التحكم الزماني المكاني لنشاط البروتين من خلال التنظيم الخيفي البصري الوراثي

Trisha Bansal; Nicholas Lechinsky; Andrei V. Karginov

doi:10.3791/67261

مقالة منهجية

التحكم الزماني المكاني لنشاط البروتين من خلال التنظيم الخيفي البصري الوراثي

DOI:

10.3791/67261

⸱

أكتوبر 4, 2024

Trisha Bansal¹ , Nicholas Lechinsky¹ , Andrei V. Karginov¹

¹Department of Pharmacology and Regenerative Medicine, University of Illinois at Chicago

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تطبيق مجال التبديل الخيفي المنشط بالضوء الأزرق (LightR) هندسيا للتحكم الزماني المكاني القابل للانعكاس في نشاط البروتين. باستخدام Src التيروزين كيناز كنموذج ، تقدم هذه الدراسة بروتوكولا مفصلا لتطوير وتوصيف Src المنظم بالضوء (LightR-Src). إنه يوضح تعدد استخدامات هذا النهج عبر فئات الإنزيمات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر علم الوراثة البصرية إمكانية محاكاة التحكم الزماني المكاني المعقد لنشاط الإنزيم وصولا إلى دقة تحت الخلوية. ومع ذلك ، غالبا ما تواجه معظم الأساليب البصرية الوراثية تحديات كبيرة في دمج قدرات متعددة في أداة واحدة قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من البروتينات المستهدفة. يعد تحقيق التحكم الدقيق في حركية التشغيل / الإيقاف ، وضمان الحد الأدنى من التسرب في الظلام ، وإظهار الأداء الفعال في خلايا الثدييات بدقة تحت الخلايا من أكثر التحديات شيوعا التي تواجهها في هذا المجال. يكمن الحل الواعد في تطبيق المجالات الحساسة للضوء المصممة بشكل عقلاني للتحكم في نشاط البروتين بشكل خيفي. باستخدام هذه الإستراتيجية ، أنشأنا طريقة بصرية وراثية تجمع بين جميع الميزات المطلوبة. يتضمن النهج دمج وحدة التبديل الخيفي المنظمة بالضوء (LightR) في البروتين المستهدف لتنظيم نشاط الإنزيم باستخدام الضوء الأزرق (465 نانومتر). يتم إنشاء مجال LightR عن طريق ربط مجالين مستقبلين للضوء Vivid (VVD) ، مما يؤدي إلى إنشاء مشبك حساس للضوء يمكن دمجه في حلقة مرنة صغيرة داخل المجال التحفيزي للإنزيم. في حالته المظلمة ، يكون مشبك LightR مفتوحا ، وبالتالي يشوه المجال التحفيزي للإنزيم ويعطله. عند التعرض للضوء الأزرق ، يغلق مجال LightR ويستعيد بنية المجال التحفيزي ونشاط الإنزيم. في هذه المخطوطة ، نناقش استراتيجيات التصميم لتوليد بروتين كيناز منظم للضوء وإثبات سيطرته عن طريق الضوء الأزرق ، والانعكاس ، والحركية ، والتنظيم الدقيق على المستوى تحت الخلوي ، مما يتيح دقة زمانية مكانية محكمة. باستخدام Src tyrosine kinase كنموذج ، نعرض بروتوكولا لتنظيم نشاط كيناز LightR-Src بشكل فعال. نظهر أيضا قابلية تطبيق LightR عبر فئات الإنزيم المختلفة ، مما يوسع فائدة نظام الأداة في معالجة الأسئلة الميكانيكية لمسارات الإشارات في الأمراض المختلفة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توجيه قدرة الخلية على تفسير الإشارات الخارجية وتحويلها إلى استجابات محددة في السياقات الفسيولوجية أو المرضية من قبل مجموعات مخصصة من البروتينات. غالبا ما يتم تحديد مساهمة أي بروتين في مثل هذه الاستجابات المعقدة من خلال موقعه تحت الخلوي ومستوى التعبير وتوقيت التنشيط العابر أو المستمر أو المتذبذب. يتطلب تشريح دور هذه المعلمات الفردية في تنظيم الإشارات طرقا قادرة على تكرار التحكم الزماني المكاني المعقد لنشاط البروتين على المستوى تحت الخلوي. التقنيات التقليدية مثل التلاعب الجيني ومثبطات الجزيئات الصغيرة تقصر في هذا الصدد. في المقابل ، تعد تقنيات البصريات الوراثية بإمكانية تشريح العمليات البيولوجية من خلال التلاعب أو محاكاة العمليات الفسيولوجية والمرضية. ومع ذلك ، غالبا ما تفتقر الأدوات الحالية إلى قابلية التطبيق الواسعة أو التحكم تحت الخلوي. تحقق العديد من الاستراتيجيات الحالية تنظيما صارما لتوطين البروتين والتفاعلات. لكنها تفتقر إلى السيطرة المباشرة على النشاط الأنزيمي¹^،²^،³^،⁴. يتيح البعض الآخر تنظيم النشاط الأنزيمي ولكنه قد يفتقر إلى التحكم تحت الخلوي أو يكون قابليته للتطبيق محدودا عبر فئات الإنزيمات المختلفة⁵^،⁶^،⁷^،⁸^،⁹. في ورقة البروتوكول هذه ، نصف طريقة جديدة لهندسة البروتين تجمع بين مزايا علم البصريات الوراثي في أداة واحدة: التنظيم الزمني الصارم ، والحركية القابلة للضبط ، والتحكم في الخلايا الفرعية ، وقابلية تطبيق الإنزيم^{الواسعة 10}. لقد صممنا مجالا منظما بالضوء (LightR) يعمل كمفتاح خيفي عند إدخاله في البروتين المستهدف محل الاهتمام. تتيح هذه الإستراتيجية تحكما مكانيا زمانيا محكما لتنشيط وتعطيل البروتين ذي الأهمية في الخلايا الحية.

هنا ، تتم مناقشة استراتيجية التصميم والتطبيق لأداة الوراثة البصرية LightR عبر العديد من فئات الإنزيمات. تقدم هذه الدراسة بروتوكولا خطوة بخطوة لتطوير وتوصيف وتطبيق التيروزين كيناز المنظم للضوء (LightR-Src). توضح الدراسة أيضا قابلية ضبط حركية تعطيل مفتاح LightR. يمكن لمفتاح LightR البطيء أن يحافظ على نشاط الإنزيم مع انخفاض تردد الإضاءة ، في حين أن إصدار الدوران السريع ، FastLightR ، يتطلب إضاءة أكثر تواترا للتنشيط ولكنه يظهر تعطيلا سريعا عند إيقاف تشغيل الإضاءة. يؤدي تنشيط / تعطيل FastLightR-Src في الخلايا الحية إلى تحفيز دورات انتشار الخلايا وانكشافها. يتفق انتشار الخلايا الناجم عن FastLightR-SRC مع الدور الفسيولوجي ل Src kinase¹¹^،¹². نظرا لحركية التعطيل السريع ، يمكن أيضا تنظيم FastLightR-Src على المستوى الخلوي ، مما يؤدي إلى تحفيز النتوءات المحلية واستقطاب الخلايا. لإثبات قابلية تطبيق أداة LightR على أنواع أخرى من الإنزيمات ، نسير القراء بإيجاز من خلال نجاح مماثل مع كيناز bRaf المنظم للضوء (LightR-bRaf ، FastLightR-bRaf) وإعادة تركيب الحمض النووي الخاص بالموقع Cre (LightR-Cre). بشكل عام ، يتمتع هذا النهج بالقدرة على تعزيز فهمنا لمسارات الإشارات المعقدة التي تشكل الفيزيولوجيا المرضية للأمراض المتنوعة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم وتطوير LightR (الشكل 1)

