مقالة منهجية

قياس أربعة أنواع فرعية من الخلايا القاتلة الطبيعية الرحمية باستخدام تلطيخ كيميائي مناعي فلوري متعدد الإرسال لدى النساء المصابات بفشل الزرع المتكرر

DOI:

10.3791/67284

⸱

أكتوبر 25, 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynaecology, Faculty of Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 2Department of Pathology, School of Clinical Medicine, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital, 3Reproduction and Development Laboratory, Li Ka Shing Institute of Health Sciences, The Chinese University of Hong Kong, 4School of Biomedical Sciences, Prince of Wales Hospital, The Chinese University of Hong Kong, 5Chinese University of Hong Kong - Sichuan University Joint Laboratory in Reproductive Medicine, The Chinese University of Hong Kong, 6Laboratory for Reproductive Immunology, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University, 7NHC Key Lab of Reproduction Regulation, Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, Fudan University, 8Shanghai Key Laboratory of Female Reproductive Endocrine Related Diseases, Hospital of Obstetrics and Gynecology, Fudan University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الدراسة طريقة رائدة لقياس المجموعات الفرعية للخلايا القاتلة الطبيعية للرحم أثناء فترة الزرع باستخدام تقنيات تلطيخ كيميائية مناعية فلورية متقدمة متعددة الإرسال.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تلعب الكيمياء المناعية (IHC) دورا مهما في البحث البيولوجي والتشخيص السريري ، حيث تعمل كالطريقة الأكثر استخداما لتحديد مستضدات الأنسجة وتصورها. ومع ذلك ، فإن طرق تلطيخ IHC التقليدية لها قيود في التمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا المناعية. دفع هذا التحدي العلماء إلى استكشاف تقنيات ومنهجيات جديدة للتحديد الدقيق والتمييز الدقيق للأنواع الفرعية للخلايا المناعية. في السنوات الأخيرة ، ظهر تعدد الإرسال IHC كحل ، مما يتيح الكشف المتزامن عن مستضدات متعددة وتصورها داخل نفس عينة الأنسجة. تلعب الخلايا القاتلة الطبيعية للرحم (uNK) دورا محوريا في عمليات الحمل المبكرة ، بما في ذلك إزالة الولادة ، وإعادة تشكيل الشرايين الحلزونية الرحمية ، وزرع الأجنة. تظهر أنواع فرعية مختلفة من خلايا uNK وظائف مختلفة ، مما يسمح لها بتنسيق الأحداث البيولوجية المختلفة لنمو الجنين الناجح والحمل. لذلك ، يعد البحث المتعمق حول الأنواع الفرعية لخلايا uNK ضروريا لتوضيح آليات تنظيم المناعة أثناء الحمل. توفر هذه الدراسات رؤى قيمة ومناهج جديدة لمعالجة الحالات ذات الصلة مثل العقم والفشل الإنجابي المتكرر. تقدم هذه الورقة بروتوكول تلطيخ IHC متعدد الإرسال مفصل لدراسة كثافة أربعة أنواع فرعية من خلايا uNK في عينات بطانة الرحم أثناء نافذة الزرع (WOI). يتضمن البروتوكول إعداد العينة ، وتحسين علامات النوع الفرعي ، والتصوير المجهري ، وتحليلات البيانات. يوفر بروتوكول تلطيخ IHC متعدد الإرسال هذا خصوصية وحساسية عالية ، مما يتيح الكشف المتزامن عن أنواع فرعية مختلفة من خلايا uNK ، وبالتالي تزويد الباحثين بأداة قوية لاستكشاف تعقيدات وآليات تنظيم المناعة أثناء الحمل.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الإبلاغ عن أول ولادة حية موثقة بعد الإخصاب في المختبر ونقل الأجنة (IVF-ET) في عام 1978. على مدار الأربعين عاما الماضية ، كان هناك طلب كبير على مساعدة أطفال الأنابيب بين الأزواج المصابين بالعقم1. في عام 2021 ، بدأ 238,126 مريضا ما مجموعه 413,776 دورة أطفال الأنابيب في الولايات المتحدة. هذا يمثل زيادة بنسبة 25٪ في الدورات عن عامين سابقين وزيادة بنسبة 135٪ عن عام 20122. وتعزى هذه الزيادة بشكل أساسي إلى ارتفاع معدل انتشار العقم وتأخر التخطيط للحمل. أدت التطورات في تقنيات زراعة الأجنة وبروتوكولات الإباضة الزائدة إلى زيادة معدل المواليد الأحياء لكل دورة ET ، حيث وصلت إلى 30٪ -50٪ في النساء دون سن 40 عاما وأقل من 30٪ في النساء الأكبر من 40 عاما2. ومع ذلك ، على الرغم من هذه التطورات ، لا يزال أكثر من نصف الأجنة المنقولة تفشل في الزرع. يؤثر فشل الزرع المتكرر (RIF) ، الذي يعرف عادة بأنه فشل بعد ثلاث محاولات متتالية أو أكثر لنقل أجنة عالية الجودة ، على 15٪ من النساء اللواتي يخضعن لعملية التلقيح الاصطناعي- ET 3. الأزواج المصابون ب RIF معرضون للغاية للخضوع لإجراءات باهظة الثمن وغير ضرورية يمكن أن تعرضهم لمخاطر لا داعي لها4. لذلك ، فإن فهم أسباب RIF وتحسين زرع الأجنة أمر بالغ الأهمية لتعزيز نجاح التلقيح الاصطناعي - ET ، خاصة بالنسبة للنساء المصابات ب RIF. يعد تحضير بطانة الرحم أمرا بالغ الأهمية لنجاح زرع الجنين. تتميز هذه العملية بتراكم كبير للخلايا القاتلة الطبيعية للرحم (uNK) ، والتي تنتقل من تشكيل 30٪ من إجمالي الخلايا الليمفاوية في بطانة الرحم خلال المرحلة المتوسطة للإفراز إلى 70٪ -80٪ في الطبقة القاتلة أثناء الحملالمبكر 5. والجدير بالذكر أن خلايا uNK تختلف عن الخلايا القاتلة الطبيعية المحيطية ، وهي خلايا ليمفاوية سامة للخلايا ضرورية لجهاز المناعة الفطري للتسبب في موت الخلايا المصابة من خلال التحلل أو موت الخلايا المبرمج. في حين أن الوظائف الدقيقة لخلايا uNK ليست مفهومة تماما بعد ، تشير عدة خطوط من الأدلة إلى أنها متورطة في إعادة تشكيل تكوين الأوعية الدموية ، وغزو الأرومة الغاذية ، ونمو الجنين6. اكتسب الارتباط بين النسبة المئوية لخلايا uNK على الخلايا اللحمية و RIF جاذبية واسعة النطاق على مدار العشرين عاما الماضية. أظهر تحليل تلوي حديث ، شمل 8 دراسات شملت 604 امرأة ، أن كثافة خلايا CD56 + uNK خلال المرحلة الصفراء المتوسطة تزداد بشكل كبير في النساء المصابات ب RIF مقارنة بالضوابط الخصوبة7. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن خصائص خلايا uNK خلال المرحلة الصفرية الأصفرية تختلف اختلافا كبيرا عن خصائص خلايا الخلايا القاتلة الطبيعية (dNK). على الرغم من أن خلايا uNK قد تتمايز بشكل أكبر إلى مجموعات فرعية مختلفة من خلايا dNK بعد الحمل ، إلا أن قياس خلايا uNK وحدها لا يمثل بدقة خلايا dNK8. تخضع خلايا uNK للتمايز الديناميكي وتلعب أدوارا مختلفة في الدورة الشهرية وعمليات إزالة الانبعاثات ، مما يجعلها أكثر تعقيدا مما يمكن تحديده بواسطة CD56 وحده. مطلوب علامات متعددة لتحقيق فهم شامل لسلوك خلايا uNK أثناء تحضير بطانة الرحم. استخدمت دراستنا الحديثة تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية لتحديد تنوع خلايا uNK طوال دورات الحيض. أظهرت النتائج ، التي تم التحقق من صحتها باستخدام قياس التدفق الخلوي ، وجود أربعة أنواع فرعية متميزة من خلايا uNK ، كل منها يظهر تغيرات ديناميكية خلال الدورة الشهرية9. يشير تحليل التخصيب الجيني والإثراء الوظيفي لعلم الأنطولوجيا الجيني إلى أن هذه المجموعات الفرعية uNK تؤدي وظائف مختلفة في مراحل مختلفة من الحيض. ومع ذلك ، فإن قياس التدفق الخلوي لا يمكن الوصول إليه عالميا في المختبرات السريرية ، كما أن المعالجة الفورية لأنسجة بطانة الرحم الطازجة لهضم الإنزيم تجعل من المستحيل تكرار الخطوات التجريبية عند الأخطاء.

