يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الاستخراج بخطوة واحدة والتحليل الزيموغرافي للجيلاتينات البكتيرية

971 مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67291

⸱

أغسطس 1, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1ICMR Regional Medical Research Centre, Port Blair

في هذه المقالة

ملخص

البروتينات حيوية للتسبب في المرض البكتيري ، مما يتيح الغزو والتهرب المناعي. يعد الاستخراج أحادي الخطوة للبروتينات السيتوبلازمية والغشائية للبكتيريا في شكلها النشط أمرا مروعا. توضح مقالة الفيديو هذه استخراج البروتينات الخلوية الكاملة من Leptospira لتحليل الزيموغرافيا لاكتشاف وتوصيف الجيلاتيناز.

الملخص

تساهم بروتينات البكتيريا المسببة للأمراض في الغزو والتسبب في المرض عن طريق تحلل مكونات المصفوفة خارج الخلية (ECM) للمضيف والحواجز الخلوية ، وتعديل الاستجابة المناعية للمضيف وتدهور نظام دفاع المضيف. هذا يجعل البروتينات واحدة من أكثر الجزيئات ضراوة وتحديدها وتوصيفها ضروريان للوقاية من الأمراض ومكافحتها. تمتلك العديد من البكتيريا أيضا بروتينات خارجية مرتبطة بالغشاء. يمثل عزل وتوصيف بروتينات الغشاء الخارجي في أشكالها النشطة تحديات كبيرة بسبب توطينها داخل الغشاء الخارجي. في هذه الدراسة ، نوضح طريقة من خطوة واحدة لاستخراج كل من الجيلاتيناز السيتوبلازمي والمرتبط بالغشاء الخارجي من Leptospira وإثبات نشاطها الأنزيمي باستخدام علم الزيموغرافيا. في هذه الطريقة ، نستخدم ديوكسي كولات الصوديوم لتعطيل غشاء الخلية وإطلاق البروتينات المرتبطة وحمض 6-أمينوكابرويك لإذابة بروتين الغشاء المنبعث في شكله الأصلي. علاوة على ذلك ، نعرض تحليلا وزيموغرافي للجيلاتيناز البريمياتي. يوفر هذا النهج إطارا متعدد الاستخدامات لعزل وتنقية وتوصيف المعادن والكولاجيناز والجيلاتينازات من مسببات الأمراض البكتيرية المختلفة.

المقدمة

يجب أن تواجه معظم مسببات الأمراض البكتيرية المصفوفة خارج الخلية للمضيف (ECM) أثناء الغزو والانتشار للأعضاء المستهدفة أثناء التسبب في المرض. يشكل الكولاجين المكون الرئيسي في ECM للأنسجةالحيوانية 1. الجيلاتينات هي مجموعة من البروتياز التي تعمل على الكولاجين وشكله المتحلل ، الجيلاتين. يتم تنفيذ تحلل ECM بشكل أساسي بواسطة مجموعة من البروتياز ، والتي تشمل الكولاجيناز والجيلاتيناز2،3. تستخدم مسببات الأمراض البكتيرية الكولاجيناز والجيلاتينازات لإعادة تشكيل أو تحطيم ECM المضيف لراحتها في الغزو والتسببفي المرض 4،5. الإنزيمات البكتيرية المهينة ل ECM هي المرشحة المحتملة لاستهداف اللقاحات والأدوية5.

تم العثور على البروتياز البكتيري في أشكال إفرازية ومرتبطة بالغشاء6،7،8،9. العديد من طرق استخراج الإنزيم الخلوي غير فعالة لعزل الجيلاتيناز البكتيري والكولاجيناز المرتبط بالغشاء ، حيث قد لا تحافظ هذه الإجراءات بكفاءة على الشكل الأصلي للبروتينات المرتبطة بالغشاء. وبالمثل ، هناك طرق خاصة بالغشاء تستخرج فقط البروتياز والجيلاتينازات المرتبطة بالغشاء. غالبا ما تتضمن طرق الاستخراج التقليدية للبروتينات الكلية ، بما في ذلك بروتينات الغشاء ، منظفات وأيونات فوضوية ، والتي يمكن أن تؤثر على النشاط الأنزيمي. يعد إجراء الاستخراج الذي يحافظ على نشاط الإنزيم وقابليته للذوبان ضروريا للفصل الكهربائي ويتيح تطوير الزيموغرافيا للكشف عن نشاط البروتياز.

