمادا على التجربة ، ولكن قيم القطع الموصى بها هي: المساحة: >200 ميكرومتر2 ، متوسط الشدة: <24.6 ، الكثافة المتكاملة: >7000.
      ملاحظة: يتم تحديد الهياكل التي تم تحديدها استنادا إلى الإعدادات المستخدمة باللون الأرجواني. سيوفر التمرير بالماوس فوق هذه الهياكل مزيدا من المعلومات حول معلمات الكائنات (أي المساحة ، والانحراف ، والكثافة المتكاملة ، ومتوسط الكثافة) ، مما يساعد على تحسين التحليل المتعلق بمعايير التضمين أو الاستبعاد لمعلمات NET. تحقق من صور متعددة (من آبار التحكم الإيجابية والسلبية) لاختبار ما إذا كانت إعدادات التحليل صحيحة.
  7. عندما تكون إعدادات تحليل NET صحيحة، انقر فوق التالي. حدد النقاط الزمنية والآبار المراد تحليلها في قسم أوقات المسح والآبار وانقر فوق التالي. أدخل اسم التعريف في قسم حفظ تعريف التحليل وتطبيقه وانقر فوق التالي. انقر فوق إنهاء عند التحقق من معلومات التحليل وصحتها.
    ملاحظة: عند تحليل لوحات متعددة أو استخدام تحليلات من تجارب سابقة، قم بتشغيل التحليل وحدد نسخ تعريف التحليل الحالي أو استخدام تعريف التحليل الحالي وانقر فوق التالي. حدد تعريف التحليل الحالي المناسب وانقر فوق التالي. بالنسبة لإجراء التحليل اللاحق، انتقل إلى الخطوة 6.4 إذا تم اختيار نسخ تعريف التحليل الحالي ، أو الخطوة 6.7 عند اختيار استخدام تعريف التحليل الحالي .
  8. افتح تحليل التجربة بالنقر فوق التحليل داخل الوعاء محل الاهتمام. افتح نافذة مقاييس الرسم البياني .
  9. انقر فوق زر علامة الجمع (إنشاء مقياس). يمكن تقديم البيانات كنسبة مئوية من التقاء NET (النسبة المئوية لمنطقة الصورة المميزة على أنها NET) أو النسبة المئوية للعدلات المعاوضة (عدد العدلات المقسومة على عدد الخلايا).
    1. عند تقديم البيانات كنسبة مئوية من التقاء NET، حدد المنطقة في قسم المقياس وحدد التقاء في قسم القيمة . عند تقديم البيانات كعدلات معاوضة النسبة المئوية، حدد عدد الكائنات في قسم المقياس وحدد لكل صورة في قسم القيمة .
    2. انقر فوق موافق. حدد التقاء منطقة NETs (٪) أو عدد كائنات NETs لكل صورة (لكل صورة) في قسم المقاييس المحددة من قبل المستخدم . حدد جميع النقاط الزمنية التي تحتاج إلى تحليل في قسم تحديد عمليات الفحص . حدد جميع الآبار التي تحتاج إلى تحليل في قسم تحديد الآبار وانقر فوق تصدير البيانات.
  10. حدد الإعدادات التالية في قسم تصدير الرسوم البيانية .
    1. حدد إظهار كل فحص كجدول خاص به (الأعمدة: 1 ، 2 ... الصفوف: أ ، ب ...).
    2. حدد إظهار تسميات الصفوف والأعمدة.
    3. حدد كافة عمليات الفحص في ملف واحد وانقر فوق استعراض لضبط موقع الملف واسمه.
    4. حدد تضمين تفاصيل التجربة في الرأس.
    5. حدد تقسيم البيانات إلى صور فردية.
  11. انقر على تصدير لتصدير البيانات كملف ".txt"، والذي يمكن استيراده وتحليله بشكل أكبر في جدول بيانات.
    ملاحظة: لتحديد النسبة المئوية للعدلات المعاوضة ، يجب تحديد عدد العدلات عند t = 0. للقيام بذلك ، تابع الخطوات التالية للبروتوكول.
  12. انتقل إلى الخطوة 6.1 لبدء التحليل الإضافي الضروري لحساب عدد العدلات للصور عند t = 0.
    1. في الخطوة 6.3، حدد Phase وقم بإلغاء تحديد Green في قسم قناة الصورة.
    2. في الخطوة 6.4، حدد t = 0 في قسم أوقات فحص السفينة.
    3. في الخطوة 6.5، قم بإلغاء تحديد اللون الأخضر، وحدد المرحلة، واضبط إعدادات قناة المرحلة عند الحاجة.
    4. في الخطوة 6.6، أضف اسم الكائن، وحدد التقاء كلاسيكي في قسم التجزئة وقم بتعيين ضبط التجزئة على 0 (الخلفية)، واضبط تعبئة الثقب على 100 ميكرومتر2، واضبط المساحة على 50 ميكرومتر2.
    5. في الخطوة 6.7، حدد t = 0 في قسم تحديد عمليات الفحص.
    6. في الخطوة 6.8 ، افتح تحليل عدد العدلات.
    7. في الخطوة 6.9، حدد عدد الكائنات لكل صورة (لكل صورة) في قسم المقاييس المعرفة من قبل المستخدم .
    8. أخيرا ، استخدم الحساب التالي لتوليد النسبة المئوية للعدلات المعاوضة: (عدد العدلات / عدد العدلات عند t = 0) × 100٪.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح الفحص المجهري عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي ، جنبا إلى جنب مع صبغة الحمض النووي غير المنفذة ، بدراسة الحركية والخصائص والمسارات الأساسية ل NETosis ويتيح تقييم المثبطات المحتملة لإطلاق NET. باستخدام هذا النهج ، تم تعريف NETs على أنها هياكل إيجابية لصبغة الحمض النووي ذات مساحة سطح أكبر بكثير مقارنة بمساحة سطح العدلات السليمة (الشكل 1 أ) ، مما يشير إلى أن الكروماتين قد تم طرده في البيئة خارج الخلية18. سمح لنا التحليل القائم على مساحة السطح بالتمييز بين NETs والعدلات المنشطة ذات سلامة غشاء البلازما المعرضة للخطر ، مما يدل على تلطيخ الحمض النووي اللامع داخل الخلايا (الشكل 1 أ).