لذلك ، كان الهدف من هذه الدراسة هو التحقيق في قياس هذه المجموعات الفرعية الأربعة لخلايا NK باستخدام مقايسة تلطيخ متعددة الإرسال ، والتي توفر نهجا تشخيصيا أكثر عملية. في التلوين المتعدد ، ترتبط الأجسام المضادة المحددة المختلفة ضد كل هدف بملصقات فلوروفور مختلفة تنبعث منها أطوال موجية مختلفة من الضوء عند إثارتها بطول موجي معين من الضوء. بالمقارنة مع طريقة تلطيخ IHC التقليدية ، يمكن لهذه الطريقة مقارنة الوفرة النسبية وتوزيع الأهداف المتعددة في عينة من الناحية الكمية وتوفير معلومات حول التفاعل والتوطين المشترك للأهداف المختلفة ، مما يمكننا من تحديد أنواع فرعية مختلفة من خلايا uNK. لن يؤدي هذا النهج إلى تعميق فهمنا للعلاقة بين خلايا uNK و RIF فحسب ، بل سيوفر أيضا رؤى للتحقيق في مجموعات الخلايا المناعية الفرعية الأخرى في الأمراض المرتبطة ببطانة الرحم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الدراسة من قبل لجنة أخلاقيات البحث السريري العنقودي الشرقي المشتركة بين الجامعة الصينية في هونغ كونغ والأقاليم الجديدة (رقم مرجع CREC: 2022.581). تم تعيين النساء المصابات ب RIF من مركز تكنولوجيا المساعدة على الإنجاب ، مستشفى أمير ويلز ، جامعة هونغ كونغ الصينية. تم تعريف RIF على أنه الفشل في تحقيق الحمل السريري بعد نقل ما لا يقل عن 4 أجنة ذات نوعية جيدة في 3 دورات جديدة أو مجمدة على الأقل في امرأة تقل أعمارها عن 40 عاماو 10 سنوات. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المشاركين قبل جمع خزعات بطانة الرحم.

1. الحصول على عينات بطانة الرحم ومعالجتها

  1. توقيت جمع عينات بطانة الرحم
    1. جمع عينات بطانة الرحم باتباع بروتوكول صارم لضمان الاتساق بين المشاركين في الدراسة. بالنسبة للمرضى الذين يعانون من دورات طبيعية ، قم بإجراء تحليل البول من اليومالتاسع من الدورة الشهرية وإجراء خزعة بطانة الرحم في اليومالسابع بعد زيادة الهرمون اللوتيني (LH + 7) 11 . بالنسبة للمرضى الذين يخضعون لدورات العلاج بالهرمونات البديلة (HRT) ، قم بإعطاء 6 ملغ من استراديول فاليرات عن طريق الفم يوميا بدءا من اليوم 2 من الدورة الشهرية.
    2. تقييم سمك بطانة الرحم عن طريق التصوير بالموجات فوق الصوتية في اليوم 13 من الدورة الشهرية. عندما يصل سمك بطانة الرحم إلى 8 مم أو يتجاوزه، يتم تطبيق هرمون البروجسترون عبر المهبل وإجراء خزعة بطانة الرحم بعد 5 أيام من إعطاء هرمون البروجسترون12.
  2. جمع عينات بطانة الرحم وتثبيتها: إدخال أخذ عينات من الماصة في تجويف الرحم ، ودفعها إلى منطقة القاع ؛ ضعي الشفط عن طريق سحب المكبس الداخلي لأسفل ، وكشط سطح بطانة الرحم في نفس الوقت من خلال الحركات الدورانية والرأسية داخل تجويف الرحم. اشطف العينات التي تم جمعها بمحلول ملحي عادي للتخلص من إفرازات عنق الرحم والرحم. قياس العينات وتقييم الحجم. للحصول على عينات 3 مم × 15-25 مم ، اغمرها على الفور في 10 مل من الفورمالين المحايد 10٪ وقم بإصلاحها في درجة حرارة الغرفة لمدة 24-48 ساعة.
  3. الجفاف: عند الانتهاء من التثبيت ، قم بإخضاع العينات لتسلسل الجفاف المصمم لاستبدال الماء بالإيثانول. للقيام بذلك ، اغمر الأنسجة في حمامات الإيثانول بنسبة 70٪ و 80٪ و 100٪ لضمان الجفاف الكامل. بعد حمام الإيثانول النهائي ، قم بمسح العينات في الزيلين لإزالة أي كحول متبقي وإعدادها لتسلل البارافين.
  4. التضمين: بعد وضع الأنسجة بشكل مسطح في قاع القالب ، قم بإذابة البارافين وإضافته بعناية إلى العينات للتأكد من أن أنسجة بطانة الرحم مغلفة بالكامل في مصفوفة البارافين. بعد ملء القوالب بشمع البارافين ، قم بتبريدها على طاولة الفريزر لتعزيز تصلب شمع البارافين. بمجرد أن تصلب كتل البارافين ، قم بتخزينها في درجة حرارة الغرفة حتى تتطلب مزيدا من المعالجة.
    ملاحظة: تم اختيار القوالب المستخدمة خصيصا لاستيعاب حجم عينات بطانة الرحم التي تم الحصول عليها للسماح لأنسجة بطانة الرحم بالاستلقاء بشكل مسطح في الأسفل دون طي ، وبالتالي ضمان الاتجاه الأمثل للتقسيم اللاحق ودون إحداث فائض غير ضروري.
  5. التقسيم: للتحضير للتقسيم ، قم بتبريد كتل البارافين على حرارة 4 درجات مئوية لمدة ساعتين. قم بتقطيع العينات إلى أقسام بحجم 4 ميكرومتر باستخدام ميكروتوم ، متبوعا بتسطيح الشرائح على سطح الماء المقطر الدافئ إلى 42 درجة مئوية وتثبيتها على شرائح زجاجية لاصقة. ضع الشرائح على مجفف منزلق طوال الليل واحفظها في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

