مقالة منهجية

تصور مصائد العدلات خارج الخلية في الأوردة المساريقية بعد إصابة نقص التروية المساريقية وإعادة التروية عبر الفحص المجهري داخل الحيوية

DOI:

10.3791/67264

⸱

سبتمبر 27, 2024

 ,  ,  ,  , 
1Center for Thrombosis and Hemostasis (CTH), University Medical Center Mainz, Johannes Gutenberg-University Mainz, 2German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Rhine-Main

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقدم هذا البروتوكول طريقة لتحفيز إصابة نقص تروية المساريق وإعادة التروية وتصور مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) في الأوردة المساريقية باستخدام الفحص المجهري داخل الحيوية. تم تقييد تدفق الدم في الشريان المساريقي العلوي لمدة ساعة واحدة ، متبوعا بإعادة التروية ، مما يسمح بالقياس الكمي المباشر للتصاق الكريات البيض و NETosis.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إصابة نقص تروية الأمعاء (I / R) هي حالة حادة تتميز بتلف الأنسجة الناتج عن تقييد تدفق الدم إلى الأوعية المساريقية ، مما يؤدي إلى أمراض موضعية وجهازية مع تشخيص ضعيف. يؤدي كل من نقص التروية وإعادة التروية إلى سلسلة من الاستجابات الخلوية والجزيئية ، حيث تعمل الخلايا الالتهابية كمنظم رئيسي لعلم الأمراض. يتم التوسط في هذه التفاعلات مع البطانة الإقفارية بواسطة مستقبلات الالتصاق المتعددة. تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية لتقليد هذا المرض والتحقيق في المسارات الجزيئية المعنية. في هذه الدراسة ، يتم الجمع بين نموذج جراحي مجهري لإصابة I / R مع الفحص المجهري داخل الحيوية لتصور دحرجة الكريات البيض ، والالتصاق ، وتشكيل مصيدة العدلات خارج الخلية (NET). يتم تطبيق هذا النموذج على الفئران المعدلة وراثيا التي تعاني من نقص في PAR1 البطاني (F2r) لتقييم تأثير PAR1 على دحرجة الكريات البيض وتكوين NET بعد ساعة واحدة من نقص التروية وبعد إعادة التروية مباشرة. في الجسم الحي ، تم استخدام تلطيخ كريات الدم البيضاء Acridine Orange ، وتم تصور NETs باستخدام صبغة الحمض النووي. ومن المثير للاهتمام ، أنه لوحظ انخفاض التصاق الكريات البيض وتكوين NET في الفئران التي تفتقر إلى مستقبلات PAR1 البطانية. يتيح هذا النموذج التحليل في الجسم الحي للمنظمين الرئيسيين المشاركين في إصابة I / R.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقص تروية المساريق الحاد (AMI) هو مرض نادر1 مع ارتفاع خطر الوفاة2 ، ويتميز بانخفاض تدفق الدم في المساريق بسبب تجلط الدم في المحور البطني ، أو الشريان المساريقي العلوي أو السفلي. في 60٪ -70٪ من الحالات ، تكون الانسداد الحاد للشريان المساريقي العلوي بسبب تجلط الدم أو الانصمام مسؤولة عن نقص تروية الأمعاءالحاد 3. في المقابل ، في 5-15٪ من الحالات ، يفسر تجلط الدم الوريدي المساريقي نقص تروية المساريقية الذي يشمل الوريد المساريقي العلوي ، ونادرا ما يكون الوريد المساريقي السفلي4. يؤدي نقص الأكسجة وسوء التغذية الناجم عن نقص التروية إلى اضطرابات استقلاب الطاقة على المستوى الخلوي5. على سبيل المثال ، ينشط ضعف وظيفة الميتوكوندريا مسارات إشارات متعددة ، مما يؤدي إلى آليات الموت الخلوي6. على الرغم من أن إعادة التروية السريعة تمكن من استعادة التمثيل الغذائي الهوائي ، إلا أن استعادة تدفق الدم إلى منطقة إقفارية غالبا ما تسبب إصابة واسعة النطاق في الأنسجة بسبب إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) 7 ، والحمل الزائد للكالسيوم8 ، والخلل البطاني9 ، والاستجابات الالتهابية10.

تم إنشاء العديد من النماذج الحيوانية التجريبية التي تستخدم انسداد الأوعية الدموية المؤقت للشريان المساريقي العلوي لتوضيح الآليات الجزيئية أثناء إصابة نقص التروية وإعادة التروية (I / R)11. يعد استخدام مثل هذه النماذج جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري داخل الحيوية (IVM) أمرا أساسيا لاكتساب رؤى حول التفاعلات الخلوية الأساسية وتطور المرض11. لوحظ خلل في حاجز الأمعاء بعد فترة وجيزة من نقص التروية12 ، حيث تفقد الظهارة سلامتها13 ، مما يؤدي إلى انتقال البكتيريا إلى مواقع خارج الأمعاء مثل الغدد الليمفاوية المساريقية والطحال والكبد والكلى12،14. يؤدي إعادة التروية إلى تفاقم إصابة الغشاء المخاطي15. تتجلى الاستجابة الالتهابية في الشرايين من خلال التصاق الكريات البيض المتدحرجة والثابتة على طبقة الخلية البطانية ، والتي تعتمد على جزيئات مثل L-selectin16 و P-selectin (CD62P) 17 والصفائح الدموية GPIIb / IIIa والفيبرينوجين18. ومن المثير للاهتمام أن التصاق الكريات البيض بالوريد المساريقية يتأثر بوجود ميكروبات الأمعاء19 والمستقبلات الشبيهة ب Toll 4 التي تشيرإلى 10. تؤدي إصابة I / R أيضا إلى تكوين مصيدة العدلات خارج الخلية (NET)10. الاستهداف العلاجي للحمض النووي خارج الخلية ، الذي ينشأ من الكريات البيض المنشطة مثل العدلات ، يحسن نتيجة إصابة I / R المعوية20. في الكبد ، يتم إشعال إصابة I / R بواسطة microphagesالمقيمة 21 ، ويخفف تثبيط microRNA بشكل ملحوظ موت الخلايا المبرمج22. وتجدر الإشارة إلى أن إصابة I / R في المساريق تؤدي إلى خلل التنسج الأمعائي ، والذي يمكن عكسه وحله بعد إعادة التوعي23.

