يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

إثراء البروتينات تحت الخلوية في Leptospira باستخدام نهج التجزئة القائم على Triton X-114

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67298

⸱

أغسطس 8, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, ICMR - Regional Medical Research Centre, 2Department of Chemistry & Molecular Biology, University of Gothenburg

في هذه المقالة

ملخص

على الرغم من أن بدائيات النوى تفتقر إلى نظام عضوي ، إلا أن هناك مناطق فرعية بها بروتينات موضعية. يعد التحليل الكمي والنوعي للإنزيمات والبروتينات في المناطق تحت الخلوية أمرا مهما لتطوير أهداف الأدوية واللقاحات. هنا ، نوضح التجزئة الخلوية للبروتينات Leptospiral باستخدام Triton X-114 وتحليله.

الملخص

تفتقر بدائيات النوى إلى عضيات دقيقة تحت الخلوية ولكنها تظهر مناطق مميزة مثل السيتوبلازم والغشاء الداخلي والمحيط والغشاء الخارجي ، حيث يتم تنظيم معظم الوظائف الكيميائية الحيوية والفسيولوجية. وبالتالي ، فإن فهم الخصائص الوظيفية للبروتينات يتطلب توضيح توطينها تحت الخلوي. ومع ذلك ، فإن استخراج البروتينات تحت الخلوية من البكتيريا سالبة الجرام يشكل تحديات بسبب طبقتها ثنائية الفوسفوليبيد المعقدة. على الرغم من أن Triton X-114 قد أظهر وعدا في استخراج بروتين الغشاء الخارجي (OMP) ، إلا أن البروتوكول الموجز لا يزال بعيد المنال. يوضح هذا البروتوكول سير عمل خطوة بخطوة لاستخراج البروتينات تحت الخلوية باستخدام لولبيات Leptospira كنموذج. تنتج هذه التقنية ، التي تتميز بالتجزئة تحت الخلوية وفصل الطور ، كسورا مميزة لبروتينات الغشاء السيتوبلازمي والخارجي والداخلي. يعتبر المنظف Triton X-114 مناسبا تماما لفصل الطور نظرا لدرجة حرارة نقطة السحابة المثلى (~ 22 درجة مئوية) وتركيز المذيلات الحرجة المنخفض (CMC) ، مما يتيح استخلاص وتنقية البروتينات الأصلية بكفاءة مع الحد الأدنى من التمسخ. والجدير بالذكر أن التحليل يكشف عن الكفاءة في تمييز البروتينات عن الأغشية الداخلية والخارجية المتميزة عن السيتوبلازم.

المقدمة

تلعب تحليلات البروتين تحت الخلوية (SCP) دورا محوريا في توضيح التسبب في المرض البكتيري من خلال تحليل البروتين داخل مقصورات فرعية محددة من الخلايا البكتيرية. يميز نهج البروتينات تحت الخلوية البروتينات البكتيرية داخل مقصورات مميزة ، مما يقلل من التعقيد عن طريق استبعاد البروتينات الوفيرة للغاية وتقديم رؤى حول تنظيمها ووفرة نسبية1،2. على سبيل المثال ، باستخدام التجزئة تحت الخلوية وتقنيات LC-MS / MS ، كشفت دراسة عن Shewanella oneidensis النقاب عن جزء كبير من بروتينها ، وقدمت تفاصيل مهمة فيما يتعلق ببنية المقصورة لوفرة الخلايا والبروتين. تعمل هذه الدراسة كإطار أساسي للتحقيقات اللاحقة في التنظيم الخلوي داخل البكتيريا سالبةالجرام 3. في مجال التسبب البكتيري ، يعد تحديد البروتين البكتيري أثناء العدوى في الجسم الحي أمرا ضروريا لفهم الآليات التي تقود الإمراض4. كان التحقيق في بروتين السالمونيلا داخل الخلايا داخل الخلايا الظهارية عبر مراحل العدوى المختلفة مفيدا في الكشف عن الاستراتيجيات التكيفية التي تستخدمها مسببات الأمراض البكتيرية داخل بيئتها داخل الخلايا4،5. توفر استراتيجيات SCP رؤى شاملة حول الديناميكيات الخلوية من خلال تقييم وفرة البروتين ونقلها داخل المقصورات الخلوية المختلفة. تسهل هذه الطريقة التحديد الشامل للبروتينات من الأجزاء البكتيرية المتنوعة ، مما يعزز التحليل الشامل للبروتينات البكتيرية6،7.

لا يملي التوزيع الخلوي للبروتينات نشاطها الوظيفي فحسب ، بل يعزز أيضا تنوعها الوظيفي8. على سبيل المثال ، تظهر الإنزيمات آليات تنظيمية متنوعة ومستويات نشاط اعتمادا على توطينها تحت الخلوي. على سبيل المثال ، تظهر ترانسجلوتاميناز (TGases) أدوارا مميزة أو آليات تنظيمية عبر مقصورات فرعية مختلفة في أنابيب حبوب اللقاح: تدمج TGases السيتوبلازمية الأمينات الأولية في بروتينات العصارة الخلوية (على سبيل المثال ، الأكتين والتوبولين) بطريقة تعتمد على Ca (2+) ، وتتفاعل مع الهيكل الخلوي. ترتبط TGases الغشائية بأغشية جولجي والبلازما ، مما يشير إلى دور في توصيل الخلايا الخارجية. وتنظم TGases المرتبطة بجدار الخلية النمو القمي عن طريق تحديد الموقع مع علامات جدار الخلية. يتم التوسط في هذه الفروق الوظيفية من خلال الأدوار الخاصةبالمقصورة 9. علاوة على ذلك ، فإن إصلاح البروتينات المؤكسدة في الغلاف البكتيري يؤكد الدور الحاسم لأنظمة الإنزيم داخل مقصورات خلوية محددة معرضة لأنواع الأكسجينالتفاعلية 10. ضع في اعتبارك سينسيز أكسيد النيتريك البطاني (eNOS) ، الذي يتم تعديل توطينه تحت الخلوي عن طريق تعديلات الدهون ، مما يؤثر على تفاعله مع الأغشية الخلويةالمتنوعة 11. يحافظ تقسيم الإنزيم على بيئات مميزة تفضي إلى التفاعلات بين الإنزيمات والركائز ، وبالتالي تسهيل عمليات التمثيل الغذائي الخاصة بالمقصورة12.

