يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بروتوكول لمزارع الزرع للأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة المتحولة IDH1

1.6K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67260

⸱

مايو 9, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

في هذه المقالة

ملخص

IDH1 الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة هي أورام نادرة يصعب زراعتها. نقدم طريقة بسيطة غير إنزيمية للاستنساخ تحافظ على تعبير البروتين المتحور IDH1 وتحافظ على الثقافات لعدة أشهر. الأهم من ذلك ، أن هذه التقنية تعمل مع الأورام المحفوظة بالتبريد ، مما يوفر مصدرا قيما لأبحاث الورم الدبقي.

الملخص

يتم تصنيف الأورام الدبقية المنتشرة ، وهي أورام الدماغ الأولية الأكثر انتشارا ، إلى درجات منخفضة وعالية بناء على المعايير النسيجية المرضية والطفرات الجينية. تشكل الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة مجموعة فرعية تصيب في الغالب الشباب وتؤهب للأورام الدبقية عالية الدرجة. هناك نوعان رئيسيان من الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة: الأورام النجمية والأورام الدبقية قليلة التغصن ، وكل منها يعرف بسمات وراثية ونسيجية مميزة. تظهر هذه الأورام بشكل مميز متغيرا متحورا من إنزيم التمثيل الغذائي IDH1 ، مما يعطل التمايز الخلوي. وهي غير متجانسة ، وتتألف من الخلايا الجذعية التكاثرية والخلايا الدبقية الأكثر تمايزا والهدوء.

تتمتع نماذج الأورام الخاصة بالمريض في المختبر بإمكانيات كبيرة لكشف آليات الأورام وتخصيص اختيار الدواء للعلاج الشخصي. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نماذج موثوقة في المختبر خصيصا للأورام الدبقية منخفضة الدرجة المتحولة IDH1 قد أعاق البحث الأساسي والانتقالي. هنا ، نقدم طريقة بسيطة لزراعة الأورام المتحولة IDH1 كمستخرجات في وسائط محددة دون الحاجة إلى تفكك إنزيمي. يمكن الحفاظ على هذه النماذج المكثفة لفترات طويلة ، مع الحفاظ على تعبير البروتين المتحور IDH1 بالإضافة إلى علامات للخلايا السلفية قليلة التغصن مثل ASCL1 (MASH1) و OLIG1 و OLIG2 وللخلايا النجمية (GFAP ، SOX9). يمكن أيضا أن يتم إنشاؤها من الأورام المجمدة في DMSO. يمكن أن تكون هذه الثقافات بمثابة منصة قيمة لفحص الأدوية والفحص المجهري بالفيديو والدراسات الجينية ، وبالتالي تسهيل التقدم في فهم وعلاج هذه الأورام الصعبة. كما أنها توفر إمكانية اشتقاق خطوط الخلايا الطافرة IDH1.

المقدمة

الأورام الدبقية المنتشرة هي أورام الدماغ الأولية الأكثر شيوعا. هذه الأورام غير قابلة للشفاء حاليا على الرغم من العلاج المكثف للغاية (الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي) < فئة الدعم = "xref" >1. تدعم الأدلة المتزايدة الفرضية القائلة بأن تكوين الورم الدبقي ينشأ من الخلايا الجذعية البالغة أو الخلايا الدبقية الموجودة في الدماغ< فئة الدعم = "xref">2. على الرغم من أن الأورام الأرومية الدبقية تمثل النوع الأكثر عدوانية ، إلا أن الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة (DLGG ، أورام الدرجة 2) منتشرة أيضا (15٪ من الأورام الدبقية المنتشرة) < فئة الدعم = "xref" >1،< sup class = "xref">3. تنمو DLGGs ببطء وتهاجر على طول مسارات المادة البيضاء ، وهي السمة المميزة لهذا الورم "المنتشر" < فئة sup = "xref" >4. غالبا ما تتكرر هذه DLGG على الرغم من العلاج ، وتتطور في النهاية إلى أورام خبيثة عالية الدرجة (الدرجتين 3 و 4) < فئة الدعم = "xref" >5.

