تجميع وقياس المزارع المشتركة التي تجمع بين الخميرة غير المتجانسة والبكتيريا الزرقاء التي تفرز السكر الضوئية

Dennis Hasenklever; Joana C. Pohlentz; Tom Berwanger; Emmanuel J. Kokarakis; Tanvir Hassan; Kerstin Schipper; Anna Matuszyńska; Ilka M. Axmann; Daniel C. Ducat

doi:10.3791/67311

مقالة منهجية

تجميع وقياس المزارع المشتركة التي تجمع بين الخميرة غير المتجانسة والبكتيريا الزرقاء التي تفرز السكر الضوئية

DOI:

10.3791/67311

⸱

ديسمبر 27, 2024

Dennis Hasenklever^*¹ , Joana C. Pohlentz^*² , Tom Berwanger^*² , Emmanuel J. Kokarakis³ , Tanvir Hassan⁴ , Kerstin Schipper² , Anna Matuszyńska⁴ , Ilka M. Axmann¹ , Daniel C. Ducat¹^,⁵

¹Institute for Synthetic Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, ²Institute of Microbiology, Heinrich Heine University Düsseldorf, ³Department of Microbiology, Genetics, & Immunology, Michigan State University, ⁴Computational Life Science, Department of Biology, RWTH Aachen University, ⁵Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوفر هذا البروتوكول إرشادات شاملة للإعداد والمراقبة الكمية للمزارع المشتركة ، بما في ذلك البكتيريا الزرقاء التي تفرز السكر ذاتية التغذية ضوئيا والخمائر غير المتجانسة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع تزايد الطلب على التقنيات الحيوية المستدامة ، يتم استكشاف اتحادات مختلطة تحتوي على ميكروب ضوئي وأنواع شريكة غير متجانسة التغذية كطريقة للإنتاج الأحيائي المدفوع بالطاقة الشمسية. يتضمن أحد الأساليب استخدام البكتيريا الزرقاء المثبتة لثاني أكسيد الكربون 2 التي تفرز الكربون العضوي لدعم عملية التمثيل الغذائي لغير متجانسة المزروعة بشكل مشترك ، والتي بدورها تحول الكربون إلى سلع أو خدمات ذات قيمة أعلى. في هذا البروتوكول ، يتم توفير وصف تقني لمساعدة التجريبي في إنشاء استزراع مشترك يجمع بين سلالة البكتيريا الزرقاء المفرزة للسكروز مع شريك (شركاء) فطري ، كما يمثله أنواع الخميرة النموذجية. يصف البروتوكول المتطلبات الأساسية لتأسيس الاستزراع المشترك: تحديد تركيبة الوسائط، ومراقبة خصائص النمو للشركاء الأفراد، وتحليل المزارع المختلطة مع أنواع متعددة مجتمعة في نفس وعاء النمو. يتم تلخيص التقنيات المختبرية الأساسية لمراقبة الزراعة المشتركة ، بما في ذلك الفحص المجهري وعداد الخلايا وقياس التدفق الخلوي أحادي الخلية ، ويتم توفير أمثلة على البرامج غير المسجلة الملكية لاستخدامها لتحليل البيانات لملفات قياسية قياس التدفق الخلوي الخام (FCS) بما يتماشى مع مبادئ FAIR (يمكن العثور عليها ، ويمكن الوصول إليها ، وقابلة للتشغيل البيني ، وقابلة لإعادة الاستخدام). أخيرا ، يتم تضمين التعليق على الاختناقات والمزالق التي تواجهها بشكل متكرر عند محاولة إنشاء ثقافة مشتركة مع البكتيريا الزرقاء التي تفرز السكر وشريك جديد غير متجانس. يوفر هذا البروتوكول موردا للباحثين الذين يحاولون إنشاء زوج جديد من الميكروبات المستزرعة المشتركة التي تتضمن البكتيريا الزرقاء وميكروبا غير متجانس التغذية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مع التوسع السريع في الأدوات الجينومية وتقنيات الحمض النووي في السنوات الأخيرة ، أصبحت جهود الهندسة الحيوية قادرة بشكل متزايد على اعتبار المجتمعات المختلطة من الميكروبات قابلة للتطبيق لاستراتيجيات الإنتاج الحيوي بدلا من التركيز فقط على الثقافات المحورية. تمتلك الاتحادات الميكروبية مزايا محتملة متعددة فيما يتعلق بثقافات النوع الفردي ، بما في ذلك التخصص وتقسيم العمل ، والقدرة على التكيف والمتانة ، وكفاءة استخدام الركيزة¹. ومع ذلك ، فإن الهندسة التي يمكن التنبؤ بها للاتحادات متعددة الأنواع معقدة بسبب عدم اليقين الناجم عن السلوكيات ذات الترتيب الأعلى التي تنشأ من التفاعلات بين الأنواع². تقع الإشارات عبر الأنواع وتبادل المستقلبات في صميم مبدأ تقسيم العمل ولكنها تؤدي أيضا إلى تآزر وخصومات غير متوقعة بين المشاركين في^{الاتحادات 3}. ومن الضروري إحداث تطوير كبير في هذا المجال إذا أمكن تحقيق الإمكانات الكاملة للاتحادات الميكروبية المختلطة، بما في ذلك استخدام منصات مرنة للاستزراع المشترك من 2 و3 شركاء، والتي يمكن استخدامها لتوصيف وفهم التفاعل الميكروبي بشكل أفضل من "الأسفل إلى الأعلى".