لا تحتوي البكتيريا وبدائيات النوى الأخرى على عضيات دون خلوية واضحة. هناك مناطق مميزة ، بما في ذلك السيتوبلازم والغشاء الداخلي والمحيط والغشاء الخارجي. يتم تنظيم معظم الوظائف البيوكيميائية والفسيولوجية في الكائن الحي في مقصورات قبو فرعيةمختلفة 13. لذلك ، يعد توطين البروتينات تحت الخلوية أمرا مهما للتنبؤ بخصائصها الوظيفية. ومع ذلك ، فإن استخراج البروتينات تحت الخلوية من البكتيريا سالبة الجرام يشكل تحديات بسبب طبقتها الثنائية الفوسفوليبيد مزدوجة الغشاء المعقدة. غالبا ما تؤثر طرق الاستخراج التقليدية ، التي تستخدم منظفات مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) والمواد المضافة مثل اليوريا ، على سلامة بروتين الغشاء ، مما يؤثر على التحليلات النهائية14،15. علاوة على ذلك ، تلعب تركيبة الدهون دورا مهما في تشكيل التعديلات التوافقية لبروتينات الغشاء. يعتمد نجاح الذوبان على عوامل مثل نسبة المنظفات إلى الدهون والبروتين ، حيث تتضمن العملية إدخال المنظفات في طبقة الدهون الثنائية متبوعا بإذابة البروتين16. يعد اختيار المنظف أمرا بالغ الأهمية لإذابة بروتينات الغشاء بشكل فعال ، مع الأخذ في الاعتبار عوامل مثل درجة حرارة نقطة السحابة ووقت الحضانة17. يمكن أن تؤثر البيئة الدهنية على التغيرات التوافقية لبروتينات الغشاء18،19.

