تؤثر النوبات سلبا على الوظائف المختلفة ونوعية الحياة. تعرضت ديدان بلاناريا لتركيزات متفاوتة من الاختلاجات الكيميائية لتقييم الأنماط الظاهرية للنوبات وحركتها التخريبية. تقترح هذه الدراسة استخدام الديدان المستوية كنموذج للنوبات الحادة لدى البشر ولها أهمية في تطوير أدوية الصرع.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المستوي كنموذج حيواني للنوبات الحادة التجريبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الصرع هو من بين الاضطرابات العصبية الأكثر انتشارا التي تتميز بنوبات عفوية متكررة. تمثل النوبات مظهرا سريريا لنشاط الخلايا العصبية غير المنضبط والمتزامن بشكل مفرط. يعتمد مدى تلف الدماغ الناتج عن النوبات على مدتها وشدتها. للأسف ، لا يوجد علاج فعال للصرع. الهدف من هذا التحقيق هو تقييم ما إذا كانت دودة بلاناريا Dugesia dorotocephala يمكن أن تكون بمثابة نموذج للمساعدة في تحديد وتطوير علاجات للصرع يمكن أن تستهدف النوبات الحادة. حاليا ، يتم استخدام نماذج مختلفة ، مثل النماذج البحرية ، لتقييم الأدوية المضادة للنوبات (ASM). ومع ذلك ، فهي باهظة الثمن ، وهناك مخاوف أخلاقية. بدلا من ذلك ، توفر نماذج اللافقاريات فرصة بحثية فعالة من حيث التكلفة في عملية اكتشاف الأدوية ل ASM. تنتمي Planaria إلى عائلة الديدان المفلطحة وتعيش في المياه العذبة البحرية والبيئات الأرضية. Dugesia dorotocephala هو النوع السائد من المسطح المائي في جميع أنحاء أمريكا الشمالية. D. dorotocephala يقدم كنموذج لافقاريات قابل للتطبيق لدراسات الصرع نظرا لفعاليته من حيث التكلفة ، والخلايا العصبية الشبيهة بالفقاريات ، والسلوكيات القابلة للقياس الكمي ، على عكس اللافقاريات الأخرى أو الكبيرة. لقد تم استخدامها في العديد من دراسات علم الأدوية والسموم البيئية المتعلقة بالعمر والذاكرة والتجديد. في هذه الدراسة ، تعرضت بلاناريا لتركيزات مختلفة من بيلوكاربين ، وهو مخلج كيميائي شائع لدراسة سلوكهم عند التعرض. بعد الملاحظة ، تم القتل الرحيم للبلاناريا وحفظها إما في محلول الفورمالديهايد أو جولجي للتقييم النسيجي العصبي. لوحظت ستة أنماط ظاهرية سلوكية متميزة في السطح: التذبذبات الظهرية ، وتذبذبات الرأس ، والتمدد الظهري للذيل ، والشكل C ، ونفض الغبار على الرأس ، ونفض الغبار عن الذيل. زادت ترددات التذبذب الظهري بشكل ملحوظ بين المجموعات التجريبية مقارنة بالمجموعات الضابطة وأظهرت اعتمادا على الجرعة. بالإضافة إلى ذلك ، عطل بيلوكاربين حركة المستويات. يمكن أن تكون النوبات التي يسببها بيلوكاربين في بلاناريا بمثابة نموذج لتقييم النوبات الحادة والأدوية المضادة للنوبات ، وهو أمر ضروري في تطوير التدخلات العلاجية للمرضى الذين يعانون من الصرع.
المقدمة
الصرع ، الذي يتميز بنوبة صرع أو أكثر في غضون 24 ساعة دون سبب واضح ، يؤثر على ~ 50 مليون شخص على مستوىالعالم 1. من بينهم ، تم الإبلاغ عن إصابة 10-15 مليون شخص بالصرع المقاومللأدوية 2. لذلك ، فإن التحقيق في أدوية الصرع أمر بالغ الأهمية. تستلزم الحالة نوبات قصيرة من الحركة اللاإرادية الجزئية أو المعممة ، تتراوح من التحديق الفارغ إلى تصلب الجسم والاهتزاز ، وترتبط بزيادة النشاط الكهربائي فيالدماغ 3.