2. تحسين ظروف الكيمياء المناعية متعددة الإرسال

  1. التحقق من صحة IHC: للتحقق من صحة معلمات تلطيخ IHC ، اعتمد نهجا منهجيا لضبط الظروف لاسترجاع المستضد وتركيز الأجسام المضادة وأوقات الحضانة.
    1. ضمن نطاقات التخفيف الموصى بها من قبل الشركة المصنعة ، اختبر 2-3 تركيزات لكل جسم مضاد. تحسين استرجاع المستضد من خلال مقارنة المخازن المؤقتة عند درجة الحموضة 6 ودرجة الحموضة 9 ، وتقييم بروتوكولات الحضانة في كل من درجة حرارة الغرفة لمدة 1.5 ساعة وبين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    2. قم بتقييم كل حالة بدقة ، مع التركيز على شدة التلوين والخصوصية وضوضاء الخلفية. حدد التركيبة المثلى التي تنتج التلطيخ الأكثر وضوحا وتحديدا مع الحد الأدنى من الربط غير المحدد. وقد ضمن هذا التحقق الصارم أعلى دقة وقابلية للتكرار في بروتوكول IHC.
  2. تلطيخ أحادي تضخيم إشارة التيراميد (TSA): بعد تحديد معلمات التلوين المثلى للأجسام المضادة الفردية ، قم بتحسين إقران الأجسام المضادة بأصباغ TSA المختلفة. قم بإقران العلامة بتعبير أعلى بصبغة ذات مستوى شدة مضان أقل ، أو العكس. خلال هذه المرحلة ، قم بإجراء تعديلات على تركيز الجسم المضاد ووقت الحضانة وفقا لقوة إشارة التألق المرصودة. إذا لوحظت خلفية كبيرة أو تلطيخ غير محدد ، فقم بتغيير الصبغة المقترنة13.
  3. تلطيخ TSA متعدد الإرسال: بالنسبة لبروتوكول الكيمياء المناعية متعددة الإرسال (m-IHC) ، تم تحديد الترتيب المتسلسل للتلوين بعناية وفقا للمبادئ المعمول بها. للتأكد من أن عملية تعدد الإرسال تعكس حساسية وخصوصية تلطيخ التسمية الواحدة ، الأجسام المضادة ذات الأولوية ذات مستويات التعبير المنخفضة في بداية تسلسل التلوين. ضع الأجسام المضادة التي تتطلب إصلاحا أساسيا لاسترجاع المستضد في نهاية تسلسل التلوين ، حيث يكون إصلاح القاعدة قويا مقارنة بالطرق القائمة على الأحماض ، والتي يمكنها ، في بعض الحالات ، تضخيم القطع الأثرية غير المحددة.
  4. باستخدام النتائج المستخلصة من الخطوتين 2.1 و 2.2 ، حدد الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها وفي أي مرحلة ، بناء على متطلبات استرجاع المستضد وكثافة التعبير. على سبيل المثال ، تم وضع الجسم المضاد CXCR4 ، الذي يتطلب إصلاحا أساسيا لاسترجاع المستضد ، في المراحل النهائية من التلوين. على العكس من ذلك ، تم إعطاء الجسم المضاد CD49a ، الذي يتميز بكثافة أقل من التعبير ، الموضع الأول في تسلسل التلوين. قم بزيادة فرص الكشف الناجح وتقليل أي تأثيرات إخفاء قد تحدث في المراحل اللاحقة من إجراء تعدد الإرسال.
  5. بالنسبة للأجسام المضادة المتبقية ، اختبر مجموعات مختلفة خلال مرحلة التحسين لتحديد التسلسل الأكثر فعالية الذي يوازن بين الحساسية والخصوصية. ستوجه نتائج هذه التحليلات المقارنة التكوين النهائي للوحة تعدد الإرسال ، كما هو مفصل في الجدول 1 ، مما يضمن أن اللوحة المختارة توفر الأداء الأمثل مع تقليل الخلفية إلى الحد الأدنى.

