مقالة منهجية

بروتوكول لمزارع الزرع للأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة المتحولة IDH1

DOI:

10.3791/67260

⸱

مايو 9, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut de Génomique Fonctionnelle, Université de Montpellier, CNRS, INSERM, 2Department of Neurosurgery, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University of Chongqing, 3Department of Neurosurgery, Gui de Chauliac Hospital, Montpellier University Medical Center, 4Jingfeng laboratories of Chongqing

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

IDH1 الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة هي أورام نادرة يصعب زراعتها. نقدم طريقة بسيطة غير إنزيمية للاستنساخ تحافظ على تعبير البروتين المتحور IDH1 وتحافظ على الثقافات لعدة أشهر. الأهم من ذلك ، أن هذه التقنية تعمل مع الأورام المحفوظة بالتبريد ، مما يوفر مصدرا قيما لأبحاث الورم الدبقي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تصنيف الأورام الدبقية المنتشرة ، وهي أورام الدماغ الأولية الأكثر انتشارا ، إلى درجات منخفضة وعالية بناء على المعايير النسيجية المرضية والطفرات الجينية. تشكل الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة مجموعة فرعية تصيب في الغالب الشباب وتؤهب للأورام الدبقية عالية الدرجة. هناك نوعان رئيسيان من الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة: الأورام النجمية والأورام الدبقية قليلة التغصن ، وكل منها يعرف بسمات وراثية ونسيجية مميزة. تظهر هذه الأورام بشكل مميز متغيرا متحورا من إنزيم التمثيل الغذائي IDH1 ، مما يعطل التمايز الخلوي. وهي غير متجانسة ، وتتألف من الخلايا الجذعية التكاثرية والخلايا الدبقية الأكثر تمايزا والهدوء.

تتمتع نماذج الأورام الخاصة بالمريض في المختبر بإمكانيات كبيرة لكشف آليات الأورام وتخصيص اختيار الدواء للعلاج الشخصي. ومع ذلك ، فإن عدم وجود نماذج موثوقة في المختبر خصيصا للأورام الدبقية منخفضة الدرجة المتحولة IDH1 قد أعاق البحث الأساسي والانتقالي. هنا ، نقدم طريقة بسيطة لزراعة الأورام المتحولة IDH1 كمستخرجات في وسائط محددة دون الحاجة إلى تفكك إنزيمي. يمكن الحفاظ على هذه النماذج المكثفة لفترات طويلة ، مع الحفاظ على تعبير البروتين المتحور IDH1 بالإضافة إلى علامات للخلايا السلفية قليلة التغصن مثل ASCL1 (MASH1) و OLIG1 و OLIG2 وللخلايا النجمية (GFAP ، SOX9). يمكن أيضا أن يتم إنشاؤها من الأورام المجمدة في DMSO. يمكن أن تكون هذه الثقافات بمثابة منصة قيمة لفحص الأدوية والفحص المجهري بالفيديو والدراسات الجينية ، وبالتالي تسهيل التقدم في فهم وعلاج هذه الأورام الصعبة. كما أنها توفر إمكانية اشتقاق خطوط الخلايا الطافرة IDH1.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأورام الدبقية المنتشرة هي أورام الدماغ الأولية الأكثر شيوعا. هذه الأورام غير قابلة للشفاء حاليا على الرغم من العلاج المكثف للغاية (الجراحة والإشعاع والعلاج الكيميائي) < فئة الدعم = "xref" >1. تدعم الأدلة المتزايدة الفرضية القائلة بأن تكوين الورم الدبقي ينشأ من الخلايا الجذعية البالغة أو الخلايا الدبقية الموجودة في الدماغ< فئة الدعم = "xref">2. على الرغم من أن الأورام الأرومية الدبقية تمثل النوع الأكثر عدوانية ، إلا أن الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة (DLGG ، أورام الدرجة 2) منتشرة أيضا (15٪ من الأورام الدبقية المنتشرة) < فئة الدعم = "xref" >1،< sup class = "xref">3. تنمو DLGGs ببطء وتهاجر على طول مسارات المادة البيضاء ، وهي السمة المميزة لهذا الورم "المنتشر" < فئة sup = "xref" >4. غالبا ما تتكرر هذه DLGG على الرغم من العلاج ، وتتطور في النهاية إلى أورام خبيثة عالية الدرجة (الدرجتين 3 و 4) < فئة الدعم = "xref" >5.