التخطيط الاستراتيجي
ملاحظة: يتكون مجال LightR من مجالين مستقبلات ضوئية متصلين جنبا إلى جنب (VVD) من Neurospora crassa¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶. تتجانس VVDs في وجود الضوء ، ويتضمن هذا التعتيم تغييرا توافقيا يجلب الطرف N لمونومر VVD بجوار الطرف C لمونومر VVD آخر (الشكل 1 أ). يؤدي توصيل مجالي VVD برابط مرن إلى إنشاء مجال يشبه المشبك سيكون مفتوحا في الظلام ويغلق عند الإضاءة بالضوء الأزرق. يتيح دمج هذا المشبك في المجال التحفيزي للإنزيم تنظيم النشاط بوساطة الضوء. في الظلام ، يشوه المشبك المفتوح المجال ، مما يؤدي إلى تعطيل الإنزيم. تؤدي الإضاءة بالضوء الأزرق إلى إغلاق المشبك ، واستعادة نشاط الإنزيم (الشكل 1 ب). يمكن تطبيق هذا المفهوم على الإنزيمات من عائلات مختلفة ، بما في ذلك كينازات البروتين وإعادة تركيب الحمض النووي¹⁰ (الشكل 1 ج).
1. تصميم LightR
  1. لتوصيل جزيئين من VVD ، استخدم رابطا مرنا من الأحماض الأمينية 22 (GGS) 4G (GGS) 3 بين كل مونومر.
    ملاحظة: يوفر الرابط مرونة وطولا كافيين لاستيعاب اقتران وتفكك مونومرات VVD.
  2. أضف روابط GPGGSGG و GSGGPG إلى الطرفين N و C لمجال LightR ، على التوالي.
    ملاحظة: قد يلزم تعديل طول وتكوين الروابط لبروتين معين. يتم استخدام روابط GSG الأقصر و Gly المفردة بشكل روتيني عند الحاجة إلى تنظيم أكثر صرامة. سيؤثر حجم حلقة الإدخال وقربها من المخلفات الحفازة أيضا على النطاق الديناميكي للتنظيم. من المرجح أن توفر الحلقات الأقصر تنظيما أكثر إحكاما للنشاط التحفيزي ولكنها قد تؤدي إلى نشاط أقل بعد الإضاءة. يتم توفير تسلسل مجال LightR في الجدول التكميلي 1.
2. إدخال LightR
  ملاحظة: سيمكن موقع إدخال LightR المناسب من التنظيم الصارم لوظيفة المجال المستهدف دون منع تفاعلاتها بشكل جسمي أو التسبب في تغييرات هيكلية لا رجعة فيها ستؤثر على دورها البيولوجي. يعد التركيب البلوري للبروتين المستهدف دليلا مثاليا في تحديد مناطق الحلقة المرنة لإدخال LightR. إذا لزم الأمر ، يمكن أن يكون التركيب البلوري للمتماثل القريب كافيا. وترد أدناه بعض المعايير العامة التي يجب مراعاتها.
  1. تأكد من أن حلقة الإدخال مقترنة هيكليا بالعناصر التحفيزية الحرجة للإنزيم. تأكد من أن حلقة الإدراج المحددة ليست موقع ربط موجود للبروتين وأن إدخال LightR لا يعطل أي تفاعلات وظيفية بسبب التأثيرات الفراغية.
  2. كاستراتيجية أولية ، استبدل حمض أميني واحد في حلقة الإدراج عند إدخال LightR. استهدف منتصف حلقة الإدراج التي تحتوي على حمض أميني قطبي أو صغير (على سبيل المثال ، Glu ، Arg ، Lys ، Gly) المعرضة للمذيب ولا يشارك في التفاعلات داخل الجزيئات.
    ملاحظة: عندما لا ينتج عن استبدال واحد للأحماض الأمينية بروتين وظيفي ، فإن تحسين بنية LightR سيتطلب استبدال أحماض أمينية متعددة أو حلقة الإدراج بأكملها. قم بتقييم وظائف مواقع الإدراج المتعددة ل LightR داخل الحلقة المحددة.
  3. تأكد من أن الإنزيم المستهدف يعمل بشكل مستقل عن التنظيم الداخلي. حقق ذلك باستخدام نسخة متحولة نشطة بشكل أساسي من الإنزيم لقالب الإدراج.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الإنزيمات من النوع البري لتوليد تركيبات LightR ، ولكن هذا قد يؤدي إلى نظام AND مسور سيتم تنظيمه بواسطة آليات داخلية وضوء.
  4. تعتبر الضوابط الإيجابية والسلبية أمرا حيويا لتحليل نشاط إنزيم LightR. استخدم الطفرات النشطة بشكل أساسي للبروتينات الداخلية كعناصر تحكم إيجابية وإصدارات متحولة غير نشطة تحفيزيا من إنزيم LightR المستهدف كعناصر تحكم سلبية.
    ملاحظة: عند اختيار الطفرات المعطلة ، من الأهمية بمكان التأكد من أن الطفرة متباعدة بدرجة كافية عن موقع إدخال LightR لتجنب تعطيل عدم الرجوع عن طي إنزيم LightR. بناء على المعايير المذكورة أعلاه ، يتم تحديد موقع إدخال LightR في Src kinase في منطقة حلقة مرنة مقترنة هيكليا بعزر GXGXXG المحفوظ للغاية في منطقة الحلقة G / الغنية بالجليسين المرتبطة ب ATP عبر حبلا بيتا. الأهم من ذلك ، أنه يتم وضعه بعيدا عن جيب ربط ATP ومنطقة ربط الركيزة¹⁰^،¹⁷ (الشكل 1C (i)).
    ملاحظة: نظرا للتماثل الهيكلي بين الكينازات ، يتم تحديد موقع إدخال LightR في bRaf في نفس الحلقة الهيكلية مثل موقع الإدراج في Src (الشكل 1C (ii)).
    ملاحظة: بناء على المبادئ المنصوص عليها في القسم 1.1.2 ، يتم اختيار موقع إدخال LightR في Cre recombinase ، وهو غير كيناز ، في إحدى الحلقات المرنة البعيدة عن النواة التحفيزية ، أي موقع ربط الحمض النووي. ومع ذلك ، لا تزال حلقة الإدراج مقترنة هيكليا بالمخلفات التحفيزية الحرجة داخل مجال ربط الحمض النووي من خلال حلزون α لضمان نجاح وظيفة LightR-Cre (الشكل 1 ج (ثالثا)). تم تفصيل جميع مواقع الإدراج ذات الضوابط الإيجابية والسلبية للإنزيمات المختلفة الموضحة في البروتوكول الحالي في الجدول التكميلي 2.
3. تطوير FastLightR.
  ملاحظة: يتيح إدخال طفرة I85V لكل من VVDs في LightR ديناميكية تنشيط وتعطيل أسرع ، تعزى إلى التحويل السريع للمتحور إلى الحالة المظلمة¹⁸^،¹⁹. يتيح جيل FastLightR-Src و FastLightR-bRaf مع حركية التعطيل السريع تحكما زمنيا صارما في التنشيط وتعطيل. يسمح بتحقيق التنظيم الخلوي ل LightR-Src في الخلايا الحية.
  ملاحظة: ينتج عن نشاط إعادة تركيب Cre إعادة تركيب الحمض النووي التي لا رجعة فيها. وبالتالي ، فإن خصائص الانعكاس ل LightR غير قابلة للتطبيق.
  ملاحظة: لتبسيط اكتشاف بنية LightR ، يمكن إرفاق بروتين فلوري أو أي علامة أخرى مناسبة بالطرف N أو C للبروتين المستهدف. استخدمت هذه الدراسة mCherry-myc ل LightR-SRC ، و Venus ل LightR-bRaf ، و miRFP670 ل LightR-Cre recombinase.
استراتيجية الاستنساخ
ملاحظة: يعتمد نهج الاستنساخ، على عكس الأساليب التقليدية، على الطفرات الموجهة نحو الموقع والتي لا تعتمد على مواقع تقييد محددة¹⁰^,²⁰.
1. جيل "Megaprimer"
  1. تحسين جينات LightR لضمان التعبير المستقر عن تسلسلي الحمض النووي الترادفي VVD من أصل فطري في خلايا الثدييات ولجعل التسلسلات مختلفة قدر الإمكان للاستنساخ الخالي من الأخطاء باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). لإجراء تحسين الكودون، اتبع الخطوات 1.2.1.2-1.2.1.3.
  2. قم بمحاذاة تسلسل الأحماض الأمينية ل VVDs والروابط المحددة جنبا إلى جنب لإنشاء خريطة التسلسل النظرية ل LightR.
  3. الصق التسلسل في أي نظام أساسي لتحسين الكودون عبر الإنترنت يستخدم خوارزمية متقدمة لتحسين الكودون لتحديد أفضل خيار تسلسل بأقل قدر من التعقيد. تأكد من تحديد الكائن الحي المستهدف ، والحفاظ على إطار القراءة ، وتحديد تسلسلات VVD للتحسين.
  4. احصل على LightR DNA كجزء مركب مخصص (انظر الجدول التكميلي 1) أو من بنية LightR¹⁰ المنشورة مسبقا.
  5. تضخيم الجين LightR لتوليد "Megaprimer" باستخدام استراتيجية²⁰ الموضحة سابقا الموضحة في الشكل 1D. قم بتصنيع LightR "Megaprimer" عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل باتباع توصيات الشركة المصنعة لبوليميراز الحمض النووي المحدد واستخدام خليط تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل التالي:
    5x مخزن مؤقت متوافق مع بوليميراز الحمض النووي: 10 ميكرولتر
    100 ميكرومتر ميجا برايمر أمامي: 0.5 ميكرولتر
    100 ميكرومتر ميجا برايمر عكسي: 0.5 ميكرولتر
    10 نانومتر dNTP خلط: 2 ميكرولتر
    بوليميراز الحمض النووي (2000 وحدة / مل): 1 ميكرولتر (0.02 وحدة / ميكرولتر)
    50 نانوغرام قالب الحمض النووي: 1 ميكرولتر
    ماء من الدرجة PCR: 35 ميكرولتر
    ملاحظة: هنا ، يتم استخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة والبدء الساخن مع درجات حرارة تلدين أولية عالمية.
  6. افصل الميجابرايمر الناتج عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. سيكون طول المنتج حوالي 1000 نيوكليوتيد. استئصال الميغبرايمر من هلام الاغاروز ونقاهة باستخدام مجموعة استخراج الجل ، باتباع توصيات الشركة المصنعة أو باستخدام تقنية مماثلة.
2. إدخال جين LightR باستخدام الطفرات الموجهة للموقع: أدخل LightR ، ليحل محل الحمض الأميني المطلوب أو طول الأحماض الأمينية. سيكون البلازميد القالب هو الذي يتم فيه إدراج مجال LightR. قم بإجراء تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل كما هو موضح سابقا²⁰ باستخدام الخليط التالي.
  5x مخزن مؤقت متوافق مع بوليميراز الحمض النووي: 5 ميكرولتر
  10 نانومتر dNTP خلط: 1 ميكرولتر
  بوليميراز الحمض النووي (2000 وحدة / مل): 1 ميكرولتر (0.02 وحدة / ميكرولتر)
  50 نانوغرام الحمض النووي للقالب المستهدف: 1 ميكرولتر
  Megaprimer المستخرج (الكتلة المحسوبة): 10 ميكرولتر
  DMSO: 2.5 ميكرولتر
  ماء من الدرجة PCR: 2.5 ميكرولتر
  ملاحظة: كتلة Megaprimer (ng) = نسبة الإدخال / المتجه المطلوبة × كتلة المتجه × نسبة الإدخال إلى أطوال المتجه. نسبة المولار المطلوبة للإدخال / المتجه المستخدمة هي 3/1.
3. بعد الانتهاء من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 1 ميكرولتر من إنزيم DpnI (2000 وحدة / مل) لهضم الحمض النووي الزائد والميثيلي بشكل انتقائي فقط واحتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 1-1.5 ساعة. سيؤدي ذلك إلى زيادة كبيرة في عائد البناء المعدل.
4. قم بتحويل 1-2 ميكرولتر من تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى خلايا مختصة DH5α باتباع بروتوكولات الشركة المصنعة.
5. صفيحة البكتيريا المحولة على لوريا مرق (LB)-لوحة أجار مع المضاد الحيوي المناسب للاختيار. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية طوال الليل أو في درجة حرارة الغرفة (RT ؛ 25-30 درجة مئوية) لمدة 72 ساعة.
  ملاحظة: يمكن تخزين ألواح LB ذات المستعمرات المزروعة عليها عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد ، ويمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا.
6. مستعمرة الشاشة PCR
  1. لفحص المستعمرة المستند إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل ، صمم بادئات تلدين في إدراج LightR وتستهدف الحمض النووي لتوليد ما يقرب من 400-700 نقطة أساس.
  2. أضف كمية صغيرة من مستعمرة من لوحة LB إلى مزيج تفاعل البوليميراز المتسلسل الموضح أدناه وانتقل إلى التدوير الحراري باتباع توصيات الشركة المصنعة لبوليميراز الحمض النووي المحدد.
    2x Taq RED Master Mix: 5 ميكرولتر
    ماء من الدرجة PCR: 5 ميكرولتر
    100 ميكرومتر برايمر أمامي: 0.5 ميكرولتر
    100 ميكرومتر برايمر عكسي: 0.5 ميكرولتر
  3. تحقق من وجود مستعمرات إيجابية عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز.
  4. اختر المستعمرات التي ولدت حجم منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المطلوب وقم بتلقيحها بشكل فردي في 3 مل من مرق LB بالمضاد الحيوي ، بما يتوافق مع مقاومة المضادات الحيوية في العمود الفقري للبلازميد. ثم احتضنها ورجيها عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
  5. استخراج الحمض النووي البلازميد من المزرعة السائلة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة تنقية البلازميد لاستخراج الحمض النووي البلازميد والتحقق من وجود الإدخال عن طريق التسلسل.
    ملاحظة: يتم تلخيص بادئات الاستنساخ في الجدول التكميلي 3.