المنظفات ضرورية لاستخراج بروتينات الغشاء من الأغشية البيولوجية وضمان قابليتها للذوبان في المحاليل المائية ، وهو شرط أساسي لتنقية البروتين اللاحقة. ومع ذلك ، غالبا ما يكون تنقية بروتينات الغشاء أمرا صعبا لأنه يتم إزالتها من بيئة الغشاء الدهني الأصلية ووضعها في مخزن مؤقت للمنظفات ، والذي يكرر جزئيا فقط الخصائص الفيزيائية والكيميائية للغشاء20. بعد الاستخراج ، يتم تنقية بروتينات الغشاء عادة في العمليات اللاحقة باستخدام غسيل الكلى وترسيب البروتين وبعض طرق الكروماتوغرافيا كبروتينات قابلة للذوبان20,21. يوفر فصل الطور بديلا قويا أو مكملا لبروتوكولات التنقية القائمة على الكروماتوغرافيا ويمكن تطبيقه مباشرة على البروتينات القابلة للذوبان. في الأساس ، يسمح فصل الطور لبروتينات الغشاء المتكاملة بالتقسيم إلى مرحلة تخصيب المنظفات والبروتينات العصارية الخلوية في المرحلة المائية المستنفدة من المنظفات20,22. تم وصف العديد من المنظفات بأنها تستخدم في إذابة بروتينات الغشاء في دراسات سابقة20. وتشمل هذه عائلة Triton (Triton X-100 و Triton X-114) ، وعائلة Tween (Tween-20 ، و -80) ، والمنظفات الأنيونية ، والمنظفات الموجبة ، ومنظفات البولي أوكسي إيثيلين جلايكول أحادية الأثير وما إلى ذلك ، ولكن لها إيجابيات وسلبيات من حيث بنية البروتينات ووظيفتها20. تؤثر الخصائص الفيزيائية والكيميائية لهذه المنظفات بشكل كبير على تقسيم الطور وذوبان بروتينات الغشاء20. المنظفات عبارة عن جزيئات برمائية ذات مجموعة رأس قطبية وسلسلة هيدروكربونية كارهة للماء. بتركيزات منخفضة ، توجد كمونومرات في الماء. فوق تركيز المذيلات الحرج (CMC) ، فإنها تشكل مذيلات يعتمد حجمها على نوع المنظف ، حيث يشير رقم التجميع إلى عدد الجزيئات لكل مذيلات (وتسمى أيضا الوزن الجزيئي للمذيلة). عامل مهم آخر هو "نقطة السحابة" التي يمكن الوصول إليها عن طريق تغيير درجة حرارة محلول المنظفات المائي الميسيلار الذي يصبح عكرا ويشكل في النهاية مرحلتين متميزتين. تعرف هذه العملية باسم فصل الطور أو استخراج نقطة السحابة. يمكن أن ينتج عن CMC العالي المزيد من بروتينات الغشاء المقابلة لتركيزات عالية من المنظفات ذات الارتباط الأضعف ، والتي يمكن تحليلها بالكلى مقابل مخزن مؤقت بتركيز منظف محدد20. ومع ذلك ، فإن الوصول إلى CMC مرتفع في معظم المنظفات يتطلب درجة حرارة عالية لنقطة السحابة ، مما قد يؤثر على بنية البروتين المستخرج ووظيفته ويؤثر على العمليات النهائية. حتى التركيز العالي للمنظفات في هذه المرحلة قد يكون ضارا بالبروتين ويخلق مشاكل في التعامل مع السوائل لسحب العينة بالحجم الدقيق بسبب اللزوجة العالية. على سبيل المثال ، يحتوي triton X-100 على إنتاجية عالية من بروتينات الغشاء في مذيلة المنظفات فوق درجة حرارة نقطة السحابة البالغة 64-65 درجة مئوية. للحفاظ على درجة حرارة العمل ، 9٪ -23٪ (NH4)2حتي4 أو يمكن تقليل إضافة كلوريد الصوديوم بنسبة 16٪ -25٪ إلى درجة حرارة الغرفة (RT) ، مما يؤدي إلى تركيز عال من المنظفات ، مما يؤثر على الأرجح على استقرار البروتين. وبالمثل ، يستخدم الاستخراج القائم على Tween درجة حرارة عالية لنقطة السحابة (76 درجة مئوية للتوين 20 و 93 درجة مئوية للتوين 80). يستخدم المنظف الأنيوني SDS بشكل متكرر في تطبيقات البروتين ولكنه عادة ما يفسد بروتينات20. حدد الباحثون ، الذين يهدفون إلى استخراج بروتينات الغشاء بكفاءة ، Triton X-114 كمنظف كلاسيكي نظرا لدرجة حرارة نقطة السحابة المثلى التي تبلغ حوالي 22 درجة مئوية ، وهي مثالية لدراسات البروتين الغشائي تم تقديم Triton X-114 لأول مرة بواسطة Bordier في عام 1981 ، ومنذ ذلك الحين تم استخدامه على نطاق واسع لاستخراج البروتين الغشائي وتنقيته عبر مصادر متنوعة ، بما في ذلك الأنسجة الحيوانية والنباتية وكذلك الكائنات الحية الدقيقة20,22. يمنع CMC المنخفض من Triton X-114 إزالته عن طريق غسيل الكلى. ومع ذلك ، فإن طبيعته المعتدلة تقلل من تمسخ بروتينات الغشاء في المرحلة الغنية بالمنظفات. بالإضافة إلى ذلك ، يشكل Triton X-114 مذيلات أصغر (ن = 7-8) مقارنة ب Triton X-10020. استخدم بروتوكول دراسة جيمس جي برايد Triton X-114 لاستخراج البروتين الغشائي من خلايا الثدييات المستزرعة. باستخدام درجة حرارة نقطة سحابة أعلى من 20 درجة مئوية (حضانة عند 30 درجة مئوية لمدة 3 دقائق) ، تم تقسيم بروتينات الغشاء المتكاملة إلى المرحلة المخصبة بالمنظفات ، بينما تم استرداد البروتينات الطرفية والعزل الخلوي من المرحلة المائية المستنفدة من المنظفات22. علاوة على ذلك ، استخدم David A. Haake et al. Triton X-114 لاستخراج بروتينات الغشاء الخارجي (OMPs) من Leptospira interrogans، مع وبدون CaCl2 كمادة مضافة23,24. أكدت الدراسات اللاحقة أن Triton X-114 يستخرج OMPs بشكل فعال من المقصورات تحت الخلوية دون إضافات مثل الجلسرين أو CaCl225,26. ومع ذلك ، فإن إدراج الأملاح يمكن أن يزيد من تركيز المنظفات ، مما قد يؤثر على دراسات البروتيوم واسعة النطاق باستخدام قياس الطيف الكتلي عالي الإنتاجية20. في عملنا على تحليل البروتين تحت الخلوي ، استخدمنا Triton X-114 إلى جانب قياس الطيف الكتلي الترادفي ، مما حقق تخصيبا كبيرا عبر جميع المقصورات تحت الخلوية ، بما في ذلك بروتينات السيتوبلازم والغشاء الداخلي والغشاء الخارجي25,26. الهدف الأساسي من البروتوكول الحالي هو إثراء الأجزاء الخلوية الفرعية لخلية بكتيرية سالبة الجرام النموذجية بكفاءة مع تقليل المشكلات في العمليات النهائية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تصميم البروتوكول ليكون فعالا من حيث التكلفة وفعالا من حيث الوقت. هنا ، نوضح بالتفصيل البروتوكول المحسن الذي طوره المختبر لعزل البروتين تحت الخلوي ونناقش كل عنق زجاجة تمت مواجهته أثناء عملية الاستخراج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول مترجم Leptospira لتجربة استخراج البروتين تحت الخلوي. في حين يمكن تكييف هذا البروتوكول للاستخدام مع البكتيريا سالبة الجرام الأخرى ، فقد يكون التحسين ضروريا اعتمادا على أهداف البحث المحددة. يقدم جدول المواد والجدول 1 قائمة بالمواد الكيميائية والمعدات، إلى جانب تركيبات المحاليل المؤقتة ومحاليل الكاشف، على التوالي، بينما يبين الجدول 2 مرافق المختبرات.