تتأثر البطانة أيضا بالآثار الضارة لإصابة I / R ، حيث يلعب ROS دورا محوريا في العملية24. لوحظ التصاق الكريات البيض بطبقة الخلايا البطانية ، وتلف البطانية ، وتغيرات في استقلاب أكسيد النيتريك (NO)9. ومع ذلك ، لم يتم بعد استكشاف المسارات الجزيئية المعنية بشكل كامل.

المستقبل المنشط بالبروتياز 1 (PAR1 ، F2r) ، هو مستقبل غشائي يتم التعبير عنه بواسطة مجموعة متنوعة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا البطانية ، ويتم تنشيطه أثناء الظروف الالتهابية25. يحدث تنشيطه عندما تشق البروتياز السيريني المستقبل عند الطرف N ، مما يعرض الترابط المربوط الذي بدوره ينشط المستقبل عن طريق الارتباط بالحلقة الثانية خارج الخلية للجزيء26. يؤثر مسار إشارات مستقبلات البروتين البطاني C (EPCR) -PAR1 على توازن NO البطاني ويسهل استعادة تدفق الدم في نقص التروية المحيطية27.

في هذه الدراسة ، تم تطبيق إصابة I / R على نموذج فأر جيني يتميز بنقص PAR1 الخاص بالخلايا البطانية لتصور دحرجة الكريات البيض والالتصاق وتكوين NET. يوفر الجمع بين نموذج الفأر الجيني والفحص المجهري داخل الحيوية بعد الجراحة المجهرية I / R رؤى قيمة من خلال تسليط الضوء على أنواع الخلايا المحددة المشاركة في تطور المرض. يعد تطبيق إصابة I / R على نماذج الفئران الجينية مفيدا في تحديد الأهداف العلاجية المحتملة التي يمكن استخدامها لتحسين مسار المرض. علاوة على ذلك ، تم عرض أهمية PAR1 البطاني في NETosis.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الإجراءات المتعلقة بالفئران من قبل اللجنة المحلية المعنية بتشريعات (Landesuntersuchungsamt Rheinland-Pfalz ، كوبلنز ، ألمانيا ؛ G21-1-041). 6-8 أسابيع ذكر وأنثى B6. تم استخدام فئران FVB-F2rtm1a (EUCOMM) Tg / Cdh5-cre) 7Mlia / Tarc للدراسة. يحدث التنظيم الخاص بالخلية البطانية ل F2r (PAR1) عبر مروج VE-Cadherin Cre28. في هذه الدراسة ، أظهر flox-F2r x VE-Cadherin Cre + (F2RΔEC) انخفاضا في تعبير F2r (PAR1) على الخلايا البطانية ، و flox-F2r x VE-Cadherin Cre- (WT) يعبر عن مستويات F2r البطانية الطبيعية F2r (PAR1). تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. التحضير للجراحة

  1. تعقيم الأدوات الجراحية اللازمة (مقص ضيق للغاية مستقيم ، ملقط ، مشبك وعائي ، إلخ).
  2. قم بإعداد نظام التخدير القائم على الأكسجين والأيزوفلوران بمخروط أنف ولوحة تسخين.

2. تحضير

  1. وزن.
  2. إجراء التخدير: تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق (IP) لمحلول يحتوي على ميدازولام (5 مجم / كجم) وميديتوميدين (0.5 مجم / مل) وفنتانيل (0.5 مجم / كجم) (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  3. قم بإزالة الشعر من منطقة عملية الرقبة والبطن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية للحيوانات الصغيرة.
  4. ضع الماوس في الاستلقاء الظهري على وسادة التدفئة وقم بتوصيله بنظام الأكسجين عبر مخروط الأنف. قم بتأمين أطراف الفأر في وسادة ساخنة بشريط جراحي. تأكد من أن غشاء مخروط الأنف اللاتكس يتناسب بإحكام مع رأس الماوس. راقب درجة حرارة جسم عن طريق المستقيم باستخدام مقياس حرارة خاص بالقوارض.
  5. ضعي كريم إزالة الشعر لإزالة أي شعر متبقي من منطقة جراحة الرقبة وامسح جلد منطقة العملية بنسبة 70٪ من الإيثانول.
  6. قم بإجراء اختبار قرصة إصبع القدم (منعكس الدواسة) للتأكد من أن مخدر تماما.