تاريخيا ، اعتمدت أبحاث الصرع على القوارض والثدييات الأخرى بسبب أوجه التشابه التطورية مع البشر. ومع ذلك ، يمكن أن تستغرق هذه الطرق وقتا طويلا ومكلفة ، مما يستلزم نهجا بديلا4،5. تم استخدام المخلوقات غير الثديية مثل ذباب الفاكهة والعلقات والضفادع الصغيرة وأسماك الزرد والديدان الأسطوانية في الدراسات وأظهرت نتائج واعدة6. علاوة على ذلك ، تبين أن بلاناريا يمكن أن توفر نموذجا للدراسة الجينومية المقارنة بين جينومات اللافقاريات والبشرية جنبا إلى جنب مع القدرة على اختبار الأدوية المؤيدة للاختلاج والأدوية المضادة للنوبات (ASM) والأنماط السلوكية6. تشتهر Planaria (Phylum Platyhelminthes) ، والمعروفة باسم الديدان المفلطحة وأعضاء فئة Turbellaria ، في المقام الأول بقدراتها على التجدد. ومع ذلك ، يركز هذا التحقيق على استجابتهم للمواد المسببة للنوبات.
تشترك Planaria في الآليات العصبية الأساسية مع البشر ، مثل الاستجابة للسيروتونين والدوبامين ، مما يدل على تشابه بنسبة 95٪ مع الجينات المرتبطة بالجهاز العصبي في دماغ الثدييات ويمتلكان بنية دماغية يمكن التعرفعليها 7. بالإضافة إلى ذلك ، فإنها تظهر حركات يمكن ملاحظتها في ظروف المختبر وهي فعالة من حيث التكلفة وفعالة من حيث الوقت وأخلاقية مقارنة بالقوارض أو الثدييات الأخرى. تم توثيق هذه السلوكيات التي يمكن ملاحظتها ، مثل الحركات الشبيهة باللولب ، والحركات الشبيهة ب C ، وعلى شكل جوز ، على نطاق واسع لعقود من الزمن وترتبط بمواد مثل الكوكايين والنيكوتين والدوبامين والبيلوكاربين7،8،9،10،11،12،13،14. ومن ثم ، تظهر بلاناريا كنموذج قابل للتطبيق لأبحاث أدوية الصرع في البشر.
تهدف هذه الطريقة إلى توصيف الخلايا العصبية للبلاناريا التي تعرضت للبيلوكاربين باستخدام صبغة جولجي. تستخدم صبغة جولجي لتصور الخلايا العصبية تحت الفحص المجهري الضوئي وقد تم استخدامها للتحقيق فيما إذا كان التغيير في التشكل مرتبطا بنوباتالصرع 15،16،17. لا يوجد في الأدبيات الحالية أي دليل على تلطيخ جولجي يتم إجراؤه على الأدمغة المستوية. على الرغم من أن الدراسات السابقة قد وثقت التأثيرات الدوائية من خلال مراقبة الأنماط الظاهرية السلوكية ، إلا أن هذه المخطوطة هي الأولى التي تميز الخلايا العصبية للبلاناريا المعرضة للبيلوكاربين باستخدام تلطيخ جولجي11،18. أثبتت هذه التقنية قيمتها في تصور وفهم التغيرات المورفولوجية المرتبطة بالنوبات. لاحظت هذه الدراسة زيادة كبيرة في تواتر سلوك التذبذب الظهري المتذبذب في الديدان المستوية مع زيادة تركيز البيلوكاربين.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: تم وصف التصميم التجريبي العام في الشكل 1.
1. فحص النمط الظاهري للسلوك
- تحضير تركيزات 1 ملي مولار و 2 ملي بيلوكاربين مذابة في مياه الينابيع وكذلك التحكم بمياه الينابيع فقط.
- ماصة 3 مل من كل محلول في صفيحة بئر 4 × 3 ، حيث يمثل كل صف تركيزا مختلفا من بيلوكاربين.
- ضع Dugesia dorotocephala التي تمت تربيتها في المختبر والتي يبلغ عمرها حوالي أسبوعين في كل من الآبار ال 12 باستخدام ماصة نقل مع قطع الطرف.
