Method Article

استئصال بانيات العظم بوساطة ليزر ثنائي الفوتون في يرقات الزرد النامية

DOI:

10.3791/67279

⸱

September 6th, 2024

 , 
1CRTD - Center for Regenerative Therapies TU Dresden, 2Center for Healthy Aging, Faculty of Medicine, TU Dresden

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نهج الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون الذي يتم إجراؤه في يرقات الزرد ، والذي يعمل كنموذج لدراسة تجديد العظام وتأثيرات الاستجابة المناعية للاستئصال.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع أسماك الزرد (Danio rerio) بقدرة رائعة على تجديد الأعضاء والملاحق المختلفة. تمت دراسة تجديد العظام في أسماك الزرد باستخدام طرق مختلفة مثل بتر الزعانف ، ونتف القشور ، ونقب الجمجمة ، والأساليب المجهرية. باستخدام إعداد المسح بالليزر متحد البؤر المجهز بليزر ثنائي الفوتون ، تم تطوير طريقة الاستئصال بالليزر كنموذج آفة لاستئصال الخلايا المكونة للعظام (بانيات العظم) في الطبقة النامية ليرقات الزرد. تسمح الطريقة الموضحة هنا باستئصال الخلايا بطريقة دقيقة ، حيث يمكن تعديل المساحة والشكل والعمق بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح هذه الطريقة بتصوير المنطقة قبل وبعد الاستئصال مباشرة ، بحيث يمكن تحليل الآثار قصيرة المدى للإصابة. في هذا الإعداد التجريبي ، تمت دراسة الاستجابة المناعية بعد استئصال بانيات العظم في المنطقة المصابة. لوحظت زيادة في تجنيد البلاعم بعد الاستئصال ، مما يشير إلى أهمية وجودها أثناء تجديد العظام.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجدد أسماك الزرد أعضاء متنوعة مثل شبكية العين والدماغ والقلب والبنكرياس1. بالإضافة إلى ذلك ، تجدد أسماك الزرد العناصر الهيكلية ، ولهذا السبب تم استخدامها لدراسة تجديد الزعانف والمقاييس والكالفاريا (أغطية الجمجمة)2. تم استخدام نماذج تجريبية مختلفة لدراسة تجديد الأنسجة والعظام ، مثل استئصال الزعانف (البتر) ، وكسر الزعنفة ، ونقب الجمجمة3،4 ، أو الإصابة بالتبريد5،6 ، أو الاستئصال الجيني7،8،9. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام مناهج الاستئصال بالليزر على نطاق واسع في أسماك الزرد لدراسة استجابة الشفاء والتجديد بعد الإصابة10،11،12،13،14.

تم استخدام الاستئصال بوساطة الليزر في مجالات مختلفة من البحث البيولوجي ، مثل علم الأحياء الميكانيكي ، وعلم الأحياء التنموي ، وأبحاث التجديد ، وجراحةالأورام 10،11،12،15،16،17،18،19. هناك العديد من المنهجيات للاستئصال بالليزر ، مثل استخدام YAG (عقيق الألومنيوم الإيتريوم) أو الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) أو 2p (ثنائي الفوتون)20. يسمح الاستئصال بالليزر بإزالة الخلايا المفردة أو أجزاء أكبر من الأنسجة بطريقة دقيقة للغاية ، مما يتيح دراسة العمليات المختلفة ، مثل استجابة الجهاز المناعي لاستئصال الورم21 أو أثناء تجديد الوخز. في المثال الأخير ، تم تأكيد الاستئصال من خلال اختفاء إشارة الفلوروفور النووية والسيتوبلازمية وتلوين النخر10،22.

من المعروف أن الاستجابة المناعية الفطرية وحركيتها المنظمة ضرورية لتجديد الأنسجة المناسبة. العدلات والضامة هي الخلايا الأولى التي يتم تجنيدها في موقع الإصابة ، حيث تؤدي أدوارا مختلفة ، مثل إطلاق السيتوكين وعامل النمو ، وإزالة الحطام الخلوي ، وإعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية23. كما لوحظ هذا التجنيد ووظائف البلاعم اللاحقة في زعانف الزرد المبتورة24 والأوبركل النامية ، والتي تعرضت ل "تشريح نانوي" بالليزر مما أدى إلى استئصال بانيات العظم10. في التجربة الأخيرة ، لوحظ استعادة عدد بانيات العظم ، والتطور الطبيعي للأوبراكل ، وتجنيد الخلايا المناعية الفطرية (العدلات ، والضامة ، والخلايا الشبيهة بناقضات العظم) في المنطقة المصابة بعد ليزر الأشعة فوق البنفسجية والاستئصال بوساطة الليزر ثنائي الفوتون10. أظهرت التجارب التي أجريت على أسماك الزرد التي تم فيها قمع الجهاز المناعي دوائيا باستخدام الجلوكوكورتيكويد ضعفا في التجدد عند سوء تنظيم المناعة ، مما يدعم الدور الوظيفي للجهاز المناعي في إصلاحالأنسجة 3،10،25،26.