3. الإجراء الجراحي

  1. زرع القسطرة في الوريد الوداجي
    1. قم بعمل شق عرضي (~ 0.5 سم) فوق القصبة الهوائية ، وإزالة الجلد الذي يغطي الرقبة ، وعزل الوريد الوداجي الأيمن.
    2. استخدم خيطا حريريا يبلغ طوله حوالي 5 سم ، وأغلق الطرف البعيد للوريد ، وثبته بالملقط الجراحي. ضع ثلاثة خيوط حريرية على بعد حوالي 2 سم أسفل الوريد: أحدهما قريب من الطرف البعيد واثنان بالقرب من الطرف القريب من الوريد الوداجي. اربط عقدة جراحية ، لكن لا تغلق الوعاء.
    3. قم بإعداد قسطرة بولي إيثيلين (معرف 0.28 مم ، 0.61 مم OD) مملوءة ب 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتوصيلها بمحقنة سعة 1 مل. استخدم المقص لقطع ثقب بين العقدتين الثانية والثالثة وزرع القسطرة في الوريد الوداجي. شفط المحقنة للتأكد من وجود الدم في القسطرة.
    4. ثبت القسطرة في الوريد عن طريق ربط الخيط الحريري ، مع التأكد من تثبيته بإحكام. استخدم شريطا طبيا لتأمين المحقنة.
    5. تحضير برتقال الأكريدين: قم بتخفيف محلول مرق 1: 4 2 مجم / مل بمحلول ملحي معقم (تركيز نهائي 0.5 مجم / مل) في حقنة سعة 1 مل. احتفظ بالمحقنة في الظلام وحقن 50 ميكرولتر في الماوس.
    6. تحضير صبغة الحمض النووي: قم بتخفيف محلول مخزون 1: 1000 5 ملي مولار بمحلول ملحي معقم (تركيز نهائي 5 ميكرومتر) في حقنة 1 مل. احتفظ بالمحقنة في الظلام وحقن 50 ميكرولتر في الماوس.
    7. حقن في الجسم الحي Acridine البرتقالي (50 ميكروغرام / ميكرولتر ، 50 ميكرولتر لكل فأر) عبر قسطرة الوريد الوداجي لتصور الكريات البيض الملطخة وصبغة فلورية الحمض النووي خارج الخلية على غرار مصائد العدلات خارج الخلية (NETs) (5 ميكرومتر ، 50 ميكرولتر لكل فأر). يتم تصوير NETs والكريات البيض في وقت واحد.
  2. نموذج إصابة المساريق I / R
    1. تطهير جلد البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول.
    2. قم بإجراء شق البطن 3-5 سم على طول الخط باستخدام مقص جراحي.
    3. باستخدام طرفين قطنيين مبللين بالمحلول الملحي ، قم بإزالة الأمعاء برفق وتحديد الموقع بأقل تغطية للدهون. ضع الفروع المعوية الصغيرة على عجينة سوداء لتقليل إشارة الخلفية.
    4. احصل على مقاطع الفيديو قبل الإدخال / المراجعة (ما قبل نقص التروية).
    5. اصنع رطوبة مضغوطة باستخدام كلوريد الصوديوم وضع الأمعاء فيها. تأكد من أن الأمعاء محاطة بالضغط والحفاظ على الرطوبة خلال الخطوة 5.6.
    6. انسداد الشريان المساريقي العلوي بمشبك وعائي صغير.
    7. ادفع الأمعاء برفق إلى تجويف البطن باستخدام مسحات قطنية مبللة بالمحلول الملحي ، واستخدم خياطة 7-0 لإغلاق جدار البطن لمنع فقدان الرطوبة ودرجة الحرارة. حافظ على نقص التروية لمدة 60 دقيقة ، وفحص التخدير كل 20 دقيقة على الأقل.
    8. بعد 1 ساعة ، ابدأ إعادة التروية عن طريق إزالة المشبك.
      ملاحظة: التنفيذ السليم لإجراء نقص التروية يؤدي إلى تغيير واضح. في البداية ، ستظهر المنطقة المصابة شاحبة أو بيضاء بسبب قلة تدفق الدم. عند إزالة المشبك ، سيعود تدفق الدم تدريجيا إلى المنطقة الإقفارية ، والتي ستستعيد لونها الطبيعي ، مما يدل على الانسداد الناجح. من الضروري مراقبة الفأر عن كثب باستمرار طوال مرحلة نقص التروية.
    9. بعد الفترة الإقفارية ، ضع بضع قطرات من المحلول الملحي على المنطقة المقطوعة ، ثم قم بإزالة مشابك الأوعية الدموية الدقيقة برفق باستخدام مشبك.
    10. باستخدام أطراف قطنية مبللة بالمحلول الملحي ، قم بإزالة الأمعاء برفق مرة أخرى ، ووضع الفروع الصغيرة للوريد على عجينة سوداء ، وحقن 50 ميكرولتر من برتقال الأكريدين مرة أخرى ، والتقط مقاطع الفيديو الخاصة بنفس الوريد في نفس الموقع (ما بعد نقص التروية).

4. الفحص المجهري عالي السرعة للتصوير العرضي بالفيديو داخل الحيوية

  1. تصور الكريات البيض و NETs باستخدام مجهر مضان واسع المجال عالي السرعة مزود بمكثف لمسافات طويلة ، وأحادي اللون ، وهدف غمر في الماء 10x ، وكاميرا جهاز مقترنة بالشحن. تم إجراء الحصول على الصورة بوقت تعرض يبلغ 30 مللي ثانية ومرشحات Alexa Fluor 488 (495/519) و Rhodamine Red (570/590).
  2. استخدم برنامج التصوير للحصول على الصور وتحليلها.
  3. تحديد تجنيد الخلايا ضمن منطقة اهتمام تبلغ مساحتها 0.06 مم².
  4. حدد كمية الكريات البيض الملتصقة كخلايا تظل ثابتة أو متصلة بالبطانة لمدة 20 ثانية لفترة مراقبة.
  5. حدد NETs كهياكل خارج الخلية مصنفة بكل من الكريات البيض والأصباغ الفلورية للحمض النووي خارج الخلية.
  6. القتل الرحيم للحيوانات عن طريق خلع عنق الرحم في نهاية التجربة (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).