ملاحظة: قم بقص الطرف بحيث تكون النهاية كبيرة بما يكفي لتناسب planaria دون إتلافها. - سجل سلوك السطح لمدة 1 ساعة باستخدام أي كاميرا تسجل السلوكيات جيدا ويمكن ملاحظتها للعين البشرية ، موضوعة فوق لوحة البئر 4 × 3 في ظروف الإضاءة الداخلية العادية.
- كرر الخطوات 1.1-1.4 بتركيزات 3 ملي مولار و 4 ملي مولار و 6 ملي بيلوكاربين مذاب في مياه الينابيع.
2. تحليل الحركة
ملاحظة: تم تسجيل سلوكيات Planaria في آبار قطرها 2.5 سم. تم تقسيم تسجيلات الفيديو التي تبلغ مدتها ساعة واحدة إلى أجزاء مدتها 30 دقيقة واقتصاصها باستخدام برامج تجارية لتحليل المستويات بشكل فردي.
- ابدأ تجربة جديدة باستخدام برنامج تحليل السلوك الآلي. افتح نظام تعقب السلوك التلقائي المحسن. انقر فوق جديد ضمن تجربة جديدة. قم بتسمية التجربة.
- قم بإعداد الإعدادات التجريبية كما هو موضح أدناه.
- انقر على إعدادات التجربة في مطالبة القائمة. تأكد من أن الإعدادات افتراضية: مصدر الفيديو (من ملف الفيديو)، عدد الساحات (1)، الميزات المتعقبة (اكتشاف النقطة المركزية)، تقنية اكتشاف نقطة الجسم (المستندة إلى المحيط)، خيارات التحليل (لا شيء)، الوحدات (سم، ثانية، درجة).
- قم بإعداد إعدادات الساحة كما هو موضح أدناه.
- انقر فوق إعدادات الساحة ضمن علامة التبويب إعدادات الساحة في أعلى يمين لوحة الإعداد. عندما يطلب منك تحميل مقطع فيديو، حدد لقطات مسجلة من بلاناريا من موقع الملف المخزن. بمجرد تحديد الفيديو، انقر على Grab.
- اتبع التعليمات الموجودة على اللوحة العلوية اليمنى من الشاشة. انقر فوق 1. ارسم المقياس للمعايرة. في صورة الفيديو الخاصة بالبئر ، اسحب خط مقياس من حافة إلى حافة بئر العينة. أدخل مسافة البئر في العالم الحقيقي (2.5 سم).
- انقر فوق 2. حدد الشكل ورسم الساحة. تأكد من تحديد Arena 1 في اللوحة اليمنى. حرك مؤشر الماوس إلى أعلى منتصف الشاشة وانقر فوق أيقونة الدائرة.
- قم بإنشاء دائرة في صورة الفيديو التي تم تحميلها عن طريق السحب من محيط من الساحة إلى آخر. تأكد من أن الساحة في المنطقة البرتقالية. اضبط الشكل بحيث يناسب الساحة. تأكد من أن ملصق Arena 1 يقع ضمن حدود الساحة.
- في الجزء السفلي من اللوحة اليمنى، قم بتغيير الشكل والحجم والموضع (العرض: 2.75، الارتفاع: 2.75، X: 0، Y: 0) إلى القياسات المطلوبة.
- انقر فوق 3. حدد مناطق الشكل والرسم (اختياري). سيتم الآن تحديد مجموعة المنطقة 1 داخل اللوحة اليمنى. حرك مؤشر الماوس إلى أعلى منتصف الشاشة وحدد أيقونة الدائرة. قم بإنشاء دائرة أصغر في صورة الساحة عن طريق سحبها بداخلها.
- في اللوحة السفلية اليمنى، قم بتغيير الشكل والحجم والموضع إلى القياسات المطلوبة (العرض: 1.75، الارتفاع: 1.75، X: 0، Y: 0).
- انقر على زر إضافة تسمية منطقة في شريط القائمة نفسه مثل الدائرة. انقر داخل وسط الدائرة الأصغر. انقر بزر الماوس الأيمن فوق علامة المنطقة 1 في اللوحة اليمنى لإعادة تسمية مركز المنطقة.