1. سلالة Leptospira وظروف الثقافة

  1. الحصول على L. interrogans المجموعة المصلية Icterohaemorrhagiae مصل كوبنهاغن سلالة فيوكروز L1-130.
    ملاحظة: تم الحصول على هذه السلالة من المجلس الهندي للبحوث الطبية - المركز الإقليمي للبحوث الطبية في بورت بلير ، الهند ، وهو مركز متعاون مع منظمة الصحة العالمية متخصص في تشخيص داء البريميات والمراجع والبحث والتدريب.
  2. تنمو Leptospira (لقاح يحتوي على ~ 1 × 106 خلايا / مل) في 50 مل من Ellinghausen McCullough Johnson Harris (EMJH) المتوسطة المكملة ب 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA).
  3. احتضان عند 30 درجة مئوية حتى تصل المزرعة إلى مرحلة نمو منتصف السجل (3.5 × 108 خلايا / مل). اختبر حصص الوسط المستزرع على ألواح أجار المغذيات للتأكد من بقاء الوسط غير ملوث.
    ملاحظة: استخدم الفحص المجهري للمجال المظلم وغرفة عد بتروف هوسر لحساب الخلايا. وللاطلاع على التفاصيل، يرجى الرجوع إلى المادة27 التي سبق نشرها.

2. حصاد الخلايا

  1. بعد فترة حضانة مدتها 7 أيام ، انقل ثلاث مكررات بيولوجية من L. interrogans إلى أنابيب الطرد المركزي بأحجام متساوية (25 مل لكل منها).
    ملاحظة: تم التعامل مع استزراع Leptospira داخل غطاء تدفق الهواء الرقائقي في منشأة مختبر BSL-2 أثناء النقل.
  2. أجهزة الطرد المركزي جميع الأنابيب عند 2500 × جم لمدة 45 دقيقة عند 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية بعناية في دورق يحتوي على مطهر وتخلص منها. استخدم حبيبات الخلية للخطوة التالية.
  3. اغسل كريات الخلية ثلاث مرات بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (1 مل في كل مرة) مكمل ب 5 ملي مولارMgClCl 2 ، والطرد المركزي عند 10,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية بعد كل غسلة.
    ملاحظة: ستؤدي هذه الخطوة إلى إزالة BSA غير المرغوب فيه الموجود في وسط EMJH من سطح حبيبات الخلية.

3. استخراج البروتين تحت الخلوي

  1. استخراج Triton X-114
    1. عالج حبيبات خلية Leptospira ، التي تم الحصول عليها بعد الحصاد ، باستخدام مخزن استخلاص يحتوي على 10 ملي مولار Tris-Cl (درجة الحموضة 8) ، و 1٪ Triton X-114 ، و 150 ملي كلوريد الصوديوم بمعدل 1 مل لكل حبيبات محصودة (الجدول 1) (اختياري - يمكن إضافة كوكتيل مثبط للبروتياز وفقا للغرض التجريبي).
      ملاحظة: يتضمن الإجراء ببساطة تعريض البكتيريا لمحلول منظف عن طريق إضافة مخزن الاستخراج لاستخراج بروتينات الغشاء.
    2. امزج المخزن المؤقت للاستخراج برفق مع الحبيبات باستخدام ماصة دقيقة أقل من 25 درجة مئوية حتى يصبح المحلول عكرا بصريا.
    3. احتضان الخليط طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    4. امزج المستخلص الناتج مرة أخرى باستخدام ماصة دقيقة وقم بالطرد المركزي عند 15,000 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    5. صب المادة الطافية في قارورة أخرى واحتفظ بحبيبات الخلية لعمليات الاستخراج اللاحقة.
      ملاحظة: يحتوي هذا المادة الطافية على مزيج من البروتينات المحبة للماء والمسعور بكثرة من السيتوبلازم والغشاء الخارجي ، ويستخدم لفصل الطور.
    6. أضف 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10 ملي مولار Tris-Cl (درجة الحموضة 8) ، و 8 M اليوريا ، وكوكتيل مثبط للبروتياز ، و 1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) إلى حبيبات الخلية.
    7. قم بدوامة الخليط باستمرار لمدة 5 دقائق بعد إضافة المخزن المؤقت للاستخراج ، ثم احتضانه عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق أخرى.
    8. الطرد المركزي الخليط مرة أخرى عند 15,000 × غرام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية وتعيين المادة الطافية الناتجة على أنها جزء الحبيبات (P).
      ملاحظة: تم العثور على جزء الحبيبات لاحتوائه على وفرة عالية من بروتينات الغشاء الداخلي في Leptospira25،26.
  2. قسم المرحلة
    1. اضبط تركيز Triton X-114 للمادة الطافية التي تم الحصول عليها من الاستخراج إلى 2٪. على سبيل المثال ، إذا كان حجم المادة الطافية 900 ميكرولتر ، أضف 9 ميكرولتر من منظف Triton X-114 لتحقيق التركيز المطلوب.
    2. احتضان الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق عند 30 درجة مئوية. يمكن أن يؤدي هذا الطرد المركزي منخفض السرعة إلى تسريع فصل المراحل.
    3. اترك الخليط ينفصل إلى مرحلتين متميزتين: مائي ومنظف. تأكد من الطرد المركزي المناسب بسرعة منخفضة لتحقيق الفصل المرئي. إذا لزم الأمر ، اتركه لمدة 1 دقيقة قبل العزل. إذا لم يحدث الانفصال، كرر الخطوة 3.2.2 حسب الحاجة.
      ملاحظة: يمكن ملاحظة فصل الطور بصريا ، عن طريق قياسات التعكر باستخدام مقياس الطيف الضوئي ، أو من خلال تشتت الضوء الساكن. لزيادة دقة مقايسة نقطة السحابة ، أضف صبغة كارهة للماء (5-Hexadecanoyl-aminoeosin) بتركيز 500 نانومتر إلى المحلول وقم بتحليلها باستخدام التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية المرئية (UV-VIS).
    4. اعزل المرحلة المائية العلوية عن طريق ثقب الواجهة بحقنة معقمة ونقلها إلى قارورة منفصلة. اعزل مرحلة المنظف السفلية باستخدام ماصة دقيقة وقم بتخزينها في قارورة منفصلة.
      ملاحظة: تعامل مع القارورة التي تحتوي على كلا المرحلتين بعناية أثناء عملية الفصل. قبل ثقب القارورة بحقنة ، افتح غطاءها لمنع كسر الإبرة أو صعوبة استخراج المرحلة المائية العلوية. يضمن استخدام المحقنة قياسا أكثر دقة للحجم لكل مرحلة بعد الفصل ويقلل من التلوث المتبادل للبروتين بين المراحل.
    5. قم بتسمية المراحل على أنها مائية (A) ومنظفات (D) وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