يتيح منقوص أوكسي كولات الصوديوم ، وهو منظف أيوني يمكنه تحلل الخلايا عن طريق تعطيل غشاء الخلية ، إطلاق محتويات الخلية وبروتين الغشاء. يمكن لحمض 6-أمينوكابرويك إذابة البروتين الغشائي المنبعث في شكله الأصلي. يتميز الذوبان بحمض 6-أمينوكابرويك بأنه لا يؤثر على الرحلان الكهربائي. هنا ، نوضح استخراج البروتينات البكتيرية الخلوية والمرتبطة بالغشاء باستخدام ديوكسيكولات الصوديوم وحمض 6-أمينوكابرويك ، مما يؤدي إلى تثبيتها في شكلها الأصلي القابل للذوبان10،11،12. تعمل هذه الطريقة على إذابة البروتينات بشكل فعال من الخلية والغشاء الذي يمكن استخدامه مباشرة دون التدخل في الرحلان الكهربائي13،14. يمكن إجراء توصيفات إنزيمية مختلفة عن طريق تغيير مثبطات الإنزيم البروتيني وأيونات المعادن المستخدمة في مخزن التنشيط ، اعتمادا على التطبيق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. استخراج الجيلاتيناز البكتيري

ملاحظة: انظر الجدول 1 لإعداد الكواشف والمواد.

  1. ينمو الكائن الحي في وسط Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) الذي يحتوي على 10 مجم / مل من ألبومين مصل الأبقار عند 30 درجة مئوية. خذ 10 مل من ثقافة Leptospira في منتصف مرحلة النمو التي تحتوي على 3.5 × 108 خلايا / مل لاستخراج البروتينات13،14. استخدم العد المجهري المباشر مع غرفة عد بتروف هوسر تحت مجهر المجال المظلم لمراقبة مرحلة منتصف السجل من النمو.
  2. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 6,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية في وعاء لإزالة التلوث عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  3. انقل الحبيبات عن طريق تعليقها في 1 مل من مخزن الغسيل إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وجهاز طرد مركزي عند 6,000 × جم لمدة 5 دقائق. كرر هذا الغسيل.
  4. استخرج البروتين من الحبيبات عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للاستخراج لحبيبات Leptospira من 10 مل من الثقافة والدوامة لمدة 5 دقائق. استمر في الاستخراج عن طريق الحضانة عند 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة. اجمع البروتين المستخرج عن طريق الطرد المركزي عند 15,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق ، وتخلص من الحبيبات في وعاء لإزالة التلوث عن طريق التعقيم عند 121 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
  5. استخدم مستخلص البروتين مباشرة لتصوير الزيموغرافيا عن طريق إضافة حجم متساو من 2x عينة مؤقتة.
  6. استخدم مقايسة تقدير برادفورد لتحديد تركيز البروتين.
  7. إذا كان تركيز البروتين منخفضا ، فقم بترسبه بالأسيتون عن طريق خلط البروتين بحجم 4 أضعاف الأسيتون لهطول الأمطار واحتضانه طوال الليل عند -20 درجة مئوية. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وجفف الحبيبات الناتجة في الهواء ، وأعد تعليقها في PBS أو قم بإذابتها في المخزن المؤقت المطلوب وتخزينها عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. استخدم التجميد للتخزين أو النقل على المدى الطويل.
    ملاحظة: بسبب البروتياز النشط في المستخلص وعدم وجود مثبطات البروتياز ، قد تتحلل البروتينات في العينة.