تتميز فئة

DLGG بطفرة خاطئة في جين نازعة هيدروجين الأيزوسيترات 1 أو 2 (IDH1 أو IDH2) ، مما يؤدي إلى إنتاج شاذ لأونكوميتابوليت 2-هيدروكسي جلوتارات (2HG). هذا يعطل تمايز الخلايا من خلال الاختلالات اللاجينية < فئة الدعم = "xref" >6. يتم تصنيف الأورام الدبقية الطافرة IDH1 أيضا إلى أنواع فرعية: عادة ما تحتوي الأورام النجمية على طفرات في ATRX و P53 ، بينما تتميز الأورام الدبقية قليلة التغصن بحذف 1p19q < فئة sup = "xref" >7. تظهر هذه الأورام عدم تجانس الخلايا السرطانية. كشف تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والتوصيف المناعي عن مجموعة متنوعة من الخلايا السرطانية ، حيث تعرض أنماطا ظاهرية شبيهة بالخلايا الجذعية ، وشبيهة بالخلايا النجمية ، وشبيهة بالخلايا الدبقية قليلة التغصن داخل هذه الأورام < فئة الدعم = "xref" >8 ، < فئة الدعم = "xref">9.

على عكس الورم الأرومي الدبقي ، الذي يستفيد من الثقافات وخطوط الخلايا المتاحة بسهولة وطويلة الأمد ، هناك ندرة ملحوظة في الأدوات الخلوية المصممة للتحقيق في الأورام المتحولة IDH1 < فئة الدعم = "xref">1. يمثل هذا عقبة كبيرة أمام تطوير العلاج وتعميق فهمنا لتكوين الورم الدبقي المتحور IDH1 وتطور المرض. خطوط الخلايا التقليدية المزروعة في المصل ، على الرغم من استخدامها لفترة طويلة ، إلا أنها لا تكرر الأورام الأصلية بشكل كاف ، وتعرض ملفات تعريف نسخ متغيرة. بدلا من ذلك ، تحافظ ظروف الثقافة الخالية من المصل ، سواء في نماذج الأورام ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد ، بشكل أكثر فعالية على ملامح النسخ للخلايا السرطانية وأنماطها الظاهرية في الجسم الحي ، مثل غزو أنسجة المخ الطبيعية<فئة الدعم = "xref">10،11.

بالإضافة إلى ذلك ، فإن مزارع الخلايا قصيرة المدى المشتقة من العينة الجراحية للمريض تحافظ على المظهر الجزيئي والتنوع الخلوي للورم ، وبالتالي تمثل بشكل أفضل السمات البيولوجية للأورام مقارنة بخطوط الخلايا< فئة الدعم = "xref">12. هنا ، نقدم طريقة مباشرة غير إنزيمية لزراعة ثقافة الأورام الدبقية المنتشرة منخفضة الدرجة المتحولة IDH1 كنباتات مستمدة من استئصال المرضى الطازج أو المجمد ، بهدف تلبية الحاجة إلى نماذج محسنة في المختبر لأبحاث الورم الدبقي والتطوير العلاجي. كما أنها توفر إمكانية اشتقاق خطوط الخلايا الطافرة IDH1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" >تم الحصول على شظايا الورم المستخدمة في هذا البروتوكول من مجموعة جيدة الخصائص ومعتمدة أخلاقيا ، بموافقة المريض. أجري هذا البحث في إطار مشروع بعنوان Gliomacult: التوصيف والثقافات الأولية للأورام الدبقية منخفضة الدرجة (Project No. RECH / P722 / 1-5) وتمت الموافقة عليه من قبل المجلس العلمي للبنك الحيوي للورم في 28 أغسطس 2023.