- انقر فوق الزر إضافة تسمية منطقة مرة أخرى. انقر فوق محيط الساحة ، خارج منطقة المركز. انقر بزر الماوس الأيمن فوق المنطقة 2 في اللوحة اليمنى لإعادة تسمية المنطقة محيط.
- انقر فوق 4. تحقق من صحة الإعداد لضمان إعدادات الساحة الصالحة.
- قم بإعداد إعدادات التحكم في الإصدار التجريبي كما هو موضح أدناه.
- انقر فوق إعدادات التحكم في الإصدار التجريبي ضمن علامة التبويب إعدادات التحكم في الإصدار التجريبي في أعلى يمين لوحة الإعداد. ستظهر ستة مربعات مكونة. انقر فوق الإعدادات داخل المربع الرابع المسمى شرط، والذي يتضمن الوقت (1) والوقت اللانهائي (الشرط لم يتم استيفائه).
- انقر على الفقاعة بجانب بعد، ثم أدخل المدة (30 دقيقة) في مربع النص الأيمن. ستكون هناك أيضا قائمة منسدلة على يمين مربع نص الوقت للاختيار بين h و min و s.
ملاحظة: تعتمد إعدادات الكشف عن اللقطات المسجلة على جودة اللقطات. يمكن التلاعب بالطرق التالية لمراقبة أفضل النتائج ، خاصة باللقطات الفردية.
- قم بإعداد إعدادات الكشف كما هو موضح أدناه.
- انقر فوق إعدادات الكشف ضمن علامة التبويب إعدادات الاكتشاف في لوحة الإعداد العلوية اليمنى. انقر على حدد فيديو زر في اللوحة العلوية اليمنى. قم بتحميل الفيديو المطلوب إلى إعدادات الكشف الأساسية.
- انقر فوق علامة التبويب خيارات متقدمة في نفس اللوحة اليمنى. الآن ، ضمن علامة التبويب الطريقة ، تأكد من تعيينه على Gray Scaling. قم بتغيير النطاق (0 - 100).
- ضمن علامة التبويب Smoothing في اللوحة اليمنى، تأكد من أن تجانس بكسل الفيديو لا شيء، وإيقاف تشغيل تصحيح الإطارات المسقطة، وإيقاف تشغيل تقليل تشويش المسار.
- أسفل علامة التبويب Subject Contour في اللوحة اليمنى، اضبط إعداد التسلسل وقم بتغيير Erosion و Dilation و Erosion إلى 1 و 1 و 0 على التوالي.
- ضمن علامة التبويب حجم الموضوع، قم بتغيير الحد الأدنى (0) والحد الأقصى (125000). انقر على حفظ في أسفل يسار الصفحة.
- إعداد سلسلة من التجارب بالفيديو للمراقبة كما هو موضح أدناه.
- انقر فوق قائمة الإصدارات التجريبية في لوحة الإعداد العلوية اليمنى. قم بتحميل لقطات فيديو للعينات بالتسلسل المطلوب بالنقر فوق علامات القطع الناقص أسفل عمود ملف فيديو النظام. لإضافة المزيد من الإصدارات التجريبية، انقر فوق إضافة إصدارات تجريبية بالقرب من أعلى يمين لوحة قائمة الإصدارات التجريبية.
- قم بإعداد إعدادات الاكتساب.
- انقر على الاكتساب ضمن علامة التبويب الاكتساب في أعلى يمين الصفحة. ضمن إعدادات الاكتساب في اللوحة اليمنى، انقر فوق تعقب جميع الإصدارات التجريبية المخطط لها.
- لبدء الاستحواذ ، انقر فوق الزر الأحمر في الجزء السفلي الأوسط من الشاشة بجوار جاهز للبدء. سيبدأ الحصول على الفيديو الآن ويستغرق وقتا معينا ، اعتمادا على كمية وطول إصدارات الفيديو التي تم تحميلها.
- قم بإعداد إعدادات التحليل كما هو موضح أدناه.
- انقر فوق ملف تعريف التحليل ضمن علامة التبويب تحليل اللوحة اليمنى. انقر فوق المتغيرات التابعة الافتراضية المحددة ، السرعة والمسافة المقطوعة ، واحذفها.