يشيع استخدام أيونوفور الكالسيوم (A23187) و PMA للحث على NETosis في المختبر. على الرغم من كونها محفزات غير فسيولوجية ، إلا أنها ذات قيمة لأنها تنشط مسارات NETosis المميزة وتضمن تحريض متسق ل NETosis مع تباين منخفض بين المتبرعين. يؤدي A23187 إلى تدفق الكالسيوم ، مما يؤدي إلى تنشيط PAD4 وإطلاق NETs الغنية بالهيستونات السترولية ، بينما ينشط PMA مركب NADPH oxidase ، مما يؤدي إلى إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والإفراج اللاحق عن NETs بمستويات منخفضة من الهستونات الكريهة5،16،21. تعتمد سرعة وحجم استجابة NETosis على تركيز كل محفز (الشكل 1 ب ، ج) ، حيث يؤدي A23187 إلى حدوث NETosis بشكل أسرع ، ويؤدي PMA إلى نسبة أعلى من العدلات التي تطلق NETs (الشكل 1D-F). كانت NETs الناتجة عن تحفيز A23187 (الشكل 1D ؛ السهم الأحمر) متميزة عن NETs التي يسببها PMA (الشكل 1D ؛ السهم الأصفر) من خلال كونها أكثر انتشارا خارج غشاء البلازما العدلات ، بينما ظلت NETs التي يسببها PMA أكثر تجاورا لغشاء البلازما العدلات. بالإضافة إلى ذلك ، أدى تحفيز A23187 إلى عدلات إيجابية للحمض النووي غير شبكية (الشكل 1D ؛ السهم الأزرق) ، والتي لم تطرد الحمض النووي الخاص بها إلى الفضاء خارج الخلية. كان الكشف عن العدلات الإيجابية لصبغة الحمض النووي غير النفاذية يعتمد على تركيز A23187 (الشكل 1G) وغائب تقريبا بغض النظر عن تركيز PMA المستخدم لتحفيز NETosis (الشكل 1D ، H). إلى جانب استخدام محفزات NETosis غير الفسيولوجية A23187 و PMA ، فإن هذا الاختبار مناسب أيضا لدراسة المحفزات المتعلقة بالأمراض ل NETosis. على سبيل المثال ، أظهرت العدلات التي يتم تنشيطها بالمجمعات المناعية القابلة للذوبان (sIC) أو البلورات الموجودة في مرض التخلص من بيروفوسفات الكالسيوم (CPPD) زيادة كبيرة في إطلاق NET مقارنة بعدم وجود محفز. لوحظ اتجاه نحو مستويات NET مرتفعة عندما تم تنشيط العدلات بمجمعات المناعة المغلفة (cIC) و fMLP وبلورات اليورات أحادية الصوديوم (MSU) (الشكل 1I). ومع ذلك ، بالنسبة لهذه المحفزات ، لاحظنا تباينا كبيرا من متبرع إلى متبرع.