4. تقدير البروتين

  1. قم بتقييم تركيزات البروتين لكل جزء من Triton X-114 (مائي ومنظف وحبيبات) باستخدام مقايسة البيسينشونيني28 أو أي طرق أخرى مناسبة.

5. الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل كبريتات الصوديوم - بولي أكريلاميد (SDS- PAGE) الرحلان الكهربائي للهلام

ملاحظة: يجب معالجة البروتينات من كل جزء (مائي ، منظف ، بيليه) ببيتا ميركابتو إيثانول لتقليلها ، ثم فصلها باستخدام 10٪ SDS-PAGE (ثلاث مكررات بيولوجية). يمكن العثور على وصفة 10٪ SDS-PAGE في الجدول 1. لاستهداف عينة البروتين ، يجب إجراء أي تحليلات لنشاط الإنزيم في شكل أصلي يمكن حله في PAGE الأصلي.

  1. أعد تعليق عينة البروتين في الأسيتون المثلج باستخدام أربعة أضعاف حجم العينة. احتضان الخليط عند -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل ، ثم جهاز الطرد المركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق. بالإضافة إلى ذلك ، أعد تعليق جزء الحبيبات في 80٪ أسيتون مثلج بارد ، ثم احتضانه لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. جهاز طرد مركزي عند 14,000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة بلورات ملح اليوريا الزائدة.
  2. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة المادة الطافية بعناية وضع حبيبات البروتين في حمام جاف حتى يتبخر كل الأسيتون المتبقي من القوارير.
  3. احتضان عينات البروتين في عينة عازلة سعة 20 ميكرولتر تحتوي على بيتا ميركابتو إيثانول ، ثم تسخينها عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق في حمام مائي أو حمام جاف.
    ملاحظة: هنا ، تمثل عينات البروتين الجزء المائي (A) الذي يحتوي على بروتينات السيتوبلازمية ، وجزء المنظف (D) الذي يحتوي على بروتينات الغشاء الخارجي ، وجزء الحبيبات (P) الذي يحتوي على بروتينات الغشاء الداخلي.
  4. قم بتحميل العينات التي تحتوي على A و D و P في كل بئر من هلام SDS-PAGE بنسبة 10٪ جنبا إلى جنب مع علامة البروتين الملطخة مسبقا (M) والبروتين الكلي (T).
    ملاحظة: يمكن تحضير البروتين الكلي عن طريق سحب جميع الكسور الثلاثة معا في قارورة واحدة باستخدام 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة.
  5. استخدم عازلة قطب كهربائي 1x في جهاز الرحلان الكهربائي (الجدول 1). اضبط معلمات تشغيل الجل على 6 مللي أمبير لجل التكديس و 12 مللي أمبير للجل المحلل. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي في RT.
  6. تلطخ الجل ب Coomassie Brilliant Blue G أو بقع البروتين الأخرى المتوفرة في المختبر.