- ضمن لوحة المتغيرات التابعة، ضمن علامة التبويب الموقع، انقر فوق In Zone. انقر فوق المربعين Center و Perimeter Zone بحيث يتم وضع علامة اختيار.
- انقر فوق علامة التبويب إحصائيات الإصدار التجريبي ضمن المربع في المنطقة. انقر لإلغاء تحديد زمن الانتقال إلى أولا. انقر على إضافة.
- ضمن علامة التبويب النص الأساسي ، انقر فوق الزر تدوير. انقر في اتجاه عقارب الساعة واترك العتبة (50.00 درجة) والحد الأدنى للمسافة المنقولة (2.00 سم) في الوضع الافتراضي. انقر على إضافة.
- انقر فوق الزر "تدبير" مرة أخرى وانقر فوق عكس اتجاه عقارب الساعة. انقر على إضافة.
- تحليل المسارات كما هو موضح أدناه.
- ضمن علامة التبويب النتائج، انقر فوق تعقب المرئيات. في اللوحة اليمنى، ضمن التصفية، قم بإلغاء تحديد الأخير. سيصور شريط التحكم في التشغيل في اللوحة الوسطى السفلية من الشاشة تصور المسار للعينات خلال أوقات محددة من المراقبة.
- تحليل النتائج وتصديرها. يمكن العثور على النتائج في بقية علامات تبويب اللوحة السفلية اليسرى. لتصدير البيانات، انقر على البيانات الأولية أو الإحصائيات ضمن تصدير في اللوحة اليمنى.
3. القتل الرحيم
- تحضير محلول 22 ملي من الأوجينول في مياه الينابيع. ضع بلاناريا في أطباق بتري مع 9 مل من محلول الأوجينول 22 ملي مولار باستخدام ماصة النقل المقطوعة ، مع الحفاظ على كل تركيز منفصل. القتل الرحيم لمدة 3 دقائق أو حتى تتوقف كل الحركة.
- ضع بلاناريا في طبق بتري طازج مملوء ب 9 مل من مياه الينابيع لشطفها 1x-2x ، وضعها إما في محلول Golgi الموضح أدناه (صبغة Golgi) أو 4٪ paraformaldehyde (صبغة التألق المناعي).
4. التحليل النسيجي
- تلطيخ جولجي
- بعد القتل الرحيم للبلاناريا ، ضعها في كوب أو طبق بتري مملوء بمزيج 1: 1 من المحاليل A و B من Golgi Stain Kit. استبدل المحاليل A و B في اليوم التالي بوضع planaria في دورق جديد مملوء بمزيج من المحاليل A و B.
- اسمح للبلاناريا بالجلوس لمدة أسبوع واحد في المحاليل A و B.
- قم بإزالة المستويات من المحاليل A و B وضعها في المحلول C في دورق آخر. استبدل المحلول C في اليوم التالي. اسمح للبلاناريا بالجلوس لمدة لا تقل عن 72 ساعة وحتى أسبوع واحد في المحلول C.
- قم بإزالة planaria من المحلول C باستخدام ماصة نقل وقم بتضمينها عن طريق وضع كمية صغيرة من مركب OCT على ظرف ، وإضافة planaria ، ثم إحاطة Planaria بمركب OCT. قم بتقطيع المستويات بشكل عرضي إلى أقسام 5 ميكرومتر باستخدام آلة ناظم البرد عند -24 درجة مئوية.
- قم بتركيب بلاناريا على شرائح مغلفة بالجيلاتين باستخدام ماصة نقل ومحلول C واتركها تجف في الظلام عند RT لمدة تصل إلى 3 أيام.
- شرائح البقع باستخدام محلول التلوين (محلول جزء واحد D ، محلول جزء واحد E ، 2 جزء من مياه الينابيع) عن طريق غمر الشرائح في أكواب مع المحاليل على النحو التالي: محلول تلطيخ لمدة 10 دقائق ، ثم في مياه الينابيع 2x لمدة 4 دقائق لكل منهما ، ثم 50٪ إيثانول لمدة 4 دقائق ، ثم 75٪ إيثانول لمدة 4 دقائق ، ثم 95٪ إيثانول لمدة 4 دقائق ، ثم في 100٪ إيثانول 4x لمدة 4 دقائق ، وأخيرا في الزيلين 3x لمدة 4 دقائق.