2. طلاء الخلية والتحليل الكيميائي الحيوي لنشاط إنزيم LightR (الشكل 2 أ)

للتحليل الكيميائي الحيوي ل LightR-kinases (LightR Src ، FastLightR Src ، LightR bRaf) ، لوحة 1 × 10⁶ خلايا LinXE لكل طبق ثقافة خلية 3.5 سم لكل مجموعة تجريبية. انظر الجدول التكميلي 4.
احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 16-18 ساعة.
في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا ببنية الحمض النووي المحددة ، باستخدام كاشف تعداء مناسب باتباع توصيات الشركة المصنعة (الجدول التكميلي 4).
ملاحظة: يعتمد كاشف التعداء الأمثل على بنية الخلايا المستخدمة ومتجه ونوعها. استخدمت هذه الدراسة 2 ميكروغرام من الحمض النووي في طبق 3.5 سم باستخدام كاشف التعداد. يجب إجراء الاختبارات التجريبية لتحديد كاشف التعداء الأمثل. نظرا لأن التركيبات المنقولة ستعبر عن البروتينات التي ينظمها الضوء الأزرق ، يجب تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة التي تتعامل مع الخلايا المنقولة تحت الضوء الأحمر. لف الألواح بخلايا منقولة بورق الألمنيوم قبل وضعها في الحاضنة لمنع الإضاءة العرضية.
بعد 16-18 ساعة من التعدي ، تعرض الخلايا للضوء الأزرق¹⁰. للقيام بذلك ، ضع نظام مصباح لوحة الصمام الثنائي الباعث للضوء (LED) 465 نانومتر في حاضنة زراعة الأنسجة. ضع لوحا زجاجيا شبكيا مثقوبا على ارتفاع 10 سم فوق المصباح للحصول على الإضاءة المطلوبة البالغة 3 ميجاوات / سم² (الملف التكميلي 1). هناك حاجة إلى لوحة مثقبة للحفاظ على دوران الهواء دون انقطاع في الحاضنة. تضيء الخلايا للفترة المطلوبة.
لتنشيط LightR-Src و LightR-bRaf ، استخدم الإضاءة المستمرة. للإضاءة المستمرة، قم بتشغيل لوحة LED وإيقاف تشغيلها يدويا.
للحفاظ على دورة التنشيط/إلغاء تنشيط FastLightR Src، استخدم دورات التشغيل/الإيقاف التي يتم التحكم فيها يدويا أو بواسطة متحكم دقيق.
ملاحظة: يمكن استخدام العديد من مجموعات أدوات البرامج التي توفر بيئة تطوير متكاملة (IDE) لكتابة التعليمات البرمجية المطلوبة وتحميلها. تدعم مجموعات الأدوات هذه برمجة C / C ++ وتوفر وصولا للأغراض العامة للإدخال / الإخراج (GPIO) ، وهو أمر ضروري للتحكم في الإضاءة النبضية. وصف مفصل للبروتوكولات والتعليمات البرمجية المستخدمة لهذه الأغراض موصوف في الملف التكميلي 1.
في نهاية النقاط الزمنية المعنية للتجربة (الجدول التكميلي 4) ، حصاد الخلايا تحت أضواء حمراء آمنة. استنشق الوسائط واغسل الخلايا باستخدام PBS البارد.
لعزل البروتين ، خلايا التحلل التي تحتوي على 500 ميكرولتر من 2x Laemmli العينة المؤقتة مع 5٪ v / v 2-Mercaptoethanol. احتضان المحللة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. تحليل تحلل الخلايا عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام البروتين والنشاف الغربي²¹.
ملاحظة: تكوين 2x Laemmli المؤقت هو كما يلي: ل 500 مل: 5.18 جم من Tris-HCL ، 131.5 مل من الجلسرين ، 52.5 مل من 20٪ SDS ، 0.5 جم من البروموفينول الأزرق ، الرقم الهيدروجيني النهائي 6.8.
قم بتقييم نشاط LightR-Src من خلال تقييم مستوى الفسفرة ل p130cas الداخلي على Tyr249 و paxillin على TyrY118²²^،²³ (الشكل 2). قم بتقييم نشاط LightR-bRaf من خلال تقييم مستوى الفسفرة ل MEK1 على Ser217 / 221 و ERK1 / 2 على TyrY202 / 204²⁴^،²⁵.

3. التحليل الوظيفي لنشاط LightR-Cre

للتحليل الوظيفي لنشاط LightR-Cre ، لوحة 1 × 10⁶ خلايا LinXE لكل طبق ثقافة خلية 3.5 سم. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 16-18 ساعة.
قم بنقل الخلايا باتباع البروتوكول الموضح في القسم 2 ، الشكل 2 أ ، والجدول التكميلي 5. شارك في نقل ما مجموعه 2 ميكروغرام من الحمض النووي ، بنسبة 1: 9 من LightR-Cre-iRFP670 وبلازميد مراسل Floxed-STOP-mCherry².
بعد 16-18 ساعة بعد التعدي ، قم بإضاءة الخلايا. يحتاج تنشيط LightR-Cre الفعال إلى إضاءة طويلة. لذلك ، لتجنب السمية الضوئية ، استخدم الإضاءة النبضية لمدة 8 ساعات مع دورتين 2 ثانية ON و 20 ثانية OFF باستخدام نظام مصباح لوحة LED 465 نانومتر يتم التحكم فيه بواسطة متحكم دقيق كما هو مفصل في القسم 2 والملف التكميلي 1.
قم بإجراء التصوير باستخدام الفحص المجهري اللامع مع هدف هوائي 20x. لتصور LightR-Cre-iRFP670 ، استخدم مجموعة مرشحات Cy5 ، ولتصور mCherry من تعبير Floxed-mCherry ، استخدم مجموعة مرشح RFP.
ملاحظة: للتصوير ، يتم استخدام مجهر epifluorescence المجهز بمكعبات ضوء Cy5 / RFP.

4. تحضير عينات لتصوير الخلايا الحية

لوحة 2 × 10⁵ خلايا هيلا لكل طبق زراعة أنسجة 35 مم في وسط زراعة الخلايا وتحتضن لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
بمجرد أن تلتصق الخلايا ويكون التقاء حوالي 60٪ -70٪ ، قم بنقل خلايا HeLa بأحد الخلطات التالية: (أنا) 0.85 ميكروغرام من FastLightR-Src-mCherry-myc / 0.15 ميكروغرام من Stargazin-iRFP ، أو (ii) 0.75 ميكروغرام من FastLightR-bRaf-Venus / 0.25 ميكروغرام من mCherry-ERK2
ملاحظة: في تجارب FastLightR-Src ، يتم استخدام Stargazin-iRFP لتسمية غشاء البلازما لتحليل انتشار الخلايا. إذا كان تعبير FastLightR-Src أعلى مطلوبا ، فيمكن حذف stargazin-iRFP ، ويمكن استخدام 1 ميكروغرام من FastLightR-Src بدلا من ذلك. في هذه الحالات ، يجب استخدام صبغة غشائية لتصور الخلايا. تستخدم بقع غشاء البلازما بشكل روتيني لوضع العلامات على أغشية الخلايا.
قم بتغطية الطبق بورق الألمنيوم لتجنب الإضاءة العرضية للخلايا واحتضانه لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
أكمل جميع الخطوات التالية تحت إضاءة الضوء الأحمر لتجنب التنشيط غير المقصود للبنيات. سيؤدي التعرض للضوء الأبيض إلى تنشيط LightR-kinases ويمكن أن يؤثر على النتائج اللاحقة.
في نفس اليوم ، قم بتغطية 3 أغطية زجاجية مستديرة (قطر 25 مم ، سمك 0.17 مم) طوال الليل مع 5 مجم / لتر من الفيبرونيكتين في PBS عند 37 درجة مئوية.
اشطف الغطاء باستخدام PBS 16-18 ساعة بعد التعدي واللوحة ~ 1 × 10⁵ خلايا HeLa المنقولة على كل غطاء. احتضان في وسط زراعة الخلايا لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
ملاحظة: كثافة البذر المنخفضة ضرورية لضمان عدم ملامسة الخلايا في مجال الرؤية لبعضها البعض.
قم بإعداد وسائط التصوير عن طريق إضافة FBS إلى وسائط التصوير L-15 من Levobitz إلى تركيز نهائي قدره 5٪. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر وقم بتسخينه إلى 37 درجة مئوية.
يسخن الزيت المعدني إلى 37 درجة مئوية.
اغسل الغطاء الذي يحتوي على الخلايا باستخدام PBS مرتين. في حالة استخدام صبغة غشائية ، قم بتلطيخ الخلايا باتباع تعليمات الشركة المصنعة قبل غسل الغطاء.
ضع الغطاء بعناية في غرفة تصوير الخلايا الحية. أضف 1 مل من وسائط التصوير L-15 إلى الغرفة.
أضف 1 مل من الزيت المعدني فوق الوسائط لمنع التبخر أثناء عملية التصوير.
حافظ على الغرفة محمية من الضوء عند 37 درجة مئوية حتى يتم إعدادها للتصوير.

5. التنشيط العالمي والتصوير ل FastLightR-Src (الشكل 3)