3. عملية M-IHC

  1. إزالة الشمع والترطيب والتثبيت: اخبز أقسام الأنسجة على حرارة 60 درجة مئوية لمدة ساعتين ، متبوعا بالغمر المتسلسل في الزيلين الأول (10 دقائق) ، الزيلين الثاني (10 دقائق) ، 100٪ إيثانول (5 دقائق) ، 95٪ إيثانول (5 دقائق) ، 80٪ إيثانول (5 دقائق) ، 75٪ إيثانول (5 دقائق) ، ddH2O (دقيقتان لمدة 3 أضعاف) ، 10٪ فورمالين محايد مخزن (20 دقيقة على الأقل) ، و ddH2O (دقيقتان لمدة 3x).
  2. استرجاع المستضد: أضف 200 مل من المخزن المؤقت AR6 أو AR9 المعني ، كما هو موضح في الجدول 1 لكل جسم مضاد ، إلى كاسيت استرجاع مستضد مقاوم للحرارة. ضع الأقسام في المخزن المؤقت المناسب لاسترجاع المستضد وقم بتسخينها في الميكروويف على طاقة عالية لمدة دقيقتين تقريبا حتى الغليان. بعد ذلك ، قم بتغطية الكاسيت بشكل غير محكم ، وقم بتسخينه على طاقة منخفضة لمدة 15 دقيقة ، ثم تبرد إلى درجة حرارة الغرفة. اشطف الأقسام باستخدام ddH2O و PBST.
  3. رسم حاجز مسعور: بعد إزالة المحلول الزائد بورق ماص ، ارسم دائرة كاملة حول الأنسجة باستخدام قلم حاجز كاره للماء.
  4. تعطيل نشاط الإنزيم الداخلي: عالج الأقسام التي تحتوي على 3٪ بيروكسيد الهيدروجين واحتضانها لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل باستخدام PBST 3x لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
  5. حجب المواقع غير المحددة: بعد التجفيف بورق ماص ، ضع محلول مانع (1x مخفف / كتلة للأجسام المضادة) واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  6. الحضانة بالجسم المضاد الأولي: بعد إزالة محلول الحجب ، ضع 150 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي الأول ، CD49a ، على كل شريحة بتخفيف 1: 1000 في 1x مخفف للأجسام المضادة. احتضان كما تم تحسينه مسبقا في القسم 2. بعد الحضانة ، اغسل الشرائح باستخدام PBST 3x لمدة دقيقتين لكل منها. بالنسبة للأجسام المضادة المتبقية ، انظر الجدول 1 لمعرفة نسب التخفيف المحددة.
  7. الحضانة بالجسم المضاد الثانوي: قبل تطبيق الجسم المضاد الثانوي ، استخدم ورقا ماصا لإزالة الرطوبة الزائدة لمنع تخفيف الكاشف. أضف 4-5 قطرات (حوالي 150 ميكرولتر) من الجسم المضاد الثانوي 1x Anti-Ms + Rb HRP على كل شريحة ، متبوعا بحضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. قم بإجراء ثلاث غسلات باستخدام PBST لمدة 2 دقيقة لكل فترة بعد الحضانة.
    ملاحظة: يرجى ملاحظة أن الجسم المضاد الثانوي 1x Anti-Ms + Rb HRP خاص بالأجسام المضادة الأولية للأرانب والفأر.
  8. تضخيم الإشارة بصبغة TSA: بعد نشاف الرطوبة الزائدة ، قم بتخفيف صبغة TSA 1: 100 في مخفف التضخيم. أضف 150 ميكرولتر من محلول صبغة TSA المخفف إلى كل شريحة. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يغسل باستخدام PBST 3x لمدة 2 دقيقة لكل منهما.
  9. كرر الخطوتين 3.2 و 3.5-3.8 لإجراء TSA باستخدام الجسم المضاد والصبغة المقابلين.
  10. نوى التلوين: بعد تلطيخ الجسم المضاد الأخير ، تخلص من الفلوروفورات غير المنضمة عن طريق وضع أقسام في الميكروويف في 200 مل من المخزن المؤقت AR6 داخل كاسيت مقاوم للحرارة ، ثم الغليان لمدة دقيقتين ، ثم تسخين منخفض الطاقة لمدة 15 دقيقة. تبرد العينات إلى درجة حرارة الغرفة واشطفها باستخدام ddH2O و PBST. أضف 150 ميكرولتر من محلول عمل DAPI المخفف في PBST (1:10) بالتنقيط ، واحتضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، واشطفه 2x باستخدام ddH2O.
  11. التركيب: بمجرد تجفيف الأقسام بالهواء بالكامل في منطقة مظلمة لمدة 30 دقيقة تقريبا ، ضع قطرة واحدة (حوالي 30 ميكرولتر) من حامل الفلورسنت المضاد للتبريد ، وضع أغطية.
    ملاحظة: حماية جميع العمليات من الضوء بعد التطبيق الأول لصبغة TSA. كانت المراقبة السريعة والتقاط الصور ضروريين بعد الانتهاء من التلوين لمنع التبريد الفلوري.