- الشرائح الغطاء مع وسائط التثبيت النسيجية ومراقبة الأنسجة تحت الفحص المجهري للمجال الساطع.
- تلطيخ التألق المناعي
- بعد القتل الرحيم للبلاناريا ، ضعه في 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة على الأقل. يمكن أيضا تخزينه في الثلاجة بعد هذه الخطوة.
- نقل بلاناريا إلى 20٪ سكروز من 4٪ PFA واتركها لمدة 1 يوم. قم بإزالة البلاناريا من السكروز وضعها في مخزن PBS المؤقت لمدة 5 دقائق.
- اشطفها ب 3-4 غسلات من PBS Buffer وانقله إلى 20٪ سكروز للتخزين حتى يصبح جاهزا للتلطيخ.
- ضعها في محاليل كحول 70٪ و 95٪ و 100٪ لمدة دقيقة واحدة لكل منها. ضعها في الزيلين لمدة 1 دقيقة.
- ضع في 95٪ و 70٪ كحول لمدة دقيقة واحدة لكل منهما. ضعها في المخزن المؤقت PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما. ضعه في محلول 60:40 من الميثانول وبيروكسيد الهيدروجين لمدة 10-15 دقيقة.
- اشطفها في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما. أضف حجم 4٪ بارافورمالدهايد المستخدم سابقا في 4.2.1 في هذا المخزن المؤقت PBS.
- اشطفها في PBS 3x لمدة 5 دقائق لكل منهما. كتلة لمدة 1 ساعة مع الحليب المجفف ، عن طريق تغطية بلاناريا به.
- قم بتخفيف الجسم المضاد الأولي (1H6) إلى 5 ميكروغرام / مل باستخدام PBS واحتضان الشرائح طوال الليل عند 4 درجات مئوية في محلول الجسم المضاد. في اليوم التالي ، اشطف planaria في PBS لمدة 10 دقائق.
- تمييع الجسم المضاد الثانوي (الماعز المضاد للفأر IgG) إلى 1 ميكروغرام / مل في PBS واحتضان الشرائح طوال الليل في RT في محلول الجسم المضاد. في اليوم التالي ، اشطف بلاناريا في PBS لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: الأجسام المضادة المختلفة لها تركيزات مثالية مختلفة. حدد هذا قبل بدء التجربة. - قم بتركيب بلاناريا كاملة على الشريحة ، وقم بتغطيتها بغطاء ، وأغلقها بوسائط تركيب مائية ، وراقب الأنسجة تحت المجهر الفلوري.
5. تحليل الصور
- افتح تطبيق برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر. قم بتثبيت المكون الإضافي colour_deconvolution2.jar في تطبيق برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر عن طريق سحب المكون الإضافي إلى التطبيق.
- حدد الصورة المراد تحليلها واسحبها إلى تطبيق برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر. انتقل إلى علامة التبويب صورة. انقر فوق اللون. انقر فوق إلغاء الالتفاف اللون2 v2.1.
- في خيار المتجهات ، انقر فوق H DAB. في خيار الإخراج ، انقر فوق 8bit_Transmittance. تأكد من تحديد جداول البحث المحاكاة والمنتج المتقاطع للون 3 وإظهار المصفوفات وإخفاء وسيلة الإيضاح. انقر فوق موافق.
- حدد الصورة بالأبيض والأسود للتأكد من أن تطبيق برنامج تحليل الصور مفتوح المصدر يمكنه تحليل الصورة بشكل فعال.
- انتقل إلى علامة التبويب صورة. انقر فوق ضبط. انقر على الحد. اضبط العتبة بحيث يكون تلطيخ DAB أو المقدمة حمراء اللون مع خلفية بيضاء. تأكد من أن الحد هو نفسه لكل صورة إذا تم تحديد صور متعددة.