قم بتوصيل مصباح حلقة مجهر LED أزرق بمكثف المجهر، ووضعه على ارتفاع 1.5 سم تقريبا فوق حامل العينة. قم بتوصيل مرحل التحكم في التيار المتردد / التيار المستمر للضوء الدائري بكمبيوتر المجهر.
ملاحظة: بالنسبة للتجارب في هذه الدراسة ، تم التحكم في الإضاءة من خلال واجهة منطق الترانزستور والترانزستور (TTL) عبر برنامج التصوير. يمكن أيضا استخدام إضاءة Epifluorescent لتنشيط تركيبات LightR عالميا في حالة عدم توفر مصدر إضاءة خارجي. تعتبر الأطوال الموجية للإثارة GFP ، مثل مرشح الإثارة 490/20 نانومتر ، فعالة في تنشيط LightR.
ضع الغرفة على مرحلة مجهرية مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية وحدد الخلايا التي تعبر عن FastLightR-Src-mCherry و Stargazin-iRFP (الشكل 3 ب) أو FastLightR-bRaf-Venus و mCherry ERK-2 (الشكل 5 ب).
لدراسة تجارب الإضاءة والتصوير العالمية ، استخدم أهدافا عالية الأداء متوافقة مع المجهر (40x) مع تصحيح شبه لوني ، وتصحيح المجال المسطح ، وفتحة عددية عالية.
1. بالنسبة للدراسات العالمية القائمة على الإضاءة ل Src kinase ، استخدم مرشحات الإثارة 561/10 نانومتر ومرشحات انبعاث 595/40 نانومتر لتصور FastLightR-Src-mCherry واستخدم الإثارة 640/20 نانومتر ومرشح انبعاث 655LP لتصور stargazin-iRFP.
2. بالنسبة للدراسات العالمية القائمة على الإضاءة ل bRaf kinase ، استخدم مرشحات الإثارة 514/10 نانومتر و 540/21 نانومتر لتصور FastLightR-bRaf-Venus واستخدم مرشحات الإثارة 561/10 نانومتر و 595/40 نانومتر لتصور mCherry-ERK-2.
3. استخدم مرآة متعددة النطاقات متعددة النطاقات في جميع قنوات التصوير الفلورية.
اعتمادا على الظروف التجريبية ، ضع في اعتبارك التوصيات التالية.
1. قم بتصوير الخلايا لمدة 10 دقائق على الأقل قبل الإضاءة لإنشاء نشاط أساسي للخلايا.
  ملاحظة: هذا الخط الأساسي مطلوب لتحديد ما إذا كان تنشيط كيناز FastLightR عن طريق الإضاءة يؤدي إلى أي تغييرات في سلوك الخلية أو توطين البروتين. يمكن للمرء أيضا إجراء فترات أطول من التصوير القاعدي لتوفير أهمية إحصائية أكبر.
2. نظرا لحركية التعطيل السريع ل FastLightRs ، فإن تضمين العديد من الخلايا للتصوير قد يتسبب في تعطيل Src / bRaf بين مواضع المرحلة ويمكن أن يخفف من استجابته. لتجنب مثل هذا الخطأ ، قم بتصوير 4 خلايا / دقيقة أثناء تحليل نشاط FastLightR-Kinase في البروتوكول الموصوف وقم بتصوير كل خلية محددة كل دقيقة لمدة 110 دقيقة (الملف التكميلي 2).
3. استخدم الإضاءة النبضية على الإضاءة المستمرة لتقليل التأثيرات السامة الضوئية المحتملة للضوء الأزرق. الإضاءة لمدة 12 ثانية لكل من الخلايا الأربع / دقيقة فعالة (الملف التكميلي 2 ، الشكل 3 أ).
  ملاحظة: يجب تحديد دورات الإضاءة تجريبيا لأنواع مختلفة من التركيبات ومصادر الإضاءة.
4. قم بإيقاف تشغيل الإضاءة أثناء تصوير الخلية لتجنب النزيف في قنوات الفلورسنت.
  ملاحظة: سيؤدي تصوير عدد كبير جدا من الخلايا في وقت واحد إلى تقليل إجمالي وقت الإضاءة المتاح للعينة، مما يؤدي إلى استجابة ضعيفة من التنشيط غير الكافي.
بعد التصوير ، احفظ الأفلام كملف . تنسيق ملف مكدس TIF للتحليل.
ملاحظة: نظرا للإضاءة الأقل اتساقا مع التألق الفائ-فلوري GFP مقارنة بالضوء الحلقي ، فإن التجارب التي تستخدم تألق GFP ستتطلب إضاءة أكثر تكرارا. ينتج عن هذا تصوير عدد أقل من الخلايا في كل تجربة.

6. التنشيط والتصوير تحت الخلوي ل FastLightR-Src (الشكل 4)

ضع الغرفة على مرحلة مجهرية مسخنة مسبقا إلى 37 درجة مئوية وحدد خلية واحدة تعبر عن كل من FastLightR-Src-mCherry و Stargazin-iRFP.
حدد المناطق المحددة (ROI) داخل الخلية المراد إضاءتها. تختار هذه الدراسة مساحة صغيرة على محيط الخلية المختارة.
ملاحظة: بالنسبة للإضاءة المحلية ، يتم استخدام ليزر 445 نانومتر يتم تركيزه بواسطة وحدة TIRF في وضع FRAP أو جهاز مرآة دقيقة يتم التحكم فيه من خلال واجهة TTL عبر برنامج التصوير. سيعمل أي نظام إضاءة منقوش مع هذه التجارب. إذا تم استخدام نظام قائم على المسح ، فحدد شدة الليزر وتجانسه للتنشيط الكافي دون الإضرار بالخلية.
قم بتصوير الخلية المحددة كل دقيقة لمدة 20 دقيقة في الحالة القاعدية قبل الإضاءة ، و 50 دقيقة أثناء الإضاءة محليا ، ثم 20 دقيقة بعد التنشيط لمدة 90 دقيقة (الملف التكميلي 2).
للتنشيط والإلغاء ، وفر قدرا مناسبا من الوقت المناسب للبروتين المستهدف للسماح بالتعطيل الكامل لبروتين LightR. بالنسبة إلى FastLightR-Src ، اسمح بإلغاء التنشيط لمدة 10 دقائق على الأقل للنشاط المتبقي للاستئصال والسماح بإلغاء التنشيط لمدة 20 دقيقة في الإعداد التجريبي الواضح للإضاءة المحلية.
بعد التصوير ، احفظ الأفلام ك . تنسيق ملف مكدس TIF للتحليل.

7. تحليل انتشار الخلايا

إعداد الصور لمعالجة البيانات وتحليلها. تأكد من أن الصور في ملف . تنسيق مكدس TIF. احفظها مباشرة من برنامج التصوير أو قم بتحويلها باستخدام برنامج مفتوح المصدر.
قم بتنزيل حزمة البرنامج النصي CellGeo من الملفات المضغوطة للبيانات التكميلية²⁶.
ملاحظة: تحتوي حزمة CellGeo على عدة برامج نصية مختلفة. اختر الحزمة المطلوبة من القائمة بناء على نوع التحليل كما هو مغطى في أقسام البروتوكول 7-9.
افتح وقم بتشغيل البرنامج النصي بعنوان MovThresh لإنشاء قناع للخلية.
1. حدد استيراد > الملف (.tif) وحدد صور Stargazin-iRFP للخلايا.
2. امسح الإطارات ضوئيا باستخدام شريط التمرير في الزاوية اليسرى السفلية. إذا كان الحد المقترح مناسبا، فانتقل إلى الخطوة 7.4.
3. إذا لم يتوافق الحد المقترح مع سلوك الخلية، فاختر منحنيات سلسة أو مخصصة أسفل تحديد المنحنى. قم بإنشاء المنحنى المخصص عن طريق التمرير عبر الإطارات ثم ضبط العتبة على الجانب الأيمن من النافذة.
4. انقر فوق إعادة الحد.
5. انقر فوق ملف > حفظ كأقنعة، وقم بتغيير اسم الملف، واحفظه باستخدام خيار حفظ باسم .
افتح ملف المكدس الذي تم إنشاؤه حديثا في برنامج تحليل صور مفتوح المصدر.
حدد الصورة > ضبط الحد > > تطبيق.
حدد تحليل > تحليل الجسيمات > التحقق من نتائج العرض -> موافق.
احسب التغير في مساحة كل خلية بقسمة المساحة في أي وقت على متوسط مساحة نفس الخلية قبل تشعيع الضوء الأزرق.
ارسم تغيير المنطقة كرسم بياني خطي أو شريطي.
احسب متوسط القيمة وفترات الثقة بنسبة 90٪ لكل نقطة زمنية لجميع الخلايا التي تمت معالجتها في نفس الظروف.

8. تحليل ديناميكيات حافة الخلية

قم بإعداد ملفات المكدس باستخدام الخطوات الموضحة في قسم البروتوكول 7.
افتح البرنامج النصي بعنوان ProActive وقم بتشغيله.
1. حدد File > Import > Masks (.tif) وحدد القناع الذي تم إنشاؤه من خلال البرنامج النصي MovThresh .
2. حدد النشاط الذي يثير اهتمامه في التحليل في الزاوية اليمنى السفلية (بارز أو انتزاع أو إجمالي).
3. حدد نوع التطبيع. عادة ، يتم استخدام تطبيع المنطقة لهذه التحليلات.
4. حدد الإطار المرجعي الأولي باستخدام شريط التمرير الموجود على اليسار. سيحدد شريط تمرير التأخر الموجود على اليمين الفاصل الزمني بين نقطتين تستخدمان لقياس المساحة المكتسبة والمفقودة من قبل الخلية.
5. إذا كان الإطار المحدد ورقم التأخر أكبر بشكل إضافي من عدد الإطارات في الفيلم، فلن يتم عرض صورة المعاينة. أعد تعيين هذه القيم لتساوي أقل من إجمالي عدد الإطارات.
قم بتعديل العتبة للنتوء أو التراجع عن طريق تحديد مربع المنحنى السلس ضمن قسم النتائج . يؤدي هذا إلى متوسط الحدود عبر نافذة معينة، والتي يمكن أن تحل المشكلات التي يتم فيها اكتشاف التقلبات الطفيفة كنشاط.
حدد تشغيل النطاق لحساب النشاط خلال الوقت المحدد بواسطة منزلقات الإطار والتأخير.
احفظ البيانات الرقمية عن طريق تحديد ملف > حفظ باسم نتائج > (.mat) واستخدمها لتحديد متوسط النشاط البارز أو التراجعي.
حدد فواصل الثقة 90٪ لكل نقطة زمنية.
ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى حفظ مصفوفة من عدة قيم مختلفة. يوفر الملف النصي "كيفية استخدام ProActive" المضمن في البرنامج النصي وصفا تفصيليا لما تمثله كل قيمة وكيف تم تحديدها²⁶.
احفظ التمثيل المرئي للنشاط عن طريق تحديد ملف > حفظ > الصور (.tif).

9. تحليل التحول المركزي

لتحليل التحول المركزي ، استخدم أي برنامج يمكنه تحديد إحداثيات النقطة الوسطى.
في برنامج التحليل ، افتح مكدس الصور المقنع للخلية محل الاهتمام كما هو موضح في القسم 7 من البروتوكول.
حدد قياس > تحليل قياس التباين المتكامل ثم انقر فوق تفضيلات > رسم علامة الوسط > التحقق ، ثم حدد قياس.
1. سجل إحداثيات المركزي قبل الحركة (A).
2. سجل إحداثيات النقطة الوسطى في نهاية التجربة (ب).
3. سجل إحداثيات مركز نمط الإضاءة (C).
الآن بعد أن تم جمع النقاط الثلاث ، حدد الزاوية BAC⁸. θ₁ يتوافق مع الزاوية ABC و θ₂يتوافق مع الزاوية CBA (الشكل 4Cii). افعل ذلك باستخدام المعادلة التالية:
cosθ = cos(θ₁ - θ₂) = cosθ₁cosθ₂ + sinθ₁sinθ₂
ملاحظة: يمكن استخدام الآلة الحاسبة لتحديد الزوايا والمسافات مباشرة من الإحداثيات لسهولة الاستخدام.
حدد إزاحة النقطة الوسطى بضرب المسافة التي قطعها النقطة الوسطى للخلية بالبكسل في عامل التحويل حيث 1 بكسل يساوي 0.4 ميكرومتر. سيعتمد التحويل المحدد لوحدات البكسل إلى المسافة على التكبير وإعداد الكاميرا على النظام.
بمجرد تحديد زاوية التحول المركزي والمسافة ، افتح برنامجا بيانيا قادرا على إنتاج صور للإحداثيات القطبية.
أدخل زاوية إزاحة النقطة الوسطى كقياس θ والمسافة المقطوعة كنصف قطر. استخدم ANOVA لاختبار فترات الثقة بنسبة 95٪.
ارسم النتائج واحفظ الصورة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم LightR-Src وإنشائه باتباع الإستراتيجية الموضحة في الشكل 1 أ ، ب. يصل التحليل الكيميائي الحيوي ل LightR-Src إلى فسفرة ركائز Src الداخلية المعروفة ، p130Cas (Y249) ²² و paxillin (Y118) ²³ استجابة للضوء الأزرق عند 60 دقيقة من الإضاءة المستمرة (الشكل 2 ب). والجدير بالذكر أنه لم يتم ملاحظة أي تنشيط في الخلفية ل Src kinase عندما يتم التعبير عن LightR-Src فقط في الظلام لمدة 16-18 ساعة بعد التعداد. علاوة على ذلك ، فإن الطفرة غير النشطة تحفيزيا ل LightR-Src مع طفرة D388R لا تحفز فسفرة ركيزة Src ، مما يدل على أن الفسفرة يتم بواسطة LightR-Src النشط ولا ينتج عن تأثير غير محدد لإضاءة الضوء الأزرق (الشكل 2 ب). اعترافا بتقارير النشاط التذبذبي ل Src²⁷ kinase في الخلايا الحية ، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان يمكن ضبط LightR-Src لإظهار التنشيط الدوري. عرض LightR-Src الأصلي حركية تعطيل بطيئة (الشكل 2C) ، مما دفع إلى إنشاء متغير جديد ، Fast-LightR-SRC ، يؤوي طفرة I85V في كل من VVD. يوضح الشكل 2D أن Fast-LightR-Src يظهر حركية إلغاء تنشيط أسرع بشكل ملحوظ ويتم تعطيله تماما في غضون 10 دقائق من إطفاء الضوء ، مقارنة بأكثر من ساعة ل LightR-Src. باستخدام FastLightR-Src ، تمكنا أيضا من تحقيق دورات متكررة من التنشيط / التعطيل (الشكل 2E). توضح هذه النتائج بشكل جماعي قدرة أداة LightR على تحقيق تنظيم محدد ومتحكم بإحكام لنشاط Src في الخلايا الحية.