تتميز فئة

DLGG بطفرة خاطئة في جين نازعة هيدروجين الأيزوسيترات 1 أو 2 (IDH1 أو IDH2) ، مما يؤدي إلى إنتاج شاذ لأونكوميتابوليت 2-هيدروكسي جلوتارات (2HG). هذا يعطل تمايز الخلايا من خلال الاختلالات اللاجينية < فئة الدعم = "xref" >6. يتم تصنيف الأورام الدبقية الطافرة IDH1 أيضا إلى أنواع فرعية: عادة ما تحتوي الأورام النجمية على طفرات في ATRX و P53 ، بينما تتميز الأورام الدبقية قليلة التغصن بحذف 1p19q < فئة sup = "xref" >7. تظهر هذه الأورام عدم تجانس الخلايا السرطانية. كشف تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والتوصيف المناعي عن مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية ، حيث تعرض أنماطا ظاهرية شبيهة بالخلايا الجذعية ، وشبيهة بالخلايا النجمية ، وشبيهة بالخلايا الدبقية قليلة التغصن داخل هذه الأورام < فئة الدعم = "xref" >8 ، < فئة الدعم = "xref">9.

على عكس الورم الأرومي الدبقي ، الذي يستفيد من الثقافات وخطوط الخلايا المتاحة بسهولة وطويلة الأمد ، هناك ندرة ملحوظة في الأدوات الخلوية المصممة للتحقيق في الأورام المتحولة IDH1 < فئة الدعم = "xref">1. يمثل هذا عقبة كبيرة أمام تطوير العلاج وتعميق فهمنا لتكوين الورم الدبقي المتحور IDH1 وتطور المرض. خطوط الخلايا التقليدية المزروعة في المصل ، على الرغم من استخدامها لفترة طويلة ، إلا أنها لا تكرر الأورام الأصلية بشكل كاف ، وتعرض ملفات تعريف نسخ متغيرة. بدلا من ذلك ، تحافظ ظروف الثقافة الخالية من المصل ، سواء في نماذج الأورام ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد ، بشكل أكثر فعالية على ملامح النسخ للخلايا السرطانية وأنماطها الظاهرية في الجسم الحي ، مثل غزو أنسجة المخ الطبيعية<فئة الدعم = "xref">10،11.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن مزارع الخلايا قصيرة المدى المشتقة من العينة الجراحية للمريض تحافظ على المظهر الجزيئي والتنوع الخلوي للورم ، وبالتالي تمثل بشكل أفضل السمات البيولوجية للأورام مقارنة بخطوط الخلايا< فئة الدعم = "xref">12. هنا ، نقدم طريقة مباشرة غير إنزيمية لزراعة ثقافة الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة المتحولة IDH1 كنباتات مستمدة من استئصال المرضى الطازج أو المجمد ، بهدف تلبية الحاجة إلى نماذج محسنة في المختبر لأبحاث الورم الدبقي والتطوير العلاجي. كما أنها توفر إمكانية اشتقاق خطوط الخلايا الطافرة IDH1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تم الحصول على قطع الأورام المستخدمة في هذا البروتوكول من مجموعة مُحددة الخصائص ومعتمدة أخلاقياً، وبموافقة المرضى. أُجري هذا البحث تحت مشروع بعنوان Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (مشروع رقم RECH/P722/1-5)، وقد تمت الموافقة عليه من قبل المجلس العلمي لبنك الأورام الحيوي في 28 أغسطس 2023.

1. تحضير أطباق المزرعة

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء تدفق صفائحي معقم لزراعة الأنسجة.