هنا ، يتم وصف منهجية الاستئصال بوساطة الليزر ثنائية الفوتون لدراسة بيولوجيا تجديد العظام في تطوير عظام الزرد. على وجه الخصوص ، يظهر تأثير نهج استئصال بانيات العظم في الأوبركيل من حيث الاستجابة المناعية ، والتي يتم التحقيق فيها من خلال مراقبة تجنيد البلاعم في موقع الاستئصال.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حصل بروتوكول الدراسة على موافقة من Landesdirektion Sachsen ، أرقام التصاريح 25-5131 / 564/2 ، DD25-5131 / 450/4 ، 25-5131 / 496/56 ، DD25.1-5131 / 354/87. تم الحفاظ على سلالات أسماك الزرد المستخدمة وفقا للقانون الوطني وفي ظل ظروف موحدة كما هو موضحسابقا 27،28. تفاصيل جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المواد والحلول

  1. حافظ على الأجنة في وسائط 1x E3. قم بإعداد وسائط 1x E3 عن طريق تخفيف 170 مل من مخزون 60x E3 في 10 لتر من الماء منزوع الأيونات وإضافة 2 مل 0.1٪ ميثيلين بلو.
    1. قم بإعداد مخزون وسائط 60x E3 عن طريق خلط 17.2 جم من كلوريد الصوديوم ، 0.76 جم من KCl ، 2.90 جم من CaCl2 · 2 H2O ، 4.90 جم من MgSO4·7 H2O في 1 لتر من الماء المعقمة منزوع الأيونات.
  2. لتضمين اليرقات ، قم بإعداد حصولات من 1٪ من الاغاروز ذات نقطة الانصهار المنخفضة (LMA) مسبقا واحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة.
    1. لتحضير الحصص ، قم بإذابة LMA في وسائط 1x E3 ، على سبيل المثال ، 500 مجم من LMA في 50 مل من 1x E3 في قارورة Erlenmeyer ، وقم بتسخين المحلول في الميكروويف حتى يذوب الاغاروز تماما ، وقم بتوزيعه على 1 مل في أنابيب سعة 1.5 مل.

2. تربية أسماك الزرد وجمع الأجنة

ملاحظة: تم استخدام يرقات الزرد المعدلة وراثيا المزدوجة التي تبلغ عن وجود بانيات العظم الملتزمة [osterix: nGFP = Tg (Ola.Sp7: NLS-GFP) zf132] 29 والضامة [mpeg: mCherry = Tg (mpeg: mCherry) gl23] هنا30 (الشكل 1 أ).

  1. قم بإعداد سمك الزرد الأبوي مع الجينات المعدلة وراثيا الفردية المرغوبة في أقفاص التزاوج القياسية في المساء السابق للتزاوج.
    ملاحظة: تسمح أقفاص التزاوج القياسية للبيض بالمرور إلى حجرة سفلية حيث لا تستطيع أسماك الزرد الأبوية الوصول إليها.
    1. حافظ على فصل الذكور والإناث حتى التزاوج باستخدام مقسم في قفص التزاوج. قم بإزالة الحاجز في صباح اليوم التالي لبدء التزاوج.
  2. في الظهيرة ، على أبعد تقدير ، قم بإزالة سمك الزرد الأبوي من أحواض التكاثر وجمع الأجنة ، مما يؤدي إلى إجهاد الماء من قفص التزاوج من خلال غربال.
    ملاحظة: في حالة أن العمر الدقيق لليرقات حاسم ، قم بحصاد الأجنة على فترات منتظمة تبلغ حوالي 30 دقيقة. يجب استخدام رفقاء القابض في التجارب مع مجموعات تجريبية مختلفة.
  3. ضع الأجنة في طبق قطره 100 مم يحتوي على 1x E3 واحتفظ بها في حاضنة عند 28 درجة مئوية31.
  4. قم بإزالة البويضات غير المخصبة والأجنة الميتة من الطبق باستخدام ماصة بلاستيكية بمساعدة مجهر مجسم وقم بتغيير وسائط 1x E3 يوميا.
  5. قبل التجربة ، قم بفرز اليرقات الإيجابية للجينات المعدلة وراثيا للمراسل باستخدام مجهر مجسم فلوري.