يسمح تطبيق FastLightR-Src أيضا بتقييم تأثيرات تنشيط Src العابر على الديناميكا مورفوديناميكية للخلية. يؤدي تنشيط FastLightR-Src في خلايا HeLa إلى انتشار الخلايا ، وتتوقف هذه العملية بمجرد تعطيل FastLightR-Src. عند التنشيط ، لاحظنا انتقال FastLightR-Src من الحجرة المحيطة بالنواة إلى الالتصاقات البؤرية وغشاء البلازما ، وهو سلوك أظهره النوع البري Src^{kinase 11}^،¹². تفشل الخلايا المضيئة التي تعبر عن المتحولة غير النشطة تحفيزيا D388RLightR-Src في إظهار مثل هذه التأثيرات المنتشرة (الشكل 3 ب ، ج). هذا يؤكد أيضا أن FastLightR-Src يعمل بشكل مشابه لنظيره من النوع البري. تؤدي الإضاءة المحلية لمنطقة الخلية إلى تنشيط موضعي ل FastLightR-Src المشار إليه بالتراكم المحلي LightR Src في الالتصاق البؤري ويرافقه تكوين نتوءات غشائية محلية (الشكل 4 ب (i) ، (ii)) وتحول المركزي للخلية (الشكل 4 ج (i) ، (ii)) مما يؤدي إلى حركة الخلية نحو الضوء. بعد إنشاء تطبيق أداة LightR لتنظيم Src kinase ، نعرض فائدة LightR واسعة النطاق الممتدة لتنظيم bRaf kinase و DNA recombinase Cre. يظهر تحليل LightR-bRaf الفسفرة الناجمة عن الضوء للركيزة الداخلية ل bRaf و MEK1 والفسفرة النهائية لكينازات ERK1 / 2²⁴^،²⁵ بمستويات مماثلة لتلك الموجودة في متحولة bRaf النشطة بشكل أساسي (V600E) (الشكل 5 أ). على العكس من ذلك ، فإن D575RLightR-bRaf غير النشط تحفيزيا لا يظهر أي فسفرة MEK1 و ERK1 / 2 ، يمكن مقارنتها بعينات LightR-bRaf غير المضيئة ، مما يؤكد خصوصية تنظيم LightR-bRaf. أظهر تصوير الخلايا الحية أن الدورات المتكررة لتنشيط / تعطيل FastLightR-bRaf تحفز الانتقال المتكرر ل ERK2 داخل وخارج النواة ، مما يؤكد النتائج المعروفة لتنشيط bRaf²⁸ (الشكل 5 ب). يؤدي تنشيط LightR-Cre إلى إعادة تركيب ناجحة لجين mCherry المراسل ، مما يدل على قابلية تطبيق LightR على فئات مختلفة من الإنزيمات (الشكل 5 ج).

figure-results-1
الشكل 1: استراتيجية تطوير نهج LightR. (أ) الهياكل البلورية لاثنين من المونومرات الزاهية في الحالة المظلمة (PDB: 2PD7) وثنائي في الحالة المضاءة (PDB: 3RH8). (ب) تمثيل الرسوم المتحركة لتصميم LightR. يعطل مستقبلان ضوئيان متصلان بشكل مترادف VVD يتم إدخالهما في المجال التحفيزي النشاط التحفيزي للبروتين في الظلام. يؤدي تثمير VVD استجابة للضوء الأزرق إلى استعادة نشاط البروتين. (ج) الهياكل البلورية ل (i) Src (PDB 1Y57) ، و (ii) bRaf (PDB 4MNF) المجالات التحفيزية. (ثانيا) هيكل Cre recombinase (PDB 1MA7). تشير الأسهم الصفراء إلى موقع إدخال LightR وتشير إلى الأحماض الأمينية المستبدلة. (د) رسم تخطيطي لاستراتيجية الاستنساخ لإدخال مجال LightR في تسلسل الإنزيم المستهدف¹⁹. في الخطوة 1 ، يتم استخدام بادئات مصممة خصيصا لتخليق تفاعل البوليميراز المتسلسل لجزء LightR محاط بمواقع تلدين في الجين المستهدف قبل وبعد موقع الإدخال. في الخطوة 2 ، يظهر أن جزء LightR الذي تم إنتاجه على هذا النحو يستخدم ك "megaprimer" لإدخال LightR في جين الإنزيم المستهدف عن طريق التغيير السريع للطفرات الموجهة إلى الموقع. تم تكييف اللوحات A-C وتعديلها بإذن من Shaaya et ^al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التوصيف الكيميائي الحيوي لبروتينات LightR المهندسة (أ) التمثيل التخطيطي للبروتوكول التجريبي للتوصيف الكيميائي الحيوي ل LightR Src. (ب) تضيء خلايا LinXE بشكل عابر عن بنية LightR Src التي تحمل mCherry وعلامة myc في الطرف C باستمرار بالضوء الأزرق لمدة 60 دقيقة ، باستخدام إعداد LED 465 نانومتر. تم فحص محللات الخلية بحثا عن فسفرة ركائز Src ، وباكسيلين ، و p130Cas. تظهر نتائج Western Blot فسفرة الباكسيلين الداخلي و p130Cas استجابة لتنشيط LightR-Src في الخلايا الحية. (ج، د) تعرضت خلايا LinXE التي تعبر بشكل عابر عن تركيبات LightR-Src المشار إليها والتي تحمل علامة mCherry-myc الترادفية في الطرف C باستمرار للضوء الأزرق لأوقات محددة (0 دقيقة و 30 دقيقة) ثم وضعت في الظلام لفترات زمنية محددة. تم فحص محللات الخلايا بحثا عن فسفرة ركائز Src ، مما يدل على مقارنة حركية التنشيط والتعطيل بين (C) LightR-Src و (D) FastLightR-Src. (ه) تعرضت خلايا LinXE التي تعبر بشكل عابر عن تركيبات LightR-Src المشار إليها والتي تحمل علامة mCherry-myc الترادفية في الطرف C باستمرار للضوء الأزرق لمدة 20 دقيقة متبوعة بحضانة متكررة في الظلام لمدة 10 دقائق وفي الضوء لمدة 20 دقيقة. تم جمع محللات الخلايا وفحصها بحثا عن فسفرة ركائز Src ، مما يدل على كفاءة دورة كيناز Src بين حالات التنشيط والتعطيل. تكررت جميع التجارب ثلاث مرات على الأقل بنتائج مماثلة. تمثل الأرقام المعروضة بجانب كل لوحات لطخة غربية B-E الأوزان الجزيئية للبروتينات ، مقاسة بالكيلودالتون (kDa). تم تكييف اللوحات B-E وتعديلها بإذن من Shaaya et ^al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التحكم في الإضاءة العالمية والزمنية وتأثيرها على نشاط FastLightR-Src. (أ) تمثيل الرسوم المتحركة للمخطط التجريبي للإضاءة الدورية العالمية والزمنية وتحليلات البيانات اللاحقة. (ب ، ج) يتم تصوير تنظيم مورفولوجيا الخلية وتوطين FastLightR-Src بواسطة الضوء الأزرق في صور تمثيلية لخلايا HeLa التي تم الحصول عليها من سلسلة الفاصل الزمني باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال. كانت هذه الخلايا تعبر بشكل عابر عن FastLightR-Src-mCherry-myc (N = 10 خلايا) أو D388RLightR-Src-mCherry-myc غير نشط تحفيزيا (N = 9 خلايا) جنبا إلى جنب مع Stargazin-iRFP670 (علامة غشاء البلازما). تم إجراء تصوير الخلايا الحية كل دقيقة بينما كانت الخلايا مضاءة عالميا بالضوء الأزرق (الخطوط العريضة الزرقاء). (ب) تسلط الأسهم الصفراء الضوء على توطين FastLightR-Src في الهياكل التي تشبه الالتصاقات البؤرية. تم الحصول على الصور من سلسلة بفاصل زمني من خلايا HeLa باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال. (ج) يظهر القياس الكمي للتغيرات في منطقة الخلية الناجمة عن تنشيط FastLightR-Src مقابل D388RLightR-Src على كل لوحة. يشار إلى نافذة الإضاءة على أنها مستطيلات زرقاء. تمثل الرسوم البيانية متوسط ± فترات الثقة 90٪. تم تكييف اللوحين B و C وتعديلهما بإذن من Shaaya et ^al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: التحكم في الإضاءة الخلوية المحلية وتأثيرها على نشاط FastLightR-Src. (أ) تمثيل كرتوني للمخطط التجريبي للتحكم المحلي في الإضاءة دون الخلوية. (ب) (ط) تسلسل الفاصل الزمني الذي يوضح خلية HeLa تعبر عن FastLightR-Src-mCherry ، مضاءة محليا بالضوء الأزرق (مصور بدائرة زرقاء). تم التقاط الصور كل دقيقة باستخدام الفحص المجهري الفلوري للانعكاس الداخلي الكلي (هدف 60x). يتم تقديم الصور كصور تباين مقلوبة تم الحصول عليها في فترات زمنية محددة. (ثانيا) صور إسقاط الخلية التي تعرض نتوءات تشكلت خلال فترات زمنية محددة. يمثل عتبة وإخفاء مورفولوجيا الخلية عبر الجدول الزمني التجريبي منصة لتحليل انتشار الخلايا وديناميكيات حافة الخلية. يتم تحديد المنطقة المضيئة المحددة للخلية بدائرة زرقاء. (ج) (ط) مخطط قطبي للخلايا التي تمثل مسافة هجرة النقطة الوسطى (د) وزاوية الانحراف (θ) بالنسبة لإضاءة الضوء الأزرق المحلية. تمثل النقاط السوداء خلايا HeLa الفردية التي تعبر عن D388RLightR-Src غير النشطة تحفيزيا (N = 6 خلايا) أو FastLightR-Src (N = 10 خلايا). (ثانيا) التمثيل التخطيطي الذي يوضح مسافة التحول المركزي (د) التي يقطعها المحور المركزي للخلية من البداية (1) إلى الاستنتاج (2) لتحفيز الضوء الأزرق المحلي. تشير زاوية الانحراف (θ) إلى مدى تباعد حركة الوسط الوسطى للخلية عن موقع الضوء الأزرق. يشير التظليل الرمادي الفاتح إلى المنطقة البارزة بواسطة الخلية استجابة لتحفيز FastLightR-Src المحلي. يشار إلى المنطقة المضيئة المحددة للخلية بدائرة زرقاء صلبة. تم تكييف اللوحين B و C وتعديلهما من Shaaya et ^al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: التطبيق الواسع لنهج LightR. (أ) تنظيم LightR-bRaf. تعرضت خلايا LinXE التي تعبر بشكل عابر عن LightR-bRaf-Venus ، أو D575R LightR-bRaf Venus غير النشط تحفيزيا ، أو bRaf النشط بشكل أساسي (V600E) -Venus للضوء الأزرق المستمر للفترة الزمنية المحددة. تم فحص محللات الخلايا لفسفرة البروتينات المشار إليها. (ب) توضح الصور التمثيلية التي تم الحصول عليها من سلسلة الفاصل الزمني لتصوير الخلايا الحية باستخدام الفحص المجهري الفلوري واسع المجال تنظيم استجابة الضوء الأزرق العالمية في خلايا LinXE التي تعبر بشكل عابر عن FastLightR-bRaf-Venus و mCherry-ERK2. كانت هذه الخلايا مضاءة عالميا بالضوء الأزرق (نبضات 50 مللي ثانية كل ثانية ، 50 نبضة في الدقيقة) لفترات محددة موضحة باللون الأزرق. تم إجراء تصوير الخلايا الحية ل mCherry-ERK2 كل دقيقة. تسلط الأسهم الصفراء الضوء على مراحل توطين ERK2 النووي الناجم عن تنشيط الضوء الأزرق ل bRaf الهندسي. (ج) تم نقل خلايا LinXE بشكل عابر مع مراسل Floxed-stop-mCherry و LightR-Cre-iRFP670. تعرضت الخلايا إما لظروف مظلمة أو ضوء أزرق نابض (2 ثانية ، 10 ثوان) لمدة تصل إلى 8 ساعات. تم الحصول على صور لجميع النقاط الزمنية لكل قناة باستخدام مجهر مضان واسع المجال (هدف 10x) في إعدادات متطابقة وتم تعديلها على مستويات سطوع وتباين متسقة لتسهيل مقارنة مستويات التعبير عن البروتين عبر العينات. تكررت التجربة ثلاث مرات على الأقل ، مما أسفر عن نتائج مماثلة. تم تكييف الشكل وتعديله من Shaaya et ^al.10. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول التكميلي 1: تسلسل LightR. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 2: وصف مواقع إدخال LightR وقائمة مرجعية لتصميم LightR-Protein. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 3: بادئات لاستنساخ LightR. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 4: شروط التعدي للتحليل الكيميائي الحيوي لنشاط LightR-Protein. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الجدول التكميلي 5: شروط التعدي للتحليل القائم على التصوير لنشاط LightR-Protein. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: الإضاءة النبضية باستخدام بيئة التطوير المتكاملة (IDE). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: إعدادات إضاءة المجهر. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم دراستنا نهجا بصريا وراثيا للتحقيق في مسارات الإشارات المتنوعة وتوضح قابليته للتطبيق الواسع في معالجة الأسئلة البيولوجية المختلفة. يوفر نظام أداة LightR العديد من المزايا الأساسية: (1) التنظيم الخيفي لنشاط البروتين ، (2) التحكم الزمني الصارم في النشاط الذي يمكن ضبطه لتحقيق حركية مختلفة للتنشيط والتعطيل ، (3) الدقة المكانية للنشاط على المستوى دون الخلوي ، (4) خصوصية تعديل الإشارات والنشاط البيولوجي و (5) مجموعة واسعة من قابلية التطبيق على البروتينات المستهدفة المختلفة. والجدير بالذكر أن LightR يدمج كل هذه الفوائد بشكل فريد في أداة واحدة ، مما يوفر خطوة مهمة إلى الأمام.