- انقر فوق تحليل. انقر فوق تعيين القياسات. حدد المنطقة والحد الأدنى والحد الأقصى للقيمة الرمادية والحد إلى الحد وتسمية العرض والوسيط ومتوسط القيمة الرمادية. انقر فوق موافق. انقر فوق تحليل. انقر على قياس. احصل على النتيجة.
- كرر الخطوات من 1.2 إلى 1. يتم تحديد جميع الصور كميا. انقر فوق صورة النتائج. انقر على ملف. انقر على حفظ باسم. احفظ الملف كجدول بيانات واعرض البيانات على برنامج جدول البيانات.
6. التحليل الإحصائي
- احسب متوسط الأخطاء والمعيار للمتوسط (SEM) لسلوك المسطح باستخدام تحليل التباين (ANOVA) واختبار t للطالب للدلالة الإحصائية (ص < 0.05).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لوحظ السلوك التالي من قبل البلاناريا المعرضة لتركيزات متفاوتة من بيلوكاربين:
التذبذبات الظهرية: تكوين يشبه الفقاعة ينتقل من نهاية الجمجمة لجسم المستوي إلى النهاية الذيلية.
تذبذبات الرأس: تشكيل يشبه الفقاعة من قبل رأس المستوي الذي يشكل مظهرا يشبه الشرغوف.
شكل C: يتحرك الرأس في اتجاه عقارب الساعة والذيل يتحرك عكس اتجاه عقارب الساعة لتشكيل C.
نفض الغبار على الرأس: يهتز رأس المستوي فجأة إلى اليسار أو اليمين.
التذبذب الظهري للذيل: تكوين يشبه الفقاعة من ذيل المستوي الذي يشكل مظه...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أظهرت هذه الدراسة السلوك الناجم عن بيلوكاربين في بلاناريا بتركيزات مختلفة. كان السلوك الأكثر صلة هو التمدد الظهري المتذبذب ، حيث لم يتم توثيق هذا السلوك في دراسات أخرى تتعلق بالسلوك الشبيه بالنوبات في Planaria9،10،11،12. لا تزال الآلية التي يحفز بها البيلوكاربين سلوكيات شبيهة بالنوبات في بلاناريا غير معروفة. ومع ذلك ، توضح هذه الدراسة أن السلوكيات المختلفة قد ت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يعلنون عنه.
شكر وتقدير
نود أن نشكر صندوق حوافز أبحاث EVMS (PI: A.E. Musto) والدكتور خورخي جاكوت على اقتراحاته المفيدة في تحسين بروتوكول التألق المناعي.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أنابيب الطرد المركزي سعة 1.5 مل محلول | |||
| بارافورمالدهايد 4٪ | هيميديا | TCL119 | |
| وسائط التركيب المائية | كليني ساينسز | NB-47-02240-30ML | |
| أكواب (واحدة لكل تركيز تم اختباره) | |||
| كارولينا سبرينغ | ووتر كارولينا | 132450 | |
| Cryostat | |||
| المضادة الأولية والثانوية المخففة | |||
| الإيثانول (100٪) | سيجما ألدريتش | ||
| EthosVision XT 16 | نولدوس | ||
| فيجي الإصدار 2.9.0 | |||
| الشرائح المطلية بالجيلاتين | سيجما ألدريتش | 643203 | |
| جولجي الأجسام المضادة 1H6 | DSHB | AB_2619608 | |
| وصمة عار جولجي kit_ | علم الأعصاب مشارك | PK 401 / 401A | |
| بيروكسيد | |||
| الهيدروجين الميثانول | |||
| تصاعد وسائل الإعلام | الحرارية فيشر العلمية | ||
| OCT مركب | |||
| PBS العازلة | سيجما ألدريتش | P4417 | |
| الحليب المجفف | |||
| ماصات | |||
| رقائق | |||
| الزيلين |
المراجع
- World Health Organization. Epilepsy. , (2024).
- Dalic, L., Cook, M. J. Managing drug-resistant epilepsy: challenges and solutions. Neuropsychiatr Dis Treat. 12, 2605-2616 (2016).
- Mayo Clinic. Seizures - Symptoms and causes. , (2023).
- Shomrat, T., Levin, M. An automated training paradigm reveals long-term memory in planarians and its persistence through head regeneration. J Exp Biol. 216 (20), 3799-3810 (2013).