3. تضمين اليرقات في الاغاروز منخفض الذوبان

  1. قم بإذابة كميات LMA في كتلة حرارية أو حمام مائي عند 65 درجة مئوية. بمجرد ذوبان LMA ، احتفظ به عند 42 درجة مئوية حتى التضمين (الشكل 1 ب). أضف 50 ميكرولتر من 0.4٪ MS-222 إلى 1 مل من LMA المذاب لتحقيق تركيز 0.02٪ MS-222 للتخدير.
  2. تخدير 4 dpf (أيام بعد الإخصاب) يرقات (أو يرقات أقدم) في وسائط 0.02٪ MS-222 E3.
  3. انقل اليرقات المخدرة إلى طبق ميكرو بئر زجاجي القاع باستخدام ماصة باستور بلاستيكية سعة 3 مل وقم بإزالة وسائط E3 الزائدة بنفس الماصة (الشكل 1 ب). تجنب جفاف اليرقات.
    ملاحظة: يمكن تضمين أكثر من يرقة واحدة في طبق في وقت واحد. يوصى بتضمين 3 إلى 5 يرقات لإتاحة الوقت الكافي لوضعها.
  4. خذ أغروز LMA المذاب من الحمام المائي / الكتلة الحرارية وأضف قطرة (تبريد) من LMA إلى الطبق ، وتغطي القاع الزجاجي حيث تم وضع اليرقات. انتبه إلى أن LMA ليس ساخنا جدا ولكنه لا يزال سائلا.
  5. ثم ضع اليرقات في الوضع الجانبي المطلوب قبل أن يتجمد الاغاروز. هنا ، تأكد من وضع جانبي يكون فيه الأوبيركل أقرب ما يمكن إلى القاع الزجاجي للطبق كتحضير لإعداد المجهر العكسي (الشكل 1 ب).
  6. دع الاغاروز يتجمد ثم أضف وسائط E3 (تحتوي على 0.02٪ MS-222 كحد أقصى) إلى الطبق لتجنب تجفيف الاغاروز (الشكل 1 ب).

figure-protocol-1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لإجراء التضمين. (أ) Tg المزدوج المعدلة وراثيا (osterix: nGFP; mpeg1: mCherry) تم استخدام 29،30 يرقات من سمك الزرد مع بانيات عظمية تشغيلية ذات علامة خضراء وضامة تحمل علامة حمراء. (ب) سير عمل إجراء التضمين، على النحو المبين في الخطوة 3 من البروتوكول. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. التصوير في الجسم الحي لليرقات والاستئصال بالليزر

  1. لاستئصال بانيات العظم بالليزر في الأوبركل النامي لأسماك الزرد المعدلة وراثيا Tg (osterix: nGFP; mpeg1: mCherry) 29،30 ، استخدم مجهر مسح ليزر مقلوب ثنائي الفوتون مع هدف مائي 25x / 0.95 أو إعداد مكافئ.
  2. ضع الطبق مع اليرقات المضمنة على المرحلة المجهرية عند المجهر المقلوب وضع المنطقة المطلوبة للاستئصال في وسط مجال الرؤية. يمكن التعرف على الوظيفة بسهولة بمساعدة إشارة مضان GFP.
  3. بمجرد تركيز الوظيفة وتوسيطها في مجال رؤية المجهر ، اختر إعدادات z-stack (غالبا ما يتم استخدام فواصل زمنية z-1-2 ميكرومتر) لتصوير اتساع الوظيفة بالكامل. في الوقت نفسه ، اختر المنطقة في مستوى z معين ليتم استئصاله (عادة في المنطقة الخلفية من الأوبركل). يتم ممارسة الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون فقط في هذا المستوى.
    ملاحظة: ستؤدي الدقة الأعلى في البعد z إلى أوقات تصوير أطول ولكنها ستمكن من إجراء تحليلات حجمية للبيانات المكتسبة لاحقا.
  4. قم بتصوير منطقة الاهتمام قبل الاستئصال. للكشف عن GFP ، استخدم ليزر الضوء الأبيض عند 488 نانومتر وكاشف هجين يتراوح من 495 نانومتر إلى 550 نانومتر أو ما يعادله. قم بتصوير البلاعم باستخدام إثارة 555 نانومتر (ليزر الضوء الأبيض) ، مع نطاق اكتشاف mCherry من 595 إلى 780 نانومتر على كاشف هجين (أو ما يعادله).
    1. استخدم تنسيق الصورة 512 × 512 للحصول على نسبة جودة / وقت جيدة (يمكن استخدام تنسيقات أخرى إذا كانت الدقة الأعلى أو السرعة الأعلى مطلوبة).
      ملاحظة: يمكن استخدام حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها مثبتة في المجهر وتعديلها ، على سبيل المثال ، إلى 28 درجة مئوية.
  5. ارسم منطقة دائرية بقطر 25 ميكرومتر (يمكن تحديد الأشكال والأحجام الأخرى حسب التجربة) في مستوى ثنائي الأبعاد محدد ، مع التركيز على الأوبركل باستخدام أداة عائد الاستثمار.
  6. لإجراء الاستئصال ، قم بتطبيق طاقة الاستئصال (تقاس بدون هدف) عند 450 ميجاوات وقم بتعريض المنطقة المحددة لليزر ثنائي الفوتون بسرعة مسح 400 هرتز ومدة إجمالية تبلغ 10 ثوان. أثناء الاستئصال ، يمكن تصور المنطقة باستخدام كاشف هجين في حدود 401-443 نانومتر أو ما يعادله.
  7. بعد الاستئصال ، قم بتأكيد الاستئصال هيكليا عن طريق تصوير نفس z-stack مرة أخرى بنفس الإعدادات المستخدمة قبل الاستئصال. لم تعد المنطقة المستعصية تحتوي على خلايا فلورية.