يوفر تصميم LightR كمحول خيفي العديد من المزايا. توفر قدرة LightR على التحكم في نشاط البروتين عند إدخاله في حلقة صغيرة مرنة تنوعا كبيرا للتطبيق عبر البروتينات المختلفة ذات الهياكل والوظائف المتنوعة. نظرا لكونه مفتاحا خيفيا ، فإن LightR ينظم فقط المجال المستهدف للبروتين محل الاهتمام ولا يؤثر على المجالات الأخرى للبروتين. ومن ثم ، تسمح هذه الطريقة بتنظيم محدد للنشاط دون المساس بالوظائف الأساسية للبروتين ، مثل التفاعلات مع شركائه المرتبطين أو التوطين الأصلي داخل الخلايا. تم تطبيق أنظمة البصريات الوراثية المكونة من عنصرين بنجاح لتنظيم توطين البروتين أو التفاعلات أو الوظائف الأساسية الأخرى باستخدام التحكم بوساطة الضوء في الثنائي المتجانس أو غير المتجانس²⁹^،³⁰^،³¹^،³²^،³³^،³⁴^،³⁵. ومع ذلك ، غالبا ما تتطلب هذه الأنظمة تعبيرا متساوي المولار الأمثل لبروتينين ، مما يجعل تطبيقهما أكثر صعوبة. يتم تحقيق التنظيم الخيفي باستخدام نظام LightR داخل بروتين واحد ، وبالتالي يوفر نهجا أكثر تنوعا لاستجواب إشارات الخلية.

يتم تحقيق النطاق الواسع لقابلية تطبيق مفتاح LightR على فئات البروتين المختلفة ، جزئيا ، من خلال تحسين الوحدات المختلفة داخل مجال LightR. يمكن أن تؤثر الروابط التي تربط LightR بالبروتين محل الاهتمام والرابط الذي يربط مجالين VVD داخل LightR (رابط بين VVD) على كفاءة التنظيم. يوفر اختيار الرابط المرن بين VVD (GGS) 4G (GGS) 3 مرونة وطول كافيين لضمان اقتران وتفكك مونومرات VVD داخل مجال LightR. لقد ضمن هذا الرابط التنظيم الناجح لجميع البروتينات المستهدفة حتى الآن. ومع ذلك ، في الحالات التي لا يقوم فيها مجال LightR بتعطيل البروتين بشكل كاف في الظلام ، يمكن إدخال رابط أكثر صلابة يبقي مجالات VVD بعيدة عن بعضها البعض لتعزيز فتح مشبك LightR ، وبالتالي الحفاظ على الإنزيم غير نشط. يجب أن يحتفظ الرابط بالمرونة الكافية لتمكين تعتيم VVDs وتنشيط البروتين المستهدف. لتوصيل LightR بالبروتين محل الاهتمام ، نستخدم روابط مرنة قصيرة ، GPGGSGG و GSGGPG ، تمت إضافتها إلى N- و C-termmini لمجال LightR. إنها توفر مرونة كافية في الاتصال ، وبالتالي تمنع الاضطراب الذي لا رجعة فيه للبروتين المستهدف. ومع ذلك ، فهي قصيرة بما يكفي لتمكين تشويه البروتين المستهدف في الظلام مع تسهيل استعادة وظيفة البروتين في الضوء. تدعم هذه الروابط التنظيم بواسطة LightR للعديد من تطبيقات البروتين. ومع ذلك ، في بعض الحالات التي قد لا توفر فيها هذه الروابط تعطيلا كافيا للبروتين في الظلام ، قد يكون تقصير الروابط مفيدا. يمكن أن يقلل تقصير Linker هذا من المرونة ويعزز التشويه الناجم عن مشبك LightR المفتوح في الظلام ، وبالتالي تقليل أي تسرب. ومع ذلك ، قد يضر هذا التعديل بأقصى نشاط للإنزيم بسبب التشوهات الهيكلية المحتملة في الحالة المضاءة. بدلا من ذلك ، يمكن أن يوفر استبدال الأحماض الأمينية المتعددة في حلقة الإدراج فوائد مماثلة للمرونة المتوازنة في الحالات التي لا يكون فيها عدم الاستقرار التوافقي مصدر قلق كبير.

يتم تنشيط العديد من عمليات الإشارات الحرجة بشكل عابر أو تنظيمها بطريقة تذبذبية³⁶^،³⁷^،³⁸^،³⁹^،⁴⁰^،⁴¹^،⁴²^،⁴³. تسمح لنا قابلية ضبط أداة LightR بتقليد أنماط الإشارات المعقدة ، وبالتالي توفر نهجا قويا لاستجواب العمليات البيولوجية التي يتم التحكم فيها مؤقتا. نحقق ذلك من خلال تعديل حركية LightR من خلال إدخال طفرة I85V في كلا مجالي VVD. تقلل هذه الطفرة من عمر النصف ل VVD dimer في الحالة المظلمة من 18,000 ثانية إلى 780 ثانية¹⁹ مما يسهل التعطيل بشكل أسرع في FastLightR-Enzyme.

تتيح حركية التعطيل السريع أيضا تنظيم نشاط البروتين بدقة تحت الخلوية. يمكن أن تجعل إنزيمات LightR ، ذات الحركية البطيئة ، من الصعب ملاحظة تأثيرات التنشيط تحت الخلوي بسبب الانتشار داخل الخلايا للبنية المنشطة. مع الحركية السريعة ، سيتم تعطيل أي إنزيم FastLightR ينتشر خارج منطقة الإضاءة المحلية بسرعة. من خلال التنشيط الانتقائي لمناطق فرعية معينة ، يمكن للباحثين اكتساب نظرة ثاقبة حول الوظائف المحلية للبروتينات من أجل فهم أفضل لمساهمتها في المسارات الخلوية المعقدة وشبكات الإشارات.

في حين أن FastLightRs لا تقدر بثمن للتحكم البصري المحصور مكانيا وزمانيا لأنشطة البروتين داخل الخلايا ، لا تزال هناك تطبيقات قد تكون فيها الحركية البطيئة مرغوبة. يمكن تنفيذ LightR مع حركية البطيئة في الدراسات التي تتطلب نشاطا مستداما ومعززا محفزا للضوء الأزرق. ستتطلب هذه التطبيقات فقط نبضات إضاءة غير متكررة للحفاظ على نشاط البصري الوراثي المستمر ، وبالتالي تقليل المشكلات مثل السمية الضوئية. بالنسبة للسيناريوهات المختلفة ، يمكن تنفيذ مجموعة واسعة من التعديلات الحركية^10,18 بمفردها أو جنبا إلى جنب مع بعضها البعض لتقديم حل واعد لضبط أداء LightR لتحسين تطبيقه لتجربة معينة.