2. الزيموغرافيا من الجيلاتينازات

  1. تحضير جل SDS PAGE المبلمر المشترك بالجيلاتين
    1. حل الجل
      1. اصنع مزيج الجل المحلل عن طريق إضافة المكونات بالكميات المطلوبة لصب الجل. إلى 3.86 مل من الماء في دورق سعة 50 مل ، أضف 2.5 مل من Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) ، و 0.1 مل من محلول مخزون الجيلاتين بنسبة 10٪ ، و 3.34 مل من محلول الأكريلاميد مكرر (ABA) ، و 0.1 مل من 10٪ SDS ، و 0.006 مل من TEMED ، و 0.1 مل من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم واخلطهم جيدا بدون رغوة وفقاعات. يتطلب النظام المذكور (الألواح الزجاجية العادية ؛ 18 × 8 سم) 10 مل من مزيج الجل المحلل.
        ملاحظة: إذا كان الجيلاتين من مادة مجمدة ، فقم بإذابة الثلج حتى يذوب لتنظيف المحلول دون أي كتل. أضف بيرسلفات الأمونيوم قبل الصب مباشرة لأن البلمرة ستبدأ مباشرة بعد إضافة بيرسلفات الأمونيوم.
      2. صب مزيج هلام المحلول في غرفة الصب حتى ~ 3-5 مم أسفل علامة قاع الآبار. تجنب فقاعات الهواء.
      3. اسكب بعض الماء ببطء للحصول على طبقة متساوية 1 مم على الجزء العلوي من الجل وإزالة الفقاعات. اسمح للجل بضبطه لمدة 1 ساعة.
        ملاحظة: يمكن تأكيد تكوين الجل من خلال البحث عن فصل الطور بين طبقة الماء والهلام. لا يمكن سكب الجل حتى لو كان كاسيت الجل مائلا.
    2. جل التراص
      1. تحضير جل التكديس عن طريق خلط المكونات التالية. إلى 1.84 مل من الماء في دورق سعة 10 مل ، أضف 2.5 مل من Tris-Cl (درجة الحموضة 6.6) ، و 0.35 مل من ABA ، و 0.03 مل من 10٪ SDS ، و 0.006 مل من TEMED. يتطلب نظام 8 × 10 سم بسماكة 1 مم 3 مل من مزيج الهلام المحلول.
      2. من كاسيت الجل ، قم بصب الماء المتكون في الجزء العلوي من الجل عن طريق إمالة إعداد الجل إلى جانب واحد ومسح الماء الذي تم جمعه من الزاوية باستخدام شريط ضيق من ورق الترشيح.
      3. أضف 0.03 مل من 10٪ APS إلى الخليط المذكور في الخطوة 2.1.2.1 واخلطه دون تكوين فقاعات.
      4. صب جل التكديس على جل الحل وضع المشط على الفور في موضعه دون تكوين فقاعات هواء تحت أسنان المشط ، مع ترك سمك 3-5 مم من جل التكديس بين الجل القابل للحل وأسفل أسنان المشط. انتظر لمدة 3 ساعات على الأقل للبلمرة الكاملة والتشابك للجيلاتين.
      5. أخرج الفاصل السفلي وقم بتثبيت الجل على جهاز الرحلان الكهربائي.
      6. ضع الجل ببطء في الخزان الذي يحتوي على عازلة قطب كهربائي 1x ، مع التأكد من عدم وجود هواء محاصر في قاع الجل.
  2. تحضير العينة
    1. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت للعينة إلى المستخلص واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة للسماح ل SDS بالارتباط بالبروتين. استخدم عينة تحتوي على 2 ميكرولتر من المصل البشري بحجم متساو من عينة المخزن المؤقت كعنصر تحكم إيجابي.
  3. تحميل العينة
    1. قم بتحميل العينة بعناية في الآبار باستخدام ماصة ضيقة الرأس أو حقنة هاميلتون (0.5-1 مل). أضف تدريجيا عازلة القطب الكهربائي لملء الأجزاء المتبقية من الآبار ، والجزء العلوي من الجل ، والخزان العلوي لوحدة الرحلان الكهربائي دون إزعاج العينات المحملة.
      ملاحظة: يجب غسل حقنة هاميلتون جيدا بين العينات لتجنب التلوث المتبادل.
  4. تشغيل الرحلان الكهربائي
    1. ابدأ الرحلان الكهربائي عند 6 مللي أمبير لكل هلام وقم بتشغيله حتى تدخل مقدمة الصبغة إلى جل الحل. بعد ذلك ، قم بزيادة التيار إلى 12 مللي أمبير لكل هلام واستمر حتى تصل مقدمة الصبغة إلى 1 سم فوق قاع الجل.
      ملاحظة: قد يتغير وقت التشغيل اعتمادا على تركيز ABA المستخدم وحجم البروتين المستهدف.
  5. وضع علامة على اتجاه نطاقات المعيار
    1. بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي ، قم بتفكيك الألواح الزجاجية بعناية باستخدام أداة فصل الألواح أو الملعقة البلاستيكية وحدد اتجاه تحميل العينة عن طريق قطع الزاوية السفلية اليمنى من الجل وقم بتمييز أشرطة العلامات الملطخة مسبقا عن طريق تثقيب الثقوب القريبة أو مسح الجل.
  6. إعادة تكوين الإنزيمات التي تم حلها
    1. اغمر الجل في محلول إعادة التشكيل الذي يحتوي على Triton X-100 في صينية هلامية واحتضنه لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون اهتزاز.
      ملاحظة: يعيد Triton X-100 تشكيل البروتينات ، حيث قد يتم تغيير طبيعة هلام التصويرم الزيني الذي يحتوي على بروتينات محلولة ويفقد نشاطه في وجود SDS.
  7. حضانة لنشاط البروتياز
    1. استبدل محلول إعادة التشكيل بمخزن مؤقت للتنشيط يغمر الجل تماما ويحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في حاضنة.
      ملاحظة: قم بتعديل المخزن المؤقت للتنشيط عن طريق إضافة مثبطات أو منشطات للبروتينات ذات الأهمية لتوصيف نشاط البروتيناز حسب الحاجة.
  8. تلطيخ الوزيموغرام
    1. بعد الحضانة ، قم بإزالة مخزن التنشيط واشطف الجل لفترة وجيزة بالماء لمدة 1 دقيقة لإزالة أي متبقي من Triton X-100 ولمنع الرغوة أثناء الرج.
    2. أضف محلول التلوين إلى الدرج ، مع التأكد من غمر الجل بالكامل. رج الجل برفق بسرعة منخفضة لمنع التلف. استمر في التلوين حتى يتحول الجل إلى اللون الأزرق تماما.
    3. قم بإزالة البقعة الزائدة من سطح الجل عن طريق شطفه بالماء لمدة 1 دقيقة. أضف محلول إزالة البقع إلى الصينية ورجه برفق. استبدل محلول إزالة البقع بمحلول جديد عدة مرات حتى يتم تحقيق تباين النطاق المطلوب على الخلفية الزرقاء.
      ملاحظة: أثناء إجراء إزالة البقع ، راقب الجل باستمرار للتأكد من أنه لا يصبح متلوثا تماما ، مما يسمح بمراقبة وتسجيل العصابات المحللة للبروتين.
    4. امسح الجل ضوئيا في نظام توثيق هلام أو ماسح ضوئي للوثائق ، وحدد الكتلة الجزيئية لنطاقات البروتين من خلال مقارنتها بمعايير البروتين.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تظهر النتيجة الرسم الوزينوماني للبروتين البريماني والجيلاتيناز من المصل البشري. تمثل النتائج ، الموضحة في الشكل 1 ، البروتياز كشرائط بيضاء شفافة على خلفية زرقاء. تمثل العصابات المناطق التي يتحلل فيها الجيلاتين المبلمر وبالتالي لا يلون ملطخا ، في حين أن مناطق أخرى من الجل بأكمله ملطخة باللون الأزرق بسبب وجود الجيلاتين. علاوة على ذلك ، فإنه يدل على أنه على الرغم من أن الجيلاتين هو أيضا بروتين ، إلا أنه لا يتسرب في الرحلان الكهربائي بسبب البلمرة المشتركة مع مادة الأكريلاميد. هذا يدل على أهمية ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أثناء تحضير هلام الأكريلاميد ، يتبلمر الجيلاتين مع مصفوفة بوليمر الأكريلاميد. وبالتالي ، يظل الجيلاتين المبلمر المشترك ثابتا داخل الجل ولا يهاجر أثناء الرحلان الكهربائي ، على الرغم من أنه بروتين. بعد الرحلان الكهربائي ، يتم فصل البروتينات الأصلية المستخرجة باستخدام deoxycholate و 6-aminocaproic acid buffer وفقا لكتلتها وشحنتها. بعد إزالة SDS ، يتم إعادة تشكيل هذه البروتينات في وجود Triton X-100 واستعادة نشاطها. في ظل الظروف الأصلية ، اعتمادا على متطلبات الجيلاتيناز المختلفة ، يحلل الإنزي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن امتنانهم لشعبة صرب ، قسم العلوم والتكنولوجيا ، نيودلهي ، على دعمهم من خلال منح No.SR/S0/HS/0108/2012 ، إلى MGM

