يصف هذا البروتوكول تطبيق مجال التبديل الخيفي المنشط بالضوء الأزرق (LightR) هندسيا للتحكم الزماني المكاني القابل للانعكاس في نشاط البروتين. باستخدام Src التيروزين كيناز كنموذج ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتطوير وتوصيف Src المنظم بالضوء (LightR-Src). إنه يوضح تعدد استخدامات هذا النهج عبر فئات الإنزيمات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
التحكم الزماني المكاني لنشاط البروتين من خلال التنظيم الخيفي البصري الوراثي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يوفر علم الوراثة البصرية إمكانية محاكاة التحكم الزماني المكاني المعقد لنشاط الإنزيم وصولا إلى دقة تحت الخلوية. ومع ذلك ، غالبا ما تواجه معظم الأساليب البصرية الوراثية تحديات كبيرة في دمج قدرات متعددة في أداة واحدة قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من البروتينات المستهدفة. يعد تحقيق التحكم الدقيق في حركية التشغيل / الإيقاف ، وضمان الحد الأدنى من التسرب في الظلام ، وإظهار الأداء الفعال في خلايا الثدييات بدقة تحت الخلايا من أكثر التحديات شيوعا التي تواجهها في هذا المجال. يكمن الحل الواعد في تطبيق المجالات الحساسة للضوء المصممة بشكل عقلاني للتحكم في نشاط البروتين بشكل خيفي. باستخدام هذه الإستراتيجية ، أنشأنا طريقة بصرية وراثية تجمع بين جميع الميزات المطلوبة. يتضمن النهج دمج وحدة التبديل الخيفي المنظمة بالضوء (LightR) في البروتين المستهدف لتنظيم نشاط الإنزيم باستخدام الضوء الأزرق (465 نانومتر). يتم إنشاء مجال LightR عن طريق ربط مجالين مستقبلين للضوء Vivid (VVD) ، مما يؤدي إلى إنشاء مشبك حساس للضوء يمكن دمجه في حلقة مرنة صغيرة داخل المجال التحفيزي للإنزيم. في حالته المظلمة ، يكون مشبك LightR مفتوحا ، وبالتالي يشوه المجال التحفيزي للإنزيم ويعطله. عند التعرض للضوء الأزرق ، يغلق مجال LightR ويستعيد بنية المجال التحفيزي ونشاط الإنزيم. في هذه المخطوطة ، نناقش استراتيجيات التصميم لتوليد بروتين كيناز منظم للضوء وإثبات سيطرته عن طريق الضوء الأزرق ، والانعكاس ، والحركية ، والتنظيم الدقيق على المستوى تحت الخلوي ، مما يتيح دقة زمانية مكانية محكمة. باستخدام Src tyrosine kinase كنموذج ، نعرض بروتوكولا لتنظيم نشاط كيناز LightR-Src بشكل فعال. نظهر أيضا قابلية تطبيق LightR عبر فئات الإنزيم المختلفة ، مما يوسع فائدة نظام الأداة في معالجة الأسئلة الميكانيكية لمسارات الإشارات في الأمراض المختلفة.
المقدمة
يتم توجيه قدرة الخلية على تفسير الإشارات الخارجية وتحويلها إلى استجابات محددة في السياقات الفسيولوجية أو المرضية من قبل مجموعات مخصصة من البروتينات. غالبا ما يتم تحديد مساهمة أي بروتين في مثل هذه الاستجابات المعقدة من خلال موقعه تحت الخلوي ومستوى التعبير وتوقيت التنشيط العابر أو المستمر أو المتذبذب. يتطلب تشريح دور هذه المعلمات الفردية في تنظيم الإشارات طرقا قادرة على تكرار التحكم الزماني المكاني المعقد لنشاط البروتين على المستوى تحت الخلوي. التقنيات التقليدية مثل التلاعب الجيني ومثبطات الجزيئات الصغيرة تقصر في هذا الصدد. في المقابل ، تعد تقنيات البصريات الوراثية بإمكانية تشريح العمليات البيولوجية من خلال التلاعب أو محاكاة العمليات ال....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. تصميم وتطوير LightR (الشكل 1)
- التخطيط الاستراتيجي