يتم تحديد قابلية تطبيق إنزيمات LightR من خلال قدرتها على تقليد الوظيفة البيولوجية لنظيراتها الذاتية. على هذا النحو ، من الأهمية بمكان تقييم خصوصية الركيزة ، والإشارات النهائية ، وتوطين الخلايا دون الخلوية. يتم تأكيد خصوصية نشاط LightR-Src من خلال فسفرة ركائز Src ، بما في ذلك paxillin و p130Cas²²^،²³. ينتقل FastLightR-Src بين المنطقة المحيطة بالنواة والتصاقات البؤرية تحت الإضاءة الدورية ، مما يؤدي إلى انتشار الخلايا. تشبه هذه الظاهرة بنجاح الملاحظات السابقة التي تم إجراؤها باستخدام Src kinase الأصلي وتؤكد أيضا فعالية الأداة الحالية في استكشاف بيولوجيا Src¹¹^،¹²^،⁴⁴^،⁴⁵^،⁴⁶^،⁴⁷. يوضح LightR-bRaf أيضا الخصوصية في استهداف مجمعات الإشارات مثل MEK و ERK kinases²⁴^،²⁵. بالإضافة إلى ذلك ، يعرض FastLightR-bRaf تذبذبات دورية للمكوك النووي ERK استجابة للضوء الأزرق ، وهو نتيجة معروفة لتنشيط bRaf²⁸. توفر قدرة إنزيمات LightR على محاكاة وظائف البروتينات الداخلية عن كثب أداة لا تقدر بثمن للاستجواب في وظيفتها.

تصور المناقشة أعلاه قدرة كينازات LightR على تكرار مسارات الإشارات الخلوية الدقيقة داخل المقصورات الخلوية المحددة. تماشيا مع هذا النجاح مع الكينازات ، يعمل LightR-Cre كنموذج توضيحي يوضح وظائف Cre recombinase الأصلي المشتق من العاثية P1. ينتمي Cre recombinase إلى عائلة Integrase من إعادة التركيب الخاصة بالموقع ، ويعمل عن طريق تسهيل إعادة التركيب بين موقعين للتعرف يسمى loxP على الحمض النووي المستهدف. يؤدي إعادة التركيب هذا إلى إعادة ترتيب الحمض النووي من خلال حدث تقاطع. بناء على الاتجاه الاتجاهي لموقع loxP على الحمض النووي المستهدف ، يمكن أن يؤدي حدث التقاطع إما إلى حذف أو تكرار أو نقل عناصر الكروموسومات⁴⁸. تم استخدام Cre recombinase على نطاق واسع لتوليد نماذج في الجسم الحي لتنظيم الجينات المحفز⁴⁹^،⁵⁰. ومع ذلك ، فإن أنظمة إعادة تركيب cre العفوية أو المحفزة كيميائيا أو المحفزة بصريا توفر تحكما محدودا في متى وأين يتم تحفيز إعادة تركيب الحمض النووي في النموذج الحيواني. يتغلب LightR-Cre على هذه القيود من خلال تمكين التحكم الزمني والمكاني الصارم في إعادة تركيب الحمض النووي. علاوة على ذلك ، تسمح لنا قابلية ضبط LightR بالقضاء على النشاط المتسرب غير المرغوب فيه وضمان تنظيم Cre بدقة عالية. تفتح هذه القدرات فرصا جديدة لنمذجة أمراض الأمراض وتطوير علاجات جديدة.

يوفر التنظيم الدقيق ل LightR في الكينازات وإعادة تركيب الحمض النووي دليلا على أنه يمكن تطبيق هذه الأداة على العديد من البروتينات بنفس الإستراتيجية. بالإضافة إلى تنشيط فئات الإنزيمات المختلفة ، يمكن ربط LightR بأنواع البروتين الأخرى ، حيث يمكن تسخير التعديل الخيفي لتوطين البروتينات في مناطق دون خلوية محددة ، والحث على تفاعلات البروتين والبروتين ، وهندسة أجهزة الاستشعار الحيوية المحفزة للضوء الأزرق ، والمزيد. نظرا للمزايا الخيفية لاستهداف مجال معين ، يمكن أيضا دمج LightRs مع الأساليب الكيميائية والوراثية البصرية الأخرى في نفس البروتين لتحقيق درجة أعلى من قابلية الضبط لدراسة العمليات البيولوجية.

لقد نجحنا في تطبيق LightR على العديد من البروتينات الأخرى (المخطوطات قيد الإعداد). على الرغم من هذا النجاح ، قد يواجه تطوير بروتين LightR الوظيفي تحديات محتملة ، لا سيما في اختيار موقع إدخال مناسب ومحاكاة الوظيفة البيولوجية للبروتين المستهدف بدقة. عندما لا يكون التركيب البلوري متاحا ، يجب على الباحثين الاعتماد على الهياكل المتوقعة أو معلومات تسلسل الأحماض الأمينية ، مما يستلزم المزيد من استكشاف الأخطاء وإصلاحها لهندسة البروتينات ذات مواقع الإدخال المتعددة أو بدائل الأحماض الأمينية. بالإضافة إلى ذلك ، يجب ضبط نشاط البروتين المصمم هندسيا بدقة لتكرار الوظيفة البيولوجية داخل الخلية بدقة. يعتمد النجاح في هذه التجارب على التقليد الوظيفي الدقيق للبروتين المصمم هندسيا ، مع تماثله الداخلي ، والذي غالبا ما يتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها بدقة ويمكن أن يختلف بناء على نوع الخلية وفئة البروتين المستهدف ونوعه ، بالإضافة إلى قوة ومدة تنشيط الضوء الأزرق.

في الختام ، يمثل نظام LightR أداة قوية لتحقيق تحكم زماني مكاني دقيق في وظيفة البروتين. إن قوتها وقابليتها للضبط وتعدد استخداماتها تجعلها لا تقدر بثمن لدراسة العمليات الخلوية المعقدة ، وكشف مسارات الإشارات ، وتوضيح آليات تنظيم الجينات. من خلال تزويد الباحثين بتحكم غير مسبوق في نشاط البروتين ، يعد نظام LightR بتعزيز فهمنا للعمليات البيولوجية الأساسية وتمهيد الطريق للتدخلات العلاجية المبتكرة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعرب المؤلفون عن تقديرهم للدكتور مارك شايع لمساهمته في تطوير إنزيمات LightR والبروتوكولات المرتبطة بها. كان pCAG-iCre هدية من ويلسون وونغ (Addgene plasmid # 89573) ، pcDNA3.1 Floxed-STOP mCherry كانت هدية من Mositoshi Sato (Addgene plasmid # 122963) ، كان بناء bRaf-Venus الذي يحمل طفرة V600E هدية من الدكتور جون أوبريان (MUSC) ؛ تم استنساخ جين ERK2 من pCEFL-ERK2 (هدية من مختبر الدكتور تشانينج دير ، UNC) في العمود الفقري mCherry-C1 للحصول على بلازميد mCherry-ERK2. و pmiRFP670-N1 كانت هدية من فلاديسلاف فيرخوشا (بلازميد Addgene # 79987). تم دعم العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R33CA258012 و R35GM145318 و P01HL151327 إلى AK. تم دعم هذا العمل أيضا من خلال زمالة التدريب T32 VBST T32HL144459 إلى NL.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
# 1.5 أغطية زجاجية 25 مم أدوات	وارنر المستديرة ؛	64-0715
1.5 مل أنابيب	الولايات المتحدة الأمريكية العلمية	cc7682-3394
2x Laemmli Buffer			ل 500 مل: 5.18 جم من Tris-HCL ، 131.5 مل من الجلسرين ، 52.5 مل من 20٪ SDS ، 0.5 غرام من البروموفينول الأزرق ، الرقم الهيدروجيني النهائي 6.8
4-20٪ Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب	Biorad	4561096
5x Phusion Plus Buffer ؛	ثرمو علمية	F538L
60 LED مجهر حلقة ضوء	بولي بصريات	ML46241324	أزرق LED ، قطر 60 مم ، 5 واط
Agarose ؛	GoldBiotech	A-201
Anti-Erk 1/2 إشارات الخلايا المضادة للأجسام المضادة		9102
الأجسام المضادة المضادة ل GAPDH	invitrogen	AM4300
Anti-GFP	Clontech	632380
الأجسام المضادة ل mCherry	invitrogen	M11217
إشارات الخلايا المضادة لمنظمة مجاهدي خلق		9122
Anti-p130Cas	BD Biosciences	610271
إشارات الخلايا	المضادة للباكسيلين	2542
مكافحة الفوسفو-Erk 1/2 T202 / Y204 إشارات خلايا الأجسام المضادة		9101
مكافحة الفوسفو-pY249 p130إشارات	خلية	Cas 4014
إشارات خلية باكسيلين المضادة للفوسفو Y118		2541
أنتو فوسفو-S217 / 221 خلية مجاهدي خلق	الإشارات	9121
Arduino متوافق مع امدادات الطاقة	كمبيوتر الشركة	LJH -186
Arduino Uno Rev3	Arduino	& lrm ؛ A000066
الخلايا الآتوفلورية	invitrogen	A7816
Benchmark Fetal Bovine Serum (FBS) ؛	منتجات الجوزاء الحيوية	100-106	ثلاثي معطل بالحرارة 0.1 ومايكرو ؛ م معقمة تصفية
bRaf-V600E-Venus			هدية من الدكتور جون أوبريان ، MUSC
BSA ؛	GoldBiotech	A-420
كاربينيسيلين (ديسوديوم)	التكنولوجيا الحيوية الذهبية	C-103-25
CellMask صبغة غشاء البلازما الأحمر العميق	invitrogen	c10046
Colony Screen MasterMix	Genesee	42-138
DH5a الخلايا المختصة	NEB	C2987H
DMEM	كورنينج	15-013-CV
سلم الحمض النووي	GoldBio	D010-500
dNTPs	NEB	N04475
Dpn1 إنزيم	NEB	R01765
DTT	GoldBio	DTT10	DL-Dithiothreitol ، كواشف Cleland ؛
EGTA	Acros	409910250
FastLightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162155
Fibronectin من بلازما البقر	سيجما	F1141
FuGENE (R) 6 كاشف النفدة ؛	Promega	E2692	كاشف التعداء
جل صبغة الحمض النووي الأخضر	GoldBio	G-740-500
جل تحميل صبغة أرجواني 6x	NEB	B7024A
GeneJET Gel Extraction Kit	ثرمو علمية	K0692	هلام استخراج كيت
GeneJET Plasmid Miniprep Kit	Thermo Scientific	K0502
Glutamax	Gibco	35050-061	GlutaMAX-l (100x) 100 مل ؛
خلايا HEK 293T	ATCC	CRL-11268
خلايا هيلا	ATCC	CRM-CCL-2
HEPES	Fischer	BP310-500
IoT Relay	Digital Loggers	DLI 705020645490	التيار المتردد / التيار المستمر التتابع للإضاءة
Kanamycin أحادي الكبريتات	الذهب التكنولوجيا الحيوية	K-120-25
KCl	Sigma & nbsp ؛	P-4504
L-15 1x	Corning	10-045-السيرة الذاتية
LB Agar	فيشر	BP1425-2
LED تنمو نظام الضوء	HQRP	884667106091218	نظام مصباح لوحة LED
LightR-bRaf-mVenus	Addgene	#162154
LightR-iCre-miRFP670	Addgene	#162158
برنامج MATLAB	Mathworks	R2024a	لتشغيل برنامج تحليل التصوير CellGEO Scripts
Metamorph	Molecular
MgCl₂	فيشر كيماويات	M33-500
زيوت معدنية	سيجما	M5310
MiniPrep Kit	اختيار الجينات	96-308
Mini-PROTEAN TGX جل مسبقة الصب 12 بئر	Bio-Rad	4561085
بيولوجيا جزيئية درجة الماء ؛	كورنينج	46-000-السيرة الذاتية
مرآة متعددة الأحرف	متعددة النطاقات 89903BS	Chroma
NaCl	فيشر كيماويات	S271-3 ؛
برنامج تلفزيوني بدون Ca و Mg & nbsp ؛	كورنينج	21-031-CV
pCAG-iCre	Addgene	# 89573
pcDNA3.1_Floxed-STOP mCherry	Addgene	# 122963
pCEFL-ERK2			هدية من مختبر الدكتور تشانينج دير ، أنابيب
UNC PCR ؛	labForce	1149Z65	0.2 مل 8 شرائط أنابيب وأغطية ، شريط صلب متصل بشكل فردي قبة أغطية ؛
Phusion Plus DNA Polymerase	Thermo Scientific	F630S
pmiRFP670-N1	Addgene	# 79987
مضلع 400 منقوش مضيء	Mightex	DSI-G-00C
بادئات	أغشية IDT
PVDF	BioRad	1620219	Immun-Blot PVDF / شطائر ورق الترشيح ؛
T0.25٪ التربسين ، 2.21 ملي مولار ، eDTA ، 1x [-] الصوديوم	Corning ؛	25-053-CI
Tris-Acetate-EDTA (TAE) 50x	فيشر	BP1332-1	للرحلان الكهربائي
UPlanSApo 40x مجهر موضوعي	أوليمبوس	1-U2B828
USB TTL Box	National Instruments	6501	لواجهة TTL
& بيتا ؛ -Mercaptoethanol	Fisher Chemical ؛	O3446I-100