أظهر التثبيط الدوائي لمسار NETosis والإنزيمات المرتبطة ب NETosis أن العلاجات التي تستهدف NETosis يمكن أن تكون علاجات فعالة للأمراض التي يؤدي فيها تراكم NET بشكل كبير إلى علم الأمراض14،17،22،23،24. يعد اختبار NET المجهري في الوقت الفعلي نهجا سهلا وموثوقا وقابلا للتكرار لدراسة مضادات NETosis بطريقة عالية الإنتاجية. لتوضيح ذلك ، استخدمنا جسما مضادا أحادي النسيلة متوافقا مع البشر من الدرجة الأولى في فئته ، CIT-013 ، والذي يستهدف هيستون H2A و H4 مع تقارب عال15،16. ينشط A23187 مسار NETosis ، مما ينتج عنه NETs تحتوي على هيستونات citrullinated والتي يتم استهدافها لاحقا بواسطة CIT-013 لأداء وظيفتها المثبطة لNETosis 16. في الواقع ، تم تثبيط إصدار NET استجابة ل A23187 تماما بواسطة CIT-013 (الشكل 2 أ والفيديو التكميلي 1) ، مع IC50 من 4.6 نانومتر (الشكل 2 ب). تعد القدرة المثبطة ل NETosis ل CIT-013 فريدة من نوعها لأن الأجسام المضادة التجارية الأخرى التي تستهدف هيستونات مختلفة (غير ) تحتوي على السترولين لم تكن قادرة على تثبيط إطلاق NET (الشكل 2 ج).

في السابق ، أظهرنا أن جزيء سلائف مشابه للغاية ل CIT-013 (يختلف عن اثنين من الأحماض الأمينية ولكنه يربط حواتم متشابهة مع تقارب متساو) يمنع NETosis استجابة للمنبهات الفسيولوجية مثل الصفائح الدموية المنشطة والسائل الزليلي النقرس وكذلك السائل الزليلي RA17. هنا ، نوضح أن إطلاق NET الناجم عن sIC يمكن تثبيطه بواسطة CIT-013 (الشكل 2 د). يتم تسليط الضوء على الأهمية العلاجية لتثبيط NETosis الناجم عن هذا الحافز من خلال SLE و RA وأمراض المناعة الذاتية الأخرى ، حيث تدعم الأجسام المضادة الذاتية في المصل أو السائل الزليلي تكوين IC ، مما يؤدي إلى NETosis25،26.

توضح هذه البيانات معا أن نهج الفحص المجهري عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي مناسب لدراسة حركية وخصائص إطلاق NET ويسمح بدراسة مثبطات NETosis. على الرغم من أن هذه الطريقة قد تم تحسينها لاستخدام العدلات البشرية ، إلا أنها قد تكون مناسبة أيضا لدراسة العدلات من الأنواع الأخرى مع التعديلات. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا الاختبار هي حجر الزاوية في الأساس المنطقي ل CIT-013 كعلاج قوي وفعال للأمراض التي يحركها NET.