6. النشاف المناعي

  1. بعد فصل الجل ، احتضن الجل غير الملطخ في مخزن النقل (25 ملي مولار قاعدة تريس ، 190 ملي جلايسين ، 20٪ ميثانول) لمدة 5 دقائق.
  2. احتضان أوراق النشاف ذات الحجم المناسب في مخزن مؤقت لنقل اللطخة المناعية لمدة 5 دقائق ، ثم قم بتجميعها كطبقة سفلية من الساندويتش.
  3. استخدم أغشية فلوريد البولي فينيلدين (PVDF) أو أغشية النيتروسليلوز لنقل البروتينات من المواد الهلامية غير الملوثة. ابدأ بغمر غشاء PVDF في الميثانول المطلق لمدة 30 ثانية ، متبوعا بنقع لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت لنقل اللطخة المناعية. بعد ذلك ، قم بدمجها في شطيرة النشاف.
  4. الآن ، ضع الجل غير الملوثة الذي تمت إزالته من مخزن النقل المؤقت واستخدمه في شطيرة نشاف النقل.
  5. أخيرا ، قم بتغطية الساندويتش بوضعه على ورق نشاف آخر فوقه ، وحرر أي فقاعات هواء محاصرة باستخدام بكرة لطخة ، وقم بتشغيل النقل باستخدام طريقة نقل شبه جافة.
    ملاحظة: يمكن استخدام نهج أخرى، بما في ذلك النقل الجاف والرطب، اعتمادا على مرافق المختبر.
  6. اغمر الغشاء في مخزن مؤقت مانع (8٪ حليب خالي الدسم في TBS-0.1٪ Tween 20 [TBS-T]) لمدة ساعتين ، متبوعا بحضانة ليلية عند 4 درجات مئوية مع مضادات الأمصال أحادية النوع * التي تستهدف البروتين الدهني Leptospira LipL41 (1: 5000) ، أو خيوط سوط 35 كيلو دالتون بروتين أساسي (FlaB) (1: 4000) (* جسم مضاد مخصص). اشطف الغشاء ثلاث مرات باستخدام TBS-T ، مما يسمح لكل شطف بالاستمرار لمدة 5 دقائق.
    ملاحظة: استخدم أي جسم مضاد محل اهتمام. قد يختلف عامل تخفيف الأجسام المضادة.
  7. احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب للفأر مقترن ببيروكسيداز الفجل الحار (HRP) IgG (تخفيف 1: 20000) لمدة ساعتين في RT.
  8. قم بتعريض الغشاء لكاشف التلألؤ الكيميائي الكهربائي (ECL) لتصور نطاقات البروتين.
  9. ضع الغشاء تحت فيلم الأشعة السينية الحساس للأزرق داخل غرفة مظلمة.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام أي طرق تطوير أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذه التجربة ، استخدمنا اللولبية Leptospira ككائن حي نموذجي لاستخراج مقصورات تحت الخلوية. استخدمنا منهجية استراتيجية ترتكز على نقطة السحابة والتركيز الفطري الحرج (CMC) ، وتسخير فعالية Triton X-114 ، وهو منظف غير أيوني (الشكل 1). قبل المضي قدما ، تم إجراء تقدير البروتين لتقييم التركيز في كل جزء لتكرار بيولوجي واحد. لاحظنا نسبة تركيز 3: 1: 1.3 في كسور المائية (A): المنظفات (D): الحبيبات (P) ، لوحظت باستمرار في كل دفعة من التكرارات البيولوجية. خضعت عينات البروتين المستخرجة من كل جزء ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تلعب تقنيات التجزئة تحت الخلوية دورا محوريا في عزل المكونات الخلوية المنفصلة للتحليل اللاحق. يستخدم Triton X-114 ، وهو منظف غير أيوني ، بشكل شائع في هذه التقنيات بسبب قدرته على تقسيم العينات إلى مراحل متميزة ، مما يسمح بفصل المكونات الخلويةالمختلفة 32. كان Triton X-114 مفيدا بشكل خاص في استخراج بروتينات الغشاء (في شكل أصلي) من مجموعة متنوعة من المصادر ، بما في ذلك حويصلات البول خارج الخلية ، وأغشية جولجي ، والأغشية البكتيرية ، وبروتينات الغشاء الخارجي لمسببات الأم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وأعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متضاربة.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن خالص امتنانهم للمجلس الهندي للبحوث الطبية ، نيودلهي ، الهند ، على الدعم المالي المقدم من خلال المنحة رقم. Leptos / 22/2013-ECD-I-2012-2400 ووزارة العلوم والتكنولوجيا ، مجلس أبحاث العلوم والهندسة، نيودلهي، الهند، لدعمهم التمويلي عبر المنحة رقم. SR / SO / HS / 0108/2012 إلى M.G.M. بالإضافة إلى ذلك ، يعرب المؤلفون عن تقديرهم للمجلس الهندي للبحوث الطبية ، نيودلهي ، الهند ، لمنحه زمالة بحثية عليا من خلال المنحة رقم. ICMR-SRF 2020-0756 / PROTEOMICS- BMS ، زمالة / 131 / 2022-ECD-II-2021-8230 إلى HP و AS على التوالي ووزارة العلوم والتكنولوجيا ، مجلس أبحاث العلوم والهندسة ، نيودلهي ، الهند ، المنحة رقم. PDF/2017/000343 إلى S.A.D.C.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حمض الخليك  سيغما  695092
أسيتون    سيغما  32201
أكريلاميد    سيغما  أ 3553
برسلفات الأمونيوم    سيغما  أ 3678
توازن  شيمادوز  Z741079
مكرر الأكريلاميد    سيغما  ط7279
جزء الألبومين المصل البقري V (BSA)  سيغما  أ 8022
بروموفينول أزرق    سيغما  ب -8026
أنبوب الطرد المركزي (50 مل)تارسونز500020
قارورة مخروطية الشكل مع غطاء (150 مل)تارسونز431030
أجهزة الطرد المركزي للتبريد  إيبندورف  5355316200
كوماسي أزرق لامع    سيغما1.12553
مجهر المجال المظلم  زييس  GmbH37081
مناديل المهام الحساسةكيمتيك للعلوم34155
حمام جاف  إيبندورف  535531620
إلينغهاوزن &ndash ؛ McCullough – جونسون – هاريس (EMJH) وسط ، ديفكو  ديفكو  279410
صواني الجل: يجب أن تكون صواني الجل بأبعاد 2 سم على الأقل ولها سطح أملس ومسطح مع غطاء.  هوفر  لا ينطبق
منقار زجاجي (150 مل)تارسونز421030
جلايسين G8790    سيغما  جي -8898
ورق الترشيح Immobilon BlottingميليبورIBFP0813C
إعداد Immunoblot شبه جاف  عطا  طراز AE-6675
حاضنة - لاحتضان صواني الجل لمدة 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.  إيلا  SLI-700
تدفق الهواء الرقائقي  لا ينطبق  لا ينطبق
لومينول  سيغما  09253
كلوريد المغنيسيوم M8266  سيغما  م 8266
محرك مغناطيسي  تارسونز  6040
ميثانول    سيغما  17995-7
أطراف الماصة الدقيقة (10 µ L &ndash ؛ 10 مل)أكسيجنT-10 ، T-200-C ، T-1000-C ، T-10ML-C
الماصات الدقيقة  إيبندورف  EP2231300010
الأنابيب الدقيقة (1.5 مل قفل آمن)إيبندورفEP022363212
تدور صغير  جيناكسي  الجنرال ميني 6 كيلو
قارئ متعدد الأوضاعبي إم جي لابتيك  ق / ن 413-3877
حليب مجفف خالي الدسم ، بقريسيجما ألدريتشط7409
حمض P-Coumaric    سيغما  سي 9008
محلول ملحي من الفوسفات    سيغماP4417 
ثلاجة  ال جي  GC-B217BLJ2
الروك - هزاز أو شاكر دوار بسرعة منخفضة لتلطيخ الجل.  تارسونز  4080
SDS-PAGE الإعداد - جهاز الرحلان الكهربائي  شركة Hoefer، Inc.  SE300-10A-1.0  نموذج هوفر ' miniVE والتي يمكن أن يلقي هلام بحجم 10 سم × 8 سم بسمك 1 مم.
كلوريد الصوديوم      سيغما  5886
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)    سيغما  إل -4396
TEMED    سيغما  تي 9281
تريتون X-114    سيغما648468
قاعدة تريزما (TRIS) T6066    سيغما  تي 6066
دوار  تارسونز  3020