- Moreira-Lobo, D. C., et al. Eugenol modifies the excitability of rat sciatic nerve and superior cervical ganglion neurons. Neurosci Lett. 472 (3), 220-224 (2010).
- Johan Arief, M. F., Choo, B. K. M., Yap, J. L., Kumari, Y., Shaikh, M. F. A systematic review on non-mammalian models in epilepsy research. Front Pharmacol. 9, 655(2018).
- Mineta, K., et al. Origin and evolutionary process of the CNS elucidated by comparative genomics analysis of planarian ESTs. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7666-7671 (2003).
- Wu, J. P., Lee, H. L., Li, M. H. Cadmium neurotoxicity to a freshwater planarian. Arch Environ Contam Toxicol. 67 (4), 639-650 (2014).
- Kim, A., Rawls, S. M. Nicotine-induced C-shape movements in planarians are reduced by antinociceptive drugs: Implications for pain in planarian paroxysm etiology. Brain Res. 1778, 147770(2022).
- Reho, G., Lelièvre, V., Cadiou, H. Planarian nociception: Lessons from a scrunching flatworm. Front Mol Neurosci. 15, 935918(2022).
- Pagán, O. R., et al. Planarians require an intact brain to behaviorally react to cocaine, but not to react to nicotine. Neuroscience. 246, 265-270 (2013).
- Raffa, R. B., Holland, L. J., Schulingkamp, R. J. Quantitative assessment of dopamine D2 antagonist activity using invertebrate (Planaria) locomotion as a functional endpoint. J Pharmacol Toxicol Methods. 45 (3), 223-226 (2001).
- Bhatt, P., Reitz, A. B., Tallarida, C. Mephedrone ("bath salt") pharmacology: insights from invertebrates. Neuroscience. 208, 79-84 (2012).
- Neufeld, T., Carniello, T., Dotta, B. A single hypoxic event ameliorates pilocarpine-induced hyperkinetic movements in Planaria. Nat Sci. 14, 149-156 (2022).
- Rossini, L., et al. Dendritic pathology, spine loss, and synaptic reorganization in human cortex from epilepsy patients. Brain. 144 (1), 251-265 (2021).
- Owuor, K., et al. LGI1-associated epilepsy through altered ADAM23-dependent neuronal morphology. Mol Cell Neurosci. 42 (4), 448-457 (2009).
- Dubey, V., et al. Dendritic reorganization in the hippocampus, anterior temporal lobe, and frontal neocortex of lithium-pilocarpine induced Status Epilepticus (SE). J Chem Neuroanat. 133, 102329(2023).
- Löscher, W. Critical review of current animal models of seizures and epilepsy used in the discovery and development of new antiepileptic drugs. Seizure. 20 (5), 359-368 (2011).
- Musto, A. E., Walker, C. P., Petasis, N. A., Bazan, N. G. Hippocampal neuro-networks and dendritic spine perturbations in epileptogenesis are attenuated by neuroprotectin D1. PLoS One. 10 (1), e0116543(2015).
- Omuro, K. G., et al. Novel monoclonal antibodies to study tissue regeneration in planarians. BMC Dev Biol. 15 (2), (2015).
- Keenan, C. L., et al. Cytoarchitecture of primitive brains: Golgi studies in flatworms. J Comp Neurol. 195, 4(1981).
- Pronin, A. N., Wang, Q., Slepak, V. Z. Teaching an old drug new trick: Agonism, antagonism, and biased signaling of pilocarpine through M3 muscarinic acetylcholine receptor. Mol Pharmacol. 92 (5), 601-612 (2017).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. An introduction to performing immunofluorescence staining. Methods Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).
- Vogt, R. V., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J Immunol Meth. 101 (1), 43-50 (1987).
- Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), 711-714 (1985).
- Chen, T. S., Huang, T. H., Lai, M. C., Huang, C. W. The role of glutamate receptors in epilepsy. Biomedicines. 11 (3), 783(2023).
- Kreshchenko, N. Immunocytochemical identification of serotoninergic neurons in Planaria Girardia tigrina. Biochem. Moscow Suppl Ser A. 11, 68-76 (2017).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