figure-results-1
الشكل 1: الفحص المجهري عالي الإنتاجية في الوقت الحقيقي لدراسة إصدار NET. تم تحفيز العدلات المعزولة من دم المتطوعين الأصحاء باستخدام A23187 أو PMA لتحفيز مسار NETosis. تم تصور إطلاق NET من خلال الفحص المجهري عالي الإنتاجية في الوقت الفعلي باستخدام صبغة الحمض النووي غير المنفذة لغشاء البلازما وقياسها كميا بناء على مساحة السطح باستخدام برنامج نظام تحليل الفحص المجهري للخلايا الحية. (أ) تحليل مساحة سطح العدلات السليمة غير المحفزة (الرمادية) ، والشبكات خارج الخلية ، والعدلات غير الشبكية القابلة للاختراق مع تلطيخ الحمض النووي داخل الخلايا (أخضر). (ب ، ج) القياس الكمي لإطلاق NET بمرور الوقت من العدلات المحفزة بتركيزات A23187 أو PMA المشار إليها (ن = 2). (د) صور تمثيلية لإطلاق NET استجابة ل A23187 (الأسهم الحمراء) و PMA (الأسهم الصفراء) في نقاط زمنية مختلفة. يشار إلى أمثلة على العدلات غير الشبكية القابلة للاختراق بأسهم زرقاء. (ه) التقدير الكمي لإطلاق NET بمرور الوقت كنسبة مئوية من التقاء NET (n = 5). تم إجراء الإحصائيات على t = 240 دقيقة. (F) تم تقديم القياس الكمي لإطلاق NET بمرور الوقت كنسبة مئوية من العدلات المعاوضة (ن = 2). (ز ، ح) القياس الكمي للعدلات غير الشبكية القابلة للاختراق بمرور الوقت من العدلات التي تم تحفيزها بتركيزات A23187 أو PMA المشار إليها (ن = 2). (I) القياس الكمي لإطلاق NET عند t = 240 دقيقة الناجم عن المجمعات المناعية القابلة للذوبان (sIC) ، IC المغلفة (cIC) ، fMLP ، بلورات اليورات أحادية الصوديوم (MSU) ، والبلورات الموجودة في مرض التخلص من بيروفوسفات الكالسيوم (CPPD) (ن = 8-28). يتم الإبلاغ عن النتائج كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. ** P < 0.01 ، و ****P < 0.0001 ، مقاييس متكررة ANOVA أحادي الاتجاه مع اختبار Dunnett للمقارنات المتعددة (B) ، اختبار Kruskal-Wallis مع اختبار Dunn للمقارنات المتعددة (I). وقد عدلت اللوحات من الألف إلى الواف بإذن من فان دير ليندن وآخرين 16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: يمنع CIT-013 إطلاق NET. (أ) التقدير الكمي لإطلاق NET الناجم عن A23187 عند t = 240 دقيقة في حالة عدم وجود (لا يوجد Ab) أو وجود CIT-013 أو الجسم المضاد للتحكم في النمط المتماثل (cIgG). (ب) تثبيط يعتمد على الجرعة لإطلاق NET الناجم عن A23187 مع CIT-013 عند t = 240 دقيقة (ن = 3). تم تطبيع البيانات إلى cIgG (تم تعيينها على أنها إصدار NET بنسبة 100٪). (ج) القياس الكمي لإطلاق NET الناجم عن A23187 عند t = 240 دقيقة في وجود تركيزات محددة من CIT-013 ، أو الجسم المضاد H4 المضاد للهيستون ، أو الجسم المضاد هيستون H3 المضاد # 1 ، أو الجسم المضاد هيستون H3 المضاد # 2 (ن = 6). (د) التقدير الكمي لإطلاق NET عند t = 240 دقيقة الناجم عن المجمعات المناعية القابلة للذوبان (ICs) في وجود CIT-013 أو cIgG. يتم الإبلاغ عن النتائج كمتوسط ± الخطأ المعياري للمتوسط. P < 0.0001 ، المقاييس المتكررة ANOVA أحادية الاتجاه مع مقارنات Tukey المتعددة (A) أو اختبار الرتبة الموقعة لأزواج Wilcoxon ذات الذيل المزدوج (D). تم تعديل اللوحات A و B و D بإذن من van der Linden et al.16. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لوحة 96 بئر # 1لوحة 96 بئر # 2
حجم 0.001٪ محلول بولي إل ليسين لكل بئر50 ميكرولتر100 ميكرولتر
حجم تعليق العدلات لكل بئر50 ميكرولتر87.5 ميكرولتر
عدد العدلات لكل بئر2 × 104 خلايا3.5 × 104 خلايا
حجم 4x صبغة الحمض النووي المركزة (= 80 نانومتر) في مخزن NET للاختبار المخزن المؤقت لكل بئر50 ميكرولتر87.5 ميكرولتر
حجم 4x محفزات NETosis المركزة في مخزن NET للاختبار لكل بئر50 ميكرولتر87.5 ميكرولتر
حجم 4x مضادات NETosis المركزة في مخزن NET للاختبار المخزن المؤقت لكل بئر50 ميكرولتر87.5 ميكرولتر

الجدول 1: الأحجام وأرقام الخلايا المحسنة للوحات التصوير المختلفة المكونة من 96 بئرا.

محلول عمل التركيز (4x مركز)التركيز النهائي
أيونوفور الكالسيوم (A23187)50 ميكرومتر12.5 ميكرومتر
سلطة النقد الفلسطينية16 نانومتر4 نانومتر
إف م.لب4 ميكرومتر1 ميكرومتر
بلورات اليورات أحادية الصوديوم (MSU)400 ميكروغرام / مل100 ميكروغرام / مل
بلورات مرض التخلص من بيروفوسفات الكالسيوم (CPPD)400 ميكروغرام / مل100 ميكروغرام / مل
المجمعات المناعية القابلة للذوبان (sIC)1. أضف 5 ميكروغرام / مل من ألبومين المصل البشري (HSA) في DPBS إلى 282.5 ميكروغرام / مل من الأرانب متعدد النسيلة المضاد ل HSA في DPBS.
2. احتضان لمدة 90 دقيقة على الأقل عند 37 درجة مئوية.
3. تجانس عن طريق الدوامة وإضافة 50 ميكرولتر محلول sIC إلى الآبار المقابلة.
المجمعات المناعية المغلفة (cIC)1. أضف 10 ميكروغرام / مل HSA في DPBS في الآبار المقابلة للوحة 96 بئرا.
2. احتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
3. اغسل الآبار 3 مرات ب 200 ميكرولتر 0.05٪ Tween-20 في DPBS (يشار إليها باسم PBS / 0.05٪ Tween فيما بعد).
4. سد الآبار ب 200 ميكرولتر 1٪ (وزن / حجم) ألبومين مصل الأبقار في PBS / 0.05٪ توين (يشار إليه باسم المخزن المؤقت المانع فيما بعد).
5. احتضان لمدة 120 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتحريك لطيف (400 دورة في الدقيقة).
6. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر PBS / 0.05٪ توين.
7. أضف 50 ميكرولتر من الأرانب متعدد النسيلة المضاد ل HSA في منع العازلة إلى الآبار المقابلة.
8. احتضان لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة والتحريك اللطيف (400 دورة في الدقيقة).
9. اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر PBS / 0.05٪ توين.
10. أخيرا ، اغسل الآبار 3 مرات باستخدام 200 ميكرولتر DPBS. الآبار جاهزة الآن للخطوة 4.7 في البروتوكول.