5. استعادة اليرقات والتصوير لمراقبة تجنيد الخلايا المناعية

  1. إذا كان من الضروري إجراء تصوير تجنيد الخلايا المناعية مع تأخير ، فاسترجع اليرقات من التصوير والتخدير. قم بإزالة اليرقات بعناية من LMA باستخدام ملقط أو إبرة تشريح.
    1. أولا ، قم بإزالة طبقة من الاغاروز تغطي اليرقات. ثانيا ، قم بإزالة الاغاروز على اتصال مباشر مع اليرقات. احذف هذه الخطوة إذا كان التصوير الفوري لتجنيد الخلايا المناعية قيد البحث.
  2. ضع اليرقات مرة أخرى في طبق به وسائط E3 نقية وتحقق من استعادتها. يتضح الانتعاش من خلال سباحة اليرقات.
  3. عند 4 أو 6 سنوات من الآفة (ساعات بعد الآفة) ، قم بتصوير منطقة الأوبركل مرة أخرى باستخدام نفس الإعدادات في نفس المجهر للتحقق من آثار الاستئصال على تجنيد البلاعم. للقيام بذلك، كرر التضمين (الخطوة 3) والتصوير كما تم إجراؤه من قبل (الخطوة 4).
  4. بعد التصوير ، قم بإزالة اليرقات من LMA. يمكن إجراء التضحية باليرقات إما عن طريق الحضانة في الماء المثلج أو بجرعة زائدة من MS-222 في E3 ، اعتمادا على المتطلبات القانونية. يمكن بعد ذلك استخدام العينات لدراسات المتابعة أو التخلص منها.

6. تحليل الصور والتحليل الإحصائي

  1. قم بمعالجة الصور باستخدام برنامج معالجة الصور مثل Fiji32. اعتمادا على دقة z للبيانات المكتسبة ، يمكن إجراء التحليلات في 2D أو 3D.
  2. قم بتحديد كمية البلاعم يدويا إما عن طريق تضمين الخلايا المنفصلة بوضوح ، مثل تمييز أجسام الخلايا الرئيسية ، أو بدلا من ذلك تحديد الخلايا بملصق نووي أو عن طريق قياس المنطقة في حالة تداخل الخلايا (الخطوة التالية).
  3. لقياس المنطقة ، قم بإنشاء قناع يشمل البلاعم. للقيام بذلك ، استخدم أداة Image > ضبط > Threshold وقم بإنشاء عائد استثمار (تحليل أدوات > > مدير ROI > إضافة) في فيجي. استبعاد الجسيمات الصغيرة في الخلفية للقياس الكمي.
    1. ثم قم بقياس المنطقة (تحليل > القياس). ضع في اعتبارك ما إذا كانت مناطق التألق الخلوي المتداخل بحاجة إلى تضمينها في القياس.
      ملاحظة: هنا ، تم حذف منطقة الاستئصال الدائري من قياسات المنطقة حيث لا يمكن تمييز البلاعم المجندة في هذا المجال.
  4. إنشاء رسوم بيانية ترسم نتائج القياس باستخدام برنامج مناسب. لمقارنة البيانات قبل وبعد الاستئصال ، قم بإجراء اختبار إحصائي مناسب (هنا ، تم إجراء اختبار t أحادي الذيل المزدوج).
    ملاحظة: يمكن إعداد الأشكال باستخدام برامج تحرير الصور والتصميم الجرافيكي.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء الاستئصال بالليزر كما هو موضح في البروتوكول أعلاه. اختفت إشارة GFP لبانيات العظم في المنطقة المستعصية على الفور بعد الاستئصال. لدراسة استجابة استئصال بانيات العظم من حيث الاستجابة المناعية ، تم تصوير وجود الضامة في يرقات 6 dpf قبل وعند 6 hpl. قبل الاستئصال ، لوحظ عدد قليل جدا من البلاعم في منطقة الأوبركل10 (الشكل 2). عند 6 درجات الحرارة ، تم الكشف عن تراكم قوي للبلاعم في منطقة البراعم المفصولة وزيادة عدد البلاعم في مجال الرؤية ، بما في ذلك البراكل والمنطقة المحيطة بالأوبركل، 10 (الشكل 2).