< p class = "jove_title" >1. تحضير لوحات الثقافة

ملاحظة: قم بتنفيذ هذه الخطوات تحت غطاء تدفق رقائقي لثقافة الأنسجة المعقمة.

  1. قبل 1 ساعة على الأقل من الاستزراع ، قم بإعداد بولي دي ليسين (PDL) و24 لوحة بئر مطلية باللامينين.
    1. خفف 10 مجم من مسحوق PDL في 100 مل من محلول البورات (درجة الحموضة 8.4) للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 ميكروغرام / مل. بمجرد الذوبان ، قم بتصفية المحلول (0.22 ميكرومتر) للعقم. PDL جاهز للاستخدام ؛ قم بإعداد 3 مل من الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    2. قم بإذابة أنبوب اللامينين 1-2 مجم / مل عند 4 درجات مئوية لتجنب تكوين الهلام. قم بإعداد 50 ميكرولتر من الحصص وتخزينها عند -20 درجة مئوية
      ملاحظة: يجب تجنب تكرار الذوبان والتجميد.
    3. طلاء اللوحة
      1. خطوة اختيارية: ضع أغطية معقمة Ø ، 13 مم ، مناسبة لأطباق زراعة الخلايا ، في طبق 24 بئرا ، غطاء واحد لكل بئر.
        ملاحظة: هذه الخطوة لمزيد من التلوين المناعي لنباتل الورم الدبقي.
      2. لطلاء الآبار ، امزج 3 مل من محلول PDL في 9 مل من 1x PBS وأضف 50 ميكرولتر من اللامينين. أضف 500 ميكرولتر من هذا المحلول إلى كل بئر بتركيز طلاء 1-2 ميكروغرام / سم². احتضان الألواح المطلية في درجة حرارة الغرفة ، ويفضل أن يكون ذلك مع هزاز بطيء (15 دورة في الدقيقة) ، لمدة 1 ساعة على الأقل.
      3. مباشرة قبل المزرعة ، قم بإزالة محلول PDL-laminin واشطفه مرتين باستخدام معقم 1x PBS.
        ملاحظة: لا تدع الآبار تجف.