الجدول 2: التركيزات الموصى بها لمحفزات NETosis.

محلول عمل التركيز (4x مركز)التركيز النهائي
الأجسام المضادة ليزوزيم بيض الدجاجة (الجسم المضاد للتحكم ؛ cIgG)80 نانومتر20 نانومتر
CIT-01380 نانومتر20 نانومتر

الجدول 3: التركيزات الموصى بها لمضاد NETosis.

فيديو تكميلي 1. تم تحفيز العدلات باستخدام A23187 في وجود cIgG (يسار) أو CIT-013 (يمين) ، وتم تصور إطلاق NET بمرور الوقت باستخدام صبغة الحمض النووي غير المنفذة لغشاء البلازما. يتم تثبيط إطلاق NET في وجود CIT-013. الفيلم عبارة عن تراكب من صبغة الحمض النووي (الأخضر) وتباين الطور. تم الحصول على هذا الفيديو بإذن من van der Linden et al.16. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ اكتشاف NETs في عام 2004 ، تم تطوير العديد من الاستراتيجيات للتحقيق تجريبيا في إطلاق NET في المختبر ، مع كون النسخ المجهري المناعي الفلوري هو الأسلوب الأكثر شيوعا لتحديد NETosis27،28. على الرغم من أن الفحص المجهري مفيد لتصور إصدار NET ، إلا أنه يحتوي على قيود نظرا لأن القياس الكمي المجهري غير الآلي لصور النقطة الزمنية الثابتة غير دقيق إلى حد ما ويمكن أن يعاني من تحيز المراقب. تقنية أخرى مستخدمة لدراسة إطلاق NET هي قياس تدفق التصوير متعدد الأطياف29،30 ، والذي يقيس أعدادا كبيرة من العدلات الشبكية ويعتمد تحليلا غير متحيز ولكنه يركز على العدلات في المراحل المبكرة من NETosis ولا يحدد العدلات التي أطلقت NETs الخاصة بها. تستخدم العديد من الدراسات حول حركية NETosis صبغة الحمض النووي لتحديد إفراز NET بالاشتراك مع قارئ لوحة التألق31. هذه التقنية غير قادرة على التمييز بين NETs والعدلات المنشطة أو المحتضرة مع تلطيخ الحمض النووي داخل الخلايا ، وبالتالي فهي غير مناسبة للقياس الكمي لإطلاق NET ودراسة مضادات NETosis. يؤكد ما سبق أن الأساليب المستخدمة حاليا لدراسة NETosis ذات قيمة ولكن لها حدودها.

تعالج طريقة الفحص المجهري في الوقت الفعلي الموصوفة في هذه الدراسة العديد من المشكلات الموجودة في التقنيات التي تم الإبلاغ عنها سابقا. إنه يوفر كمية NET غير متحيزة وشبه آلية وعالية الإنتاجية وقابلة للتكرار ودقيقة. في الواقع ، يقلل هذا النهج من القطع الأثرية الماصة ، مثل التشكل الممتد ل NETs18 ، وهو قادر على التمييز بين NETosis والنخر وموت الخلايا المبرمج من خلال التشكل والحركية المميزة لإطلاق الحمض النووي18،32. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر هذا النهج الفرصة لدراسة المسارات الكيميائية الحيوية المختلفة لموت الخلايا المنظم ، مثل تكوين NET في العدلات التشريعية ، والتي تولد هياكل تلبي المعايير الوظيفية والظاهرية ل NETs33.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول التي يجب اتباعها من أجل القياس الكمي الناجح للشبكات. أولا ، يعد العدد الصحيح للخلايا لكل بئر مهما لقياس NET بدقة. عندما تكون كثافة العدلات عالية جدا ، ستتداخل الخلايا والشبكات مع الخلايا المجاورة و NETs ، مما يجعل من الصعب تمييزها ، ونتيجة لذلك ، سيصبح القياس الكمي غير دقيق. ثانيا ، من الضروري استخدام تركيز منخفض من صبغة ربط الحمض النووي غير السامة لغشاء البلازما غير السام لتلطيخ NETs عند إفرازها في البيئة خارج الخلية. يمكن لأصباغ ربط الحمض النووي القابلة للاختراق لغشاء البلازما أن تحفز بسهولة تنشيط العدلات أو موت الخلايا. ثالثا ، يجب مسح صور متعددة لكل بئر للحصول على نظرة عامة تمثيلية لإطلاق NET بين مجموعات العدلات غير المتجانسة. رابعا ، صورة تباين الطور للعدلات عند t = 0 ضرورية لتصحيح عدد العدلات لكل صورة وحساب النسبة المئوية للعدلات المعاوضة.