4. الحصول على الصور وتحليلها

  1. وقت التعرض: التقط الصور باستخدام جهاز تصوير يرث الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث المقابلة للفلوروفورات. عند تعيين أوقات التعريض الضوئي، تحقق من الشرائح التي تحتوي على مجموعة كبيرة من تعبيرات العلامات لضمان الدقة. لكل مجموعة علامة/مرشح، ركز يدويا على مناطق مختلفة من الشريحة. استخدم ميزة التعريض الضوئي التلقائي لضبط وقت التعريض الضوئي.
  2. حدد المرشحات وفقا لأصباغ TSA ، وافحص شرائح متعددة لتحديد أوقات التعرض المثلى لكل قناة. قم بتطبيق هذه الإعدادات بشكل متسق على جميع عمليات الاقتناء اللاحقة للحفاظ على قابلية المقارنة طوال التصوير.
  3. اختيار مناطق الالتقاط: لضمان أخذ عينات غير متحيزة عبر أقسام الأنسجة وإدراج متسق للظهارة اللمعية في كل حقل تم تحليله ، حدد بشكل عشوائي المنطقة الأولية للحصول على الصورة ، مع وجود المعيار الحاسم هو وجود الحدود الظهارية اللمعية.
  4. بعد التقاط هذا الحقل الأولي ، حدد المناطق اللاحقة بشكل منهجي عن طريق تحريك حقل واحد إلى يسار أو يمين نقطة البداية (حذف حقل واحد بين كل صورة تم التقاطها) مع الحفاظ على الحدود الظهارية اللمعية داخل الإطار. كرر هذه العملية لالتقاط خمس مناطق مختلفة على الأقل ، تحتوي كل منها على جزء على الأقل من الظهارة اللمعية ، للحفاظ على عمق ثابت للتحليل طوال14. يهدف هذا النهج إلى تضمين ما لا يقل عن 10,000 خلية لحمية في جميع الحقول التي تم التقاطها لضمان جمع البيانات الشاملة والتمثيلية.
  5. تحليل الصور
    1. إعداد الصورة: لاستيراد الصور متعددة الأطياف وتحليلها، انتقل أولا إلى ملف > فتح الصورة في واجهة البرنامج لتحميل الملفات وشريحة التألق الذاتي (AF). بعد تحميل الصور ، تابع فك خلط الفلوروفورات بالنقر فوق حدد الفلور زر وتحديد المكتبة الطيفية المناسبة. بمجرد تحديد جميع الفلوروفورات ، انقر فوق موافق لتأكيد التحديد. لعزل طيف التركيز البؤري التلقائي، استخدم أداة قطارة التركيز البؤري التلقائي لأخذ عينات من منطقة تمثيلية من الأنسجة من صورة التركيز البؤري التلقائي، مع الحرص على استبعاد أي وحدات بكسل غير نسيجية. بعد أخذ العينات ، انقر فوق إعداد الصورة أو إعداد الكل في الزاوية اليسرى السفلية من الواجهة15.
    2. تجزئة الأنسجة: ابدأ عملية التجزئة عن طريق تحديد خط أساس يدويا من 3-5 مناطق لكل نوع من الأنسجة داخل الصورة ، بما في ذلك المناطق الظهارية التي تحتوي على الخلايا الظهارية ، والمناطق اللحمية التي تحتوي على الخلايا اللحمية ، والمناطق الفارغة التي لا تحتوي على محتوى خلوي. إذا كانت نتائج التجزئة الأولية غير مرضية ، فقم بالتعليق يدويا على مناطق إضافية لتحسين مجموعة بيانات التدريب ، وبالتالي زيادة دقة وموثوقية التحليلات اللاحقة. يضمن هذا الضبط الديناميكي للمناطق والمعلمات أن البرنامج يمكنه تحديد الهياكل المتشابهة تلقائيا في الصور الحالية وغيرها من الصور المستوردة بدقة متزايدة.
      ملاحظة: يعمل التعليق التوضيحي الأولي كمجموعة بيانات تدريبية للبرنامج لمعرفة خصائص كل مكون من مكونات الأنسجة. ثم يتم تحسين قدرات تجزئة البرنامج بشكل متكرر بناء على تعقيد الأنسجة وتنوعها.
    3. تجزئة الخلايا: انقر فوق تجزئة الخلايا لبدء تجزئة الخلايا. في إعداد تجزئة الخلايا، حدد النوى والغشاء. اختر DAPI لتحديد نوى الخلية وضبط إعداد الشدة لاكتشاف جميع نوى الخلية بدون ضوضاء في الخلفية. حدد إشارات CD16 و CD49a و CD56 للعثور على الغشاء واستخدم هذه الإشارة للمساعدة في الانقسام النووي. استخدم ميزة تقسيم المكونات النووية لتمييز النوى الموجودة عن كثب.
      ملاحظة: يسلط DAPI الضوء على الجزء الداخلي من الخلايا. تساعد ميزة تقسيم المكونات النووية على تمييز نوى الخلية عندما تكون قريبة من بعضها البعض أو تبدو مدمجة. هذه الخطوة مهمة للحصول على عدد خلايا موثوق به والحفاظ على سلامة التحليل.
    4. التنميط الظاهري للخلية: اعتماد أربع علامات مختلفة لسطح الخلية بما في ذلك CD56 و CD49a و CXCR4 و CD16 للتمييز بين الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا القاتلة الطبيعية. في مخطط التنميط الظاهري ، قم بتسمية هذه العلامات الأربع على أنها الأنماط الظاهرية للمضي قدما. في المقطع إقران طريقة العرض، قم بتعيين ألوان محددة لكل نمط من الأنماط الظاهرية للتحديد. باستخدام الزر "إضافة" ، قم بتصنيف الخلايا على أنها تعبر بشكل إيجابي أو سلبي عن العلامات ؛ على سبيل المثال ، في النمط الظاهري CD56 ، يمكن تسمية الخلايا على أنها CD56 + أو CD56-. قم بتسمية خمس خلايا على الأقل يدويا لكل نمط ظاهري أثناء عملية التدريب. قم بإجراء وضع العلامات اليدوية الإضافية إذا لم يسفر التدريب الأولي عن نتائج فعالة.
    5. بعد تعيين تكوين التنميط الظاهري للخلية، ستشير كل خلية في الصورة إلى ما إذا كانت علامات السطح الأربعة يتم التعبير عنها بشكل إيجابي أو سلبي. تصدير البيانات الناتجة إلى جدول بيانات لمزيد من التحليل.
    6. معالجة البيانات: استيراد البيانات التي تم الحصول عليها من جميع الصور إلى جدول بيانات للمعالجة. احسب النسب المئوية لجميع الأنواع الفرعية لخلايا uNK بالنسبة إلى إجمالي عدد الخلايا في الصورة. يمثل عدد الخلايا النهائي متوسط العدد عبر صور متعددة ، مما يوفر نظرة عامة شاملة على مجموعة الأنواع الفرعية المختلفة لخلايا uNK داخل العينة.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحفاظ على الاتساق في توقيت جمع عينات بطانة الرحم للنساء اللواتي يخضعن للدورة الطبيعية ، تم إجراء اختبار بول للكشف بدقة عن زيادة الهرمون اللوتيني (LH) ، مع إجراء خزعات بطانة الرحم بعد 7 أيام من زيادة الهرمون اللوتيني (LH). بالنسبة للنساء اللواتي يخضعن لدورات العلاج التعويضي بالهرمونات ، تمت جدولة العينات بالضبط بعد 5 أيام من بدء مكملة البروجسترون. لتحديد أنواع فرعية مختلفة من خلايا القاتل الطبيعية في بطانة الرحم ، تم استخدام تلطيخ m-IHC. تم تصوير مخطط تخطيطي للإجراء التجريبي في الشكل 1.

يعد تحسين الإجراء التجريبي أمرا بالغ الأهمية لتحقيق نتائج تلطيخ m-IHC عالية الجودة لضمان الدقة والاتساق في نتائج التجربة. في البداية ، تم استخدام IHC لتحديد تركيز الأجسام المضادة المناسب ، مع اختيار حلول استرجاع المستضد AR6 أو AR9. بالنسبة للأجسام المضادة مثل CD56 و CD16 و CD49 ، يوصى بمحلول استرجاع المستضد مع درجة الحموضة 6 ، بينما بالنسبة للجسم المضاد CXCR4 ، تم تحقيق نتائج تلطيخ فائقة باستخدام محلول إصلاح المستضد بدرجة حموضة 9 مقارنة بمحلول الأس الهيدروجيني 6. بمجرد تحديد المعلمات ، بما في ذلك نسبة تخفيف الجسم المضاد ، ووقت الحضانة ، وظروف استرجاع المستضد ، يمكن اختيار أنسب صبغة TSA بناء على تقارب الجسم المضاد. يجب اختيار صبغة ذات سطوع مضان ضعيف لاستكمال التقارب العالي للجسم المضاد. يمكن العثور على البيانات المرجعية حول شدة إشارة أصباغ TSA في الجدول 2. بعد الانتهاء من اختبار أحادي الإرسال TSA ، يمكن تحديد ترتيب مضاعفة TSA. بالنظر إلى أن الأجسام المضادة الأربعة مصممة لتحديد أنواع فرعية مختلفة من خلايا uNK ، فإن التوطين المشترك بين الأجسام المضادة أمر لا مفر منه. لتقليل التداخل الطيفي ومنع التداخل بين شقوق الفلورسنت ، تم استخدام الإستراتيجية التالية: اختيار شقوق الفلورسنت ذات الأطوال الموجية المتباعدة قدر الإمكان ، ومقارنة موضع وعدد الإشارات الإيجابية لمضاعفة TSA مع تلك الخاصة بأحادي الإرسال TSA لضمان هويتها (الشكل 2) ، وضمان خلفية واضحة (الشكل 3) 16.