  1. قبل الزرع بساعة واحدة على الأقل، قم بتجهيز أطباق ذات 24 بئراً مغلفة بالبولي-دي-لايسين (PDL) واللامينين.
    1. قم بتخفيف 10 mg من مسحوق PDL في 100 mL من محلول البورات المنظم (pH 8.4) للوصول إلى تركيز نهائي قدره 100 µg/mL. وبمجرد الذوبان، قم بترشيح المحلول (0.22 µm) لضمان التعقيم. يصبح PDL جاهزاً للاستخدام؛ قم بتجهيز حصص قدرها 3 mL واحفظها في درجة حرارة -20 °C.
    2. قم بإذابة أنبوب اللامينين بتركيز 1-2 mg/mL عند درجة حرارة 4 °C لتجنب تكوّن هلام. قم بتجهيز حصص قدرها 50 µL واحفظها في درجة حرارة -20 °C.
      ملاحظة: يجب تجنب تكرار عمليات الإذابة والتجميد.
    3. تغليف الأطباق
      1. خطوة اختيارية: ضع أغطية شرائح زجاجية معقمة بقطر 13 mm، مناسبة لأطباق الزرع الخلوي، في طبق ذي 24 بئراً، بمعدل غطاء شريحة واحد لكل بئر.
        ملاحظة: هذه الخطوة مخصصة لإجراء صبغ مناعي لاحق لمستأصلات الورم الدبقي.
      2. لتغليف الآبار، اخلط 3 mL من محلول PDL في 9 mL من 1x PBS وأضف 50 µL من اللامينين. أضف 500 µL من هذا المحلول إلى كل بئر للحصول على تركيز تغليف يتراوح بين 1-2 µg/cm². قم بحضن الأطباق المغلفة في درجة حرارة الغرفة، ويفضل مع رج بطيء (15 RPM)، لمدة ساعة واحدة على الأقل.
      3. قبل الزرع مباشرة، قم بإزالة محلول PDL-laminin واشطف الآبار مرتين باستخدام 1x PBS معقم.
        ملاحظة: لا تترك الآبار تجف.

2. الأوساط

  1. قم بزراعة المستنبتات الطحلبية الطافرة لـ IDH1 في وسط محدد يتكون من DMEM/F12 مضاف إليه L-glutamine، بالإضافة إلى مزيج بديل للمصل يتكون من N2 وB27 بدون Vitamin A. استخدم المضادات الحيوية، بما في ذلك ciprofloxacin وgentamicin وfungin، لمنع التلوث البكتيري والفطري. علاوة على ذلك، أضف عوامل النمو heparin وEGF وFGF2 إلى الوسط، ثم قم بترشيحه (0.2 µm)، واحفظه لمدة تصل إلى أسبوعين عند 4 °C.
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول مكونات الوسط وتحضيره، يرجى الرجوع إلى الجدول 1 وجدول المواد.