على الرغم من أن نهج الفحص المجهري في الوقت الفعلي عالي الإنتاجية له العديد من المزايا مقارنة بمقايسات الكشف عن NET الأخرى ، إلا أن هناك قيودا على هذه الطريقة لأنه ، على حد علمنا ، لا توجد أصباغ فلورية متاحة للكشف عن مكونات NET الإضافية لتأكيد إطلاق NETs. يمكن استخدام الأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت للكشف عن مكونات NET الإضافية ولكن يمكن أن يكون لها تأثيرات غير مرغوب فيها لأن المجمعات المناعية للأجسام المضادة تؤثر على تنشيط العدلات وربما NETosis. لذلك ، نفضل عدم استخدام أجسام مضادة إضافية في إعداد الفحص هذا ونوصي باستخدام محفزات NETosis المعروفة بدلا من ذلك. عندما لم يتم استخدام محفزات NETosis بعد ، فإننا ندعو إلى استخدام ELISA للكشف عن الحمض النووي المعقد ببروتينات خاصة ب NET مثل الهستونات الcitrullined قبل فحص التصوير الحي. ثانيا ، قد ينتج التباين داخل الفحص وفيما بينه عن التباين من متبرع إلى متبرع ، حيث تستجيب العدلات من المتبرعين الأصحاء بشكل مختلف لمحفزات NETosis المختلفة بسبب عدم التجانس داخل السكان الأصحاء. لتقليل تباين الفحص ، يجب عزل العدلات في غضون ساعة واحدة من الدم المسحب حديثا واستخدامها على الفور في التجربة لأن العدلات قصيرة العمر ولا يمكن حفظها بالتبريد. علاوة على ذلك ، من المهم التحقق من صحة بروتوكول عزل العدلات واعتماده لتقليل تنشيط العدلات. العدلات هي خلايا حساسة ويمكن أن تغير استجابتها للمنبهات أثناء عملية التنقية بسبب الإجهاد الميكانيكي وأنواع أخرى. يمكن أن تتأثر حالة تنشيط العدلات وإطلاق NET بنوع الإبرة وأنابيب جمع الدم المستخدمة ودرجة حرارة الحضانة وسرعة الطرد المركزي والوقت من جمع الدم إلى عزل العدلات34،35،36،37. تم وصف طريقة عزل العدلات الإضافية التي يمكن أخذها في الاعتبار بواسطة Krémer et al.36 باستخدام طريقة الانتقاء المناعي المغناطيسي السلبي دون تحلل خلايا الدم الحمراء. تشبه هذه الطريقة العدلات البكر في الدم الكامل وقد تكون مناسبة لمنع أي تنشيط للعدلات أثناء عملية التنقية. يجب أن يعمل كل ما سبق على تحذير المجال من أن البيانات من مجموعات البحث المختلفة تحتاج إلى المقارنة بعناية فائقة.