المراجع

  1. Curreem, S. O. T., Watt, R. M., Lau, S. K. P., Woo, P. C. Y. Two-dimensional gel electrophoresis in bacterial proteomics. Protein Cell. 3 (5), 346-363 (2012).
  2. King, B. R., Latham, L., Guda, C. Estimation of subcellular proteomes in bacterial species. Open Appl Informatics J. 3 (1), 1-11 (2009).
  3. Brown, R. N., Romine, M. F., Schepmoes, A. A., Smith, R. D., Lipton, M. S. Mapping the subcellular proteome of Shewanella oneidensis MR-1 using Sarkosyl-based fractionation and LC−MS/MS protein identification. J Proteome Res. 9 (9), 4454-4463 (2010).
  4. Cash, P. Investigating pathogen biology at the level of the proteome. Proteomics. 11 (15), 3190-3202 (2011).
  5. Liu, Y., et al. Temporal regulation of a Salmonella Typhimurium virulence factor by the transcriptional regulator YdcR. Mol Cell Proteomics. 16 (9), 1683-1693 (2017).
  6. Rey, S., Gardy, J. L., Brinkman, F. S. Assessing the precision of high-throughput computational and laboratory approaches for the genome-wide identification of protein subcellular localization in bacteria. BMC Genomics. 6 (1), 162(2005).
  7. Lietzén, N., et al. Quantitative subcellular proteome and secretome profiling of influenza A virus-infected human primary macrophages. PLoS Pathog. 7 (5), e1001340(2011).
  8. Arioka, Y., Watanabe, A., Saito, K., Yamada, Y. Activation-induced cytidine deaminase alters the subcellular localization of Tet family proteins. PLoS One. 7 (9), e45031(2012).
  9. Del Duca, S., Faleri, C., Iorio, R. A., Cresti, M., Serafini-Fracassini, D., Cai, G. Distribution of transglutaminase in pear pollen tubes in relation to cytoskeleton and membrane dynamics. Plant Physiol. 161 (4), 1706-1721 (2013).
  10. Gennaris, A., et al. Repairing oxidized proteins in the bacterial envelope using respiratory chain electrons. Nature. 528 (7582), 409-412 (2015).
  11. Schilling, K., et al. Translocation of endothelial nitric-oxide synthase involves a ternary complex with caveolin-1 and NOSTRIN. Mol Biol Cell. 17 (9), 3870-3880 (2006).
  12. Mintz-Oron, S., Aharoni, A., Ruppin, E., Shlomi, T. Network-based prediction of metabolic enzymes' subcellular localization. Bioinformatics. 25 (12), i247-i252 (2009).
  13. Phukan, H., Sarma, A., Rex, D. A. B., Rai, A. B., Prasad, T. S. K., Madanan, M. G. Unique posttranslational modification sites of acetylation, citrullination, glutarylation, and phosphorylation are found to be specific to the proteins partitioned in the Triton X-114 fractions of Leptospira. ACS Omega. 7 (22), 18569-18576 (2022).
  14. Tinrat, S. Preliminary phytochemical analysis, antibacterial and anti-biofilm activities of Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe extracts. Malaysian J Microbiol. 18 (4), 344-353 (2022).
  15. Silhavy, T. J., Kahne, D., Walker, S. The bacterial cell envelope. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (5), a000414-a000414 (2010).
  16. Arnold, T., Linke, D. The use of detergents to purify membrane proteins. Curr Protoc Protein Sci. 53 (1), ps0408s53(2008).
  17. Santos, H. deL., Ciancaglini, P. A practical approach to the choice of a suitable detergent and optimal conditions for solubilizing a membrane protein. Biochem Educ. 28 (3), 178-182 (2000).
  18. Picard, M., Duval-Terrié, C., Dé, E., Champeil, P. Stabilization of membranes upon interaction of amphipathic polymers with membrane proteins. Protein Sci. 13 (11), 3056-3058 (2004).
  19. Rice, A. J., Alvarez, F. J., Davidson, A. L., Pinkett, H. W. Effects of lipid environment on the conformational changes of an ABC importer. Channels. 8 (4), 327-333 (2014).
  20. Arnold, T., Linke, D. Phase separation in the isolation and purification of membrane proteins. BioTechniques. 43 (4), 427-440 (2007).
  21. Fricke, B. Phase separation of nonionic detergents by salt addition and its application to membrane proteins. Anal Biochem. 212 (1), 154-159 (1993).
  22. Pryde, J. G. Partitioning of proteins in Triton X-114. In: Methods in Molecular Biology. , Humana Press. Totowa. (2000).
  23. Haake, D. A., Walker, E. M., Blanco, D. R., Bolin, C. A., Miller, J. N., Lovett, M. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59 (3), 1131-1140 (1991).