figure-results-1
الشكل 2: تجنيد البلاعم عند 6 هشلون في يرقات 6 dpf من يرقات أسماك الزرد. منطقة Opercle بدون استئصال وعند 6 hpl. يتم تمييز بانيات العظم الجراحية باللون الأخضر ، والضامة باللون الأرجواني ، وتشير الدائرة المتقطعة إلى المنطقة المستعصية بالليزر. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم تحليل تجنيد البلاعم أيضا في 4 يرقات dpf مع عمليات أصغر بكثير عند 4 hpl لملاحظة نتائج مماثلة (الشكل 3). أظهر القياس الكمي لعدد البلاعم (خارج موقع الاستئصال الفوري بالليزر) زيادة في الإطار الزمني الذي تم فحصه (4.00 ± 2.37 ضامة قبل الاستئصال مقابل 7.00 ± 2.76 ضامة عند 4 هكتار) (الشكل 3 ب)). وبالمثل ، زادت مساحة البلاعم (المقاسة بميكرومتر2 ، 785.8 ميكرومتر2 ± 723.1 ميكرومتر2 قبل الاستئصال مقابل 1553 ميكرومتر2 ± 869.9 ميكرومتر2 عند 4 هكتار) (الشكل 3 ج). نظرا لأنه يصعب أحيانا التمييز بين البلاعم ، يوصى بقياس مساحة البلاعم بدلا من رقم البلاعم ، كما حدث هنا.

figure-results-2
الشكل 3: تجنيد البلاعم عند 4 هشلون في 4 يرقات أسماك الزرد dpf. (أ) منطقة الجراحة بدون استئصال وعند 4 درجات حرارة. يتم تمييز بانيات العظم الجراحية باللون الأخضر ، والضامة باللون الأرجواني ، وتشير الدائرة المتقطعة إلى المنطقة المستعصية بالليزر. شريط المقياس: 50 ميكرومتر. (ب) القياس الكمي لعدد الضامة في منطقة البراكل مباشرة قبل (0 hpl) وبعد الاستئصال (4 hpl). (ج) القياس الكمي لمنطقة البلاعم (باستثناء موقع الاستئصال بالليزر). اختبارات t ذات الذيل الواحد. تمثل كل نقطة بيانات يرقة واحدة ، ويظهر متوسط ± SD ، ن = 6. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطبيق الاستئصال بالليزر في مختلف تخصصات البحث البيولوجي. على وجه الخصوص ، كان مفيدا كطريقة لدراسة تجديد الأنسجة10،11،12. على سبيل المثال ، تم مؤخرا تحليل التوظيف وتغيرات النمط الظاهري للخلايا المناعية الفطرية بمرور الوقت باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية أو فحوصات الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون ، جنبا إلى جنب مع استعادة بانيات العظم في موقع الاستئصال بالليزر10. تم إجراء التصوير الحي لتجنيد الخلايا المناعية لمدة تصل إلى 12 ساعة بعد الآفة (hpl). ومع ذلك ، يمكن تصور فترات تصوير أطول من خلال التعديلات المناسبة في التخدير والموافقة من السلطات المعنية. في Geurtzen et al. ، تم إجراء التحليلات لمدة تصل إلى عدة أيام بعد الاستئصال بالليزر وساعدت في تحديد البيئة الالتهابية في موقع الاستئصال ، وكذلك لتحديد الدور الداعم للبلاعم في تجديد العظام10. يمكن تصور العديد من التطبيقات الأخرى ، مثل دراسة دور أنواع الأكسجين التفاعلية التي تطلق33 عند موت الخلايا في أنسجة العظام.

تتمثل إحدى مزايا استخدام استئصال الخلايا بوساطة ليزر ثنائي الفوتون في إمكانية دمجها مع التصوير متحد البؤر. يمكن ضبط البرنامج المستخدم هنا (انظر جدول المواد) على وضع (وضع البيانات الحية) حيث يحدث التصوير والاستئصال على التوالي ، مما يؤدي إلى تسريع العملية. ميزة أخرى للتكنولوجيا هي دقة الاستئصال. يمكن ضبط حجم وشكل الاستئصال بسهولة في البرنامج بطريقة دقيقة للغاية. في الإعداد التجريبي المعروض هنا ، تم اختيار منطقة دائرية بقطر 25 ميكرومتر للاستئصال. ومع ذلك ، استخدمت تجارب الاستئصال الأخرى في ذبابة الفاكهة استئصالات خطية 25 ميكرومتر من أجل تقليل توتر الأنسجة في الظهارة الجنينية عن طريق قطع التقاطعات الخلوية المجاورةوالجار 34. تسمح هذه الدقة باستئصال عدد محدد وخاضع للرقابة من الخلايا أو الخلايا المفردة أو حتى أغشية الخلايا.

والجدير بالذكر أن نوع الآفة التي يتم إجراؤها باستخدام ليزر ثنائي الفوتون لا يشبه الإصابات وموت الخلايا التي تحدث بشكل طبيعي ، والتي يجب وضعها في الاعتبار في أبحاث التجديد ولكن أيضا في التخصصات الأخرى. على وجه الخصوص ، تخلق عمليات الاستئصال بالليزر آفات مركزة للغاية عن طريق تدمير (حرق) الخلايا في المنطقة ذات الأهمية20 مع الحد الأدنى من الضرر في الأنسجة المحيطة ، بينما تميل أنواع الإصابات الميكانيكية أو غيرها من الإصابات إلى التأثير على العديد من أنواع الأنسجة والطبقات على نطاق أوسع. يمكن أن يؤدي هذا إلى عواقب متعددة تنطوي على أنواع مختلفة من موت الخلايا (على سبيل المثال ، النخر ، موت الخلايا المبرمج ، الالتهام الذاتي)35 ونتائج تجديدية مختلفة. علاوة على ذلك ، قد تختلف ردود الفعل على الاستئصال بالليزر من الناحية الخلوية والجزيئية. على سبيل المثال ، تبين أنه على الرغم من أن الخلايا المحيطة بموقع آفة الليزر قد تفقد سلامة غشاء البلازما ، إلا أنها يمكن أن تنجو من الضرر واستعادة السلامة36. يؤدي الاستئصال بالليزر أيضا إلى مناطق من المصفوفة التالفة خارج الخلية ، والتي قد تنتج عن "الانفجارات الحرارية" في وسط شعاع الليزر المطبق وكذلك التعرض القوي للحرارة في الخلايا المجاورةمباشرة 10،37. ومع ذلك ، تظهر الخلايا المحيطة بمواقع الاستئصال بالليزر عددا متزايدا من الأجسام المبرمج ، كما هو موضح في أنسجة القلب المستعصصة بالليزر38 ، ويتم تشغيل استجابة مناعية ، كما هو موضح هنا. بالإضافة إلى الاختلافات الموصوفة ، قد يكون هناك قيد آخر لمقايسات الاستئصال بمساعدة الليزر وهو العمق الذي يمكن أن يتم فيه إجراء الإصابة والحجم المحدود للعينات. قد لا يتم استئصال الهياكل المخبأة في عينات سميكة بشكل مناسب ، وسيكون التصوير صعبا. ومع ذلك ، سيعتمد هذا إلى حد كبير على المجهر والليزر المستخدم ، بالإضافة إلى الهدف والتضمين.

يعد تضمين اليرقات بطريقة بحيث يتم وضع البراكل على مقربة من القاع الزجاجي للطبق أمرا ضروريا في حالة استخدام إعداد مقلوب ، كما هو الحال في البروتوكول المقدم. علاوة على ذلك ، من المهم جدا اختبار درجة حرارة LMA قبل تطبيقه لتغطية اليرقات (الخطوة 3.4) لأن الاغاروز الساخن سيتلف اليرقات. لتجنب ذلك ، خذ كمية LMA من الكتلة الحرارية مبكرا ، على سبيل المثال ، أثناء إزالة وسائط E3 المتبقية من الطبق ذو القاع الزجاجي ، واختبر درجة الحرارة ، مثل جلد المعصم. من المفترض أن يكون LMA دافئا ولكن ليس ساخنا.

بمجرد تغطية اليرقات ب LMA ، من المهم وضعها بسرعة في الموضع الصحيح قبل أن يبدأ LMA في التصلب. الموقف الجانبي هو الأسهل في تحقيقه ؛ في الدراسة المقدمة ، كان الموضع المطلوب جانبيا مع ميل طفيف إلى الجانب البطني. في حالة تصلب LMA قبل وضع اليرقات بشكل صحيح ، فمن الممكن إزالة LMA (كما في الخطوة 5.1) وتكرار التضمين. وبالمثل ، من المهم أن تكون المنطقة المراد تصويرها (واستئصالها بالليزر) قريبة قدر الإمكان من القاع الزجاجي للطبق للحصول على أقصى جودة للصورة واستئصال الخلية ، على الرغم من أن هذا سيعتمد أيضا على مسافة العمل للهدف.

من الممكن تضمين أكثر من يرقة في نفس الطبق للتصوير. سيوفر هذا الوقت ويستفيد بشكل أفضل من LMA. يعتمد عدد اليرقات التي يمكن تضمينها على خبرة المجرب ، ولكن يوصى باستخدام 3-5 يرقات.

يمكن أيضا إجراء الاستئصال بالليزر باستخدام إعدادات مجهرية منتصبة باستخدام عدسات الغمس. في هذه الحالة ، من المهم تضمين اليرقات برؤية بطنية طفيفة (من الأعلى) لتمكين جودة تصوير جيدة ونجاح الاستئصال بالليزر للأوبركل. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن تغطي طبقة رقيقة فقط من LMA اليرقات للسماح بالإثارة الجيدة واكتشاف إشارات الفلورسنت.

في هذا البروتوكول ، يتم وصف إعداد الاستئصال بوساطة الليزر ثنائي الفوتون لبانيات العظم على أنه منهجية لأداء الآفات في العظام النامية ، وتحديدا في الوبركل. يمكن تكييف هذه الطريقة لاستئصال الخلايا في العظام الأخرى لأسماك الزرد النامية. علاوة على ذلك ، من المفيد بشكل عام دراسة تجديد الأنسجة المصابة11،12. تسمح سهولة إجراء عمليات الاستئصال وقطع الأنسجة بأحجام وأشكال مختلفة باستخدامه في مختلف الإعدادات التجريبية والمجالاتالبحثية 15،17،18،19،21،34. إجمالا ، يعد الاستئصال بوساطة الليزر ثنائي الفوتون طريقة قابلة للتكيف للغاية - لمختلف الأنسجة والكائنات الحية وحتى في المختبر - وتمثل أداة مهمة في البحث البيولوجي.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) Transregio 67 (المشروع 387653785) ، DFG SPP 2084 μBone (مشروع KN 1102 / 2-1) إلى FK. تم دعم هذا العمل من قبل مرفق الفحص المجهري الخفيف (DFG project 413875620) ، وهو مرفق أساسي لمنصة CMCB التكنولوجية في TU Dresden. تم تمويل العمل في TU Dresden بشكل مشترك مع عائدات الضرائب بناء على الميزانية التي وافق عليها البرلمان السكسوني ("Landtag").

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم, CaCl2& middot; H2< / sub>OCarl Roth5239.1
طبق ثقافة الخلية ، PS ، 100/20 ممGreiner Bio-one664160
Dumont # 55 FocepsFST11295-51شكل طرف مستقيم ، 11 سم ، 0.05 × 0.02 مم
Falcon 6-well لوحةCorning353502
طبق ميكروويل زجاجيقاع MatTekP35G-1.5-14-Cطبق 35 مم ، رقم 1.5 غطاء ، قطر زجاج 14 مم ، ليزر غير مصقول
Insight X3Spectra-Physics
Leica Application SuiteLAS X ، Leica Microsystems
Low ذوبان agarose   ؛Biozyme840101Biozym Plaque Agarose
كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات ، MgSO4< / sub> & middot ؛ 7H2< / sub>OSigma-AldrichM5921
أقفاصالعديد من الأصناف ، على سبيل المثال Tecniplast
MethyleneblueCarl RothA514.1
MS-222SIGMA AldrichA5040
كلوريد البوتاسيوم ، KClPanReac AppliChem131494 كلوريد
الصوديوم ، كلوريد الصوديوم كارلروث3957.1
SP8 FALCON Leica Microsystemsمجهزة بليزر Insight X3 متعدد الفوتون وبرنامج Leica Application Suite
إبرة تشريح الفولاذ المقاومBochem12010140 مم
SZX16Olympusمجهزة بقاعدة إضاءة LED خزانات ثرموستاتي SZX2-ILLTQ
TS - WTWxylemTS 608 / 2-iللحضانة (الجنين)
ماصة ، 3.5 مل861171 SARSTEDT155 × 15 مم ، LD-PE ، Zeiss
SteREO Discovery.V12 الشفاف الإصدار 4.7.1.0.زايسمجهزة بكاميرا Axiocam MRm وبرامج AxioVision
التزاوج للصدأ نظام مجهر ستيريو النقل