بشكل عام ، تتيح طريقة الفحص المجهري عالية الإنتاجية الموصوفة في الوقت الفعلي القياس الكمي الدقيق للشبكات الشبكية بطريقة قابلة للتكرار وفعالة ويمكن استخدامها لدراسة خصائص وحجم وحركية إطلاق NET وتمكن من التحقيق في نشاط مضادات NETosis. كمثال على هذا الأخير ، استخدمنا الجسم المضاد أحادي النسيلة هيستون H2A و H4 CIT-013 المتوافق مع البشر ، والذي هو حاليا قيد التطوير السريري.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون موظفون في Citryll ولديهم مصالح مالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا بول فينك على إدارة جزء من المشروع فيما يتعلق بطريقة الفحص المجهري للتصوير الحي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
A-23187 حمض خال (كالسيمايسين)ثيرمو فيشرA1493
كلوريد الأمونيوم (NH4< / sub>Cl)سيجما ألدريتشA9434
ليزوزيم بيض الدجاجة المضاد للتحكم (الجسم المضاد للتحكم ؛ cIgG)CrownBioC0001
APC-Cy7 المترافق للفأر المضاد للجسم المضاد CD45 للإنسان (استنساخ 2D1) Biolegend368515الاستخدام عند 1 & micro ؛ جم / مل التركيز النهائي
BD FACSCantoTM II نظام + برنامج FACSDiva (الإصدار 8.0.1)  BDn /a نظام قياس التدفق
ألبومين مصل البقر (BSA) الكسر VRoche
CaCl 2< / sub> (1 M) VWRE506
بلورات مرض التخلص من بيروفوسفات الكالسيوم (CPPD) InvivoGenlrl-cppd
السيلومتر التلقائي T4 عداد خلايا المجال الساطع + برنامج التحليل (الإصدار 3.3.9.5)Nexcelom العلومالبيولوجية غير / أعداد خلايا المجال الساطع
CIT-013Citryll BV.ن / أ
كوستار أسود 96 بئر صفيحة, قاع واضح كورنينج360396 بئر لوحة # 1
ديكستران T500فارماكوسموس551005009006
DPBS (1x)جيبكو14190-144
مصل الأبقار الجنيني (FBS) سيريناS-FBS-SA-015
Ficoll & nbsp ؛GE Healthcare17-1440-02محلول تدرج الكثافة
FITC المترافق للجسم المضاد للإنسان CD66b (استنساخ G10F5)eBioscience17-0666-42الاستخدام عند 1.5 & micro ؛ جم / مل التركيز النهائي
صبغة الجدوى القابلة للإصلاح eFluor 506eBioscience65-0866-14
برنامج تحليل قياس التدفقالخلوي FLowJoالإصدار 10.8.0
fMLPSigma Aldrich47729-10MG-F
HEPES (1M)Gibco15630-080
ألبومين مصل الإنسان (HSA)VWR31020
Human TruStain FcX  Biolegend422302كتلة مستقبلات Fc
IBIDI 96-well لوحة ، قاع واضح   ؛IBIDI89626لوحة 96 بئر # 2
IncuCyte SX3 + برنامج التحليل (الإصدار 2022B Rev1)  Satoriusn / aنظام التحليل المجهري للخلايا
الحية بلورات اليورات أحادية الصوديومInvivoGentlrl-msu
الفأر المضاد للهيستون H3 (السيترولين R2 + R8 + R17) الجسم المضاد  كايمان17939استنساخ 11D3 ؛ يشار إليه باسم # 1
الفأر المضاد للهيستون H4 (K8Ac + K12Ac + K16Ac) الجسم المضاد (استنساخ KM-2)الأجسام المضادة المطلقةAb01681-2.0
Na 2< / sub>EDTASigma AldrichE5134
NaCl (0.9٪) B. Braun25900
Penicillin (5000 U / mL) - Streptomycin (5000 & micro ؛ جم / مل)Gibco15070-063
PerCP-Cy5.5 مترافق الفأر المضاد للجسم المضاد للإنسان CD16 (استنساخ 3G8)Biolegend302027الاستخدام عند 0.33 وميكرو ؛ جم / مل التركيز النهائي
PMASigma AldrichP1585
الأرانب متعدد النسيلة الأجسام المضادة ل HSASigma AldrichA0433-2ml
Poly-L-Lysine (0.01٪)Sigma AldrichP4832
بيكربونات البوتاسيوم (KHCO 3< / sub>)سيجما ألدريتش237205
الأرنب المضاد للهيستون H3 (السيترولين R2 + R8 + R17) الجسم المضاد Abcamab281584متعدد النسيلة ؛ يشار إليه باسم # 2
RPMI 1640 مع ملحق GlutaMAXTM   ؛Gibco61870-010وسط الثقافة الذي يحتوي على L-glutamine
RPMI 1640 بدون الفينول الأحمر   ؛Gibco11835-030وسط ثقافة بدون فينول أحمر
أزيد الصوديوم (NaN3< / sub>)Sigma AldrichS2002
معقم H2< / sub>OGibco15230204
Sytox Green Nucleid Acid Stain  Thermo FisherS7020DNA صبغة
محلول تريبان الأزرق (0.4٪)Gibco15250-061
Tween-20Sigma AldrichP1379
أنابيب دم فراغ Li-Heparin (17 وحدة دولية / مل) BD367526
الخلوي 10735108001 مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  2. De Bont, C., Pruijn, G. J. M. Citrulline is not a major determinant of autoantibody reactivity to neutrophil extracellular traps. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 378 (1890), 20220249(2023).
  3. Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathog. 5 (10), e1000639(2009).
  4. Hoppenbrouwers, T., et al. In vitro induction of NETosis: Comprehensive live imaging comparison and systematic review. PLoS One. 12 (5), e0176472(2017).
  5. Kenny, E. F., et al. Diverse stimuli engage different neutrophil extracellular trap pathways. ELife. 6, e24437(2017).
  6. Parker, H., Dragunow, M., Hampton, M. B., Kettle, A. J., Winterbourn, C. C. Requirements for NADPH oxidase and myeloperoxidase in neutrophil extracellular trap formation differ depending on the stimulus. J Leukoc Biol. 92 (4), 841-849 (2012).
  7. Neeli, I., Radic, M. Opposition between PKC isoforms regulates histone deimination and neutrophil extracellular chromatin release. Front Immunol. 4, 38(2013).
  8. Bosmann, M., Ward, P. A. Protein-based therapies for acute lung injury: targeting neutrophil extracellular traps. Expert Opin Ther Targets. 18 (6), 703-714 (2014).
  9. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  10. Shiratori-Aso, S., Nakazawa, D. The involvement of NETs in ANCA-associated vasculitis. Front Immunol. 14, 1261151(2023).