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
6-أمينوكابرويكميركأ2504
حمض الخليك  سيغما  695092
أسيتون    سيغما  32201
أكريلاميد    سيغما  أ 3553
برسلفات الأمونيوم    سيغما  أ 3678
مكرر الأكريلاميد    سيغما  ط7279
جزء الألبومين المصل البقري V (BSA)  سيغما  أ 8022
بروموفينول أزرق    سيغما  ب -8026
CaCl2ميركج 4901
كوماسي أزرق لامع    سيغما1.12553
ديوكسيكولات    سيجما ألدريتشD6750
إلينغهاوزن &ndash ؛ McCullough – جونسون – هاريس (EMJH) وسط ، ديفكو  ديفكو  279410
الجيلاتينميركجي 9382
الجلسرينميركجي 5516
جلايسين G8790    سيغما  جي -8898
Leptospira interrogans serovar Copenhageni سلالة Fiocruz L1-130 (ATCC BAA-1198) , يتم الاحتفاظ بها في المستودع الحيوي ل ICMR-RMRC Portblairيتم الاحتفاظ بها في المستودع الحيوي ل ICMR-RMRC بورت بليردرجة حرارة النمو المثلى 30 ° ؛ C
كلوريد المغنيسيوم M8266  سيغما  م 8266
ميثانول    سيغما  17995-7
محلول ملحي من الفوسفات    سيغماP4417 
أداة فصل الألواحعجب ويجل
الدوارالعلوم الحراريةفايبر لايت F15 8x50 cy
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)    سيغما  إل -4396
TEMED    سيغما  تي 9281
تريتون X-100    سيجما ألدريتشتي 8787
قاعدة تريزما (TRIS)     سيغما  تي 6066