3. تحضير المستنبتات

  1. قبل معالجة العينة، قم بتجهيز مساحة العمل والأدوات المعقمة كما هو موضح في الشكل 1A. قم بتطهير عبوة التبريد عن طريق رشها بإيثانول 70%. وعقم المقصات والملاقط عن طريق غمرها في إيثانول 70% وشطفها بمحلول PBS.
  2. انقل الورم المستأصل فوراً للزراعة على الثلج، ويفضل أن يكون ذلك خلال ساعتين من الاستخراج الجراحي (الشكل 1B).
    ملاحظة: يجب أن يكون قطر عينة الورم 9-10 mm كحد أدنى لضمان نتائج أفضل. يتم نقل النسيج بدون وسط زراعي لأن هذه الطريقة مفضلة للأغراض النسيجية. ويمنع غياب السوائل تكون بلورات ثلجية أثناء التجميد السريع، مما يحافظ على سلامة النسيج للفحص النسيجي اللاحق إذا لزم الأمر.
  3. ضع طبق الزراعة الذي يحتوي على عينة الورم فوق عبوة التبريد واشطفه برفق باستخدام 1X PBS لإزالة الدم الزائد.
  4. غالباً ما يظهر الورم المستأصل حجماً كبيراً وعدم تجانس، حيث يتكون من كتلة ورمية، وأنسجة متخللة، ومكونات غير ورمية (الشكل 1C). اختر الأجزاء التي تظهر بلون رمادي وقوام ناعم أو هلامي لعزل الخلايا الورمية، لأنها تميل إلى احتواء عدد أكبر من الخلايا الورمية. وعلى العكس من ذلك، تجنب المناطق الصلبة والبيضاء لأنها قد تحتوي على عدد أقل من الخلايا الورمية المناسبة للزراعة (الشكل 1D)، وكذلك المناطق المسودة، لأنها على الأرجح نتيجة للكي الكهربائي وقد لا تعطي نتائج موثوقة للتحليل.
  5. انقل العينات المختارة إلى أنبوب ميكروي سعة 1.5 mL أو أنبوب تجميد لتقطيعها. أضف 1 mL من الوسط المعقم إلى الأنبوب الميكروي أو أنبوب التجميد، وقم بتقطيع العينة باستخدام المقصات المعقمة حتى يتم الحصول على قطع صغيرة (1-2 mm3).
    ملاحظة: يلزم التقطيع لمدة 1-2 دقيقة تقريباً للحصول على شظايا متناهية الصغر، يتراوح حجمها عادةً بين 1-2 mm3 (الشكل 1E).
  6. باستخدام مقصات معقمة، قم بقص طرف رأس ماصة زرقاء سعة 1,000 µL بعناية لإنشاء فتحة واسعة، بقطر يتراوح تقريباً بين 3-4 mm. باستخدام هذا الرأس المعدل، اسحب 50-200 µL من شظايا النسيج المقطعة ووزعها بالتساوي على كل بئر. ونظراً لأن القطع الصغيرة تميل إلى الترسيب بسرعة، قم بإعادة تجانس المعلق برفق في كل بئر لضمان التوزيع الموحد.
    ملاحظة: تجنب الاكتظاظ وحافظ على التوازن بعدم إدخال عدد مفرط من الشظايا في كل بئر (الشكل 1F).
  7. قم بتحضين شظايا الورم عند 37°C في حاضنة 5% CO2 مع رطوبة 100%. قم بتغيير الوسط يومياً إذا تطلب الأمر ذلك بناءً على النشاط الأيضي للورم (والذي يستدل عليه بالاصفرار السريع للوسط) وعدد الشظايا في كل بئر. أثناء تغيير الوسط، توخَّ الحذر عن طريق سحب الوسط بدقة باستخدام ماصة مزودة برأس 200 µL، مع الحرص على عدم تحريك أي شظايا ورمية ملتصقة.

عملية تحضير أنسجة الورم؛ إعداد المعدات؛ عينات الأنسجة؛ نتائج الطرد المركزي؛ مخطط التحليل.
الشكل 1: إجراء زراعة مستنبت الورم. تم الحصول على عينة استئصال لورم دبقي منخفض الدرجة منتشر من مريض يبلغ من العمر 44 عاماً شُخص بإصابة بـ astrocytoma من الدرجة الثانية وفقاً لتصنيف WHO 2021. أظهر الورم طفرة في IDH1 (Exon 4 c.395 G>A, p.Arg132His) وطفرة في TP53 (Exon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis)، بالإضافة إلى غياب صبغ ATRX. ولم يتم اكتشاف أي طفرات في مواقع ارتباط Ets/TCF (C250T و C228T) في جين TERT. (A) يتكون سطح العمل من حزمة تبريد، مما يوفر بيئة تقلل من تحلل العينات وتحافظ على حيوية المكونات البيولوجية. وتعد هذه الاحتياطات مهمة للحفاظ على جودة وسلامة الأنسجة. (B) يجب نقل العينة من المستشفى إلى المختبر على الثلج. (C) قطعة من استئصال الورم. تشير الأسهم إلى الأجزاء الأكثر ملاءمة للزراعة. (D) يتم تشريح الورم لاختيار الجزء الأكثر ملاءمة ليتم فرمه. وبناءً على خبرتنا، تكون المادة البيضاء بشكل عام أقل قدرة على إنتاج مستنبتات ناجحة. (E) قطع من الورم بقطر 1-2 mm³ تقريباً في أنبوب سعة 15 mL بعد فرمها ميكانيكياً باستخدام المقص. (F) يوضح عدد قطع الورم المطلوبة للتلقيح الصحيح للآبار في طبق يحتوي على 24 بئراً. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

4. حفظ الورم المفروم بالتجميد وإذابته

ملاحظة: يضمن الحفظ بالتجميد وجود نسخ احتياطية في حالة حدوث تلوث أو فقدان لمزارع المستأصلات، أو لمعالجة عينات الأورام في وقت لاحق.

  1. الحفظ بالتجميد: قم بتحضير وسط التجميد (محلول DMSO بنسبة 20% حجم/حجم) بإضافة 2 mL من DMSO إلى 8 mL من وسط زراعة الخلايا.
  2. امزج حجماً واحداً من معلق الورم المفروم مع حجم مساوٍ من وسط التجميد الذي يحتوي على 20% DMSO لتحقيق تركيز نهائي قدره 10% DMSO. قم بسحب الخليط وإطلاقه بعناية بواسطة الماصة لضمان الامتزاج التام، ثم وزع حوالي 1 mL في أنابيب التجميد (cryovials).
  3. انقل أنابيب التجميد بسرعة إلى حاوية تبريد لخفض درجة الحرارة تدريجياً، يتبع ذلك تحضين طوال الليل عند -80 °C قبل التخزين النهائي في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة فور وضع الخلايا في وسط التجميد، حيث يمكن أن تكون بعض المواد الواقية من التجميد، مثل DMSO، ضارة إذا تعرضت لها الخلايا في درجة حرارة الغرفة لفترة أطول من اللازم.
  4. إذابة التجميد: أخرج أنابيب التجميد من النيتروجين السائل وضعها فوراً في حمام مائي عند 37 °C حتى تذوب حوالي 80% من الخلايا.
  5. لإزالة DMSO، انقل المعلق بسرعة بواسطة الماصة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 mL يحتوي على 5 mL من 1x PBS المسخن مسبقاً، ثم قم بالطرد المركزي عند 300 × g لمدة 5 min.
  6. تخلص من السائل الطافي وكرر عملية الغسل باستخدام 1X PBS يليه الطرد المركزي (الخطوة 4.5). اسحب السائل الطافي، مع الحرص على عدم تعكير الراسب، وأضف الكمية المناسبة من الوسط لنقل الخلايا إلى طبق 24-well مطلي مسبقاً بـ PDL-Laminin وضعه في المحضنة.
  7. بعد 24 h، تحقق من التصاق الخلايا. بعد بضعة أيام، قم بإزالة الشظايا غير الملتصقة عن طريق استبدال أوساط الزراعة.

5. تمرير المزرعة

ملاحظة: بمجرد استقرار المستنبتات، يمكن استخدامها في الفحص المجهري بالفيديو أو الصبغ المناعي. وبدلاً من ذلك، إذا كانت الخلايا الورمية قد هاجرت خارج المستنبت وتبدو سليمة، يمكن نقل المستنبت عبر التفكيك الإنزيمي وإعادة زراعته في آبار لإجراء المزيد من التجارب. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول غير مصمم للنقل المتكرر. وعادةً، لا يمكن محاولة إجراء سوى نقل واحد فقط قبل أن تصبح الخلايا الورمية هرمة أو تموت. كما أنه ليس بالضرورة أن تؤدي جميع مستنبتات الأنسجة إلى نقل ناجح.

  1. لإجراء عملية الممر (passage)، قم بإزالة الوسط القديم، واشطف باستخدام 1X PBS، ثم أضف (125 µL) من 0.05% trypsin-EDTA إلى الآبار وحضنها لمدة 3-4 min عند 37 °C، يليه إضافة 6.5 µL من Trypsin Inhibitor، و12 µL من 20 mM CaCl2 (للوصول إلى تركيز نهائي 2mM)، و1 µL من DNAse I.
    ملاحظة: قد تختلف مدة التحضين اللازمة للتفكك اعتماداً على المزرعة. من المهم التحقق مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت بعد 3 min على الأقل. عادةً، قد لا يتفكك المستنبت (explant) بالكامل إلى معلق من خلية واحدة، وغالباً ما تتبقى تجمعات صغيرة يمكنها توليد مستنبتات جديدة.
  2. باستخدام ماصة p1000 مضبوطة على 500-600 µL، قم بالضخ برفق لتفكيك المستنبتات. تجنب تكوين الفقاعات.
  3. أضف 5 mL من 1x PBS وقم بالطرد المركزي لمدة 5 min عند 300 × g. اشفط السائل الطافي، وأعد تعليق الراسب في وسط جديد مُدفأ مسبقاً، ثم قم بالعد من أجل الاستزراع.
  4. حدد المزارع التي لديها القدرة على توليد خطوط خلوية من خلال مراقبة الخلايا المنقسمة تحت مجهر تباين الأطوار (phase-contrast microscope). تتميز هذه الخلايا المنقسمة عادةً بمورفولوجيا مستديرة وكروموسومات مرئية، كما هو موضح في الشكل 2A.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بعد بضعة أيام، ستلتصق بعض شظايا الورم بأسطح الآبار، مما يؤدي إلى بدء نمو الخلايا من المستنبتات. ويختلف الوقت المنقضي بين الزراعة الأولية وظهور الخلايا الورمية النامية من عينة إلى أخرى. غالبًا ما تحتوي المزارع الأولية على كميات كبيرة من الحطام الخلوي، مما يجعل من الصعب تقييم وجود خلايا حية. وبناءً على ذلك، يجب الحفاظ على المزرعة لمدة لا تقل عن 4 أسابيع. وبمجرد أن تبدأ الخلايا في النمو، تظهر خلايا مستطيلة ذات مظهر ثنائي القطب أو متعدد الأقطاب (الشكل 2B،C).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد تطوير نماذج مخبرية ونماذج قبل سريرية للأورام الدبقية منخفضة الدرجة ذات الطفرة في IDH1 تحديًا كبيرًا، وذلك بسبب النمو البطيء لهذه الأورام وتعقيد محاكاة التغيرات الجينومية والجينومية الفوقية الواسعة الناتجة عن طفرة IDH. علاوة على ذلك، تتفاعل هذه الخلايا الورمية الارتشاحية بنشاط مع الخلايا المحيطة بها، بما في ذلك الخلايا المناعية، والخلايا البطانية، والخلايا الدبقية، والخلايا العصبية، وقد تعتمد عليها من أجل البقاء. ومن الصعب محاكاة هذا التفاعل المعقد في بيئة مختبرية.