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Marques, I. J., Lupi, E., Mercader, N. Model systems for regeneration: Zebrafish. Dev. 146 (18), dev167692(2019).
  2. Dietrich, K., Fiedler, I. A. K., Kurzyukova, A. Skeletal biology and disease modeling in zebrafish. J Bone Miner Res. 36 (3), 436-458 (2021).
  3. Geurtzen, K., Knopf, F. Adult zebrafish injury models to study the effects of prednisolone in regenerating bone tissue. J Vis Exp. (140), e58429(2018).
  4. Sousa, S., Valerio, F., Jacinto, A. A new zebrafish bone crush injury model. Biol Open. 1 (9), 915-921 (2012).
  5. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  6. Chassot, B., Pury, D., Jaźwińska, A. Zebrafish fin regeneration after cryoinjury-induced tissue damage. Biol Open. 5 (6), 819-828 (2016).
  7. Singh, S. P., Holdway, J. E., Poss, K. D. Regeneration of amputated zebrafish fin rays from de novo osteoblasts. Dev Cell. 22 (4), 879-886 (2012).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. Ando, K., Shibata, E., Hans, S., Brand, M., Kawakami, A. Osteoblast production by reserved progenitor cells in zebrafish bone regeneration and maintenance. Dev Cell. 43 (5), 643-650.e3 (2017).
  10. Geurtzen, K., López-Delgado, A. C., Duseja, A., Kurzyukova, A., Knopf, F. Laser-mediated osteoblast ablation triggers a pro-osteogenic inflammatory response regulated by reactive oxygen species and glucocorticoid signaling in zebrafish. Dev. 149 (8), 1998030(2022).
  11. Volpe, B. A., Fotino, T. H., Steiner, A. B. Confocal microscope-based laser ablation and regeneration assay in zebrafish interneuromast cells. J Vis Exp. (159), e60966(2020).
  12. Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. Laser ablation of the zebrafish pronephros to study renal epithelial regeneration. J Vis Exp. (54), e2845(2011).
  13. Goldstein, A. M., Fishman, M. C. Notochord regulates cardiac lineage in zebrafish embryos. Dev Biol. 201 (2), 247-252 (1998).
  14. Zhang, J., Jeradi, S., Strähle, U., Akimenko, M. A. Laser ablation of the sonic hedgehog-a-expressing cells during fin regeneration affects ray branching morphogenesis. Dev Biol. 365 (2), 424-433 (2012).
  15. Marshall, A. R., et al. Two-photon cell and tissue level laser ablation methods to study morphogenetic biomechanics. Methods Mol Biol. 2438, 217-230 (2022).
  16. Angelo, J. R., Tremblay, K. D. Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development. Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).
  17. Lee, J., Lee, S., Truong, V. G., et al. Laser ablation of pancreatic cancer using a cylindrical light diffuser. Lasers Med Sci. 37 (6), 2615-2621 (2022).
  18. Luther, E., Mansour, S., Echeverry, N., et al. Laser ablation for cerebral metastases. Neurosurg Clin N Am. 31 (4), 537-547 (2020).
  19. Smutny, M., Behrndt, M., Campinho, P., Ruprecht, V., Heisenberg, C. -P. UV laser ablation to measure cell and tissue-generated forces in the zebrafish embryo in vivo and ex vivo. Methods Mol Biol. 1189, 219-235 (2015).
  20. Vogel, A., Venugopalan, V. Mechanisms of pulsed laser ablation of biological tissues. Chem Rev. 103 (2), 577-644 (2003).
  21. Wu, F. Heat-based tumor ablation: Role of the immune response. Adv Exp Med Biol. 880, 131-153 (2016).
  22. Renvoizé, C., Biola, A., Pallardy, M., Bréard, J. Apoptosis: Identification of dying cells. Cell Biol Toxicol. 14 (2), 111-120 (1998).
  23. Julier, Z., Park, A. J., Briquez, P. S., Martino, M. M. Promoting tissue regeneration by modulating the immune system. Acta Biomater. 53, 13-28 (2017).
  24. Petrie, T. A., Strand, N. S., Tsung-Yang, C., Rabinowitz, J. S., Moon, R. T. Macrophages modulate adult zebrafish tail fin regeneration. Dev. 141 (13), 2581-2591 (2014).
  25. Geurtzen, K., Vernet, A., Freidin, A. Immune suppressive and bone inhibitory effects of prednisolone in growing and regenerating zebrafish tissues. J Bone Miner Res. 32 (12), 2476-2488 (2017).
  26. Fleischhauer, L., López-Delgado, A. C., Geurtzen, K., Knopf, F. Glucocorticoid effects in the regenerating fin reflect tissue homeostasis disturbances in zebrafish by affecting Wnt signaling. Front Endocrinol. (Lausanne). 14, 1122351(2023).
  27. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. https://books.google.de/books?id=Iy8PngEACAAJ (2002).
  28. Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. (2002).
  29. Spoorendonk, K. M., Peterson-Maduro, J., Renn, J. Retinoic acid and Cyp26b1 are critical regulators of osteogenesis in the axial skeleton. Dev. 135 (22), 3765-3774 (2008).
  30. Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A. mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish. Blood. 117 (4), e49-e56 (2011).
  31. JoVE Science Education Database. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
  32. Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Niethammer, P., Grabher, C., Look, A. T., Mitchison, T. J. A tissue-scale gradient of hydrogen peroxide mediates rapid wound detection in zebrafish. Nature. 459 (7249), 996-999 (2009).
  34. Blanchard, G. B., Scarpa, E., Muresan, L., Sanson, B. Mechanical stress combines with planar polarised patterning during metaphase to orient embryonic epithelial cell divisions. Dev. 151 (10), dev202862(2024).
  35. Park, W., Wei, S., Kim, B. -S., et al. Diversity and complexity of cell death: A historical review. Exp Mol Med. 55 (8), 1573-1594 (2023).
  36. O'Connor, J., Akbar, F. B., Hutson, M. S., Page-McCaw, A. Zones of cellular damage around pulsed-laser wounds. PLoS One. 16 (9), e0253032(2021).
  37. Griebel, M., Vasan, A., Chen, C., Eyckmans, J. Fibroblast clearance of damaged tissue following laser ablation in engineered microtissues. APL Bioeng. 7 (1), 16112(2023).
  38. Matrone, G., Taylor, J. M., Wilson, K. S. Laser-targeted ablation of the zebrafish embryonic ventricle: a novel model of cardiac injury and repair. Int J Cardiol. 168 (4), 3913-3919 (2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Two Photon AblationOsteoblast AblationZebrafish LarvaeBone RegenerationConfocal MicroscopyMacrophage RecruitmentImmune ResponseOpercle ImagingLow Melting AgaroseTransgenic Zebrafish

Related Articles