  24. Haake, D. A., et al. The leptospiral major outer membrane protein LipL32 is a lipoprotein expressed during mammalian infection. Infect Immun. 68 (4), 2276-2285 (2000).
  25. Thoduvayil, S., et al. Triton X-114 fractionated subcellular proteome of Leptospira interrogans shows selective enrichment of pathogenic and outer membrane proteins in the detergent fraction. Proteomics. 20 (19-20), (2020).
  26. Phukan, H., et al. Physiological temperature and osmotic changes drive dynamic proteome alterations in the leptospiral outer membrane and enhance protein export systems. J Proteome Res. 22 (11), 3447-3463 (2023).
  27. Murray, G. L., King, A. M., Srikram, A., Sermswan, R. W., Adler, B. Use of luminescent Leptospira interrogans for enumeration in biological assays. J Clin Microbiol. 48 (6), 2037-2042 (2010).
  28. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
  29. Shang, E. S., Summers, T. A., Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding LipL41, a surface-exposed lipoprotein of pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 64 (6), 2322-2330 (1996).
  30. Evangelista, K. V., Hahn, B., Wunder, E. A. Jr, Ko, A. I., Haake, D. A., Coburn, J. Identification of cell-binding adhesins of Leptospira interrogans. PLoS Negl Trop Dis. 8 (10), e0003215(2014).
  31. Picardeau, M. Virulence of the zoonotic agent of leptospirosis: still terra incognita. Nat Rev Microbiol. 15 (5), 297-307 (2017).
  32. Hu, S., et al. Purification and identification of membrane proteins from urinary extracellular vesicles using Triton X-114 phase partitioning. J Proteome Res. 17 (1), 86-96 (2018).
  33. Radolf, J. D., Chamberlain, N. R., Clausell, A., Norgard, M. V. Identification and localization of integral membrane proteins of virulent Treponema pallidum subsp. pallidum by phase partitioning with the nonionic detergent Triton X-114. Infect Immun. 56 (2), 490-498 (1988).
  34. Nally, J. E., Whitelegge, J. P., Bassilian, S., Blanco, D. R., Lovett, M. A. Characterization of the outer membrane proteome of Leptospira interrogans expressed during acute lethal infection. Infect Immun. 75 (2), 766-773 (2007).
  35. Crother, T. R., Nally, J. E. Analysis of bacterial membrane proteins produced during mammalian infection using hydrophobic antigen tissue Triton extraction (HATTREX). Curr Protoc Microbiol. 9 (1), mc1201s9(2008).
  36. Casey, T. M., Meade, J. L., Hewitt, E. W. Organelle proteomics. Mol Cell Proteomics. 6 (5), 767-780 (2007).
  37. Bell, A. W., et al. Proteomics characterization of abundant Golgi membrane proteins. J Biol Chem. 276 (7), 5152-5165 (2001).
  38. Boonciew, P., et al. Improved antibody detection for canine leptospirosis: ELISAs modified using local leptospiral serovar isolates from asymptomatic dogs. Animals. 14 (6), (2024).
  39. Nogueira, S. V., et al. Leptospira interrogans enolase is secreted extracellularly and interacts with plasminogen. PLoS One. 8 (10), e0078150(2013).
  40. Riazi, M., Zainul, F. Z., Bahaman, A. R., Amran, F., Khalilpour, A. Role of 72 kDa protein of Leptospira interrogans. as a diagnostic marker in acute leptospirosis. Indian J Med Res. 139 (2), 308-313 (2014).
  41. Domingos, R. F., et al. Features of two proteins of Leptospira interrogans with potential role in host-pathogen interactions. BMC Microbiol. 12, 50(2012).
  42. Dhandapani, G., et al. Proteomic approach and expression analysis revealed the differential expression of predicted leptospiral proteases capable of ECM degradation. Biochim Biophys Acta Proteins Proteomics. 1866 (5-6), 712-721 (2018).
  43. Matsunaga, J., Werneid, K., Zuerner, R. L., Frank, A., Haake, D. A. LipL46 is a novel surface-exposed lipoprotein expressed during leptospiral dissemination in the mammalian host. Microbiology. 152 (12), 3777-3786 (2006).
  44. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4 (6), e6071(2009).
  45. Madathiparambil, M. G., Cattavarayane, S., Perumana, S. R., Manickam, G. D., Sehgal, S. C. Presence of 46 kDa gelatinase on the outer membrane of Leptospira. Curr Microbiol. 62 (5), 1478-1482 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Triton X 114 Leptospira SDS
إثراء البروتينات تحت الخلوية في Leptospira باستخدام نهج التجزئة القائم على Triton X-114
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.