5. عزل الخلايا البطانية الكبدية (LEC) وRT-PCR الكمي

  1. عزل LECs عبر فرز الخلايا المغناطيسية (MACS)29.
  2. عزل الحمض النووي الريبي الكلي.
  3. قم بإجراء تخليق الحمض النووي التكميلي (cDNA)27 عن طريق خلط 2 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي مع 2 ميكرولتر من RT Buffer ، و 0.8 ميكرولتر من مزيج dNTP ، و 2 ميكرولتر من RT Random Primers ، و 1 ميكرولتر من النسخ العكسي ، و 4.2 ميكرولتر H2O.
  4. تم إجراء نسخ (كدنا) بتطبيق الشروط التالية: 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 37 درجة مئوية لمدة 120 دقيقة ، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. استخدم 20 نانوغرام من (كدنا) ل qPCR.
  6. استخدم البادئات التالية: F2r (للأمام): TGAACCCCCGCTCATTCTTTC ، F2r (عكس): CCAGCAGGACGCTTTTTTTTTTT ، L32 (إلى الأمام): CCTCTGGTGAAGCCCAAGATC ، L32 (عكسي): TCTGGGTTTCCGCCAGTTT. استخدم الشروط التالية: 95 درجة مئوية 30 ثانية ، 45 دورة (95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، 60 درجة مئوية لمدة 25 ثانية) ، 60 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية لمدة 6 ثوان مع ΔΤ 1 درجة مئوية.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لدراسة التأثيرات المعتمدة على الخلايا البطانية على دحرجة الكريات البيض والالتصاق وكذلك على تكوين NET ، في البداية ، تم فحص فعالية نقص F2r المحفز VE-Cadherin Cre في الخلايا البطانية. تم استخدام فرز الخلايا المغناطيسية لعزل الخلايا البطانية الكبدية. بعد ذلك ، تم عزل الحمض النووي الريبي ، متبوعا ب PCR الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR). أظهرت الفئران F2rΔEC ، التي يكون فيها إعادة تركيب Cre المعبر عنها تحت سيطرة محفز VE-Cadherin غائبا ، انخفاضا كبيرا في مستويات mRNA F2r (PAR1) (حوالي الثلث) مقارنة بعناصر التحكم في WT (الشكل 1).

بعد تأكيد النقص في خط الفأر ، تم إجراء إصابة I / R المساريقية لفحص تأثير PAR1 الذي تعبر عنه الخلايا البطانية الوعائية على دحرجة الكريات البيض والالتصاقها ، والتي تم تصورها بواسطة الفحص المجهري داخل الحيوية (الشكل 2 أ ، ب). بعد 1 ساعة من نقص التروية ، تمت إزالة المشبك ، وسمح للوعاء بالانعكاس مرة أخرى. لوحظ تدحرج الكريات البيض والالتصاق وتسجيلها (أخضر ملون ، يشار إليه بالسهام البيضاء). على الرغم من أن كلتا المجموعتين أظهرتا أعدادا متزايدة من الكريات البيض الملتصقة بعد إصابة I / R ، إلا أن نقص البطانة F2r (PAR1) أدى إلى انخفاض ملحوظ ولكن ليس بشكل ملحوظ في التصاق الكريات البيض بالبطانة المساريقية المنشطة I / R ، مما يشير إلى دور نشط لتنشيط PAR1 البطاني في تجنيد الكريات البيض في الأوردة المساريقية الإقفارية (الشكل 2 ج).

كان الهدف التالي هو فحص ما إذا كان تعبير PAR1 البطاني ينظم تكوين NET الناجم عن الإصابة I / R. لذلك ، تم تلطيخ الأحماض النووية خارج الخلية بصبغة غير منفذةللخلية 30 ، وتصور الشبكات الشبكية المتولدة باستخدام الفحص المجهري داخل الحيوية (يشار إليه بالأسهم السوداء) (الشكل 2 أ ، ب). بعد إصابة I / R ، لوحظت NETs فقط في مجموعة WT التي تعبر عن المستويات الطبيعية من PAR1 على الخلايا البطانية ، مما يشير إلى الدور التنظيمي ل PAR1 في NETosis (الشكل 2C ، D). والجدير بالذكر أنه عندما تم قمع تعبير F2r البطاني ، لم تكن هناك شبكات في الأوردة المساريقية المصابة I / R.