بعد تحسين وإكمال إجراءات تلطيخ m-IHC ، تم استخدام محطة عمل التصوير للحصول على الصور وتم تطبيق برنامج تحليل الصور لتحليل الصور المتعمق (الشكل 4). لتصنيف خلايا uNK ، تم استخدام كل من الطرق التقليدية والمبتكرة. يقسم التصنيف التقليدي خلايا NK إلى فئتين ، CD56 + CD16- و CD56 + CD16 + 17 ، بناء على مستوى التعبير عن CD16. بناء على هذا الأساس ، سعينا إلى تحديد عدم تجانس الخلايا القاتلة الطبيعية باستخدام استراتيجية تصنيف جديدة. باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية (scRNA-seq) من بحثنا السابق ، قمنا بعزل خلايا NK الفردية عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) وأجرينا تسلسل الحمض النووي الريبي لالتقاط ملفات تعريف النسخ لكل خلية. كشف تحليلنا عن أربعة أنواع فرعية مميزة من الخلايا القاتلة الطبيعية: NK1 (CD56 + CD49a + CXCR4-) ، NK2 (CD56 + CD49a + CXCR4 +) ، NK3 (CD56 + CD49a-CXCR4-) ، و NK4 (CD56 + CD49a-CXCR4 +). تميزت هذه الأنواع الفرعية بالتعبير التفاضلي عن CD49a و CXCR4 ، حيث يعمل CD56 كعلامة عالمية لجميع الخلايا القاتلة الطبيعية. تم اكتشاف CD49a على وجه التحديد في الأنواع الفرعية NK1 و NK2 ، بينما كان CXCR4 موجودا في الأنواع الفرعية NK2 و NK4. للتحقق من صحة هذا التصنيف ، أجرينا تحليل قياس التدفق الخلوي لضمان دقة طريقة التصنيف الفرعي (الشكل 5) 9. يتم تقديم نسبة كل نوع فرعي من خلايا uNK كنسبة مئوية بالنسبة إلى العدد الإجمالي للخلايا اللحمية.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لسير عمل تحليل الخلايا القاتلة الطبيعية في بطانة الرحم. تشمل الخطوات الرئيسية الحصول على بطانة الرحم وجمعها ، وتحسين لوحة m-IHC ، وتلوين m-IHC لبطانة الرحم ، واكتساب الصورة وتحليلها. تم إنشاؤه باستخدام BioRender.com الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: صور تمثيلية للقياس الكمي للمؤشرات الحيوية عبر تلطيخ DAB و TSA monoplex و TSA. أظهرت الصور التمثيلية لكل من الأجسام المضادة الملطخة ب DAB (الألواح اليسرى) ، و TSA monoplex IHC (الألواح الوسطى) ، و TSA multiplex IHC (اللوحات اليمنى) الحد الأدنى من الانحراف من خلال تطوير m-IHC. تقلد صور IHC التي تحاكي TSA تحتها بشكل كبير صور المجال الساطع المقابلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: النتائج التجريبية بعد تلطيخ m-IHC لبطانة الرحم. (أ) تم الحصول على صورة غير مختلطة باستخدام جهاز التصوير بتكبير 200x. (ب) زيادة تكبير هذه الصورة غير المختلطة. (C-F) لوحظت الصور في صبغة TSA 570 (CD16) ، وصبغة TSA 650 (CD56) ، وصبغة TSA 620 (CXCR4) ، وصبغة TSA 520 (CD49a) بعد فك الخلط باستخدام برنامج التصوير. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل الصور الملطخة ب m-IHC. تم تحليل الصور باستخدام تجزئة الأنسجة (أ) لبرنامج التصوير ، (ب) تجزئة الخلايا ، و (ج) وظائف النمط الظاهري للخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الشكل 5: تحليل النوع الفرعي لخلايا بطانة الرحم NK. (أ) يمكن تصنيف خلايا بطانة الرحم التقليدية إلى خلايا CD56 + CD16-NK وخلايا CD56 + CD16 + NK بناء على تعبير CD16. (ب) صنفت طريقة تحليل النوع الفرعي المبتكرة خلايا بطانة الرحم إلى أربع فئات: NK1 (CD56 + CD49a + CXCR4-) ، NK2 (CD56 + CD49a + CXCR4 +) ، NK3 (CD56 + CD49a-CXCR4-) ، و NK4 (CD56 + CD49a-CXCR4 +). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

دورة تلطيخعلامهاستنساخشركةحاصل الضربتخفيف الأجسام المضادةمخزن AR المؤقتفلوروفور
1CD49aCL7207نوفوس بيولوجيكسNBP2-764781:1000AR6TSA 520
2CD56سي دي 564لايكاNCL-L-CD56-5041:100AR6TSA 650
3CD16SP175أبكامأب1833541:100AR6TSA 570
4CXCR444716البحث والتطويرMAB1721:100AR9TSA 620

الجدول 1: قائمة تركيزات الأجسام المضادة وصبغة TSA المستخدمة في m-IHC.