ملاحظة: يتكون مجال LightR من مجالين مستقبلات ضوئية متصلين جنبا إلى جنب (VVD) من Neurospora crassa13,14,15,16. تتجانس VVDs في وجود الضوء ، ويتضمن هذا التعتيم تغييرا توافقيا يجلب الطرف N لمونومر VVD بجوار الطرف C لمونومر VVD آخر (الشكل 1 أ). يؤدي توصيل مجالي VVD برابط مرن إلى إنشاء مجال يشبه المشبك سيكون مفتوحا في الظلام ويغلق عند الإضاءة بالضوء الأزرق. يتيح دمج هذا المشبك في المجال ا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تصميم LightR-Src وإنشائه باتباع الإستراتيجية الموضحة في الشكل 1 أ ، ب. يصل التحليل الكيميائي الحيوي ل LightR-Src إلى فسفرة ركائز Src الداخلية المعروفة ، p130Cas (Y249) 22 و paxillin (Y118) 23 استجابة للضوء الأزرق عند 60 دقيقة من الإضاءة المستمرة (الشكل 2 ب). والجدير بالذكر أنه لم يتم ملاحظة أي تنشيط في الخلفية ل Src kinase عندما يتم التعبير عن LightR-Src فقط في الظلام لمدة 16-18 ساعة بعد التعداد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تقدم دراستنا نهجا بصريا وراثيا للتحقيق في مسارات الإشارات المتنوعة وتوضح قابليته للتطبيق الواسع في معالجة الأسئلة البيولوجية المختلفة. يوفر نظام أداة LightR العديد من المزايا الأساسية: (1) التنظيم الخيفي لنشاط البروتين ، (2) التحكم الزمني الصارم في النشاط الذي يمكن ضبطه لتحقيق حركية مختلفة للتنشيط والتعطيل ، (3) الدقة المكانية للنشاط على المستوى دون الخلوي ، (4) خصوصية تعديل الإشارات والنشاط البيولوجي و (5) مجموعة واسعة من قابلية التطبيق على البروتينات المستهدفة المختلفة. والجدير بالذكر .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يعرب المؤلفون عن تقديرهم للدكتور مارك شايع لمساهمته في تطوير إنزيمات LightR والبروتوكولات المرتبطة بها. كان pCAG-iCre هدية من ويلسون وونغ (Addgene plasmid # 89573) ، pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry كانت هدية من Mositoshi Sato (Addgene plasmid # 122963) ، كان بناء bRaf-Venus الذي يحمل طفرة V600E هدية من الدكتور جون أوبريان (MUSC) ؛ تم استنساخ جين ERK2 من pCEFL-ERK2 (هدية من مختبر الدكتور تشانينج دير ، UNC) في العمود الفقري mCherry-C1 للحصول على بلازميد mCherry-ERK2. و pmiRFP670-N1 كانت هدية من فلاديسلاف فيرخوشا (بلازميد Addgene # 79987). تم دعم العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R33CA258012 و R35GM145318 و P01HL15132....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| # 1.5 أغطية زجاجية 25 مم أدوات | وارنر المستديرة ؛ | 64-0715 | |
| 1.5 مل أنابيب | الولايات المتحدة الأمريكية العلمية | cc7682-3394 | |
| 2x Laemmli Buffer | ل 500 مل: 5.18 جم من Tris-HCL ، 131.5 مل من الجلسرين ، 52.5 مل من 20٪ SDS ، 0.5 غرام من البروموفينول الأزرق ، الرقم الهيدروجيني النهائي 6.8 | ||
| 4-20٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب | Biorad | 4561096 | |
| 5x Phusion Plus Buffer ؛ | ثرمو علمية | F538L | |
| 60 LED مجهر حلقة ضوء | بولي بصريات | ML46241324 | أزرق LED ، قطر 60 مم ، 5 واط |
| Agarose ؛ | GoldBiotech | A-201 | |
| Anti-Erk 1/2 إشارات الخلايا المضادة للأجسام المضادة | 9102 | ||
| الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH | invitrogen | AM4300 | |
| Anti-GFP | Clontech | 632380 | |
| الأجسام المضادة ل mCherry | invitrogen | M11217 | |
| إشارات الخلايا المضادة لمنظمة مجاهدي خلق | 9122 | ||
| Anti-p130Cas | BD Biosciences | 610271 | |
| إشارات الخلايا | المضادة للباكسيلين | 2542 | |
| مكافحة الفوسفو-Erk 1/2 T202 / Y204 إشارات خلايا الأجسام المضادة | 9101 | ||
| مكافحة الفوسفو-pY249 p130إشارات | خلية | Cas 4014 | |
| إشارات خلية باكسيلين المضادة للفوسفو Y118 | 2541 | ||
| أنتو فوسفو-S217 / 221 خلية مجاهدي خلق | الإشارات | 9121 | |
| Arduino متوافق مع امدادات الطاقة | كمبيوتر الشركة | LJH -186 | |
| Arduino Uno Rev3 | Arduino | & lrm ؛ A000066 | |
| الخلايا الآتوفلورية | invitrogen | A7816 | |
| Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) ؛ | منتجات الجوزاء الحيوية | 100-106 | ثلاثي معطل بالحرارة 0.1 ومايكرو ؛ م معقمة تصفية |