figure-results-1
الشكل 1: F2r (PAR1) تعبير mRNA. F2r التعبير عن الخلايا البطانية للكبد ل WT (ن = 6) و F2rΔEC (ن = 9) الفئران بالنسبة لجين التدبير المنزلي L32 . يتم تقديم البيانات كوسيط بفاصل ثقة 95٪. تم استخدام اختبار مان ويتني لمقارنة مجموعتين مستقلتين ، * ص < 0.05. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: يؤثر PAR1 البطاني على التصاق الكريات البيض وتكوين NET في الأوردة المساريقية المصابة I / R. صور مجهرية تمثيلية داخل الحيوية للكريات البيض الملتصقة الملطخة ببرتقالي Acridine (سهام بيضاء) و NETs ملطخة ب Sytox Orange (سهام سوداء) لفئران WT و F2rΔEC قبل (قبل) وبعد (بعد) إصابة I / R (A) تكبير 10x و (B) 20x. قضبان المقياس: أ ، 50 ميكرومتر ؛ ب ، 20 ميكرومتر. (ج) التصاق الكريات البيض و (د) NETs لكل مم2 من WT (ن = 7) و F2rΔEC (ن = 4) الفئران قبل (قبل) وبعد (بعد) إصابة I / R. تم تمثيل جميع المعطيات كوسيط بفاصل ثقة 95٪. تم إجراء المقارنات الإحصائية باستخدام اختبار ANOVA ثنائي الاتجاه ، ** ص < 0.01 ، واختبارات المقارنة المتعددة ل Sídák لمقارنة متوسطات الأنماط الجينية المختلفة في كل نقطة زمنية (قبل وبعد نقص التروية). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق إصابة I / R المساريقية جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري داخل الحيوية على نموذج الفأر الجيني لنقص F2r (PAR1) في الخلايا البطانية لتحليل في الجسم الحي للكريات البيض و NETs بعد ساعة واحدة من نقص التروية. كثيرا ما يستخدم نموذج إصابة I / R المساريقية في القوارض المصابة بأوقات نقص التروية وإعادة التروية التي تتراوح من دقائق إلى عدة ساعات23،31 ، مما يؤثر على النتيجة الالتهابية32 والوفيات33. يعتمد النموذج أيضا على عدة عوامل ، بما في ذلك الجراثيم19،34 ، والمستقبلات المناعية10،35،36،37 ، والجنس38،39 ، والعمر35. بصرف النظر عن أوقات الإدخال / الرؤية المتغيرة ، هناك متغير آخر في هذا النموذج وهو الاستجابة التفاضلية لأجزاء مختلفة من الأمعاء للإصابة ، حيث تظهر الأمعاء الدقيقة تلفا مخاطيا أكبر من القولون40. يعد وضع مقطع الأوعية الدموية الدقيقة الذي يؤثر على المنطقة الإقفارية أمرا بالغ الأهمية لقابلية تكرار الطريقة32،33. الأهم من ذلك ، أن انسداد الشريان المساريقي الفائق جنبا إلى جنب مع انقطاع التدفق الجانبي ينتج عنه معدلات وفيات ترتبط باستمرار بمدة نقص التروية41.

في هذه الدراسة ، تعرضت الفئران لساعة واحدة من نقص التروية ، وتم تصور التصاق الكريات البيض في الجسم الحي وتكوين NET مباشرة بعد إعادة التروية لفحص الاستجابة الالتهابية المبكرة الناجمة عن الحالة الإقفارية في غياب تعبير F2r البطاني. يسمح تطبيق هذه الأساليب على نماذج الفئران الجينية بالتحقيق في كيفية تأثير جزيئات مستهدفة معينة على السلوك الخلوي والاستجابة الالتهابية بعد نقص التروية وأثناء إعادة التروية.

هناك العديد من الخطوات الحاسمة في البروتوكول ، بما في ذلك الحفاظ على سلامة الأمعاء. يجب أن يتم التعامل مع الأمعاء برفق لتجنب تلف الأنسجة. لهذا الغرض ، تعتبر مسحات القطن الرطبة الأداة المناسبة لفصل الأمعاء مؤقتا عن تجويف البطن. من الأهمية بمكان أن تظل الأمعاء رطبة حتى يتم إعادة وضعها في البطن. يمكن أن تؤدي إصابات المناولة الطفيفة إلى تنشيط أنواع مختلفة من الخلايا ، مثل الصفائح الدموية والخلايا البطانية ، والتي يمكن أن تؤثر على النتائج.

من أجل الاتساق ، من الضروري تصور نفس موقع الأجزاء المعوية قبل وبعد نقص التروية. قد يكون هذا صعبا لأن الأمعاء يتم إعادة وضعها في تجويف البطن بعد نقص التروية. لمعالجة هذه المشكلة ، تتمثل إحدى الطرق في وضع قطعة صغيرة من الكمادات الرطبة على جزء من الأمعاء تم تصورها قبل نقص التروية.

لتصور تدحرج الكريات البيض والالتصاق بالإضافة إلى تكوين NET في الجسم الحي ، تم حقن الفئران بكل من الكريات البيض وصبغة مضان الحمض النووي عبر الوريد الوداجي. صبغة الكريات البيض (انظر جدول المواد) هي صبغة مضان متتالية اللون قابلة للاختراق للخلية ترتبط بخلايا الدم البيضاء ولكن ليس خلايا الدم الحمراء وقد استخدمت على نطاق واسع لتلوين الكريات البيض في الجسم الحي17،42. يتم تطبيق الصبغة عن طريق الوريد وتوفر تلطيخا قويا للكريات البيض في غضون ثوان. ومع ذلك ، يمكن أن تكون الخصوصية قيدا لأنها تلطخ أيضا الخلايا ذات النواة الأخرى ، مثل الخلايا البطانية. ومع ذلك ، تحتفظ خلايا الدورة الدموية بالتلوين لفترة أطول بسبب تأثير الغسيل43. صبغة مضان الحمض النووي (انظر جدول المواد) هي صبغة حمض نووي غير منفذة للخلية تستخدم بشكل شائع لتصور تكوين NET30،44،45. يمكن أيضا تطبيقه عن طريق الوريد ، ويرتبط بتقارب عال ، وهو سريع وسهل الاستخدام. مرة أخرى ، تعد الخصوصية عيبا لأن الصبغة سوف ترتبط بأي خلية ذات غشاء غير سليم. من الناحية المثالية ، يجب دمجه مع علامة عدلات (على سبيل المثال ، CD15 ، CD11b) أو علامة NETosis (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة ل citH3) لتعزيز الخصوصية. تتيح هذه الأصباغ التصوير في الجسم الحي للكريات البيض في الأوردة المساريقية لحيوانات المختبر.

يتمثل القيد الرئيسي لهذه التقنية في وجود الدهون الحشوية ، مما يحد من تصور الشعيرات الدموية المعوية ويعيق بشكل كبير اكتساب الصور. لتجنب هذه المضاعفات ، من الضروري استخدام التجارب الصغيرة (6-8 أسابيع) التي قللت من تكوين الدهون الحشوية. بالإضافة إلى ذلك ، يعوق التحليل النسيجي خارج الجسم الحي استخدام التلوين في الجسم الحي . هناك قيد آخر يتمثل في تأثير ميكروبات الأمعاء والنظام الغذائي على هذا النموذج ، والذي قد يختلف بشدة بين تربية الفئرانالمختلفة 46. لمعالجة هذا القيد ، يمكن اعتبار دراسة نماذج الفئران الجنوتوحيوية10.

في هذه الدراسة ، تم فحص الاستجابة الخلوية الفورية بعد نقص التروية ، ولوحظ انخفاض ترسب الكريات البيض في البطانة المساريقية المنشطة ولوحظ تكوين NET في الجسم الحي. يقلل تدهور NET عن طريق الإعطاء الوريدي ل DNase بعد ساعة واحدة من نقص التروية من الاستجابة المسببة للالتهابات المبكرة ويحسن اضطراب حاجز الأمعاء47. وتجدر الإشارة إلى أن العلاج بالثرومبومودولين ، وهو بروتين سكري عبر الغشاء يثبط نشاط الثرومبين48 ، أدى إلى تحسين بقاء الفئران المصابة بإصابة I / R الشديدة المعوية ، مما يخفف من الاستجابة الالتهابية للخلل البطاني ويقلل من تراكم الهيستون المكثف في الأعضاءالبعيدة 49. هنا ، تبين أن مستقبل الثرومبين البطاني يؤثر على نتيجة I / R ، مما يسلط الضوء على أهمية الجمع بين نموذج إصابة I / R المعوية مع الفحص المجهري داخل الحيوية في الفئران المعدلة وراثيا للتحقيق في الوسطاء المهمين لأمراض المرض.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا يكشف المؤلفان عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقر C.R. بالتمويل المقدم من مبادرة Forschungsinitiative Rheinland-Pfalz و ReALity (مشروع MORE) ، و BMBF Cluster4Future CurATime (مشروع MicrobAIome ؛ 03ZU1202CA) ، و Wilhelm Sander-Stiftung (رقم 2022.131.1) ، وصندوق الابتكار Deutsche Zentren der Gesundheitsforschung (DZG) "Microbiome" (81X2210129). C.R. عالم في المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK). C.R. هو عضو في مركز بيولوجيا الأوعية الدموية الانتقالية (CTVB) ، ومركز أبحاث العلاج المناعي (FZI) ، و Potentialbereich EXPOHEALTH في جامعة يوهانس جوتنبرج ماينز. C.R. هو عضو في وحدة أبحاث DFG 5644 INFINITE (RE 3450 / 15-1). حصل C.R. على زمالة من كلية غوتنبرج للأبحاث في جامعة يوهانس جوتنبرج في ماينز. يتم دعم KK من قبل برنامج التميز "تعزيز العالمات" التابع ل DZHK وهو عضو في Young DZHK. Z.G و O.D. هما طلاب دكتوراه في كلية ماينز للأبحاث للطب الحيوي الانتقالي (TransMed).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Acridine orangeSigma-Aldrich   A-6014
لوحة 96 بئر مضاعفة PCR-Platten Sarstedt721977202.00
أنظمة التخدير للقوارضGROPPLER medizintechnikUni Vet -Porta T-8
Aqua ad injectabilia IVMB Braun Melsungen53402101
العجين الأسودStaedtlerنمذجة الطين
CD146 Microbeads ، الماوسMiltenyi Biotec130-092-007
cellSensأوليمبوسأوليمبوس cellSense Dimension Desktop 2.3برنامج
جهاز مقترن بالشحنHamamatsu PhotonicsORCA-R2كاميرا
مسحات قطنيةB & ouml; ttger09-119-9100
محرقة منحنية 125 مم / 5 "أدوات نيلي 22466
كريم مزيل الشعرBaleaغير قابل للتطبيق
Dorbene Vetzoetis
Dumont Fallpsأدوات العلوم الدقيقة11251-35
الإيثانول p.a. 99,5٪روث5504.20
مقص ضيق إضافي – مستقيم / حاد حاد / 10.5FST14088-10
ملقط فنتانيلJanssen-Cilag GmBH
"Dumont # 5" (Inox ، طرف 0.1 مم ، طول 11 سم)FST11251-20
GentleMACS C TubesMiltenyi Biotec130-093-236
GraphpadprismGraphpad Prism 10برنامج
isoflurane   ؛بيرامال4150097146757.00
iTaq UniversalSYBR Green Supermix 10x5mlBioRad1725125.00
شريط طبي LeukofixBSNMedical0213600
طقم تفكك الكبد ، ماوسMiltenyi Biotec130-105-807
LS-Separation أعمدة MACSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Smart Strainer 100 وميكرو ؛ mMiltenyi Biotec130-098-463
Microseal B Seal SealsBioradMSB1001
Midazolamhameln5918501.00
NaClBraun2350748
حامل إبرةFST12001-13
خياطة حريرية مضفرة غير قابلة للامتصاص ، الحجم: 7/0 ، 91 متر   ؛أدوات العلوم الدقيقة18020-70
أوليمبوس BX51WI مجهر مضانأوليمبوس
مجهر PCR لشرائط الأنبوبSarstedt72985002.00
أغطية أنبوب PCRSarstedt65989002.00
قسطرة الإيثيلينسميث الطبية Deutschland GmbH800/100/100
Prolene (8648G) ، بولي بروبيلين 6-0 ، Nahtmaterial جونسون & أمبير جونسون ميديكال جي إم بي إتش 8695H
Relia Prep RNA Miniprep SystemsPromegaZ6112
Reverse Tanscription Kit (cDNA عالي السعة)الأنظمة الحيوية التطبيقية4368813.00
مقياس المدرسة KERN & أمبير مقص زنبركي SOHN GmbHEMB 500-1
- بزاوية إلى الجانبFST15006-09
مجهر ستيريوLeicaM50
مرقئ مستقيم 135 مم / 5.5 بوصةأدوات نيلي 22468
حقنة 1 ملبراون9166017V
SYTOX برتقاليثيرمو فيشر العلميS11368
تحكم في درجة الحرارة TC-1000FMI F & ouml; hr Medical Instruments GmbHغير قابل للتطبيق