فلوروفورتعويذه
صبغة TSA 520عال
صبغة TSA 540متوسط
صبغة TSA 570متوسط
صبغة TSA 620متوسط
صبغة TSA 650عال
صبغة TSA 690منخفض

الجدول 2: أصباغ TSA وشدة التألق المقابلة.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ينطوي زرع الجنين على تفاعل معقد بين الجنين وبطانة الرحم. تلعب الحالة المناعية لتوازن بطانة الرحم دورا محوريا في تحديد تقبل بطانة الرحم. خلال WOI ، تكون مجموعة الكريات البيض السائدة في بطانة الرحم هي الخلايا القاتلة الطبيعية. ما يقرب من 90٪ من خلايا uNK تظهر تعبيرا عاليا عن CD56 ولكنها تفتقر إلى CD16. ومع ذلك ، فإن مجموعة فرعية ثانوية من خلايا uNK تشبه خلايا NK في الدم المحيطي ، وتعرض تعبيرا منخفضا عن CD56 ولكن تعبير CD16 إيجابيا18. يوضح هذان النوعان الفرعيان من خلايا uNK وظائف مميزة. يساهم النوع الفرعي CD56 + CD16- بشكل أساسي في إنتاج السيتوكين وإعادة تشكيل الأوعية الدموية والتفاعلات مع خلايا الأرومة الغاذية ، والتي تعتبر ضرورية لتأسيس الحمل والحفاظ عليه. في المقابل ، يظهر النوع الفرعي CD56 + CD16 + سمية خلوية أعلى. باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية ، صنفت دراستنا الأخيرة خلايا uNK إلى أربع مجموعات فرعية ، مما أدى إلى تجميع خلايا CD56 + CD16- NK التنظيمية إلى ثلاث مجموعات سكانية فرعية بناء على أنماطها الظاهرية ووظائفهاالمحددة 9. تشارك المجموعة الفرعية NK1 ، التي تتميز ب CD56 + CD49a + CXCR4- ، في إعادة تشكيل الأنسجة. المجموعة الفرعية NK2 ، التي تم تحديدها بواسطة CD56 + CD49a + CXCR4 + ، تنظم الاستجابة المناعية. تتفاعل المجموعة الفرعية NK3 ، المميزة ب CD56 + CD49a-CXCR4- ، مع الأرومات الغاذية. تشترك المجموعة الفرعية NK4 ، التي تعرض CD56 + CD49a-CXCR4 + ، في أوجه التشابه مع خلايا CD56 + CD16 + NK ، وتعرض وظائف سامةللخلايا 9. في الدراسة الحالية ، ولأول مرة ، نجحنا في إنشاء بروتوكول لتحديد هذه المجموعات الفرعية الأربع المتميزة لخلايا القاتل الطبيعية باستخدام تلطيخ m-IHC.

يعد تلطيخ IHC التقليدي وقياس التدفق الخلوي من أكثر الطرق استخداما لتحديد الخلايا المناعية ، ولكل منها نقاط قوتها وقيودها19. في حين أن IHC التقليدي يستخدم على نطاق واسع في البيئات السريرية نظرا لسهولة الوصول إليه ، فإنه يواجه تحديات في اكتشاف مستضدات متعددة في وقت واحد وتحديد الإشارات الإيجابية. يمثل هذا عقبة كبيرة في توصيف الأنماط الظاهرية للخلايا المناعية بدقة ، والتي غالبا ما تتطلب استخدام علامات متعددة للقياس الدقيق. من ناحية أخرى ، فإن قياس التدفق الخلوي قادر على اكتشاف علامات الخلايا المتعددة في وقت واحد ، ولكنه يتطلب كمية كبيرة من العينات الجديدة ولا يوفر معلومات مكانية حول موقع الخلية داخل الأنسجة. والجدير بالذكر أن الخلايا المناعية لبطانة الرحم ليست مشتتة بشكل موحد في جميع أنحاء أنسجة بطانة الرحم. على سبيل المثال ، يتم تجميع خلايا uNK بشكل أكثر كثافة بالقرب من الطبقة القاعدية لبطانة الرحم مقارنة بالمناطق القريبة من التجويف اللمعي20. يمكن معالجة هذه القيود على IHC التقليدي وقياس التدفق الخلوي من خلال m-IHC ومنصة تحليل الصور المقترنة بخوارزميات التعلم الآلي لتحقيق تجزئة الأنسجة وتجزئة الخلايا وتحديد الخلايا الإيجابية. يعزز هذا النهج الكفاءة من خلال تحليل عشرات الآلاف من الخلايا في غضون دقائق ، ويقلل من تحيز المراقب عن طريق تحديد الخلايا الإيجابية تلقائيا ، ويتيح تحليلا أكثر دقة باستخدام علامات متعددة. علاوة على ذلك ، فإنه يلغي الحاجة إلى عينات جديدة ويسمح بإجراء تجارب مجمعة أو تحليلات متكررة عند الضرورة.

يمكن أن يوفر إجراء تقييم شامل للأنماط الظاهرية لخلايا uNK باستخدام تقنية m-IHC فهما أعمق للعلاقة بين خلايا uNK وزرع الأجنة ، بالإضافة إلى تغيراتها في النساء المصابات ب RIF. بصرف النظر عن خلايا uNK ، تساهم الخلايا المناعية الأخرى لبطانة الرحم أيضا في التوازن المناعي الموضعي. على سبيل المثال ، تحافظ الخلايا الليمفاوية التائية التنظيمية (خلايا Treg) على تحمل المناعة عن طريق إطلاق عوامل مثبطة ، مثل IL-10 و TGF-β ، والتي تثبط نشاط خلايا Th1 و Th221. يساهم تمايز الضامة M2 ، التي تنظمها المنشطات والسيتوكينات Th2 ، في حالة التحمل المناعي عن طريق تنظيم نشاط الأرجيناز وتثبيط إنتاج أكسيدالنيتريك 22. علاوة على ذلك ، تتمايز الخلايا المتغصنة (DCs) إلى خلايا توليروجينيك ناضجة داخل الرحم ، وتطلق عوامل مثل sFLT1 و TGF-β1 التي تنظم تكوين الأوعية الدموية وتمنع وظيفة الخلايا التائية CD8 + ، وبالتالي الحفاظ على التوازن المناعي ودعم نمو الجنين18. على غرار خلايا uNK ، فإن هذه الخلايا المناعية غير متجانسة أيضا ، ولا يمكن لعلامة واحدة تحديد أنماطها الظاهرية بدقة. يوضح تطبيق m-IHC لتقييم المجموعات الفرعية لخلايا uNK إمكانية تحديد مجموعات فرعية من هذه الخلايا المناعية لبطانة الرحم.

بالإضافة إلى بطانة الرحم ، يمكن تطبيق هذه الطريقة على الأنسجة المختلفة لتحديد الأنماط الظاهرية للخلايا المناعية. عند تطبيقه على الأنسجة الأخرى ، لا يلزم سوى تعديلات طفيفة لضمان التلوين الأمثل. علاوة على ذلك ، إذا كان الباحثون يعتزمون استبدال علامات معينة ، فيمكن تعديل اللوحة الأصلية لتلبية المتطلبات التجريبية المحددة. إن تعدد استخدامات ومرونة هذه اللوحة يجعلها أداة قابلة للتكيف لدراسة الأنسجة المختلفة أو مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا.