| bRaf-V600E-Venus | هدية من الدكتور جون أوبريان ، MUSC | ||
| BSA ؛ | GoldBiotech | A-420 | |
| كاربينيسيلين (ديسوديوم) | التكنولوجيا الحيوية الذهبية | C-103-25 | |
| CellMask صبغة غشاء البلازما الأحمر العميق | invitrogen | c10046 | |
| Colony Screen MasterMix | Genesee | 42-138 | |
| DH5a الخلايا المختصة | NEB | C2987H | |
| DMEM | كورنينج | 15-013-CV | |
| سلم الحمض النووي | GoldBio | D010-500 | |
| dNTPs | NEB | N04475 | |
| Dpn1 إنزيم | NEB | R01765 | |
| DTT | GoldBio | DTT10 | DL-Dithiothreitol ، كواشف Cleland ؛ |
| EGTA | Acros | 409910250 | |
| FastLightR-bRaf-mVenus | Addgene | #162155 | |
| Fibronectin من بلازما البقر | سيجما | F1141 | |
| FuGENE (R) 6 كاشف النفدة ؛ | Promega | E2692 | كاشف التعداء |
| جل صبغة الحمض النووي الأخضر | GoldBio | G-740-500 | |
| جل تحميل صبغة أرجواني 6x | NEB | B7024A | |
| GeneJET Gel Extraction Kit | ثرمو علمية | K0692 | هلام استخراج كيت |
| GeneJET Plasmid Miniprep Kit | Thermo Scientific | K0502 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | GlutaMAX-l (100x) 100 مل ؛ |
| خلايا HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| خلايا هيلا | ATCC | CRM-CCL-2 | |
| HEPES | Fischer | BP310-500 | |
| IoT Relay | Digital Loggers | DLI 705020645490 | التيار المتردد / التيار المستمر التتابع للإضاءة |
| Kanamycin أحادي الكبريتات | الذهب التكنولوجيا الحيوية | K-120-25 | |
| KCl | Sigma & nbsp ؛ | P-4504 | |
| L-15 1x | Corning | 10-045-السيرة الذاتية | |
| LB Agar | فيشر | BP1425-2 | |
| LED تنمو نظام الضوء | HQRP | 884667106091218 | نظام مصباح لوحة LED |
| LightR-bRaf-mVenus | Addgene | #162154 | |
| LightR-iCre-miRFP670 | Addgene | #162158 | |
| برنامج MATLAB | Mathworks | R2024a | لتشغيل برنامج تحليل التصوير CellGEO Scripts |
| Metamorph | Molecular | ||
| MgCl2 | فيشر كيماويات | M33-500 | |
| زيوت معدنية | سيجما | M5310 | |
| MiniPrep Kit | اختيار الجينات | 96-308 | |
| Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب 12 بئر | Bio-Rad | 4561085 | |
| بيولوجيا جزيئية درجة الماء ؛ | كورنينج | 46-000-السيرة الذاتية | |
| مرآة متعددة الأحرف | متعددة النطاقات 89903BS | Chroma | |
| NaCl | فيشر كيماويات | S271-3 ؛ | |
| برنامج تلفزيوني بدون Ca و Mg & nbsp ؛ | كورنينج | 21-031-CV | |
| pCAG-iCre | Addgene | # 89573 | |
| pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry | Addgene | # 122963 | |
| pCEFL-ERK2 | هدية من مختبر الدكتور تشانينج دير ، أنابيب | ||
| UNC PCR ؛ | labForce | 1149Z65 | 0.2 مل 8 شرائط أنابيب وأغطية ، شريط صلب متصل بشكل فردي قبة أغطية ؛ |
| Phusion Plus DNA Polymerase | Thermo Scientific | F630S | |
| pmiRFP670-N1 | Addgene | # 79987 | |
| مضلع 400 منقوش مضيء | Mightex | DSI-G-00C | |
| بادئات | أغشية IDT | ||
| PVDF | BioRad | 1620219 | Immun-Blot PVDF / شطائر ورق الترشيح ؛ |
| T0.25٪ التربسين ، 2.21 ملي مولار ، eDTA ، 1x [-] الصوديوم | Corning ؛ | 25-053-CI | |
| Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x | فيشر | BP1332-1 | للرحلان الكهربائي |
| UPlanSApo 40x مجهر موضوعي | أوليمبوس | 1-U2B828 | |
| USB TTL Box | National Instruments | 6501 | لواجهة TTL |
| & بيتا ؛ -Mercaptoethanol | Fisher Chemical ؛ | O3446I-100 |
المراجع
- Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
- Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