  11. Byrd, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps, B cells, and type I interferons contribute to immune dysregulation in hidradenitis suppurativa. Sci Transl Med. 11 (508), eaav5908(2019).
  12. Kimball, A. S., Obi, A. T., Diaz, J. A., Henke, P. K. The emerging role of NETs in venous thrombosis and immunothrombosis. Front Immunol. 7, 236(2016).
  13. O'Neil, L. J., et al. Neutrophil extracellular trap-associated carbamylation and histones trigger osteoclast formation in rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis. 82 (5), 630-638 (2023).
  14. Li, M., et al. A novel peptidylarginine deiminase 4 (PAD4) inhibitor BMS-P5 blocks formation of neutrophil extracellular traps and delays progression of multiple myeloma. Mol Cancer Ther. 19 (7), 1530-1538 (2020).
  15. Chirivi, R. G. S., et al. Anti-citrullinated protein antibodies as novel therapeutic drugs in rheumatoid arthritis. J Clin Cell Immunol. S6, 006(2013).
  16. Van der Linden, M., et al. Anti-citrullinated histone monoclonal antibody CIT-013, a dual action therapeutic for neutrophil extracellular trap-associated autoimmune diseases. MAbs. 15 (1), 2281763(2023).
  17. Chirivi, R. G. S., et al. Therapeutic ACPA inhibits NET formation: a potential therapy for neutrophil-mediated inflammatory diseases. Cell Mol Immunol. 18 (6), 1528-1544 (2021).
  18. Van der Linden, M., Westerlaken, G. H. A., Van Der Vlist, M., Van Montfrans, J., Meyaard, L. Differential signalling and kinetics of neutrophil extracellular trap release revealed by quantitative live imaging. Sci Rep. 7 (1), 6529(2017).
  19. Hoffmann, J. H. O., Schaekel, K., Gaiser, M. R., Enk, A. H., Hadaschik, E. N. Interindividual variation of NETosis in healthy donors: introduction and application of a refined method for extracellular trap quantification. Exp Dermatol. 25 (11), 895-900 (2016).
  20. Silva, L. M., Moutsopoulos, N., Bugge, T. H., Doyle, A. Live imaging and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Curr Protoc. 1 (7), e157(2021).
  21. De Bont, C. M., Koopman, W. J. H., Boelens, W. C., Pruijn, G. J. M. Stimulus-dependent chromatin dynamics, citrullination, calcium signalling and ROS production during NET formation. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1865 (11 Pt A), 1621-1629 (2018).
  22. Gajendran, C., et al. Alleviation of arthritis through prevention of neutrophil extracellular traps by an orally available inhibitor of protein arginine deiminase 4. Sci Rep. 13 (1), 3189(2023).
  23. Biron, B. M., Chung, C. -S., O'Brien, X. M., Chen, Y., Reichner, J. S., Ayala, A. Cl-Amidine prevents histone 3 citrullination and neutrophil extracellular trap formation, and improves survival in a murine sepsis model. J Innate Immun. 9 (1), 22-32 (2017).
  24. Perdomo, J., et al. Neutrophil activation and NETosis are the major drivers of thrombosis in heparin-induced thrombocytopenia. Nat Commun. 10 (1), 1322(2019).
  25. Lood, C., et al. Neutrophil extracellular traps enriched in oxidized mitochondrial DNA are interferogenic and contribute to lupus-like disease. Nat Med. 22 (2), 146-153 (2016).
  26. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent NET release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  27. De Buhr, N., Von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. J Immunol Res. 2016, 1-13 (2016).
  28. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  29. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
  30. Gavillet, M., et al. Flow cytometric assay for direct quantification of neutrophil extracellular traps in blood samples. Am J Hematol. 90 (12), 1155-1158 (2015).
  31. Sil, P., Yoo, D., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. J Vis Exp. (112), e52779(2016).
  32. Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
  33. D'Cruz, A. A., et al. The pseudokinase MLKL activates PAD4-dependent NET formation in necroptotic neutrophils. Sci Signal. 11 (546), eaao1716(2018).
  34. Nash, G., Abbitt, K., Tate, K., Jetha, K., Egginton, S. Changes in the mechanical and adhesive behaviour of human neutrophils on cooling in vitro. Pflugers Arch. 442 (5), 762-770 (2001).
  35. Hundhammer, T., Gruber, M., Wittmann, S. Paralytic impact of centrifugation on human neutrophils. Biomedicines. 10 (11), 2896(2022).
  36. Krémer, V., Godon, O., Bruhns, P., Jönsson, F., De Chaisemartin, L. Isolation methods determine human neutrophil responses after stimulation. Front Immunol. 14, 1301183(2023).
  37. Freitas, M., Porto, G., Lima, J. L. F. C., Fernandes, E. Isolation and activation of human neutrophils in vitro. The importance of the anticoagulant used during blood collection. Clin Biochem. 41 (7-8), 570-575 (2008).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Neutrophil Extracellular TrapsNETosis AntagonistsReal Time MicroscopyHigh Throughput QuantificationNeutrophil IsolationNET ReleaseLive Cell ImagingMonoclonal Antibody InhibitorPhase Contrast MicroscopyInflammatory Diseases

مقالات ذات صلة