غرفة Devices

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Guntas, G., et al. Engineering an improved light-induced dimer (iLID) for controlling the localization and activity of signaling proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 112-117 (2015).
Kawano, F., Okazaki, R., Yazawa, M., Sato, M. A photoactivatable Cre-loxP recombination system for optogenetic genome engineering. Nat Chem Biol. 12 (12), 1059-1064 (2016).
Strickland, D., et al. TULIPs: tunable, light-controlled interacting protein tags for cell biology. Nat Methods. 9 (4), 379-384 (2012).
Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
Diaz, J. E., et al. A split-Abl kinase for direct activation in cells. Cell Chem Biol. 24 (10), 1250-1258.e4 (2017).
Hongdusit, A., Zwart, P. H., Sankaran, B., Fox, J. M. Minimally disruptive optical control of protein tyrosine phosphatase 1B. Nat Commun. 11 (1), 788(2020).
Wang, J., et al. Time-resolved protein activation by proximal decaging in living systems. Nature. 569 (7757), 509-513 (2019).
Wu, Y. I., et al. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461 (7260), 104-108 (2009).
Zhou, X. X., Fan, L. Z., Li, P., Shen, K., Lin, M. Z. Optical control of cell signaling by single-chain photoswitchable kinases. Science. 355 (6327), 836-842 (2017).
Shaaya, M., et al. Light-regulated allosteric switch enables temporal and subcellular control of enzyme activity. Elife. 9, e60647(2020).
Chu, P. H., et al. Engineered kinase activation reveals unique morphodynamic phenotypes and associated trafficking for Src family isoforms. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (34), 12420-12425 (2014).
Kaplan, K. B., Swedlow, J. R., Morgan, D. O., Varmus, H. E. c-Src enhances the spreading of src-/- fibroblasts on fibronectin by a kinase-independent mechanism. Genes Dev. 9 (12), 1505-1517 (1995).
Nihongaki, Y., Suzuki, H., Kawano, F., Sato, M. Genetically engineered photoinducible homodimerization system with improved dimer-forming efficiency. ACS Chem Biol. 9 (3), 617-621 (2014).
Vaidya, A. T., Chen, C. H., Dunlap, J. C., Loros, J. J., Crane, B. R. Structure of a light-activated LOV protein dimer that regulates transcription. Sci Signal. 4 (184), ra50(2011).
Zoltowski, B. D., Crane, B. R. Light activation of the LOV protein vivid generates a rapidly exchanging dimer. Biochemistry. 47 (27), 7012-7019 (2008).
Zoltowski, B. D., et al. Conformational switching in the fungal light sensor vivid. Science. 316 (5827), 1054-1057 (2007).
Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
Zoltowski, B. D., Vaccaro, B., Crane, B. R. Mechanism-based tuning of a LOV domain photoreceptor. Nat Chem Biol. 5 (11), 827-834 (2009).
Karginov, A. V., Hahn, K. M. Allosteric activation of kinases: Design and application of RapR kinases. Curr Protoc Cell Biol. 53 (1), 14.13.1-14.13.16 (2011).
Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6 (1), 6256(2015).
Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N Am J Med Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
Cunningham-Edmondson, A. C., Hanks, S. K. p130Cas substrate domain signaling promotes migration, invasion, and survival of estrogen receptor-negative breast cancer cells. Breast Cancer. 1, 39-52 (2009).
Sachdev, S., Bu, Y., Gelman, I. H. Paxillin-Y118 phosphorylation contributes to the control of Src-induced anchorage-independent growth by FAK and adhesion. BMC Cancer. 9, 12(2009).
Cope, N., et al. Mechanism of BRAF activation through biochemical characterization of the recombinant full-length protein. ChemBioChem. 19 (18), 1988-1997 (2018).
Singhal, A., Li, B. T., O'Reilly, E. M. Targeting KRAS in cancer. Nat Med. 30 (4), 969-983 (2024).
Tsygankov, D., et al. CellGeo: A computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries. J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).
Kaimachnikov, N. P., Kholodenko, B. N. Toggle switches, pulses and oscillations are intrinsic properties of the Src activation/deactivation cycle. FEBS J. 276 (15), 4102-4118 (2009).
Burack, W. R., Shaw, A. S. Live cell imaging of ERK and MEK. J Biol Chem. 280 (5), 3832-3837 (2005).
Baaske, J., et al. Dual-controlled optogenetic system for the rapid down-regulation of protein levels in mammalian cells. Sci Rep. 8 (1), 15024(2018).
Dagliyan, O., et al. Computational design of chemogenetic and optogenetic split proteins. Nat Commun. 9 (1), 4042(2018).
Harmer, Z. P., et al. Dynamic multiplexed control and modeling of optogenetic systems using the high-throughput optogenetic platform, Lustro. ACS Synth Biol. 13 (5), 1424-1433 (2024).
Liu, Q., Tucker, C. L. Engineering genetically-encoded tools for optogenetic control of protein activity. Curr Opin Chem Biol. 40, 17-23 (2017).
Morikawa, K., et al. Photoactivatable Cre recombinase 3.0 for in vivo mouse applications. Nat Commun. 11 (1), 2141(2020).
Shekhawat, S. S., Ghosh, I. Split-protein systems: beyond binary protein-protein interactions. Curr Opin Chem Biol. 15 (6), 789-797 (2011).
Wu, J., et al. A non-invasive far-red light-induced split-Cre recombinase system for controllable genome engineering in mice. Nat Commun. 11 (1), 3708(2020).
Conlon, P., Gelin-Licht, R., Ganesan, A., Zhang, J., Levchenko, A. Single-cell dynamics and variability of MAPK activity in a yeast differentiation pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (40), E5896-E5905 (2016).
Jacquel, A., et al. Colony-stimulating factor-1-induced oscillations in phosphatidylinositol-3 kinase/AKT are required for caspase activation in monocytes undergoing differentiation into macrophages. Blood. 114 (17), 3633-3641 (2009).
Kholodenko, B. N. Negative feedback and ultrasensitivity can bring about oscillations in the mitogen-activated protein kinase cascades. Eur J Biochem. 267 (6), 1583-1588 (2000).
Kholodenko, B. N. Cell-signalling dynamics in time and space. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (3), 165-176 (2006).
Li, Y., Roberts, J., Aghdam, Z. A., Hao, N. Mitogen-activated protein kinase (MAPK) dynamics determine cell fate in the yeast mating response. J Biol Chem. 292 (50), 20354(2017).
Maeda, M., et al. Periodic signaling controlled by an oscillatory circuit that includes protein kinases ERK2 and PKA. Science. 304 (5672), 875-878 (2004).
Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
Roche, S., Fumagalli, S., Courtneidge, S. A. Requirement for Src family protein tyrosine kinases in G2 for fibroblast cell division. Science. 269 (5230), 1567-1569 (1995).
Klomp, J. E., et al. Mimicking transient activation of protein kinases in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (52), 14976-14981 (2016).
Karginov, A. V., et al. Dissecting motility signaling through activation of specific Src-effector complexes. Nat Chem Biol. 10 (4), 286-290 (2014).
Cary, L. A., Klinghoffer, R. A., Sachsenmaier, C., Cooper, J. A. Src catalytic but not scaffolding function is needed for integrin-regulated tyrosine phosphorylation, cell migration, and cell spreading. Mol Cell Biol. 22 (8), 2427-2440 (2002).
Fu, P., et al. Sphingolipids signaling in lamellipodia formation and enhancement of endothelial barrier function. Curr Top Membr. 82, 1-31 (2018).
Tian, X., Zhou, B. Strategies for site-specific recombination with high efficiency and precise spatiotemporal resolution. J Biol Chem. 296, 100509(2021).
Abremski, K., Hoess, R., Sternberg, N. Studies on the properties of P1 site-specific recombination: Evidence for topologically unlinked products following recombination. Cell. 32 (4), 1301-1311 (1983).
Abremski, K., Hoess, R. Bacteriophage P1 site-specific recombination. Purification and properties of the Cre recombinase protein. J Biol Chem. 259 (3), 1509-1514 (1984).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Optogenetic Regulation Spatiotemporal Control Protein Activity Allosteric Regulation LightR Domain Blue Light Activation Protein Kinase Control Subcellular Precision Cell Migration Focal Adhesions

التحكم الزماني المكاني لنشاط البروتين من خلال التنظيم الخيفي البصري الوراثي

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة