استخدام المتفطرة smegmatis كمؤشر حيوي لظروف النمو المحدودة بالزنك في البكتيريا الفطرية

Allexa D. Burger; Jayna Wong; Endrei Marcantonio; Sladjana Prisic

doi:10.3791/67274

مقالة منهجية

استخدام المتفطرة smegmatis كمؤشر حيوي لظروف النمو المحدودة بالزنك في البكتيريا الفطرية

1.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67274

⸱

سبتمبر 20, 2024

Allexa D. Burger^*¹ , Jayna Wong^*¹ , Endrei Marcantonio¹ , Sladjana Prisic¹

¹School of Life Sciences, University of Hawaiʻi at Mānoa

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول تفاصيل تحضير الوسائط المحدودة Zn^{2 +} وأوعية النمو ومزارع البذور لإنتاج ريبوسومات Zn^{2 +} محدودة في البكتيريا الفطرية. تؤدي آثار Zn²⁺ إلى الحد من نمو Zn^{2 +} ونصف السمات المورفولوجية المستخدمة كمؤشرات حيوية للتحقق من قيود Zn²⁺ في المختبر في البكتيريا النموذجية ، المتفطرة اللطخة ، وممرض الإنسان M. tuberculosis.

الملخص

تقوم العديد من البكتيريا ببناء ريبوسومات بديلة في ظروف النمو Zn^{2 +} التي تحد من خلال استبدال البروتينات الريبوسومية المرتبطة بالزنك^{2 +} بمعلمات مستقلة عن Zn²⁺. ثبت أن تحديد نظام لدراسة هذه الريبوسومات البديلة صعب لأن تلوث Zn²⁺ في المختبر شائع. لمعالجة هذه المشكلة ، تتم إضافة عوامل المخلب أحيانا إلى وسائط النمو ، لكن هذا النهج يلتف على الاستجابة البيولوجية للحد التدريجي من Zn²⁺ويرتبط بسبات الريبوسوم. هنا ، يتم تحديد التعليمات التفصيلية لإعداد الوسائط ومزارع البذر للنمو المحدود Zn²⁺ دون إضافة المخلبات. باتباع هذه الطريقة ، تخضع البكتيريا النموذجية ، المتفطرة اللطاخة ، للتشكل ، والذي يعتمد على الريبوسومات البديلة. نظرا لأن التشكل قابل للتتبع ولا يحدث إلا في ظروف الحد من Zn²⁺ ، يمكن استخدام M. smegmatis كمؤشر حيوي للتحقق من ظروف النمو ذات الصلة بيولوجيا. تم وصف ثلاثة أنماط ظاهرية للمؤشرات الحيوية (كثافة الخلية ، وطول الخلية ، والإنزيم المساعد F₄₂₀ المضيان) التي تشير إلى حد Zn²⁺ في النوع البري ، وتم تحديد التغييرات في هذه المؤشرات الحيوية لمتحور الحذف الذي لا يمكنه بناء ريبوسومات بديلة. نظرا لأنه يصعب التحكم في تتبع تلوث Zn²⁺ لكل دفعة من الوسائط ، كما أن القياس الكمي الدقيق ل Zn²⁺ في كل تحضير وسائط مرهق للغاية ، فإن اتباع هذا النمط الظاهري للمؤشر الحيوي هو طريقة يسهل الوصول إليها للتحقق من صحة إعداد وسائط النمو المحدودة Zn^{2 +}. للمساعدة في تحديد الظروف المناسبة للنمو الذي يحد من Zn^{2 +} وإنتاج الريبوسوم البديل ، تم تحديد التغييرات في الأنماط الظاهرية للمؤشر الحيوي للمستحضرات الملوثة بالزنك^{2 +} أو المستنفدة بشدة من الزنك 2⁺ من الوسائط المحدودة Zn^{2 +} أيضا. يتم تقديم مزيد من التفاصيل لتحقيق النمو الذي يحد من Zn²⁺ وإنتاج الريبوسوم البديل في M. tuberculosis ، جنبا إلى جنب مع النمط الظاهري للمؤشر الحيوي المرتبط به. بشكل عام ، ستساعد التعليمات التفصيلية والأنماط الظاهرية للمؤشرات الحيوية الموضحة هنا في توحيد إنتاج الريبوسومات البديلة النشطة ترجميا في البكتيريا الفطرية.

المقدمة

فئة

أيون الزنك (Zn²⁺) هو عنصر غذائي دقيق أساسي ومكون قياسي للوسائط الميكروبيولوجية. ومع ذلك ، فإن العديد من البكتيريا تتحمل قيود Zn²⁺ في البيئة حيث تنتشر الظروف المحددة ل Zn^{2 +}. غالبا ما تكون فئة التربة < المرتفعة = "xref" >1 ، فئة البحرية < الطبقة = "xref" >2 ، والمنافذ داخل فئة المضيف 3 Zn^{2 +} محدودة. على هذا النحو ، طورت معظم البكتيريا آليات للتغلب على قيود Zn²⁺ والحفاظ على الوظيفة الخلوية < فئة sup = "xref" >4. تخضع الأنظمة المشاركة في الحفاظ على توازن Zn²⁺ لسيطرة نسخ مشددة < فئة sup = "xref" >5 وتشارك في كسح Zn²⁺ باستخدام أنظمة استيراد Zn^{2 +} عالية التقارب ، وتعبئة احتياطيات Zn^{2 +} الخلوية ، واستبدال بعض بروتينات ربط Zn^{2 +} بمعلمات بديلة مستقلة عن Zn^{2 +} < فئة sup = "xref" >6. مثال على هذا الأخير هو Paralogs البروتين الريبوزومي المستقل عن Zn^{2 +} (RPs) ، والتي تعد سمة شائعة للمنظمات المستجيبة ل Zn^{2 +} في البكتيريا < فئة sup = "xref" >4. تتميز هذه RPs المستقلة عن Zn^{2 +} شديدة التباين عن معلمات ربط Zn^{2 +} من خلال تعطيل شكل CXXC المرتبط بالزنك^{2 +} < فئة سوب = "xref" >7. يحتوي أكثر من نصف الجينومات بدائية النواة المتسلسلة على زوج واحد على الأقل من RPs المكررة حيث ، في العديد منها ، يربط RP واحد Zn²⁺ ، في حين أن paralog الخاص به لا < فئة sup = "xref">8. في حين أن تدوين C +/C- (الذي يشير إلى وجود / عدم وجود شكل ربط Zn^{2 +} الغني بالسيستين) يستخدم بشكل شائع في الإشارة إلى أزواج RP المتوازلة هذه<فئة الدعم = "xref">7 ، تم أيضا وصف RPs المستقلة عن Zn^{2 +} على أنها إصدارات بديلة (Alt) من معلمات RP الأولية (Prim) و Zn^{2 +} - ملزمة ، نظرا لأن AltRPs تعمل كوحدات RP بديلة للتكوين الحيوي للريبوسوم في Zn²⁺- حالة محدودة في بعض البكتيريا وهي كلمة رئيسية ذات قابلية بحث أفضل9^,¹⁰^,¹¹.

نظرا لأن تعبير AltRP يتم تنظيمه بإحكام بواسطة Zn²⁺ ، فمن المنطقي افتراض أن تعبير AltRP يوفر تكرارا وظيفيا للبروتينات الريبوسومية المعتمدة على Zn^{2 +} في مواجهة قيود Zn²⁺. في الواقع ، تم إثبات هذه الميزة من AltRPs لبكتيريا التربة النموذجية Bacillus subtilis ، حيث يتم إنقاذ النمو أثناء تقييد Zn²⁺ عن طريق تحرير السطح PrimRP L31 والاستبدال ب AltRP L31¹²^،¹³. ومع ذلك ، فإن بعض AltRPs موازية ل PrimRPs الأساسية ، على سبيل المثال ، S14 ، مما يعني أن دمجها مطلوب أثناء التكوين الحيوي للريبوسوم < فئة sup = "xref" > 12 ^، 13. إعادة بناء الريبوسوم باستخدام AltRPs هو برنامج ملتزم وكثيف الاستهلاك للطاقة. في حين أن AltRPs الأساسية هذه قد تعمل على تحرير Zn²⁺ من الريبوسوم ، فمن الممكن أيضا أن تكون بعض AltRPs قد طورت وظيفة إضافية في بيئة Zn^{2 +} المحدودة. هذا مدعوم من خلال الملاحظة القائلة بأن AltRPs متباعدة عن PrimRPs المتوازلة. غالبا ما يكون التماثل التسلسلي لجينات AltRP أعلى بين المتماثلات في الأنواع المختلفة مقارنة بتسلسل جين PrimRP المرتبط ب Zn^{2 +} داخل نفس النوع < فئة sup = "xref" >7^،10. نظرا لأن الجينات التي تشفر AltRPs شديدة التباين تخضع لتحكم النسخ المعتمد على Zn^{2 +} ، يتم إزالتها من الضغط الانتقائي الذي يمارس على superoperons الريبوسومي الخاضع بإحكام والمحفوظ للغاية 14. يعرض الضغط الانتقائي المنفصل على المعلومات الجينية التي تشفر آلية الريبوسومات و AltRPs هذه RPs لمسارات تطورية مختلفة عن PrimRPs المتجانسة ويمكن أن يسمح بالتطور الخاص بالنسب لنفس AltRP في فئة البكتيريا المختلفة 10 ^، 15. يثير الوجود الواسع النطاق ل AltRPs في البكتيريا والتنظيم الجيني المنفصل لهذه الريبوسومات الفريدة سؤالا مثيرا للاهتمام حول ما إذا كان دمج AltRPs في الريبوسومات البكتيرية يمنح خاصية خاصة للريبوسومات المحتوية على AltRP (الريبوسومات البديلة).

البكتيريا الفطرية هي مجموعة مثالية من البكتيريا للتحقيق في الخصائص الميكانيكية للريبوسومات البديلة. أولا ، تمتلك البكتيريا الفطرية أوبرون altRP محفوظ للغاية يحتوي على أربعة جينات تشفر AltRPs: S14-2 و S18-2 و L28-2 و L33-2⁸^،⁹. تختلف AltRPs الفطرية اختلافا كبيرا عن معلمات PrimRP الخاصة بها. في جميع أزواج PrimRP / AltRP الأربعة ، يكون جين AltRP معينا أكثر تشابها عبر جميع أنواع البكتيريا الفطرية مما هو عليه مع جين PrimRP في نفس النوع < فئة الدعم = "xref">10. يتضح التطور الخاص بالنسب ل AltRPs أيضا داخل البكتيريا الفطرية ، كما يتضح من AltRPs S18-2 و L28-2 في المتفطرة السلية و M. bovis ، والتي تحتوي على تسلسلات فريدة في الطرف C غير موجودة في البكتيريا الفطرية الأخرى < فئة sup = "xref">10. ثانيا ، تحتوي هذه المجموعة من البكتيريا شديدة الصلة على أعضاء غير مسببة للأمراض ومسببة للأمراض تعيش في بيئات متنوعة من التربة (على سبيل المثال ، M. smegmatis) إلى عدد لا يحصى من العواطف: الإنسان (على سبيل المثال ، M. السل) ، البقر (على سبيل المثال ، M. bovis) ، المائية (على سبيل المثال ، M. marinum) ، والطيور (على سبيل المثال ، M. avium) ، على سبيل المثال لا الحصر. توفر الطبيعة المحفوظة للغاية لمشغل altRP في البكتيريا الفطرية ، والتطور الخاص بالنسب لجينات AltRP المحددة ، والبيئات المختلفة إلى حد كبير التي يتواجد فيها أعضاء هذه المجموعة فرصة فريدة لتحليل التطور المحفوظ والخاص بالنسب لوظيفة AltRP والخصائص الميكانيكية للريبوسومات البديلة. على الرغم من وفرة AltRPs في جينومات بدائية النواة ، فقد تم التحقيق في دور AltRPs و Alt-ribosomes في عدد قليل فقط من البكتيريا 9^,¹⁰^,¹¹^,¹²^,¹³^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹. إن إنشاء نظام موحد بمقاييس محددة للتحقق من صحة ظروف النمو التي تحد من Zn^{2 +} في البكتيريا الفطرية من شأنه أن يحسن النتائج التجريبية ويعزز فهم الريبوسومات البديلة في مجال أبحاث الريبوسوم.

Zn²⁺ هو من المغذيات الدقيقة ؛ لذلك ، فإن آثار تلوث Zn²⁺ في المواد الكيميائية والماء تساهم في التوافر البيولوجي ل Zn²⁺ ، حتى عند حذفها من إعداد الوسائط. يمكن أن تختلف الكميات الضئيلة من Zn²⁺ الموجودة في الماء أو المواد الكيميائية بشكل كبير بين المختبرات ، مما يؤثر على نتيجة Zn^{2 +} - الحد من النمو. يعد القياس الكمي تجريبيا ل [Zn²⁺] في كل إعداد مستقل للوسائط مرهقا للغاية بالنسبة لمعظم المختبرات التي تجري فحوصات النمو الروتينية ، ولكن آلية القضاء على إمكانية تلوث Zn^{2 +} في وسائط النمو ستكون ذات قيمة جوهرية. تحقيقا لهذه الغاية ، يتم تقديم طريقة مفصلة هنا لإعداد وسائط Zn^{2 +} محدودة محددة كيميائيا (ZLM) ، وأوعية نمو ، ومزارع بذور للحد من نمو Zn^{2 +} وإنتاج الريبوسوم البديل في M. smegmatis و M. tuberculosis. يتم استخدام السمات المورفولوجية الرئيسية (كثافة الخلية المقاسة بواسطة OD₆₀₀ ، وطول الخلية ، وتألق الإنزيم المساعد F₄₂₀) بعد النمو في ZLM للتحقق من تحقيق حد Zn²⁺. الإنزيم المساعد F₄₂₀ هو عامل مساعد ديزافلافين له أدوار مهمة في التقويض والدفاع ضد الإجهاد التأكسدي في الميثانوجينات والبكتيريا الفطرية< فئة الدعم = "xref" >20^،< فئة الدعم = "xref">21. الأهم من ذلك ، أن البكتيريا الفطرية تكون ذاتية الفلورية عند إثارة 420 نانومتر بسبب وفرة هذا العامل المساعد < فئة الدعم = "xref" >22. لا يزال الارتباط الجزيئي بين [Zn²⁺] و F₄₂₀ مضان دون حل ، ولكن اتباع مضان F₄₂₀ في الثقافات هو مؤشر حيوي يمكن تتبعه ويمكن الاعتماد عليه.

في M. smegmatis ، تحدث الأنماط الظاهرية للمؤشر الحيوي في البكتيريا من النوع البري ، لكن طفرة الحذف التي تفتقر إلى مشغل altRP لا تخضع لنفس البرنامج المورفولوجي ويمكن استخدامها كمؤشر حيوي تفاضلي<فئة sup = "xref">10. على الرغم من أن M. السل لا يتبع نفس البرنامج المورفولوجي مثل M. smegmatis أثناء الحد من Zn²⁺ ، فإن M. السل له استجابة قوية وعالمية للزنك²⁺ قيد ونمط ظاهري رئيسي للمؤشر الحيوي باتباع هذه الطريقة<فئة SUP = "XREF">23. وبالتالي ، فإن النظام المحدد هنا يمكن من توليد الريبوسومات الأولية والبديلة في ظل نفس ظروف النمو (أي حد Zn²⁺) ، مما يسهل التشريح الميكانيكي لوظيفة الريبوسوم البديل ودورها في تشكيل فسيولوجيا البكتيريا. تم استخدام طريقة النمو هذه لحل بنية الريبوسومات البديلة النشطة وإظهار نشاطها الانتقالي في النوع البري M. smegmatis²⁴. علاوة على ذلك ، مما يدعم أن طريقة النمو هذه والنمط الظاهري للمؤشر الحيوي يسلط الضوء على الوظيفة البيولوجية ل AltRPs أثناء قيود Zn^{2 +} ، فإن تعبير AltRP مطلوب للتشكل المعتمد على Zn^{2 +} وله تأثير عميق على النسخ والبروتين ل Zn^{2 +} - محدود M. smegmatis10^،²⁵. تستخدم نفس الطريقة ، مع تعديلات طفيفة في مقدار التلقيح ووقت الحضانة ، لتوليد مزارع Zn^{2 +} محدودة من M. tuberculosis⁹^,²³. هنا ، تم تفصيل البروتوكولات والأنماط الظاهرية للمؤشرات الحيوية لتحقيق النمو المحدد ل Zn²⁺ في كل من M. smegmatis و M. tuberculosis ، مع التركيز على M. smegmatis لأن هذه البكتيريا أكثر حساسية لتلوث Zn²⁺ في الوسائط ويمكن الوصول إليها على نطاق أوسع من العامل الممرض بطيء النمو.

البروتوكول

ملاحظة: السلالات المستخدمة في هذه الدراسة هي السلالة البرية M. smegmatis mc² 155 (هدية من الدكتور روبرت هوسون، مستشفى بوسطن للأطفال) وسلالة الحذف ΔaltRP (من مختبر بريسيك¹⁰). يمكن استزراع هذه السلالات في مختبر من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية (BSL2) أو المستوى الأول (BSL1)، وذلك حسب لوائح السلامة البيولوجية المحلية والموارد المتاحة. تم كتابة البروتوكول هنا ليكون متوافقاً مع مختبر BSL2. وفي حال تنفيذه في مختبر BSL1، يمكن استبدال كابينة السلامة البيولوجية باستخدام تقنية التعقيم مع موقد بنزن. بالإضافة إلى ذلك، يتعين على الباحثين الراغبين في إدراج سلالات أو ظروف أخرى حساب حجم الوسط الغذائي المطلوب بناءً على العدد الإجمالي للمزارع التي سيتم تحليلها. يجب التعامل مع سلالة M. tuberculosis H37Rv الممرضة (Mtb-H37Rv؛ هدية من الدكتور روبرت هوسون، مستشفى بوسطن للأطفال) في مختبر من المستوى الثالث للسلامة البيولوجية (BSL3) مع ارتداء جهاز تنفس (مثل PAPR أو N95). كما يجب عدم إعادة استخدام الدوارق عند استزراع المتفطرات شديدة الفوعة، مثل Mtb-H37Rv. أما سلالة M. tuberculosis mc²6206 المساعدة في التغذية (Mtb-Aux) فهي موهنة ويمكن التعامل معها في مختبر BSL2 (هدية من الدكتور ويليام ر. جاكوبس الابن، كلية ألبرت أينشتاين للطب).

1. تحضير الدوارق

ملاحظة: يتم تحقيق ظروف النمو المحدودة من Zn²⁺ في دورق إرلنماير (Erlenmeyer) مصنوع من البولي كربونات سعة 250 mL وقابل لإعادة الاستخدام (قابل للتعقيم بالبخار). لا تستخدم الدوارق الزجاجية للنمو المحدود من Zn²⁺ أو لبحث ومقارنة إجراءات الغسل الحمضي الصارمة مع النتائج المعروضة في هذا البروتوكول¹⁹. تعد الدوارق الجديدة تماماً كافية لتحقيق ظروف النمو المحدودة من Zn²⁺، ولكن لا تخلط أبداً بين الدوارق الجديدة والقديمة في تجربة واحدة. تخلص من الدوارق التي تظهر عليها علامات ضعف (عادةً عند الحواف) أو التي استُخدمت أكثر من 20 مرة تقريباً. افحص مرشحات الأغطية بانتظام للتأكد من عدم تحللها وتخلص منها في حال تضررها. وإذا كانت موجودة، تخلص من أغطية السدادات التي تُربط في أعلى السدادات وتغطي المرشحات. توضح هذه الطريقة الاحتياطات المتخذة لتنظيف الدوارق وتجهيزها لإعادة الاستخدام.

ضع ملصقات دائمة على الدوارق بحيث تُستخدم المجموعة نفسها لعنصر Zn فقط.²⁺-ظروف محدودة. قم بتمييز مجموعة أخرى من الدوارق لـ Zn²⁺-نمو وافر. يُعد التمييز بألوان مختلفة مفيداً لمنع خلط الدوارق.
لا تسمح أبداً بجفاف بقايا المزرعة في الدوارق. أضف الماء إلى الدوارق فور تفريغ المزرعة منها (على سبيل المثال، 100 مل). إذا لم يتم حصاد المزرعة في نهاية مرحلة النمو، فرّغ الدوارق عن طريق صب المزرعة بأكملها في وعاء للتخلص من النفايات السائلة يحتوي على تركيز نهائي من المبيض بنسبة 10%، وذلك بعد تسجيل الأنماط الظاهرية للمؤشر الحيوي كما هو موضح في هذا البروتوكول.
تعقيم الدوارق في الموصدة باستخدام دورة السوائل (لمدة لا تقل عن 121 °C عند 15 رطل/بوصة مربعة (psi) لمدة 20 دقيقة مع وجود الماء بالداخل وإغلاق الأغطية.
بعد التعقيم بجهاز الأوتوكلاف، تُغسل الدوارق بمنظف غير أيوني ومنخفض الرغوة، وتُفرك جيداً باستخدام فرشاة فرك ناعمة. تُخصص فرشاة لاستخدامها فقط في غسل الدوارق المستخدمة للزنك (Zn).²⁺-تحديد النمو. تأكد من نظافة الدوارق وخلوها من أي بقايا أو رواسب. لا تفرك الأغطية ولا تستخدم الصابون عليها، بل اشطفها برفق باستخدام الماء منزوع الأيونات.
اشطف الدوارق جيدًا بمياه الصنبور، ثم تتبع ذلك بثلاث شطفات بمياه منزوعة الأيونات (النوع الثاني أو الثالث)، وشطفة واحدة إضافية على الأقل بمياه فائقة النقاء (النوع الأول) (18.2 ميجا أوم-سم عند 25 °C و≤ 5 جزء في المليار من إجمالي الكربون العضوي).
ضع الدوارق عموديًا في وضع مقلوب بحيث لا يتجمع الماء في القاع. لا تستخدم رفوف التجفيف المختبرية القياسية المثبتة على الحائط، لأنها تمسك الدوارق بزاوية مائلة مما يسمح بتجمع كمية صغيرة من الماء. وتكفي رفوف الأواني القياسية لهذا الغرض. اترك الدوارق والأغطية لتجف تمامًا.
بمجرد أن تجف، قم بربط الأغطية على الدوارق وغطِّ الأغطية بورق ألومنيوم. ثبت قطعة من شريط مؤشر التعقيم (autoclave indicator tape) على ورق الألومنيوم للإشارة إلى حالة التعقيم ولحماية مرشحات الأغطية من الغبار.
عقم الدوارق النظيفة بجهاز التعقيم البخاري (أوتوكلاف) (لمدة لا تقل عن 121 °C عند 15 رطل/بوصة مربعة) لمدة 20 دقيقة، يليه تفريغ هوائي بعد الدورة لتجفيف الحمولة (إذا كان جهاز التعقيم مجهزاً بهذه الخاصية). تُخزن الدوارق جافة ومحمية من الغبار.

2. تحضير الوسط المحدود من Zn²⁺ (ZLM)

ملاحظة: استخدم فقط الكؤوس البلاستيكية، والمخابير المدرجة، وأي مستلزمات أخرى لتحضير الأوساط الزرعية. خصص مجموعة من الأدوات المخبرية التي تُستخدم حصرياً لتحضير الأوساط المحدودة من Zn²⁺. اشطف جميع الأدوات المخبرية جيداً بالماء فائق النقاء (النوع I) قبل الاستخدام وبعده. استخدم مواد كيميائية عالية النقاء واشترِها من الموردين أنفسهم قدر الإمكان.

حضّر وسط Sauton المحدود من Zn²⁺ بدون إضافة أملاح Zn²⁺²⁶ عن طريق خلط المواد الكيميائية التالية مع ~950 mL من الماء فائق النقاء في بيكر بلاستيكي سعة 1 L مع قضيب تحريك:
0.5 g من KH₂PO₄ (0.05%; MW: 136.09)
0.5 g من MgSO₄ x 7H₂O (0.05%; MW: 246.48)
2 g من حمض الستريك، اللامائي (0.2%; MW: 192.12)
4 g من L-asparagine، بنسبة 99% (0.4%; MW: 132.12)
60 mL من الجلسرين (6%)
189 µL من سترات الحديديك الأمونيوم بتركيز 1 M (0.005%; MW: 265)
1. أضف الجلسرين باستخدام ماصة سيرولوجية بلاستيكية تستخدم لمرة واحدة سعة 50 mL. اشطف الماصة جيداً عن طريق سحب وسحب السائل للأعلى والأسفل حوالي 10 مرات في الوسط حتى لا يتبقى أي جلسرين بداخلها.
  ملاحظة: الجلسرين عالي اللزوجة ويصعب قياسه. وكبديل لذلك، يمكن صب الجلسرين في مخبار مدرج وشطفه عدة مرات باستخدام حوالي 30 mL من الماء فائق النقاء الذي يُضاف بعد ذلك إلى الأوساط. في حال اتباع هذا النهج، ابدأ بحجم أقل (~600 mL) لضمان ألا يتجاوز الحجم النهائي ~950 mL بعد إضافة الجلسرين ومحاليل الشطف من المخبار المدرج إلى الأوساط.
أكمل حجم الوسط ليصل إلى حوالي 950 mL واخلطه جيداً. يستغرق L-asparagine بضع دقائق ليذوب؛ انتظر حتى تختفي جميع الرقائق البيضاء قبل المتابعة.
ملاحظة: يجعل محلول سترات الحديديك الأمونيوم لون الوسط أصفر فاتحاً.
حضّر 15 mL من محلول NaOH الطازج (~10% w/v) باستخدام الماء فائق النقاء في حاوية بلاستيكية (مثلاً، أنبوب مخروطي سعة 15 mL).
اشطف مقياس pH جيداً بالماء فائق النقاء قبل الاستخدام واغمر بصلة مقياس pH فقط في الوسط. اترك مقياس pH في الوسط مع التحريك اللطيف أثناء ضبط قيمة pH. وباستخدام ماصة نقل بلاستيكية تستخدم لمرة واحدة، أضف محلول NaOH المحضر حديثاً حتى تصل قيمة pH النهائية إلى 7.4.
ملاحظة: تكون قيمة pH الابتدائية للوسط حمضية جداً. يتطلب الأمر حجماً كبيراً من محلول NaOH لرفع قيمة pH إلى النطاق المتعادل. أضف 4-6 mL من محلول NaOH في البداية؛ وبمجرد وصول قيمة pH إلى حوالي 6.5، أضف محلول NaOH قطرة تلو الأخرى. لا تتجاوز قيمة pH المستهدفة وهي 7.4. في حال حدوث ذلك، لا تحاول إعادة الضبط باستخدام HCl أو أحماض أخرى - تخلص من الوسط. من الممارسات الجيدة تخصيص مقياس pH لصنع ZLM وعدم استخدامه لقياس pH أوساط أو محاليل منظمة أخرى قد تلوث المسبار.
انقل الوسط إلى مخبار مدرج وأكمل الحجم النهائي إلى 1 L بالماء فائق النقاء. قم بتعقيم الوسط بالترشيح عبر دورق ترشيح بلاستيكي يستخدم لمرة واحدة بمسامية 0.2 µm.
أضف بطريقة معقمة 2.5 mL من محلول Tween-80 بتركيز 20% المعقم بالترشيح (التركيز النهائي 0.05%). يُحفظ في درجة حرارة 4 °C بعيداً عن الضوء لمدة تصل إلى 6 أشهر.

3. النمو المحدود بـ Zn²⁺ في M. smegmatis

ملاحظة: نظرًا للاختلاف بين الدفعات في كمية Zn²⁺ الموجودة في ZLM، فمن الضروري استخدام الدفعة نفسها من الوسط الغذائي أو عدة أوساط تم خلطها جيدًا لجميع المزارع في التجربة الواحدة. وبالإضافة إلى الوسط الغذائي المطلوب لإعداد المزارع، يلزم توفير حوالي 100 mL إضافية لغسل مزارع البذور ومعايرتها.

يتم تنفيذ جميع الخطوات داخل كابينة السلامة البيولوجية. تُحضّر المزارع البذرية قبل 18 ساعة من بدء تجربة النمو. لا تستخدم مزارع بذرية ذات نمو مفرط أو متكتلة. تكفي مزرعة بذرية واحدة لكل سلالة.
1. أضف بطريقة معقمة 5 mL من وسط 7H9-ADC (مرق Middlebrook 7H9 مع 0.05% Tween 80 وإثراء ADC بنسبة 10% [التركيز النهائي: 0.5% ألبومين مصل بقري، 0.2% ديكستروز، 0.085% NaCl وكاتالاز بنسبة 0.0003% اختيارياً]) إلى أنبوب مفاعل حيوي سعة 50 mL.
2. أضف بطريقة معقمة 10 µL من خلايا مخزون الجلسرين المذابة (المحضرة وفقاً لـ²⁶) مباشرة إلى الوسط. أحكم إغلاق غطاء الأنبوب.
3. ثبت الأنابيب بإحكام في حاضنة هزازة بزاوية 45° تقريباً بحيث يرتفع السائل إلى منتصف الأنبوب تقريباً أثناء الهز.
4. حضن الأنابيب عند 37 °C مع الهز بسرعة 120 rpm لمدة 18 ساعة تقريباً.
افحص المزارع البذرية التي نمت طوال الليل للتأكد من أن المزرعة عكرة بشكل متجانس ولا يوجد بها تكتل ملحوظ. من المثالي أن تكون الكثافة الضوئية عند 600 nm (OD₆₀₀) للمزرعة التي نمت طوال الليل حوالي 0.5-0.8.
قم بترسيب المزارع التي نمت طوال الليل في أنابيب المفاعل الحيوي، المستخدمة للنمو الليلي، عن طريق الطرد المركزي بسرعة 3,000 x g لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
قم بسكب أو سحب السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 5 mL من ZLM. كرر خطوات الطرد المركزي وإعادة التعليق مرتين (2x) لإجراء ثلاث غسلات إجمالاً.
1. خلال خطوات الطرد المركزي، املأ كيوفيت حتى الفيضان بـ 70% إيثانول للتعقيم. اترك الكيوفيت الممتلئة في كابينة السلامة البيولوجية لمدة 10 دقائق ثم اشطفها جيداً 3 مرات باستخدام ZLM بواسطة الماصة.
  ملاحظة: تستغرق عملية توحيد عدد الخلايا وقتاً وتدريباً لتحقيقها بكفاءة. ومن خلال توحيد الخلايا مباشرة في الكيوفيت المعقمة بالإيثانول، يتم تسريع العملية بشكل كبير.
2. حضّر عدداً كافياً من الكيوفيتات بما يتناسب مع عدد السلالات المدرجة في الدراسة؛ على سبيل المثال، يتطلب هذا البروتوكول كيوفيتين معقمتين، واحدة للسلالة البرية وأخرى للطافرة ΔaltRP.
بعد ثلاث غسلات بـ ZLM، أعد تعليق كل راسب خلوي في 2 mL من ZLM.
قم بمعايرة تصفير جهاز مقياس الطيف الضوئي (Blank) باستخدام 600 µL من ZLM في كيوفيت. لا يلزم تعقيم هذه الكيوفيت. ضع الكيوفيت جانباً واستخدمها لتصفير جهاز مقياس الطيف الضوئي قبل توحيد كل مزرعة (أي كل سلالة).
بالعمل مع سلالة واحدة في كل مرة، انقل 600 µL من الخلايا المغسولة من الخطوة 3.5 إلى كيوفيت معقمة محضرة في الخطوة 3.4.1 وقس قيمة OD₆₀₀ الابتدائية. إذا كانت OD₆₀₀ أعلى من 1، انتقل إلى الخطوة 3.8. أما إذا كانت OD₆₀₀ أقل من 1، فاتبع الخطوات الفرعية 3.7.1 و 3.7.2.
1. إذا كانت قراءة OD₆₀₀ الابتدائية من الخطوة 3.7 أقل من 1، اجمع كل المزرعة من داخل الكيوفيت، وأضفها مرة أخرى إلى الخلايا البذرية المغسولة المتبقية في أنبوب الطرد المركزي، وقم بإجراء الطرد المركزي للمزرعة مرة أخرى كما في الخطوة 3.3. أعد تعليق المزرعة في حجم أقل من ذلك المستخدم في الخطوة 3.5 (مثلاً 1 mL) لتحقيق كثافة خلوية أعلى، وكرر الخطوة 3.7.
2. إذا كانت OD₆₀₀ بعد الخطوة 3.7.1 لا تزال أقل من 1، فهذا يعني أن المزرعة ليست كثيفة بما يكفي؛ أعد بدء الإجراء من الخطوة 3.1. حضن المزارع لفترة أطول أو زد كمية اللقاح عند تحضير المزارع الليلية بحيث تكون كثافة المزرعة النهائية بعد الليل حوالي OD₆₀₀ = 0.5-0.8، كما هو موضح في الخطوة 3.2.
احسب حجم ZLM الذي يجب إضافته إلى 600 µL من الخلايا المغسولة في الكيوفيت للحصول على OD₆₀₀ بقيمة 1 باستخدام المعادلة التالية وقيمة OD₆₀₀ المقاسة في الخطوة 3.7:
حجم ZLM (μL) = (OD₆₀₀ الابتدائية - 1) × 600 μL
أضف حجم ZLM المحسوب في الخطوة 3.8 إلى الكيوفيت المحضرة في الخطوة 3.7، واخلط جيداً بالماصة من 5 إلى 10 مرات، ثم أعد قياس OD₆₀₀.
اضبط OD₆₀₀ لتكون ضمن نطاق 5% من OD₆₀₀ = 1 باتباع الخطوات الفرعية المذكورة أدناه. استخدم ماصتين، حيث تخصص إحداهما (مقاس P1000) لخلط المزرعة لتجنب استهلاك عدد كبير جداً من الرؤوس لكل عملية ضبط.
1. إذا كانت OD₆₀₀ أعلى من 1، أضف ZLM قطرة بقطرة (حوالي 50 µL في المرة الواحدة)، واخلط جيداً بسحب ودفع السائل بالماصة 5-10 مرات، وقس OD₆₀₀. كرر هذه العملية حسب الحاجة حتى تصبح المزرعة ضمن نطاق 5% من OD₆₀₀ = 1.
2. إذا انخفضت OD₆₀₀ إلى أقل من 1 أثناء التوحيد، أضف المزيد من الخلايا المغسولة (حوالي 20 µL في البداية) من الخطوة 3.5، واخلط جيداً بسحب ودفع السائل بالماصة 5-10 مرات، وقس OD₆₀₀. كرر هذه العملية حسب الحاجة (أو أضف المزيد من ZLM كما هو موضح في الخطوة 3.10.1 إذا ارتفعت OD₆₀₀ فوق 1) حتى تصبح المزرعة ضمن نطاق 5% من OD₆₀₀ = 1.
3. تأكد من أن الحجم في الكيوفيت لا يتجاوز ~1.5 mL أثناء توحيد الخلايا لتجنب انسكاب المزرعة في مقياس الطيف الضوئي. قم بإزالة جزء من المزرعة من الكيوفيت عند التخفيف إذا لزم الأمر. تأكد أيضاً من أن حجم المزرعة في الكيوفيت أعلى من الحد الأدنى المطلوب لقياس OD₆₀₀ بدقة بواسطة مقياس الطيف الضوئي؛ حيث تتطلب معظم أجهزة مقياس الطيف الضوئي 600 µL على الأقل.
كرر خطوات توحيد الخلايا (3.6 - 3.10) لجميع السلالات والظروف المدرجة في الدراسة.
حضّر العدد الإجمالي من الدوارق المطلوبة للتجربة عن طريق إضافة 50 mL من ZLM بطريقة معقمة إلى دوارق إرلنماير بلاستيكية سعة 250 mL محضرة كما هو موضح في الخطوة 1.
لقّح الدوارق بإضافة 50 µL من المزرعة الموحدة ذات OD₆₀₀ = 1 مباشرة من الكيوفيت للحصول على OD₆₀₀ نهائية تبلغ 0.001 (تخفيف 1:1000 من اللقاح الموحد).
بالنسبة للمزارع التي تنمو بدون تقييد Zn²⁺ (أي الأوساط الغنية بـ Zn²⁺، ZRM)، أضف 30 µL من ZnSO₄ المعقم بتركيز 10 mM (المحضر حديثاً من محلول مخزون معقم بتركيز 1M) مباشرة إلى دوارق المزرعة ليصل التركيز النهائي إلى 6 µM من ZnSO₄.
حضن الدوارق عند 37 °C مع الهز بسرعة 100 rpm لمدة 3 أيام حتى الوصول إلى طور الثبات (اليوم 0 هو يوم التلقيح).
في كل يوم من أيام النمو، استخدم قارئ ألواح دقيقة (microplate reader) يعتمد على أحادي اللون (monochromator) أو مرشح (filter) لقياس مقاييس النمو التالية باستخدام 200 µL من المزرعة في لوح دقيق ذو قاع مسطح بـ 96 بئراً. خذ قراءات اللوح فور توزيع الخلايا لمنع ترسبها.
ملاحظة: لا داعي للتسخين المسبق لقارئ الألواح لأن قيم الفلورة المطلقة ليست مفيدة بقدر النسبة والمسوحات الفلورية، كما أن الحجم الصغير المقاس يتوازن بسرعة مع درجة حرارة الغرفة أثناء تحضير اللوح. يمكن قياس الفلورة من أعلى أو أسفل اللوح إذا كان التكثيف على الغطاء يمثل مشكلة، رغم أن قيم شدة الفلورة تكون أقل بشكل عام عند القراءة من الأسفل.
1. كثافة الخلايا (أي OD₆₀₀): للإبلاغ عن قيمة OD₆₀₀ التي تم الحصول عليها من قارئ الألواح الدقيقة، أنشئ منحنى قياسياً لتحويل القراءة من طول مسار اللوح الدقيق باستخدام حجم محدد (مثلاً 200 µL) إلى طول المسار القياسي 1 cm.
2. فلورة العامل المساعد F₄₂₀ (إثارة 420 nm/انبعاث 475 nm): بالنسبة لقارئات الألواح الدقيقة المعتمدة على المرشحات، استخدم أقرب مجموعة مرشحات (مثلاً إثارة 430 nm/انبعاث 488 nm) وألواح دقيقة سوداء بـ 96 بئراً.
3. قس الفلورة الخلفية عند 375 nm (إثارة 375 nm/انبعاث 475 nm).
4. في حال استخدام أحادي اللون، قم بإجراء مسح لشدة الفلورة من إثارة 230 - 440 nm بخطوات قدرها 5 nm وانبعاث ثابت عند 475 nm.
5. في حال استخدام أحادي اللون، احسب النسبة المئوية لشدة الفلورة عند 375 nm إلى 420 nm باستخدام المعادلة:
  F_375/420 (%) = (F₃₇₅/F₄₂₀) x 100

4. تسجيل وقياس طول الخلية

في اليوم الثالث، يتم فحص وتسجيل طول الخلايا. تُنظف شريحة زجاجية وغطاء شريحة باستخدام منديل خالٍ من الوبر، ثم تُنقل كمية من... بواسطة الماصة. 10 µL ضع قطرة من المزرعة على الشريحة، ثم ضع غطاء الشريحة مباشرة فوق المزرعة. اضغط بلطف على غطاء الشريحة بحيث تتوزع المزرعة وتملأ كامل المنطقة الموجودة أسفله تقريباً. جهز الشرائح وافحصها فوراً لمنع الجفاف.
ملاحظة: إذا لم تنتشر المزرعة بسهولة، فإن الحطام سيمنع التلامس الجيد، كما أن حركة المياه ستؤدي إلى طمس رؤية الخلايا عند ضبط التركيز. في هذه الحالة، قم بتجهيز شريحة جديدة.
باستخدام مجهر مركب (أو مجهر تباين التداخل التفاضلي DIC، انظر أدناه) مع عدسة شيئية غمر زيتية بقوة تكبير 100x وعدسات عينية بقوة 10x (تكبير إجمالي 1000x) وملحق كاميرا، قم بمعاينة الشريحة المُحضرة.
ملاحظة: يسهل رؤية الخلايا بشكل أكبر باستخدام التباين الناتج عن مجهر تباين التداخل التفاضلي (DIC).¹⁰استخدم هذا النوع من المجاهر للحصول على صور عالية الجودة، إن أمكن. أما بالنسبة للتحليل الروتيني والتحقق من Zn²⁺وفي حالة محدودية النمو، يكفي استخدام مجهر ضوئي مركب قياسي.
التقط صوراً لمناطق من الشريحة تحتوي على خلايا متعددة تكون في بؤرة التركيز، وفي المستوى (أي يكون طول الخلية بالكامل مرئياً) وغير متحركة. سجل عدداً كافياً من الصور في مناطق مختلفة من الشريحة (أو عبر شرائح متعددة من المزرعة نفسها) بحيث يتم قياس 100 خلية على الأقل.
باستخدام المجهر والعدسة الشيئية ذاتهما، قم بتصوير شريحة معايرة.
في فيجي²⁷استخدم أداة الخط المستقيم لرسم خط على طول شريحة المعايرة. حدد تحليل > ضبط المقياس وقم بتعبئة المسافة المعروفة ووحدة شريط المقياس. حدد عالمي لتطبيق المقياس على جميع الصور والقياسات المستقبلية.
افتح صورة مجهرية. استخدم أداة الخط المستقيم لرسم خط يمتد على طول الخلية ثم اضغط على مـ المفتاح الموجود على لوحة المفاتيح لقياس الخلية. قم بقياس 100 خلية على الأقل من كل مستنبت.
انسخ بيانات طول النسخ الناتجة في النافذة المنبثقة في برنامج Fiji إلى برنامج جداول بيانات أو احفظها كملف قيم مفصولة بفواصل (.csv) لإجراء التحليل الإحصائي.

5. تعديلات لزراعة بكتيريا M. tuberculosis (Mtb) محدودة الزنك Zn²⁺

ملاحظة: على عكس سلالة Mtb-H37Rv، لا تستطيع سلالة Mtb-Aux تخليق L-leucine و D-pantothenate، لذا تضاف هذه المكملات إلى الأوساط الزراعية²⁸. ولا يؤثر هذا التكميل لسلالة Mtb-Aux على تقييد Zn²⁺، وتظهر كلتا السلالتين أنماطًا ظاهرية متشابهة في وسط ZLM²³. تم تعديل هذا البروتوكول عن بروتوكول منشور سابقاً²³، ويكمن الاختلاف الرئيسي في تنمية المزارع لمدة 8 أيام بدلاً من 10 أيام لتقليل التكتل والسماح بإثراء الخلايا المفردة، وهو أمر ضروري للتطبيقات اللاحقة مثل عدوى الخلايا البلعمية. وبالنسبة للاختلافات الطفيفة الأخرى، يرجى الرجوع إلى المنشور الأصلي²³. وتختلف طريقة التلقيح عن تلك المستخدمة مع M. smegmatis نظراً للحاجة إلى لقاح أعلى بكثير لبدء نمو M. tuberculosis.

بالنسبة لسلالة Mtb-Aux، يتم توفير مكملات إضافية بتركيز 50 µg/mL من L-leucine و 48 µg/mL من D-pantothenate في جميع الأوساط. يتم تعقيم المحاليل المخزنة بتركيز 1000x (بتركيز 50 mg/mL من L-leucine و 48 mg/mL من calcium D-pantothenate) عن طريق الترشيح باستخدام مرشح 0.2 µm، ثم تُضاف إلى الأوساط المعقمة.
أضف بطريقة معقمة 1 mL من خلايا المخزون الغليسيرولي المذابة إلى 4 mL من وسط 7H9-ADC في أنبوب بقاعدة مستديرة وغطاء محكم سعة 14 mL (لسلالة Mtb-Aux) أو أنبوب مفاعل حيوي سعة 50 mL (لسلالة Mtb-H37Rv).
حضن العينات عند 37 °C بدون رج حتى تصل الكثافة الضوئية OD₆₀₀ إلى ~1. ستستغرق هذه العملية حوالي أسبوع واحد. قم بتهوية المزرعة مرة واحدة يومياً عن طريق فتح الأنبوب في كابينة السلامة البيولوجية واستخدام الماصة لعدة مرات لخلط المزرعة.
قم بتلقيح 1 mL من المزرعة الساكنة في 50 mL من وسط 7H9-ADC في دورق بلاستيكي مهوى سعة 250 mL. تكفي مزرعة واحدة بحجم 50 mL في وسط 7H9-ADC لإجراء ثلاث مكررات بيولوجية لكل سلالة وحالة (على سبيل المثال، النوع البري في ZLM و ZRM). احرص على تجنب التكتلات الكبيرة (أي التجمعات الخلوية الكبيرة) عن طريق ترك المزرعة تسكن لمدة 5-10 دقائق قبل التلقيح، مما يسمح للتكتلات بالترسب في قاع الأنبوب، ثم سحب المزرعة من الأعلى.
ملاحظة: التلقيح بتكتلات كبيرة يؤدي إلى الحصول على مزارع متكتلة، مما يؤثر على معايرة المزرعة وقابلية تكرار النتائج.
حضن العينات عند 37 °C مع الرج بسرعة 100 rpm حتى تصل الكثافة الضوئية OD₆₀₀ إلى 0.5-0.8 (مرحلة النمو اللوغاريتمي المتوسطة). ستستغرق هذه العملية من 3 إلى 5 أيام.
انقل المزرعة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 mL وقم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي بسرعة 3,000 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السائل الطافي عن طريق سحب 40 mL باستخدام ماصة سيرولوجية، وإزالة السائل الطافي المتبقي باستخدام ماصة دقيقة P1000.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لتقليل انتقال Zn²⁺ من وسط 7H9-ADC.
أعد تعليق الراسب في 5 mL من ZLM وارفع الحجم الإجمالي للمزرعة إلى 50 mL في الأنبوب المخروطي باستخدام ZLM.
كرر عملية الطرد المركزي بسرعة 3,000 x g لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة لترسيب الخلايا. تخلص من السائل الطافي. أعد تعليق راسب الخلايا ليصل الحجم النهائي إلى 50 mL كما هو موضح في الخطوة 5.7.
قس الكثافة الضوئية OD₆₀₀ للخلايا البذرية المغسولة واحسب الحجم المطلوب للحصول على كثافة ضوئية OD₆₀₀ ابتدائية تبلغ 0.05 (لسلالة Mtb-H37Rv) أو 0.08 (لسلالة Mtb-Aux) في 50 mL باستخدام المعادلة التالية:

ملاحظة: نمو Mtb-Aux عند كثافة ضوئية OD₆₀₀ ابتدائية تبلغ 0.05 يكون غير مستقر؛ لذا تُستخدم كثافة ضوئية OD₆₀₀ أعلى تبلغ 0.08 لضمان نمو متسق.
قم بنقل حجم المزرعة البذرية المحسوب في الخطوة 5.9 إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 mL وارفع الحجم إلى 50 mL باستخدام ZLM. صب المزرعة المغسولة والمعايرة من الأنبوب المخروطي إلى دوارق إرلنماير بلاستيكية محضرّة كما هو موضح في الخطوة 1. كرر العملية باستخدام نفس الأنبوب المخروطي لجميع المكررات البيولوجية لكل سلالة وحالة.
بالنسبة للمزارع التي نمت بدون تقييد Zn²⁺ (أي الأوساط الغنية بـ Zn²⁺، ZRM)، أضف 30 µL من ZnSO₄ المعقم بتركيز 10 mM مباشرة إلى دوارق المزرعة ليصل التركيز النهائي إلى 6 µM من ZnSO₄.
حضن دوارق المزارع عند 37 °C مع الرج بسرعة 100 rpm لمدة 8 أيام. قس الكثافة الضوئية OD₆₀₀ والفلورة F₄₂₀ طوال فترة النمو كما هو موضح في الخطوة 3. تخلص من المزارع إذا كانت متكتلة خلال الأيام القليلة الأولى من النمو (أي أن المزرعة لا تبدو عكرة، وتوجد تكتلات في جميع أنحاء المزرعة).
ملاحظة: من الناحية المثالية، تكون المزارع في الغالب بلانكتونية (أي خالية من التكتلات الكبيرة المرئية بالعين) خلال الأيام القليلة الأولى من النمو. تصبح مزارع Mtb، وخاصة مزارع ZLM، أكثر تكتلاً تدريجياً طوال فترة النمو، ومن المتوقع ظهور تكتلات تطفو على سطح الوسط على شكل رقائق بحلول نهاية المرحلة اللوغاريتمية²³.

النتائج

الأنماط الظاهرية للمؤشرات الحيوية لـ M. smegmatis
تُظهر مستنبتات M. smegmatis من النوع البري التي نُميت في وسط ZLM وحققت نمواً محدود الزنك Zn²⁺ ثلاثة أنماط ظاهرية رئيسية للمؤشرات الحيوية عند مقارنتها بالخلايا التي نُميت في ظروف غنية بالزنك Zn²⁺ وهي: [1] انخفاض في OD₆₀₀، و[2] استطالة الخلايا، و[3] انخفاض ذروة الفلورة عند 420 nm. أما الطفرة التي تفتقر إلى AltRPs (ΔaltRP) فلا تظهر نفس التشكيل المورفولوجي المعتمد على الزنك Zn²⁺ الذي يظهره النوع البري¹⁰^, ويمكن استخدام نمطها الظاهري الفريد في الأوساط المحدودة الزنك Zn²⁺ كمؤشر حيوي تفريقي. لذلك، يجب أولاً تقييم مقاييس المؤشرات الحيوية الثلاثة في النوع البري الذي نُمي في ZRM وZLM. وإذا لوحظ النمط الظاهري المتوقع للنوع البري المحدود الزنك Zn²⁺، يتم بعد ذلك تقييم سلالة الحذف ΔaltRP. إن النمو في ZLM لا يحقق دائماً ظروفاً محدودة الزنك Zn²⁺، وهذا هو السبب الرئيسي للحاجة إلى المؤشرات الحيوية. حيث تؤكد الأنماط الظاهرية الفريدة للمؤشرات الحيوية في النوع البري وΔaltRP الوصول إلى ظروف محدودة الزنك Zn²⁺ ذات صلة بيولوجية. وعندما لا تحقق المستنبتات التي نُميت في ZLM نمواً محدود الزنك Zn²⁺ بسبب تلوث الوسط أو أوعية الاستنبات بالزنك Zn²⁺ (ZLM-C)، تكون هذه الأنماط الظاهرية للمؤشرات الحيوية أقل وضوحاً، كما هو موضح في الشكل 1 و الشكل 2. وعلى العكس من ذلك، إذا كان تركيز الزنك Zn²⁺ في ZLM منخفضاً جداً، فإن النمو يتضرر بسبب استنزاف الزنك Zn²⁺ (ZLM-D)، وهو ما يظهر بوضوح في انخفاض عكارة المستنبت وتغير الأنماط الظاهرية للمؤشرات الحيوية، وهو ما تم تفصيله أيضاً في الشكل 1 و الشكل 2.

تعد كثافة الخلايا مقياساً قوياً لنقص Zn²⁺. تصل المزارع النامية في ZRM باستمرار إلى عكارة عالية (OD₆₀₀ أعلى من 5) بعد 72 h، مع احتمال حدوث تكتل، وتكون أكثر اصفراراً بشكل ملحوظ (البيانات غير معروضة) من المزارع النامية في ZLM (الشكل 1A). يؤدي نقص Zn²⁺ إلى تقييد نمو جميع السلالات (يستدل عليه بانخفاض OD₆₀₀) عند مقارنتها بحالة وفرة Zn²⁺، وتظهر سلالة ΔaltRP كثافة خلوية أقل من النوع البري (الشكل 1A). ينتج عن النمو المحدود بـ Zn²⁺ في ZLM باستمرار OD₆₀₀ أعلى من 3.5 وأقل من 5 في النوع البري وأقل من 3 في سلالة ΔaltRP (الشكل 1A). أما المزارع النامية في ZLM التي تعرضت لتلوث بـ Zn²⁺ (ZLM-C) فتصل إلى كثافة خلوية مماثلة (OD₆₀₀ أعلى من 5) للمزارع الوفيرة بـ Zn²⁺ النامية في ZRM (الشكل 1A). وإذا كان تركيز [Zn²⁺] في ZLM منخفضاً جداً، ستعاني المزارع من استنزاف شديد لـ Zn²⁺ (ZLM-D)، ويتأثر النمو سلباً، كما يتضح من انخفاض كثافة الخلايا في مزارع النوع البري (OD₆₀₀ أقل من 3؛ الشكل 1A). يجب أن تكون كثافة خلايا النوع البري (3.5 < OD₆₀₀< 5) هي أول نقطة فحص للنمط الظاهري للمؤشر الحيوي للتحقق من ظروف نقص Zn²⁺. وينبغي النظر فقط في مزارع النوع البري التي تنمو لتصل إلى كثافة الخلايا المتوقعة، على أن يأتي تحليل سلالة ΔaltRP في المرتبة الثانية بعد التحقق من النمط الظاهري للمؤشر الحيوي المحدود بـ Zn²⁺ في النوع البري.

تكون مستنبتات النوع البري في طور الثبات التي نمت في وسط ZLM المحدود من Zn²⁺ متطاولة بمتوسط طول خلية يبلغ حوالي 9 µm، بينما تكون المستنبتات المكتفية بـ Zn²⁺ والتي نمت في وسط ZRM قصيرة بمتوسط طول خلية يبلغ حوالي 3 µm (الشكل 1B). أما مستنبتات النوع البري التي نمت في وسط ZLM الملوث بـ Zn²⁺ (ZLM-C) فلا تتطاول بشكل كامل، ولكنها تكون أطول قليلاً من الخلايا المكتفية بـ Zn²⁺ بمتوسط طول خلية يبلغ 5 µm. يشير المؤشر الحيوي للتلوث بـ Zn²⁺ في دفعات كاملة من وسط ZLM إلى احتمال حدوث تلوث أثناء التحضير، بينما يشير التلوث في مستنبتات فردية (أي الدوارق) إلى تلوث ناتج عن غسل الدوارق أو تحضير المستنبت بشكل غير صحيح. وبالنسبة لمستنبتات النوع البري التي نمت في وسط ZLM المنضب بشدة من Zn²⁺ (ZLM-D)، فإن التطاول يكون أقل وضوحاً بمتوسط طول خلية يبلغ حوالي 7 µm (الشكل 1B). لا يُلاحظ النمط الظاهري المتطاول للنوع البري في سلالة ΔaltRP، حيث يبلغ متوسط طول خلايا ΔaltRP المحدودة من Zn²⁺ حوالي 5 µm (الشكل 1B). يوضح الشكل 2 صوراً تمثيلية لخلايا نمت في تحضيرات مختلفة من ZLM أو ZRM (وفقاً للخطوة 2) وتم فحصها باستخدام مجهر ضوئي مركب. وبناءً على الخطوة 4، تُستخدم الخلايا من حقول عديدة في صور مماثلة لما هو موضح في الشكل 2 لحساب متوسط طول الخلايا للمستنبتات الموضحة في الشكل 1B. يُعد النمط الظاهري المتطاول للنوع البري خاصاً بظروف تحديد Zn²⁺؛ حيث لا يُلاحظ تطاول الخلايا عندما تكون المستنبتات مكتفية بـ Zn²⁺ أو منضبة بشدة من Zn²⁺ (الشكل 1B و الشكل 2).

يمكن ملاحظة النمط الظاهري للمؤشر الحيوي المتمثل في انخفاض تألق F₄₂₀ بشكل أفضل في عمليات مسح التألق (الشكل 1C). ويتم قياس الانخفاض في التألق الناتج عن العامل المساعد F₄₂₀ عن طريق حساب النسبة المئوية لشدة التألق عند 375 nm (الخلفية) إلى 420 nm (التألق الذاتي من العامل المساعد F₄₂₀) كما هو موضح في الخطوة 3.16.5، ويُمثل بـ F_375/420. وبالنسبة لأجهزة قراءة الأطباق أحادية اللون التي تفتقر إلى القدرة على مسح التألق، فإن القراءات النقطية عند 375 nm و 420 nm (كلاهما بانبعاث عند 475 nm) تكون مناسبة لحساب F_375/420. وتُظهر مزارع النوع البري التي نمت في ظروف وافرة من Zn²⁺ (أي في ZRM) قيم F_375/420 قابلة للتكرار بدرجة عالية حول 17% (الشكل 1D). أما الانخفاض في تألق F₄₂₀ في المزارع المحدودة من Zn²⁺ والنامية في ZLM فيتميز بزيادة في F_375/420 لتصل إلى حوالي 27% (الشكل 1D). ويكون تألق F₄₂₀ في سلالة ΔaltRP المحدودة من Zn²⁺ أقل بشكل ملحوظ من النوع البري في نفس الظروف، وهذا واضح بصرياً في عمليات مسح التألق (الشكل 1C). وتكون قيمة F_375/420 أكثر تغيراً في سلالة ΔaltRP المحدودة من Zn²⁺، حيث تتراوح ما بين 50%-80% تقريباً (الشكل 1D). أما المزارع التي نمت في ZLM ولكنها أظهرت مؤشراً حيوياً على تلوث Zn²⁺ (ZLM-C) فلديها F_375/420 منخفضة تصل إلى حوالي 21%، بينما المزارع المستنفدة من Zn²⁺ (ZLM-D) لديها F_375/420 تصل إلى حوالي 35% (الشكل 1D).

باختصار، يجب تقييم ثلاثة أنماط ظاهرية للمؤشرات الحيوية في سلالات النوع البري وسلالات ΔaltRP للتحقق من حالة نقص Zn²⁺ في المزارع النامية في وسط ZLM. يجب أن تكون المؤشرات الحيوية للنمو المحدود بـ Zn²⁺ ذا الصلة بيولوجياً كما يلي: [1] أن تكون قيمة OD₆₀₀ للنوع البري بين 3.5 - 5، ولِسلالة ΔaltRP أقل من 3، [2] أن يكون طول خلايا النوع البري حوالي 10 µm، وطول خلايا ΔaltRP نصف هذا الطول، و[3] أن تكون قيمة F_375/420 لسلالة ΔaltRP مرتفعة، أي أعلى من 50%.

الأنماط الظاهرية للمؤشرات الحيوية لـ M. tuberculosis
لا تُظهر بكتيريا M. tuberculosis المحدودة بـ Zn²⁺ نفس البرنامج المورفوجيني الذي تظهره M. smegmatis. وتحديداً، لا يوجد فرق في OD₆₀₀ بين المزارع الغنية بـ Zn²⁺ والمزارع المحدودة بـ Zn²⁺، كما لا تُظهر المزارع المحدودة بـ Zn²⁺ أي نمط ظاهري مورفولوجي واضح، أي أنها لا تستطيل²³. وبالمثل، لا يوجد نمط ظاهري لمؤشر حيوي ناتج عن استنزاف Zn²⁺ (أي انخفاض كثافة الخلايا) في M. tuberculosis كما هو ملاحظ في M. smegmatis. وتُظهر المزارع المحدودة بـ Zn²⁺ تكتلاً أكثر وضوحاً مقارنة بالمزارع الغنية بـ Zn²⁺، رغم أن كلتا الحالتين تكونان متكتلتين بشكل ملحوظ بحلول اليوم العاشر (لوحظ ذلك في كل من Mtb-H37Rv وMtb-Aux). ويتمثل النمط الظاهري الرئيسي للمؤشر الحيوي لنقص Zn²⁺ في M. tuberculosis في انخفاض ذروة فلورة F₄₂₀، كما تم الإبلاغ عنه سابقاً²³. وتُعرض هنا نتائج المزارع التي نمت لمدة 8 أيام بدلاً من 10 أيام لتقليل التكتل. ويكون انخفاض فلورة F₄₂₀ واضحاً في المزارع المحدودة بـ Zn²⁺ باستخدام أجهزة قراءة الأطباق أحادية اللون (الشكل 3) وأجهزة قراءة الأطباق المعتمدة على المرشحات. وبالنسبة لأجهزة قراءة الأطباق المعتمدة على المرشحات، وباستخدام Mtb-H37Rv، تمتلك المزارع المحدودة بـ Zn²⁺ (أي التي نمت في ZLM) حوالي 50% من قيم الفلورة الخام مقارنة بالمزارع الغنية بـ Zn²⁺ (أي التي نمت في ZRM؛ البيانات غير معروضة). وباستخدام جهاز قراءة أطباق أحادي اللون، في وضع القراءة السفلية، وبسلالة Mtb-Aux، تمتلك المزارع الغنية بـ Zn²⁺ قيمة F_375/420 تقارب 75%، كما تمتلك مزارع ZLM الملوثة بـ Zn²⁺ قيماً مماثلة. وينعكس انخفاض فلورة F₄₂₀ في المزارع المحدودة بـ Zn²⁺ التي نمت في ZLM من خلال قيمة F_375/420 تزيد عن 100%. وتُظهر سلالة ΔaltRP المحدودة بـ Zn²⁺ نمواً وفلورة F₄₂₀ مماثلين لما لوحظ في النوع البري المحدود بـ Zn²⁺ (الشكل 3)، وبالتالي فهي ليست مفيدة كمؤشر حيوي في M. tuberculosis كما هو الحال في M. smegmatis (الشكل 1). لذا، يُنصح باختبار الأوساط التي ستُستخدم لنمو M. tuberculosis باستخدام بكتيريا M. smegmatis سريعة النمو.

منحنيات النمو، وتوزيع الطول، وتحليل الفلورة في دراسة بكتيرية؛ رسوم بيانية ومخططات صندوقية.
الشكل 1: الأنماط الظاهرية للمؤشر الحيوي لبكتيريا M. smegmatis المنماة تحت ظروف نقص Zn²⁺ وتأثير تلوث Zn²⁺ واستنزاف Zn²⁺ على هذه الأنماط الظاهرية. تمثل الأمثلة النموذجية للنمط الظاهري للمؤشر الحيوي الموضحة في كل لوحة عينات من نفس المزارع عند 72 ساعة. وتأتي أمثلة نتائج النمو الملوثة بـ Zn²⁺ (ZLM-C)، والمحدودة بـ Zn²⁺ (ZLM-L)، والمستنزفة من Zn²⁺ (ZLM-D) من تحضيرات أوساط مستقلة اتبعت جميعها نفس طريقة التحضير الموضحة هنا (الخطوة 2). أما الأنماط الظاهرية النموذجية لسلالات النوع البري وسلالات ΔaltRP المحدودة بـ Zn²⁺ فهي من نفس دفعة ZLM. لجميع السلالات والظروف ثلاث مكررات بيولوجية (n=3). (أ) منحنيات النمو التي توضح الكثافة الضوئية المقاسة عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) وانخفاض كثافة الخلايا مع نقص واستنزاف Zn²⁺. تمثل أشرطة الخطأ الانحراف المعياري بين المكررات. (ب) أطوال خلايا سلالات النوع البري وسلالات ΔaltRP التي توضح النمط الظاهري المستطيل للنوع البري المحدود بـ Zn²⁺. يوضح المخطط الصندوقي والشاربي المسافة بين الربيعين، والحد الأدنى، والحد الأقصى، ومتوسط أطوال الخلايا بوحدة µm. (ج) مسوحات فلورية نموذجية للمزارع تظهر انخفاض ذروة فلورة F₄₂₀ مع نقص Zn²⁺ وانخفاض فلورة F₄₂₀ في سلالة ΔaltRP المحدودة بـ Zn²⁺. تم عرض مزرعة نموذجية واحدة فقط من المكررات البيولوجية الثلاثة في كل من تحضيرات الأوساط المختلفة. تستخدم المسوحات الفلورية نطاق طول موجي للإثارة من 230 نانومتر إلى 440 نانومتر بحجم خطوة 5 نانومتر وطول موجي للانبعاث قدره 475 نانومتر. اللوحة الداخلية الموضحة في أعلى اليسار هي عرض مكبر لسلالات النوع البري وسلالات ΔaltRP المحدودة بـ Zn²⁺ لإبراز انخفاض ذروة الفلورة عند 420 نانومتر في سلالة ΔaltRP المحدودة بـ Zn²⁺. وحدات المحاور هي نفسها في الرسم البياني الرئيسي. جميع الأساطير هي نفسها كما في (أ). (د) تقدير كمي لانخفاض الفلورة من العامل المساعد F₄₂₀، المحسوب من النسبة المئوية لـ F_375/420. تم حساب النسب المئوية من القيم التي تم الحصول عليها من المسوحات الفلورية في (ج). يوضح المخطط الصندوقي والشاربي المسافة بين الربيعين، والحد الأدنى، والحد الأقصى، ومتوسط النسب المئوية. الاختصارات التي تمثل حالة الوسط المتعلقة بـ Zn²⁺ والموضحة بين قوسين بعد نوع الوسط هي: R = وفير بـ Zn²⁺، وC = ملوث بـ Zn²⁺، وL = محدود بـ Zn²⁺، وD = مستنزف من Zn²⁺، والاختصارات الأخرى هي: WT = سلالة النوع البري، a.u. = وحدات اعتباطية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

نتائج الرحلان الكهربائي لحالة Zn²⁺، مقارنة بين WT و ΔaltRP، تحليل فصل البروتين.
الشكل 2: صور مجهرية نموذجية لبكتيريا M. smegmatis عند 72 h. الصور مأخوذة من المزارع الموضحة في الشكل 1. تم تصوير الخلايا باستخدام مجهر ضوئي مركب بتكبير إجمالي 1000x باستخدام عدسة غمر زيتية 100x. أشرطة المقياس تمثل 10 µm. الاختصارات التي تمثل حالة Zn²⁺ في الوسط والموضحة بين قوسين بعد نوع الوسط هي: R = غني بـ Zn²⁺، C = ملوث بـ Zn²⁺، L = محدود بـ Zn²⁺، و D = مستنزف من Zn²⁺، والاختصارات الأخرى هي: WT = السلالة البرية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط طيف إثارة الفلورة؛ الطول الموجي مقابل الفلورة؛ تحليل دراسة البروتين.
الشكل 3: فقدان النمط الظاهري للمؤشر الحيوي F₄₂₀ في بكتيريا M. tuberculosis المحدودة من Zn²⁺ كما هو موضح في مسوحات الفلورة التمثيلية لسلالة Mtb mc²6206 المساعدة في التغذية (Mtb-Aux). أمثلة على نتائج النمو الملوثة بـ Zn²⁺ والمحدودة من Zn²⁺ مأخوذة من تحضيرات أوساط مستقلة. السلالات البرية وسلالات ΔaltRP المحدودة من Zn²⁺ مأخوذة من نفس دفعة ZLM. جميع السلالات والظروف لديها ثلاث مكررات بيولوجية (n=3). يتم عرض مستنبت تمثيلي واحد فقط من المكررات البيولوجية الثلاثة في كل من تحضيرات الأوساط والسلالات المختلفة في الرسم البياني. تم إجراء مسوحات الفلورة باستخدام وضع القراءة السفلية بعد 8 أيام من النمو باستخدام نطاق طول موجي للإثارة من 230 nm إلى 440 nm وبخطوة 5 nm وطول موجي للانبعاث قدره 475 nm. الاختصارات التي تمثل حالة الوسط المتعلقة بـ Zn²⁺ والموضحة بين قوسين بعد نوع الوسط هي: R = غني بـ Zn²⁺، C = ملوث بـ Zn²⁺، L = محدود من Zn²⁺، و D = مستنفد من Zn²⁺، والاختصارات الأخرى هي: WT = السلالة البرية، a.u. = وحدات تعسفية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

المناقشة

تتمثل إحدى المساهمات الرئيسية في الفجوة المعرفية حول الأسس الميكانيكية للريبوسومات البديلة في صعوبة تحقيق ظروف الحد من Zn²⁺ في المختبر. تتبع تلوث Zn²⁺ في بيئة المختبر أمر شائع. وبالتالي ، فإن تحقيق ظروف نمو محدودة Zn²⁺ قابلة للتكرار يمثل تحديا. يمكن أن ينشأ تلوث الزنك²⁺ من عدة مصادر ، على الرغم من أن المصدر الأكثر أهمية وشيوعا للتلوث والتباين هو من المياه فائقة النقاء المستخدمة لشطف أدوات المختبر وصنع الوسائط. يجب صيانة أنظمة المياه فائقة النقاء بشكل صحيح ويجب شطفها لمدة 1 دقيقة قبل شطف أدوات المختبر أو استخدام الماء للوسائط. قد تتسبب القوارير التي لا يتم غسلها أو شطفها جيدا بالماء فائق النقاء في تلوث Zn²⁺ ، وسيكون هذا واضحا من خلال زيادة كثافة الخلايا في قارورة (قوارير) معينة ولكن ليس في قوارير أخرى من نفس دفعة ZLM. يمكن استخدام قوارير جديدة تماما لتقييم ما إذا كان مصدر تلوث Zn²⁺ ناتجا عن قوارير أو وسائط معاد استخدامها. يجب معالجة تلوث Zn²⁺ في ZLM عن طريق زيادة شطف العناصر المستخدمة في صنع الوسائط ومجموعة مخصصة من المواد لتحضير ZLM. إذا لم يثبت أي من هذه المقاييس نجاحا في تحقيق الأنماط الظاهرية المتوقعة للمؤشرات الحيوية ، فيجب قياس [Zn²⁺] في المياه فائقة النقاء و ZLM لاستبعاد احتمال أن يكون مصدر المياه ملوثا بالزنك²⁺. كما ذكرنا سابقا ، فإن [Zn²⁺] من ZLM هو 115 ± 37 نانومتر²³ ، وعادة ما تؤدي التركيزات التي تقل عن 70 نانومتر وأعلى من 150 نانومتر إلى أنماط ظاهرية ملوثة بالزنك²⁺ و Zn²⁺ ، على التوالي. ومع ذلك ، فإن التحضير الجيد للوسائط هو عامل واحد فقط يؤثر على النتيجة ، وقد يحدث عدم كفاية أو مفرط من Zn²⁺ بسبب التحضير غير السليم للتلقيح و / أو الاستزراع ، أي سوء صب الوسائط المليئة بالزنك²⁺ أثناء خطوات الغسيل. تم إعداد جميع مزارع M. smegmatis المدرجة هنا بنفس الطريقة - تم تضمين نتائج نمو Zn²⁺ الملوثة بالزنك (ZLM-C) والزنك²⁺ المستنفدة (ZLM-D) لتسليط الضوء على التباين الذي يمكن أن يحدث بين دفعات مختلفة من الوسائط باستخدام نفس نظام المياه فائق النقاء ، حتى عندما يتم إجراء التجارب بشكل صحيح.

للتأكد من أن زراعة الخلايا في ZLM تنتج أنماطا ظاهرية للمؤشرات الحيوية الملوثة بالزنك²⁺ قابلة للتكرار ، من المهم تسمية القوارير بشكل فريد ، واستخدامها دائما لنفس الحالة (على سبيل المثال ، مع ZLM أو ZRM) ، وتتبع القوارير على استخدامات متعددة والتخلص من القوارير الموجودة في نهاية دورة حياتها ، أو التي تستمر في إنتاج أنماط ظاهرية للمؤشرات الحيوية الملوثة بالزنك²⁺ مع ZLM. يعد التحضير السليم للتلقيح أمرا مهما جدا لتحقيق نمو محدود من Zn²⁺ ، حيث أن ترحيل Zn²⁺ من خلايا البذور المغسولة بشكل غير كاف هو مصدر شائع لتلوث Zn²⁺ الذي قد يكون من الصعب تحليله من Zlm الملوث^{بالزنك 2+}. يجب فحص مزارع M. smegmatis وحصادها بعد 72 ساعة من النمو في ZLM (و ZRM المزروعة بالتوازي). يتم نطق الأنماط الظاهرية للتشكل والمؤشر الحيوي من 48-72 ساعة ؛ لذلك ، فإن تقييم أو حصاد المزارع للحد من Zn²⁺ في وقت مبكر جدا (أو بعد فوات الأوان) قد لا ينتج عنه النمط الظاهري الكامل للمؤشر الحيوي. ستظهر الثقافات المستنفدة في Zn²⁺ أطوال خلايا مشابهة لتلك الملوثة بالزنك²⁺. وبالتالي ، يجب استخدام مضان F₄₂₀ و OD₆₀₀للتمييز بين الاثنين. وبالمثل ، قد لا تنمو الثقافات الملوثة بالزنك²⁺ دائما بشكل أفضل من البكتيريا المحدودة من Zn^{2 +} ، ولكن يجب أن يكشف مضان F₄₂₀ وطول الخلية من النوع البري و ΔaltRP المتحولة عما إذا تم تحقيق حالة Zn^{2 +}-limited.

وينطبق الشيء نفسه على M. tuberculosis ، حيث أن فقدان النمط الظاهري للمؤشر الحيوي F₄₂₀ في المزارع المحدودة Zn^{2 +} واضح بين 8-10 أيام من النمو في ZLM. على الرغم من أن M. tuberculosis لا يظهر نمطا ظاهريا قويا للمؤشر الحيوي المحدود Zn^{2 +} مثل M. smegmatis ، فقد تم استخدام طريقة النمو المعروضة هنا لربط فقدان النمط الظاهري للمؤشر الحيوي F₄₂₀ بالنمو المحدود Zn^{2 +} باستخدام المقايسات الوظيفية والنسخ في كل من السلالات الخبيثة والموهنة من M. tuberculosis (المرجع²³والبيانات غير المنشورة). لذلك ، فإن اتباع مضان F₄₂₀ هو طريقة يمكن الوصول إليها لمراقبة والتحقق من الظروف البيولوجية للزنك²⁺ في مرض السل. من المهم ملاحظة أن الآلية المؤدية إلى انخفاض مضان F₄₂₀ خلال ظروف الحد من Zn²⁺ لا تزال دون حل ، كما هو الحال مع التمييز بين ما إذا كان التألق المنخفض يرجع إلى انخفاض وفرة تجمع الإنزيم المساعد ككل أو تحول في حالة الأكسدة والاختزال لأن الشكل المؤكسد فقط ينبعث منه مضان²⁹.

كما هو موضح هنا ، فإن تحضير الوسائط المحددة للZn²⁺ دقيق ، وهناك العديد من العوامل التي يمكن أن تؤثر على التركيز الفعال لأيونات Zn²⁺ في الوسائط حتى عند اتباع نفس البروتوكول واستخدام نفس الكواشف. تسمح آثار الزنك²⁺ في ZLM بالنمو الكافي والتعبير عن النمط الظاهري المحدد للزنك²⁺. يشبه هذا الانخفاض التدريجي في Zn²⁺ لتحقيق الحد نموذج واين لنقص الأكسجة حيث يتم استهلاك الأكسجين تدريجيا بواسطة البكتيريا المزروعة في قارورة مغلقة³⁰. نظرا لأن كلا من نقص الأكسجة والزنك²⁺ - الأنماط الظاهرية المحدودة تعتمد على نمو البكتيريا ، إذا لم يكن هناك ما يكفي من الأكسجين ، أو في هذا النموذج ، Zn²⁺ ، في اللقاح أو الوسط ، ستتوقف البكتيريا عن النمو قبل أن تتمكن من الخضوع للبرنامج المورفوجيني ذي الصلة. لذلك ، في حين أن تلوث الزنك²⁺ هو مشكلة أكثر وضوحا عندما يرغب المرء في تحقيق الحد من Zn²⁺ ، فإن استنفاد Zn²⁺ يمكن أن يمثل أيضا مشكلة بسبب ضعف النمو وفقدان الزناد المعتمد على Zn²⁺ أثناء النمو النشط. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام قارئات الألواح أحادية اللون أو القائمة على المرشح مع أوضاع القراءة العلوية أو السفلية لشدة التألق يؤثر قليلا على النسبة المئوية F_375/420 المحسوبة. لذلك ، قد لا تكون القيم من كل مختبر قابلة للمقارنة بشكل مباشر مع تلك المعروضة هنا ، ولكن يجب أن تكون متشابهة وتتبع نفس الاتجاهات. وبالتالي ، يجب تحسين طرق وإجراءات صنع ZLM التي تنتج نموا يحد من Zn²⁺ لكل مختبر ونظام مياه فائق النقاء ، ويجب استخدام الأنماط الظاهرية للمؤشرات الحيوية المعروضة هنا كمعيار لتحديد ظروف الحد من Zn²⁺.

نظرا لصعوبة توحيد وإعادة إنتاج ظروف النمو المحدودة Zn²⁺ ، فإن النهج الذي يمكن الوصول إليه للتحايل على تلوث Zn²⁺ هو إضافة عامل مخلب إلى الوسائط المحضرة دون إضافة Zn²⁺. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يربك الاستجابة البيولوجية الحقيقية لقيود Zn²⁺ ، وغالبا ما يخلق بيئة متعطشة للZn²⁺ والمغذيات الدقيقة الأخرى. حتى العوامل المخلبية الخاصة بالزنك²⁺ تظهر أنها تنظم الاستجابة لتجويع الحديد ، بالإضافة إلى استجابة النسخ المعتمدة على Zn²⁺ في M. tuberculosis²³. علاوة على ذلك ، يتطلب استخدام عوامل المخلب معايرة وتوقيت دقيقين لتجنب بيئة متعطشة بشدة للZn²⁺ لا تعكس الاستجابة البيولوجية أثناء التحول من ظروف Zn²⁺ المليئة بالزنك إلى ظروف Zn²⁺ المحدودة أو النمو المستمر في البيئات ذات التوافر الحر المحدود للZn²⁺. أخيرا ، قد لا تكون إضافة عوامل مخلبية متوافقة مع التطبيقات النهائية (على سبيل المثال ، البلاعم أو التهابات). تم استخلاص استنتاجات مختلفة بشكل أساسي حول شكل ووظيفة الريبوسومات البديلة التي تم الحصول عليها باستخدام عوامل مخلبية مقابل النضوب التدريجي^{للزنك 2+} في الثقافات التي تنمو بنشاط¹⁷^،²⁴. يتم تسليط الضوء هنا على الأنماط الظاهرية المختلفة الناتجة عن اختلافات طفيفة نسبيا في نقاء المياه في دفعات مختلفة من الوسائط ، حتى عندما يتم الإجراء بشكل صحيح. يوفر النظام القابل للقياس الكمي والقابل للتكرار وذو الصلة بيولوجيا لتوليد الريبوسومات البديلة المعروضة هنا ، أي في المزارع البرية المحدودة من Zn²⁺ دون إضافة مخلبات ، طريقة موحدة ستكون ذات أهمية قصوى لتوحيد المساهمات عبر المجال نحو فهم أفضل لبيولوجيا الريبوسوم البديلة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من قبل 1844854 جائزة CAREER التابعة لمؤسسة العلوم الوطنية (NSF) ، وجائزة الابتكار لجمعية الرئة الأمريكية IA -937538 ، والمعهد الوطني للصحة (NIH) NIAID R21 AI109293 إلى SP العنوان الحالي ل Allexa D. Burger هو مركز أبحاث العلوم البيولوجية في المحيط الهادئ ، جامعة هاواي في مانوا ، هونولولو ، هاواي ، الولايات المتحدة الأمريكية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أنظمة الترشيح الفراغي 1000 مل ، الخط القياسي	VWR	10040-440
125 مل Erlenmeyer Shaker Flsings	Greiner Bio-One	679501
14 مل أنابيب الثقافة ، بلاستيك ، مع أغطية مزدوجة الموضع	VWR	60818-725
250 مل Erlenmeyer Shaker Flasks	Greiner Bio-One	679502
40X-1000X Lab مركب بيولوجي مجهر مجهر	Omax	M82EZ
50 مل أنابيب التفاعل الحيوي ،	VWR	76211-286
50 مل مع أغطية العلم VWR		89039-656
Alcojet مسحوق التنظيف منخفض الرغوة	Alconox	1404
حديد الأمونيوم (III) سترات ، بني	Thermo Scientific	AAA1119930 ؛	ميغاواط: 265 جم / مول ، لمحلول 1M أضف 1.325 جم إلى 5 مل من الماء عالي النقاء ؛ يخزن محميا من الضوء عند 4 درجات مئوية
ألبومين مصل الأبقار	Thermo Scientific	J10857-A1
الكالسيوم D-Pantothenate	Thermo Scientific	AC243300050
كاتالاز	سيجما ألدريتش	C1345-10G
حامض الستريك اللامائي ، بلوري	فيشر Scientific	BP339-500
سكر العنب اللامائي	فيشر Scientific	D14-500
Difco Middlebrook 7H9 Broth	BD Diagnostics	271310
DiluPhotometer OD600 لتحديد كثافة الخلايا وفحوصات برادفورد	Implen	OD600-10
GENios FL Microplate Reader	Tecan		Discontinued
Glycerol	Fisher Scientific	G33-4
Infinite M200 PRO Multimode Microplate Reader	Tecan	LGE140213-20BL
L-Asparagine	Thermo Scientific	AAB2147336
L-Leucine	Thermo Scientific	A1231122
Macrofire SP CCD camera	Optronics		للاستخدام مع مجهر أوليمبوس
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات	VWR	97062-134
Milli-Q Direct 8 نظام تنقية المياه	Millipore	C85358
Moticam X3	Motic		توقف ، تم استبداله ب Moticam X5 Plus ؛ للاستخدام مع المجهر المركب
حمض الأوليك	الحراري العلمي	031997-14
أوليمبوس BX51 مجهر مستقيم	أوليمبوس		توقف ، تم استبداله بفوسفات البوتاسيوم BX53M
، أحادي القاعدة	فيشر Scientific	BP362-500
شبه مايكرو على الوجهين كوفيت بلاستيكي يمكن التخلص	VWR	97000-590
كلوريد الصوديوم ، الكريستال	VWR	VW1494-01
هيدروكسيد الصوديوم	فيشر Scientific	S318-500 & nbsp ؛
Tween 80	MP Biomedicals	103170
كبريتيد الزنك سباعي الهيدرات ، بلوري / ACS	MP Biomedicals	219145290

أنابيب الطرد المركزي المعقمة منه

المراجع

Alloway, B. Soil factors associated with zinc deficiency in crops and humans. Environ Geochem Health. 31 (5), 537-548 (2009).
Middag, R., de Baar, H. J. W., Bruland, K. W. The relationships between dissolved zinc and major nutrients phosphate and silicate along the GEOTRACES GA02 transect in the west Atlantic ocean. Global Biogeochem Cycles. 33 (1), 63-84 (2019).
Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
Panina, E. M., Mironov, A. A., Gelfand, M. S. Comparative genomics of bacterial zinc regulons: Enhanced ion transport, pathogenesis, and rearrangement of ribosomal proteins. Proc Natl Acad Sci. 100 (17), 9912-9917 (2003).
Outten, C. E., O’Halloran, T. V. Femtomolar sensitivity of metalloregulatory proteins controlling zinc homeostasis. Science. 292 (5526), 2488-2492 (2001).
Merchant, S. S., Helmann, J. D. Elemental economy: microbial strategies for optimizing growth in the face of nutrient limitation. Adv Micro Physiol. 60, 91-210 (2012).
Makarova, K. S., Ponomarev, V. A., Koonin, E. V. Two C or not two C: recurrent disruption of Zn-ribbons, gene duplication, lineage-specific gene loss, and horizontal gene transfer in evolution of bacterial ribosomal proteins. Genom Biol. 2 (9), RESEARCH 0033(2001).
Yutin, N., Puigbò, P., Koonin, E. V., Wolf, Y. I. Phylogenomics of prokaryotic ribosomal proteins. PLoS One. 7 (5), e36972(2012).
Prisic, S., et al. Zinc regulates a switch between primary and alternative S18 ribosomal proteins in Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 97 (2), 263-280 (2015).
Dow, A., Prisic, S. Alternative ribosomal proteins are required for growth and morphogenesis of Mycobacterium smegmatis under zinc limiting conditions. PLoS One. 13 (4), e0196300(2018).
Chen, Y. X., et al. Selective translation by alternative bacterial ribosomes. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19487-19496 (2020).
Natori, Y., et al. A fail-safe system for the ribosome under zinc-limiting conditions in Bacillus subtilis. Mol Microbiol. 63 (1), 294-307 (2007).
Gabriel, S. E., Helmann, J. D. Contributions of Zur-controlled ribosomal proteins to growth under zinc starvation conditions. J Bacteriol. 191 (19), 6116-6122 (2009).
Wolf, Y. I., Rogozin, I. B., Kondrashov, A. S., Koonin, E. V. Genome alignment, evolution of prokaryotic genome organization, and prediction of gene function using genomic context. Genom Res. 11 (3), 356-372 (2001).
Akanuma, G., et al. Evolution of ribosomal protein S14 demonstrated by the reconstruction of chimeric ribosomes in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 203 (10), e00599(2021).
Owen, G. A., Pascoe, B., Kallifidas, D., Paget, M. S. B. Zinc-responsive regulation of alternative ribosomal protein genes in Streptomyces coelicolor involves Zur and σR. J Bacteriol. 189 (11), 4078-4086 (2007).
Li, Y., et al. Zinc depletion induces ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 115 (32), 8191-8196 (2018).
Li, Y., Corro, J. H., Palmer, C. D., Ojha, A. K. Progression from remodeling to hibernation of ribosomes in zinc-starved mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 117 (32), 19528-19537 (2020).
Graham, A. I., et al. Severe zinc depletion of Escherichia coli. J Biol Chem. 284 (27), 18377-18389 (2009).
Greening, C., et al. Physiology, biochemistry, and applications of F420- and Fo-dependent redox reactions. Microbiol Mol Biol Rev. 80 (2), 451-493 (2016).
Gurumurthy, M., et al. A novel F 420 -dependent anti-oxidant mechanism protects Mycobacterium tuberculosis against oxidative stress and bactericidal agents. Mol Microbiol. 87 (4), 744-755 (2013).
Patino, S., et al. Autofluorescence of mycobacteria as a tool for detection of Mycobacterium tuberculosis. J Clin Microbiol. 46 (10), 3296-3302 (2008).
Dow, A., et al. Zinc limitation triggers anticipatory adaptations in Mycobacterium tuberculosis. PLoS Pathogens. 17 (5), e1009570(2021).
Tobiasson, V., Dow, A., Prisic, S., Amunts, A. Zinc depletion does not necessarily induce ribosome hibernation in mycobacteria. Proc Natl Acad Sci. 116 (7), 2395-2397 (2019).
Dow, A., Burger, A., Marcantonio, E., Prisic, S. Multi-omics profiling specifies involvement of alternative ribosomal proteins in response to zinc limitation in Mycobacterium smegmatis. Front Microbiol. 13, 811774(2022).
Singh, A. K., Reyrat, J. Laboratory maintenance of Mycobacterium smegmatis. Curr Protoc Microbiol. Chapter 10, Unit10C.1(2009).
Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
Sampson, S. L., et al. Protection elicited by a double Leucine and Pantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis in Guinea pigs. Infect Immunity. 72 (5), 3031-3037 (2004).
Cheeseman, P., Toms-Wood, A., Wolfe, R. S. Isolation and properties of a fluorescent compound factor420, from Methanobacterium strain M.o.H. J Bacteriol. 112 (1), 527-531 (1972).
Wayne, L. G., Hayes, L. G. An in vitro model for sequential study of shiftdown of Mycobacterium tuberculosis through two stages of nonreplicating persistence. Infect Immunity. 64 (6), 2062-2069 (1996).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

F420 Mycobacterium tuberculosis

استخدام المتفطرة smegmatis كمؤشر حيوي لظروف النمو المحدودة بالزنك في البكتيريا الفطرية