ملقط الأنسجة - 1x2 الأسنانFST18057-14
مشبك الأوعية الدمويةأدوات العلوم الدقيقة18055-02
Vetiva miniWAHL1584-0480
كاميرا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cudnik, M. T., et al. The diagnosis of acute mesenteric ischemia: A systematic review and meta-analysis. Acad Emerg Med. 20 (11), 1087-1100 (2013).
  2. Kassahun, W. T., Schulz, T., Richter, O., Hauss, J. Unchanged high mortality rates from acute occlusive intestinal ischemia: Six-year review. Langenbecks Arch Surg. 393 (2), 163-171 (2008).
  3. Florim, S., Almeida, A., Rocha, D., Portugal, P. Acute mesenteric ischemia: A pictorial review. Insights Imaging. 9 (5), 673-682 (2018).
  4. Kumar, S., Sarr, M. G., Kamath, P. S. Mesenteric venous thrombosis. N Engl J Med. 345 (23), 1683-1688 (2001).
  5. Dugbartey, G. J. Cellular and molecular mechanisms of cell damage and cell death in ischemia-reperfusion injury in organ transplantation. Mol Biol Rep. 51 (1), 473(2024).
  6. Ikeda, H., et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium. Gut. 42 (4), 530-537 (1998).
  7. Gutierrez-Sanchez, G., Garcia-Alonso, I., Gutierrez Saenz De Santa Maria, J., Alonso-Varona, A., Herrero De La Parte, B. Antioxidant-based therapy reduces early-stage intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Antioxidants (Basel). 10 (6), 853(2021).
  8. Jia, Z., Chen, Q., Qin, H. Ischemia-induced apoptosis of intestinal epithelial cells correlates with altered integrin distribution and disassembly of f-actin triggered by calcium overload. J Biomed Biotechnol. 2012, 617539(2012).
  9. Gordeeva, A. E., et al. Vascular pathology of ischemia/reperfusion injury of rat small intestine. Cells Tissue Organs. 203 (6), 353-364 (2017).
  10. Ascher, S., et al. Gut microbiota restricts netosis in acute mesenteric ischemia-reperfusion injury. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 40 (9), 2279-2292 (2020).
  11. Kiouptsi, K., Casari, M., Mandel, J., Gao, Z., Deppermann, C. Intravital imaging of thrombosis models in mice. Hamostaseologie. 43 (5), 348-359 (2023).
  12. Wang, B., Huang, Q., Zhang, W., Li, N., Li, J. Lactobacillus plantarum prevents bacterial translocation in rats following ischemia and reperfusion injury. Dig Dis Sci. 56 (11), 3187-3194 (2011).
  13. Guan, Y., Worrell, R. T., Pritts, T. A., Montrose, M. H. Intestinal ischemia-reperfusion injury: Reversible and irreversible damage imaged in vivo. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 297 (1), G187-G196 (2009).
  14. Joao, S. A., Medeiros, A. C., Diniz, S. O. F., Cardoso, V. N., Brandt, C. T. Translocation of 99mTc labelled bacteria after intestinal ischemia and reperfusion. Acta Cir. Bras. 19 (4), (2004).
  15. Parks, D. A., Granger, D. N. Contributions of ischemia and reperfusion to mucosal lesion formation. Am J Physiol. 250 (6 Pt 1), G749-G753 (1986).
  16. Kurose, I., et al. Molecular determinants of reperfusion-induced leukocyte adhesion and vascular protein leakage. Circ Res. 74 (2), 336-343 (1994).
  17. Massberg, S., et al. Platelet-endothelial cell interactions during ischemia/reperfusion: The role of p-selectin. Blood. 92 (2), 507-515 (1998).
  18. Salter, J. W., Krieglstein, C. F., Issekutz, A. C., Granger, D. N. Platelets modulate ischemia/reperfusion-induced leukocyte recruitment in the mesenteric circulation. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 281 (6), G1432-G1439 (2001).
  19. Bayer, F., et al. Colonization with altered schaedler flora impacts leukocyte adhesion in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Microorganisms. 9 (8), 1601(2021).
  20. Boettcher, M., et al. Therapeutic targeting of extracellular DNA improves the outcome of intestinal ischemic reperfusion injury in neonatal rats. Sci Rep. 7 (1), 15377(2017).
  21. Li, T. T., et al. Fbxw5 aggravates hepatic ischemia/reperfusion injury via promoting phosphorylation of ask1 in a traf6-dependent manner. Int Immunopharmacol. 99, 107928(2021).
  22. Huang, Z., et al. Inhibition of mir-450b-5p ameliorates hepatic ischemia/reperfusion injury via targeting cryab. Cell Death Dis. 11 (6), 455(2020).
  23. Munley, J. A., et al. Chronic mesenteric ischemia-induced intestinal dysbiosis resolved after revascularization. J Vasc Surg Cases Innov Tech. 9 (2), 101084(2023).