من أجل الكشف عن رؤى بيولو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

شظايا الورم المستخدمة هنا هي جزء من مجموعة NEUROLOGY لعينات الأنسجة الطازجة التي يحتفظ بها مركز الموارد البيولوجية في مستشفى جامعة مونبلييه (CRB@chu-montpellier.fr). تم إجراء هذا البحث في إطار مشروع بعنوان "Gliomacult: التوصيف والثقافات الأولية للأورام الدبقية منخفضة الدرجة" ، بقيادة البروفيسور J. P. Hugnot (مشروع رقم. RECH/P722/1-5). تم دعم هذا العمل من قبل La ligue contre le cancer, ARC (جمعية أبحاث السرطان), ARTC, ARTC SUD, LES ETOILES DANS LA MER, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. يتم دعم KAC من قبل المجلس الوطني للعلوم الإنسانية والتكنولوجيا (CONAHCYT) ، المكسيك ، وجمعية أبحاث أورام الدماغ (ARTC) ، فرنسا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مكافحة ASCL1BD Pharmingen & trade ؛556604التخفيف 1: 500
التخفيف HPA001906 المضاد ل ATRXSigma-Aldrich1:100
Anti-CD68AgilentM081401-2التخفيف 1: 500
Anti-GFAPAves LabsAB_2313547التخفيف 1:500
Anti-IBA1Fujifilm Wako الأجسام المضادة019-19741التخفيف 1: 1000
الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر المضادة ل IDH1 (R132H)DianovaDIA-H09
Anti-Ki67BD Pharmingen & trade ؛556003التخفيف 1: 1000
مكافحة OLIG1R & D Systems®AF2417Dulituion 1: 300
Anti-OLIG2Sigma-AldrichMABN50التخفيف 1: 250
Anti-SOX9Abcam & reg ؛EPR14335-78التخفيف 1: 100
B-27 الملحق (50x) ، ناقص فيتامين أThermo Fisher Scientific12587010
ألبومين مصل الأبقار (BSA)CiteAbA-421-100
Ciprofloxacin HClSigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning & reg ؛432000حاوية تجميد الخلايا ، لمدة 12 × 1 مل أو 2 مل غطاء قوارير مبردة
Ø ؛ 13 ممKarl Hecht & trade ؛ مساعد & تجارة;328017
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418
DMEM / F-12 ، لا يحتوي على الجلوتامينثيرمو فيشر العلمي21331020
DNAse Iسيجما ألدريتش10104159001
Dulbecco & Prime ؛ s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100 مم طبق ثقافة الخلية المعالجTC Corning & reg ؛353003
فالكون 24 جيدا شفاف مسطحالقاع Corning & reg ؛353047لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار المعالجة TC ، مع غطاء ، معقمة & nbsp ؛
FunginInvivoGenant-fn-1
GentamicinThermo Fisher Scientific15750-037
HeparinSigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
Human EGFPeproTechAF-100-15-1MG
Human FGF-basicPeproTech100-18B-1MG
LamininSigma-AldrichL2020
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030-024
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502-048
PDLSigma-AldrichP7886
مصل acrodisc مرشح حقنة 37 مم مع GF / 0.2 & micro ؛ م سوبوربال كوربور4525
مثبط التربسينثيرمو فيشر العلمي17075-029
التربسين-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرثيرمو فيشر العلمي25300054
زايس Z1 Apotome 3 مجهرزايسمجهر التألق العريض
مستقيم

المراجع

  1. Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. Preclinical models of low-grade gliomas. Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).
  2. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  3. Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review. Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).
  4. Louis, D. N. Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).
  5. Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data. J Pers Med. 11 (8), 818(2021).
  6. Pirozzi, C. J., Yan, H. The implications of idh mutations for cancer development and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).
  7. Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma. J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).
  8. Suva, M. L., Tirosh, I. The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).
  9. Augustus, M., et al. Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis. Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).
  10. Hubert, C. G., Rich, J. N. Patient-derived explants as tumor models. Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).
  11. Abdullah, K. G., et al. Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma. Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).
  12. Yuzhakova, D. V., et al. Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging. Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).
  13. Kloosterman, D., et al. Morphology of microglia across contexts of health and disease. Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).
  14. Thomas, D. L. 2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review. Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).
  15. Azar, S., et al. Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation. Glia. 66 (2), 239-255 (2018).
  16. Bhaduri, A., et al. Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma. Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

أورام الدبقية ذات الطفرة في IDH1بروتوكول استزراع أنسجة الورمالخلايا السلفية قليلة التغصنعلامات الخلايا النجميةالبيئة الدقيقة للورمبروتوكول الحفظ بالتجميدنماذج الأورام ثلاثية الأبعادالفرز الدوائي المخصص
بروتوكول لمزارع الزرع للأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة المتحولة IDH1
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.