لا تسهل هذه التقنية فهم التغييرات التفصيلية في الخلايا المناعية لبطانة الرحم لتشريح الآلية الأساسية لعدم تقبل بطانة الرحم فحسب ، بل توفر أيضا إمكانية تطوير الاختبارات التشخيصية. مهدت السهولة النسبية للحصول على كتل وأقسام البارافين والحفاظ عليها الطريق للاستخدام الواسع النطاق لهذه التقنية. باستخدام ألواح التلوين القياسية ، يمكن للمستشفيات الاستفادة من تقنية التلوين الآلي جنبا إلى جنب مع خوارزميات البرامج المتطورة لتعزيز كفاءة إجراءات التحليل الخاصة بها بشكل كبير. مزايا تقنية m-IHC تجعلها خيارا قابلا للتطبيق للممارسات السريرية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل صندوق البحوث الصحية والطبية (10210956).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CD49aNovus BiologicalsNBP2-76478الأجسام المضادة الأولية
CD56LeicaNCL-L-CD56-504الأجسام المضادة الأولية
CD16abcamab183354الأجسام المضادة الأولية
CXCR4R & DMAB172الأجسام المضادة الأولية
تضخيف المخففAkoya BiosciencesFP1498 سلسلةتخفيف الفلوروفور
مخففات الأجسام المضادة مخففات الأجسام المضادةAkoya BiosciencesARD1001EAتمييع المحلول المخزن المخزن للسترات للجسم المضاد
، درجة الحموضة 6.0 / 9.0 (10x)Akoya BiosciencesA6001 / A9001حل استرجاع المستضد
في إبلاغ برنامج تحليل الصور المتقدمبرنامج Akoya BiosciencesinForm Tissue Finder 2.2.6برنامج تحليل البيانات
تعويذةAkoya BiosciencesCLS140089التصوير الطيفي
الميكروويفAkoya Biosciencesالعاكس تجريد الميكروويف
TSA 520Akoya BiosciencesFP1487001Kالكواشف الفلورية المناسبة القائمة على التيراميد
TSA 620Akoya BiosciencesFP1495001Kكواشف الفلورسنت المناسبة القائمة على التيراميد
TSA 650Akoya BiosciencesFP1496001Kالكواشف الفلورية المناسبة القائمة على التيراميد
TSA 570Akoya BiosciencesFP1488001Kالكواشف الفلورية المناسبة القائمة على التيراميد
مطلية ب Poly-L-lysineFisher Technologies120-550-15Slides للاستخدام النسيجي الروتيني
PolyHRP واسع الطيفPerkin ElmerARH1001EAالأجسام المضادة الثانوية
Invitrogen & trade;   Fluoromount-G & trade; تركيب متوسطThemoFisher Science495802التثبيت
الطيفي DAPIAkoya BiosciencesFP1490Aتلطيخ الحمض النووي
محطات عمل شرائح

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Geyter, C. Assisted reproductive technology: Impact on society and need for surveillance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 33 (1), 3-8 (2019).
  2. State-Specific Assisted Reproductive Technology Surveillance. CDC. , https://www.cdc.gov/art/state-specific-surveillance/2021/index.html (2024).
  3. Busnelli, A., et al. How common is real repeated implantation failure? An indirect estimate of the prevalence. Reprod Biomed Onl. 40 (1), 91-97 (2020).
  4. Ben Rafael, Z. Repeated implantation failure (RIF): an iatrogenic meaningless definition that generates unnecessary and costly use of add-on procedures. Human Reprod. 35 (7), 1479-1483 (2020).
  5. Hanna, J., et al. Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface. Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).
  6. Vento-Tormo, R., et al. Single-cell reconstruction of the early maternal-fetal interface in humans. Nature. 563 (7731), 347-353 (2018).
  7. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  8. Manaster, I., et al. Endometrial NK cells are special immature cells that await pregnancy. J Immunol. 181 (3), 1869-1876 (2008).
  9. Lai, Z. Z., et al. Single-cell transcriptome profiling of the human endometrium of patients with recurrent implantation failure. Theranostics. 12 (15), 6527-6547 (2022).
  10. Coughlan, C., et al. Recurrent implantation failure: definition and management. Reprod BioMed Onl. 28 (1), 14-38 (2014).
  11. Chen, X., et al. Measurement of uterine natural killer cell percentage in the periimplantation endometrium from fertile women and women with recurrent reproductive failure: establishment of a reference range. Am J Obst Gyneco. 217 (6), 680.e1-680.e6 (2017).
  12. Yang, W. J., et al. A comparison of uterine natural killer cell density in the peri-implantation period between natural cycles and hormone replacement therapy cycles. Am J Reprod Immunol. 82 (3), e13156(2019).
  13. Syed, J., et al. Multiplex immunohistochemistry: The importance of staining order when producing a validated protocol. Immunother. 5 (2), 1-9 (2019).
  14. Lash, G. E., et al. Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure. J Reprod Immunol. 116, 50-59 (2016).
  15. Mansfield, J. R., Gossage, K. W., Hoyt, C. C., Levenson, R. M. Autofluorescence removal, multiplexing, and automated analysis methods for in vivo fluorescence imaging. J Biomed Optics. 10 (4), 41207(2005).
  16. Hoyt, C. C. Multiplex immunofluorescence and multispectral imaging: Forming the basis of a clinical test platform for immuno-oncology. Front Mol Biosci. 8, 674747(2021).
  17. Von Woon, E., et al. Number and function of uterine natural killer cells in recurrent miscarriage and implantation failure: a systematic review and meta-analysis. Human Reprod Update. 28 (4), 548-582 (2022).
  18. Lee, J. Y., Lee, M., Lee, S. K. Role of endometrial immune cells in implantation. Clin Exp Reprod Med. 38 (3), 119-125 (2011).
  19. Gothe, J. P., de Mattos, A. C., Silveira, C. F., Malavazi, K. C. Exploring natural killer cell testing in embryo implantation and reproductive failure: An overview of techniques and controversies. Reprod Sci. 31 (3), 603-632 (2024).
  20. Russell, P., et al. The distribution of immune cells and macrophages in the endometrium of women with recurrent reproductive failure: I: Techniques. J Reprod Immunol. 91 (1), 90-102 (2011).
  21. Wang, W., Sung, N., Gilman-Sachs, A., Kwak-Kim, J. T. Helper (Th) cell profiles in pregnancy and recurrent pregnancy losses: Th1/Th2/Th9/Th17/Th22/Tfh cells. Front Immunol. 11, 2025(2020).
  22. Nagamatsu, T., Schust, D. J. The contribution of macrophages to normal and pathological pregnancies. Am J Reprod Immunol. 63 (6), 460-471 (2010).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NK CD49a CXCR4

مقالات ذات صلة