2. الوسائط

  1. استزراع المشتغلات المتحولة IDH1 في وسط محدد يتكون من DMEM/F12 المكمل ب L-glutamine، جنبا إلى جنب مع مزيج بديل للمصل يتكون من N2 و B27 بدون فيتامين A. استخدم المضادات الحيوية، بما في ذلك السيبروفلوكساسين والجنتاميسين والفطريات لمنع التلوث البكتيري والفطري. بالإضافة إلى ذلك ، قم بدمج عوامل النمو الهيبارين و EGF و FGF2 في الوسط ، وقم بتصفيته (0.2 ميكرومتر) ، وقم بتخزينه لمدة تصل إلى أسبوعين عند 4 درجات مئوية
    ملاحظة: للحصول على تفاصيل حول مكونات الوسائط وإعدادها ، راجع الجدول 1 وجدول المواد.
< ص الفئة = "jove_title" >3. تحضير المصنع
  1. قبل معالجة العينة ، قم بإعداد مساحة العمل والأدوات المعقمة كما هو موضح في <فئة قوية = "xfig">الشكل 1 أ. قم بتعقيم عبوة باردة عن طريق رشها بنسبة 70٪ من الإيثانول. عقم المقص والملقط عن طريق غمرها في 70٪ من الإيثانول وشطفها باستخدام PBS.
  2. انقل استئصال الورم على الفور للثقافة على الجليد ، من الناحية المثالية في غضون ساعتين بعد الاستخراج الجراحي (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 ب).
    ملاحظة: يجب أن يكون قطر عينة الورم 9-10 مم كحد أدنى لضمان نتائج أفضل. يتم نقل الأنسجة بدون وسيط استزراع حيث تفضل هذه الطريقة للأغراض النسيجية. يمنع عدم وجود سائل تكوين بلورات الثلج أثناء التجميد السريع ، وبالتالي الحفاظ على سلامة الأنسجة للفحص النسيجي اللاحق إذا لزم الأمر.
  3. ضع طبق المزرعة مع عينة الورم فوق العبوة الباردة واشطفه برفق باستخدام 1X PBS لإزالة الدم الزائد.
  4. غالبا ما يظهر الورم المقطوع حجما كبيرا وعدم تجانس ، ويشمل كتلة الورم والأنسجة المتسللة والمكونات غير السرطانية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 ج). حدد الأجزاء التي تعرض لونا رماديا مع نسيج ناعم أو يشبه الهلام لعزل الخلايا السرطانية ، لأنها تميل إلى احتواء المزيد من الخلايا السرطانية. على العكس من ذلك ، تجنب المناطق الصلبة والبيضاء لأنها قد تحتوي على عدد أقل من الخلايا السرطانية المناسبة للزراعة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 د) ، بالإضافة إلى المناطق السوداء ، لأنها من المحتمل أن تكون نتيجة للكي الكهربائي وقد لا توفر نتائج موثوقة للتحليل.
  5. انقل العينات المختارة إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل أو كريوفيال للفرم. أضف 1 مل من الوسائط المعقمة إلى الأنبوب الدقيق سعة 1.5 مل أو التبريد وقم بتقطيع العينة بالمقص المعقم حتى يتم الحصول على قطع صغيرة (1-2 مم3).
    ملاحظة: ما يقرب من 1-2 دقيقة من التقطيع ضروري للحصول على شظايا صغيرة ، عادة ما يكون حجمها 1-2 مم3 (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1E).
  6. باستخدام مقص معقم، قم بقص نهاية طرف الماصة الأزرق سعة 1,000 ميكرولتر بعناية لإنشاء فتحة واسعة قطرها حوالي 3-4 مم. باستخدام هذا الطرف المعدل ، قم بعمل 50-200 ميكرولتر من شظايا الأنسجة المفرومة وتوزيعها بالتساوي على كل بئر. نظرا لأن القطع الأصغر تميل إلى الاستقرار بسرعة ، فأعد تجانس التعليق برفق في كل بئر لضمان توزيع موحد.
    ملاحظة: تجنب الاكتظاظ وحافظ على التوازن من خلال عدم إدخال عدد كبير من الشظايا في كل بئر (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1F).
  7. احتضان شظايا الورم عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ مع رطوبة 100٪. قم بتغيير الوسائط كل يوم إذا كان النشاط الأيضي للورم (يشار إليه بالاصفرار السريع للوسائط) وعدد الشظايا في كل بئر يتطلب ذلك. أثناء تغيير الوسائط ، قم بتوخي الحذر عن طريق شفط الوسائط بدقة باستخدام ماصة مزودة بطرف 200 ميكرولتر ، مما يضمن تجنب إزعاج أي شظايا ورم ملتصقة.
< p class = "jove_content biglegend" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-protocol-1
<فئة قوية = "xfig">الشكل 1: إجراء زراعة الورم. تم الحصول على استئصال الورم الدبقي المنتشر منخفض الدرجة من مريض يبلغ من العمر 44 عاما تم تشخيص إصابته بورم نجمي من الدرجة الثانية وفقا لتصنيف منظمة الصحة العالمية لعام 2021. أظهر الورم طفرة IDH1 (Exon 4 c.395 G>A ، p.Arg132His) وطفرة TP53 (Exon 8 c.843_844delinsGT ، p.Asp281_Arg282delinsGluHis) ، إلى جانب عدم وجود تلطيخ ATRX. لم يتم الكشف عن أي طفرات في مواقع ربط ETS / TCF (C250T و C228T) لجين TERT. (أ) يتكون سطح العمل من عبوة باردة ، مما يوفر بيئة تقلل من تدهور العينة وتحافظ على صلاحية المكونات البيولوجية. هذه الاحتياطات مهمة للحفاظ على جودة وسلامة الأنسجة. (ب) يجب أن يتم نقل العينة من المستشفى إلى المختبر على الجليد. (ج) جزء استئصال الورم. تظهر الأسهم أنسب الأجزاء للثقافة. (د) يتم إجراء تشريح الورم لتحديد الجزء الأكثر صلة ليتم فرمه. في تجربتنا ، من غير المرجح أن تولد المادة البيضاء نباتات ناجحة. (ه) شظايا الورم التي يبلغ قطرها حوالي 1-2 مم³ في أنبوب سعة 15 مل بعد فرمها ميكانيكيا بالمقص. (و) يظهر عدد قطع الورم المطلوبة للبذر المناسب للآبار على صفيحة 24 بئرا. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. < p class = "jove_title" >4. حفظ الورم المفروم بالتبريد والذوبان