المراجع

  1. Yue, B. Biology of the extracellular matrix. J Glaucoma. 23 (8 Suppl 1), S20-S23 (2014).
  2. Cabral-Pacheco, G. A., et al. The roles of matrix metalloproteinases and their inhibitors in human diseases. Int J Mol Sci. 21 (24), 1-53 (2020).
  3. Ambili, M., Jayasree, K., Sudhakaran, P. R. 60K gelatinase involved in mammary gland involution is regulated by β-oestradiol. Biochim Biophys Acta. 1403 (3), 219-231 (1998).
  4. Zhang, Y. -Z., Ran, L. -Y., Li, C. -Y., Chen, X. -L. Diversity, structures, and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases. Appl Environ Microbiol. 81 (18), 6098-6107 (2015).
  5. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Crit Rev Microbiol. 42 (1), 106-126 (2016).
  6. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).
  7. Kramer, R. A., Zandwijken, D., Egmond, M. R., Dekker, N. In vitro folding, purification and characterization of Escherichia coli outer membrane protease OmpT. Eur J Biochem. 267 (3), 885-893 (2000).
  8. Kum, S. L., Ho, J. C. S., Parikh, A. N., Liedberg, B. Amphiphilic membrane environments regulate enzymatic behaviors of Salmonella outer membrane protease. ACS Bio Med Chem Au. 2 (1), 73-83 (2022).
  9. Sarma, A., et al. Extracellular proteome analysis shows the abundance of histidine kinase sensor protein, DNA helicase, putative lipoprotein containing peptidase M75 domain and peptidase C39 domain protein in Leptospira interrogans grown in EMJH medium. Pathogens. 10 (7), 852(2021).
  10. Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
  11. Levy, D., Gulik, A., Seigneuret, M., Rigaud, J. L. Phospholipid vesicle solubilization and reconstitution by detergents. Symmetrical analysis of the two processes using octaethylene glycol mono-n-dodecyl ether. Biochemistry. 29 (40), 9480-9488 (1990).
  12. Lichtenberg, D., Ahyayauch, H., Alonso, A., Goñi, F. M. Detergent solubilization of lipid bilayers: a balance of driving forces. Trends Biochem Sci. 38 (2), 85-93 (2013).
  13. Schägger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  14. Schägger, H., von Jagow, G. Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form. Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).
  15. Zeug, A., et al. Current microscopic methods for the neural ECM analysis. Prog Brain Res. 214, 287-312 (2014).
  16. Madathiparambil, M. G., et al. A zymography analysis of proteinase activity present in Leptospira. Curr Microbiol. 62 (3), 917-922 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

استخلاص البروتينيزبروتينات الغشاء الخارجيإمراضية الليبتوسبيراتحليل الزيموغرافيا بالجيلاتينالفصل الكهربائي للهلام باستخدام دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS-PAGE)توصيف الميتالوبروتيازتحلل المصفوفة خارج الخلويةتحليل البروتينات باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة ومطياف الكتلة المتوالي (LC-MS/MS Proteomics)
الاستخراج بخطوة واحدة والتحليل الزيموغرافي للجيلاتينات البكتيرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.