  24. Rubio-Gayosso, I., Platts, S. H., Duling, B. R. Reactive oxygen species mediate modification of glycocalyx during ischemia-reperfusion injury. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 290 (6), H2247-H2256 (2006).
  25. Grimsey, N. J., et al. Ubiquitin plays an atypical role in gPCR-induced p38 map kinase activation on endosomes. J Cell Biol. 210 (7), 1117-1131 (2015).
  26. Weithauser, A., Rauch, U. Role of protease-activated receptors for the innate immune response of the heart. Trends Cardiovasc Med. 24 (6), 249-255 (2014).
  27. Bochenek, M. L., et al. EPCR-PAr1 biased signaling regulates perfusion recovery and neovascularization in peripheral ischemia. JCI Insight. 7 (14), e157701(2022).
  28. Alva, J. A., et al. Ve-cadherin-cre-recombinase transgenic mouse: A tool for lineage analysis and gene deletion in endothelial cells. Dev Dyn. 235 (3), 759-767 (2006).
  29. Formes, H., et al. The gut microbiota instructs the hepatic endothelial cell transcriptome. iScience. 24 (10), 103092(2021).
  30. Tanaka, K., et al. In vivo characterization of neutrophil extracellular traps in various organs of a murine sepsis model. PLoS One. 9 (11), e111888(2014).
  31. How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells alleviate lung injury from mesenteric ischemia-reperfusion. J Trauma Acute Care Surg. 79 (4), 592-601 (2015).
  32. Gubernatorova, E. O., Perez-Chanona, E., Koroleva, E. P., Jobin, C., Tumanov, A. V. Murine model of intestinal ischemia-reperfusion injury. J Vis Exp. 111, e53881(2016).
  33. Henein, L., Clevenger, R., Keeran, K., Brinster, L. Rodent model of intestinal ischemia-reperfusion injury via occlusion of the superior mesenteric artery. J Vis Exp. (200), e64314(2023).
  34. Yoshiya, K., et al. Depletion of gut commensal bacteria attenuates intestinal ischemia/reperfusion injury. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 301 (6), G1020-G1030 (2011).
  35. Watanabe, T., et al. Activation of the myd88 signaling pathway inhibits ischemia-reperfusion injury in the small intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 303 (3), G324-G334 (2012).
  36. Watanabe, T., et al. Toll-like receptor 2 mediates ischemia-reperfusion injury of the small intestine in adult mice. PLoS One. 9 (10), e110441(2014).
  37. Tatum, P. M., Harmon, C. M., Lorenz, R. G., Dimmitt, R. A. Toll-like receptor 4 is protective against neonatal murine ischemia-reperfusion intestinal injury. J Pediatr Surg. 45 (6), 1246-1255 (2010).
  38. Wu, M., Rowe, J. M., Fleming, S. D. Eicosanoid production varies by sex in mesenteric ischemia-reperfusion injury. Clin Immunol. 220, 108596(2020).
  39. Mester, A., et al. gender-related hemorheological alterations in intestinal ischemia-reperfusion in the rat. J Surg Res. 225, 68-75 (2018).
  40. Leung, F. W., Su, K. C., Passaro, E., Guth, P. H. Regional differences in gut blood flow and mucosal damage in response to ischemia and reperfusion. Am J Physiol. 263 (3 Pt 1), G301-G305 (1992).
  41. Megison, S. M., Horton, J. W., Chao, H., Walker, P. B. A new model for intestinal ischemia in the rat. J Surg Res. 49 (2), 168-173 (1990).
  42. Von Bruhl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. J Exp Med. 209 (4), 819-835 (2012).
  43. Cahoon, J. M., et al. Acridine orange leukocyte fluorography in mice. Exp Eye Res. 120, 15-19 (2014).
  44. Jiang, D., Saffarzadeh, M., Scharffetter-Kochanek, K. In vitro demonstration and quantification of neutrophil extracellular trap formation. Bio Protoc. 7 (13), e2386(2017).
  45. Westhorpe, C. L., et al. In vivo imaging of inflamed glomeruli reveals dynamics of neutrophil extracellular trap formation in glomerular capillaries. Am J Pathol. 187 (2), 318-331 (2017).
  46. Rausch, P., et al. Analysis of factors contributing to variation in the c57bl/6j fecal microbiota across German animal facilities. Int J Med Microbiol. 306 (5), 343-355 (2016).
  47. Wang, S., et al. DNase-1 treatment exerts protective effects in a rat model of intestinal ischemia-reperfusion injury. Sci Rep. 8 (1), 17788(2018).
  48. Li, Y. H., Kuo, C. H., Shi, G. Y., Wu, H. L. The role of thrombomodulin lectin-like domain in inflammation. J Biomed Sci. 19 (1), 34(2012).
  49. Hayase, N., et al. Recombinant thrombomodulin on neutrophil extracellular traps in murine intestinal ischemia-reperfusion. Anesthesiology. 131 (4), 866-882 (2019).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PAR1

مقالات ذات صلة