ملاحظة: يضمن الحفظ بالتبريد النسخ الاحتياطي في حالة تلوث وفقدان مزارع الزرع أو لمعالجة عينات الورم لاحقا.

  1. الحفظ بالتبريد: قم بإعداد وسط التجميد (20٪ حجم / حجم محلول DMSO) عن طريق إضافة 2 مل من DMSO إلى 8 مل من وسط زراعة الخلايا.
  2. اجمع بين حجم واحد من معلق الورم المفروم مع حجم متساو من وسط تجميد DMSO بنسبة 20٪ لتحقيق تركيز نهائي بنسبة 10٪ DMSO. قم بتقطيع الخليط بعناية لأعلى ولأسفل لضمان الخلط الشامل، ثم قم بتوزيع 1 مل تقريبا في كريفيالات.
  3. انقل المبردات بسرعة إلى حاوية مبردة لخفض درجة الحرارة تدريجيا ، متبوعا بحضانة الليل عند -80 درجة مئوية قبل التخزين النهائي في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يجب تنفيذ هذه الخطوة فور وضع الخلايا في وسط التجميد ، حيث يمكن أن تكون بعض المواد الواقية من الفراغ بالتبريد ، مثل DMSO ، ضارة إذا تعرضت الخلايا لها في درجة حرارة الغرفة لفترة أطول من اللازم.
  4. الذوبان: قم بإزالة المبردات من النيتروجين السائل وضعها على الفور في حمام مائي 37 درجة مئوية حتى تذوب حوالي 80٪ من الخلايا.
  5. لإزالة DMSO، قم بإدخال التعليق بسرعة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من 1x PBS الدافئ مسبقا وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإزالة المادة الطافية وكرر الغسيل باستخدام 1X PBS متبوعا بالطرد المركزي (الخطوة 4.5). قم بشفط المادة الطافية ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات ، وأضف الكمية المناسبة من الوسط لنقلها إلى صفيحة PDL-Laminin مطلية مسبقا مكونة من 24 بئر وضعها في الحاضنة.
  7. بعد 24 ساعة ، تحقق من أن الخلايا متصلة. بعد بضعة أيام ، قم بإزالة الأجزاء غير الملتصقة عن طريق استبدال وسائط الثقافة.
< [ب] class="jove_title">5. مرور الثقافة

ملاحظة: بمجرد إنشائها ، يمكن استخدام النباتات الخارجية للفحص المجهري بالفيديو أو التلوين المناعي. بدلا من ذلك ، إذا هاجرت الخلايا السرطانية خارج النبتة الخارجية وظهرت بصحة جيدة ، فيمكن تمرير النبتة الخارجية من خلال التفكك الأنزيمي وإعادة زرعها في الآبار لمزيد من التجارب. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذا البروتوكول غير مصمم للمرور المتكرر. عادة ، يمكن محاولة مرور واحد فقط قبل أن تصبح الخلايا السرطانية شيخوخة أو تموت. لن تؤدي جميع ثقافات الزرع إلى مرور ناجح.

  1. للمرور ، قم بإزالة الوسائط القديمة ، واشطفها باستخدام 1X PBS ، وأضف (125 ميكرولتر) 0.05٪ تريبسين-EDTA إلى الآبار واحتضانها لمدة 3-4 دقائق عند 37 درجة مئوية ، متبوعا بإضافة 6.5 ميكرولتر من مثبط التربسين ، و 12 ميكرولتر من 20 ملي مولار CaCl2 (التخفيف النهائي إلى 2 ملليمتر) ، و 1 ميكرولتر من DNAse I.
    ملاحظة: قد يختلف وقت الحضانة اللازم للتفكك حسب الثقافة. من المهم التحقق مما إذا كانت الخلايا قد انفصلت بعد 3 دقائق على الأقل. عادة ، قد لا يتم فصل النبات بالكامل إلى معلق أحادي الخلية ، وغالبا ما يتم الاحتفاظ بالمجموعات الصغيرة ، والتي يمكن أن تولد مزارع جديدة للنبات.
  2. مع ضبط p1000 على 500-600 ميكرولتر ، اشطفها برفق لتفكيك النباتات. تجنب تكوين الفقاعات.
  3. أضف 5 مل من 1x PBS وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 300 × جم. استنشق المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط طازج دافئ مسبقا ، وقم بحساب البذر.
  4. تحديد الثقافات التي لديها القدرة على توليد خطوط الخلايا من خلال مراقبة الخلايا المنقسمة تحت مجهر تباين الطور. عادة ما يكون لهذه الخلايا المنقسمة مورفولوجيا مستديرة وكروموسومات مرئية ، كما هو موضح في <فئة قوية = "xfig" > الشكل 2 أ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content">بعد بضعة أيام ، ستلتصق بعض شظايا الورم بأسطح البئر ، مما يؤدي إلى نمو الخلايا من النباتات. يختلف الوقت بين الطلاء الأولي وظهور الخلايا السرطانية النامية من عينة إلى أخرى. غالبا ما تحتوي الثقافات الأولية على حطام خلوي كبير ، مما يجعل من الصعب تقييم وجود خلايا قابلة للحياة. وبالتالي ، يجب الحفاظ على الثقافة لمدة لا تقل عن 4 أسابيع. بمجرد أن تبدأ الخلايا في النمو ، لوحظت خلايا ممدودة ذات مظهر ثنائي القطب أو متعدد الأقطاب (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2 ب ، ج).

< p class = "jove_content">...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تطوير النماذج في المختبر وما قبل السريرية للأورام الدبقية منخفضة الدرجة المتحولة IDH1 أمرا صعبا بشكل خاص بسبب النمو البطيء لهذه الأورام وتعقيد تكرار التغيرات الجينومية والجينية الواسعة الناجمة عن طفرة IDH. علاوة على ذلك ، تتفاعل هذه الخلايا السرطانية المتسللة بنشاط مع الخلايا المحيطة ، بما في ذلك الخلايا المناعية والبطانية والدبقية والخلايا العصبية ، ومن المحتمل أن تعتمد عليها للبقاء على قيد الحياة. يصعب تكرار هذا التفاعل المعقد في بيئة معملية.

للكشف عن رؤى بيولوجية جديدة حول الأورام الدبق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

شظايا الورم المستخدمة هنا هي جزء من مجموعة NEUROLOGY لعينات الأنسجة الطازجة التي يحتفظ بها مركز الموارد البيولوجية في مستشفى جامعة مونبلييه (CRB@chu-montpellier.fr). تم إجراء هذا البحث في إطار مشروع بعنوان "Gliomacult: التوصيف والثقافات الأولية للأورام الدبقية منخفضة الدرجة" ، بقيادة البروفيسور J. P. Hugnot (مشروع رقم. RECH/P722/1-5). تم دعم هذا العمل من قبل La ligue contre le cancer, ARC (جمعية أبحاث السرطان), ARTC, ARTC SUD, LES ETOILES DANS LA MER, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA. يتم دعم KAC من قبل المجلس الوطني للعلوم الإنسانية والتكنولوجيا (CONAHCYT) ، المكسيك ، وجمعية أبحاث أورام الدماغ (ARTC) ، فرنسا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مكافحة ASCL1BD Pharmingen & trade ؛556604التخفيف 1: 500
التخفيف HPA001906 المضاد ل ATRXSigma-Aldrich1:100
Anti-CD68AgilentM081401-2التخفيف 1: 500
Anti-GFAPAves LabsAB_2313547التخفيف 1:500
Anti-IBA1Fujifilm Wako الأجسام المضادة019-19741التخفيف 1: 1000
الأجسام المضادة أحادية النسيلة للفأر المضادة ل IDH1 (R132H)DianovaDIA-H09
Anti-Ki67BD Pharmingen & trade ؛556003التخفيف 1: 1000
مكافحة OLIG1R & D Systems®AF2417Dulituion 1: 300
Anti-OLIG2Sigma-AldrichMABN50التخفيف 1: 250
Anti-SOX9Abcam & reg ؛EPR14335-78التخفيف 1: 100
B-27 الملحق (50x) ، ناقص فيتامين أThermo Fisher Scientific12587010
ألبومين مصل الأبقار (BSA)CiteAbA-421-100
Ciprofloxacin HClSigma-AldrichPHR1044-1G
CoolCellCorning & reg ؛432000حاوية تجميد الخلايا ، لمدة 12 × 1 مل أو 2 مل غطاء قوارير مبردة
Ø ؛ 13 ممKarl Hecht & trade ؛ مساعد & تجارة;328017
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD8418
DMEM / F-12 ، لا يحتوي على الجلوتامينثيرمو فيشر العلمي21331020
DNAse Iسيجما ألدريتش10104159001
Dulbecco & Prime ؛ s محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1xSigma-AldrichD8537
Falcon 100 مم طبق ثقافة الخلية المعالجTC Corning & reg ؛353003
فالكون 24 جيدا شفاف مسطحالقاع Corning & reg ؛353047لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار المعالجة TC ، مع غطاء ، معقمة & nbsp ؛
FunginInvivoGenant-fn-1
GentamicinThermo Fisher Scientific15750-037
HeparinSigma-AldrichH3149-100KU
HEPESSigma-AldrichH-3375
Human EGFPeproTechAF-100-15-1MG
Human FGF-basicPeproTech100-18B-1MG
LamininSigma-AldrichL2020
L-GlutamineThermo Fisher Scientific25030-024
N-2 Supplement (100x)Thermo Fisher Scientific17502-048
PDLSigma-AldrichP7886
مصل acrodisc مرشح حقنة 37 مم مع GF / 0.2 & micro ؛ م سوبوربال كوربور4525
مثبط التربسينثيرمو فيشر العلمي17075-029
التربسين-EDTA (0.05٪) ، الفينول الأحمرثيرمو فيشر العلمي25300054
زايس Z1 Apotome 3 مجهرزايسمجهر التألق العريض
مستقيم

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. Preclinical models of low-grade gliomas. Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).
  2. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  3. Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review. Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).
  4. Louis, D. N. Molecular pathology of malignant gliomas. Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).
  5. Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data. J Pers Med. 11 (8), 818(2021).
  6. Pirozzi, C. J., Yan, H. The implications of idh mutations for cancer development and therapy. Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).
  7. Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma. J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).
  8. Suva, M. L., Tirosh, I. The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).
  9. Augustus, M., et al. Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis. Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).
  10. Hubert, C. G., Rich, J. N. Patient-derived explants as tumor models. Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).
  11. Abdullah, K. G., et al. Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma. Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).
  12. Yuzhakova, D. V., et al. Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging. Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).
  13. Kloosterman, D., et al. Morphology of microglia across contexts of health and disease. Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).
  14. Thomas, D. L. 2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review. Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).
  15. Azar, S., et al. Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation. Glia. 66 (2), 239-255 (2018).
  16. Bhaduri, A., et al. Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma. Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

IDH1

مقالات ذات صلة