وهناك عدد قليل من أنواع السائدة من منصات الاستزراع المشترك قيد الاستخدام حاليا في هذا المجال، بما في ذلك الشركاء الأكسوتروفيتيين المجانيين والميكروبات التي تفرز مستقلبات مفيدة بشكل عام لمجموعة واسعة من الأنواع الميكروبية. في الفئة الأخيرة ، تم تصميم البكتيريا الزرقاء لتصبح منتجين أساسيين معززين من خلال إدخال مسارات تؤدي إلى إفراز الكربوهيدرات التي يتم استقلابها بسهولة وتم استكشافها الآن في مجموعة متنوعة من الاتحادات المصممة بشكل عقلاني. باختصار ، في مثل هذه المجتمعات الميكروبية الهندسية ، يكون شريك البكتيريا الزرقاء قادرا على استخدام الضوء وثاني أكسيد الكربون₂ كمدخلات أساسية ، ومن خلال عملية التمثيل الضوئي الأكسجين ، يمكن لهذه السلالات إفراز سكريات الكربون المركزية كمنفعة عامة. فئة واحدة من هذه السلالات الزرقاء الهندسية هي تلك التي تم تصميمها لإفراز السكروز ثنائي السكاريد⁴. من المحتمل أن تكون هذه السلالات قد تمتعت بنجاحها لأن السكروز هو مستقلب قريب من التمثيل الغذائي المركزي للكربون للعديد من الأنواع ، كما أنه غالبا ما يتراكم بشكل مفرط على أنه ما يسمى ب "المذاب المتوافق" للتكيف مع مجموعة متنوعة من الضغوط البيئية اللاأحيائية⁵. يمكن أن يؤدي الحد الأدنى من التدخلات الجينية إلى إفراز السكروز بكفاءة في مجموعة من الكائنات الحية النموذجية للبكتيريا^{الزرقاء 4}.

تعد البكتيريا الزرقاء التي تفرز السكروز منصة مفيدة للتحقيق في الاتحادات الميكروبية المصممة بشكل عقلاني لأن مجموعة واسعة من الأنواع غير المتجانسة يمكن أن تستقلب السكروز كمصدر مهيمن للكربون والطاقة. في الواقع ، باستخدام عدد قليل من البكتيريا الزرقاء النموذجية ذات القدرات على إفراز السكروز ، صممت العديد من المختبرات بشكل عقلاني مزارع واتحادات مختلطة للأنواع تحتوي على واحد أو أكثر من الميكروبات غير المتجانسة والتي تدعمها في النهاية المدخلات الأولية للضوء وثاني أكسيد الكربون₂ دون تكميل المواد الأولية للكربون^{العضوي 4}. قد تعيش السلالات غير المتجانسة التغذية ببساطة على الكربوهيدرات المشتقة من البكتيريا الزرقاء ، أو يمكن استخدامها لتحويل المواد الأولية للسكروز إلى منتجات حيوية عالية القيمة (مثل الوقود والبوليمرات والأصباغ وما إلى ذلك). وبالإضافة إلى كونها استراتيجية محتملة للإنتاج الأحيائي المستدام، قد تكون هذه المزارع المشتركة المبسطة مفيدة أيضا كمنصة للتحقيق في التفاعلات الناشئة بين الأنواع الميكروبية غير ذات الصلة.

تركز مقالة الفيديو هذه على المنهجيات والمتطلبات الأساسية لاستخدام البكتيريا الزرقاء المنتجة للسكر كمنصة مرنة لتصميم اتحادات ميكروبية بسيطة يمكن أن تكون مستقرة من خلال استكمال مدخلات الكربون الخفيفة وغير العضوية فقط. في حين أن إعداد ومراقبة الثقافات التي تحتوي على كائنات دقيقة واحدة ثابتة يكون في الغالب مباشرا ويمكن تحقيقه بسهولة باستخدام الكثافة البصرية (OD) أو منهجية الانتثار الخلفي ، فإن هذا غير ممكن بمجرد دمج كائنين أو أكثر في وعاء واحد. السبب الرئيسي هو أن هذه الطرق لا تميز بين الكائنات الحية الدقيقة المختلفة ، وبالتالي فهي توفر فقط صورة شاملة للثقافة ولا تحل نمو الكائنات الحية الفردية. علاوة على ذلك ، تتمتع البكتيريا الزرقاء بطيف امتصاص واسع في نطاق 400-750 نانومتر ، لذا فإن قياس OD₆₀₀من غير متجانسة قد يؤدي إلى نتائج خاطئة بسبب الفيكوسيانين (الذي يمتص في 620 نانومتر). لذلك ، يتم توفير بروتوكولات محددة لإعداد المجتمعات المختلطة بين البكتيريا الزرقاء وغير المتجانسة داخل المختبر بالإضافة إلى بروتوكولات عامة مفيدة لتحليل أداء هذه الاتحادات بمرور الوقت. بينما تركز البروتوكولات على اقتران معين لنموذج ، وأنواع البكتيريا الزرقاء التي تفرز السكروز مع نموذج واحد أو أكثر من الميكروبات غير المتجانسة ، فإن الغرض من هذا العمل هو توفير مورد للباحثين الذين قد يرغبون في تصميم أزواج جديدة من الأنواع وتسريع مرحلة التحسين لإنشاء مثل هذه الثقافات. لذلك ، بالإضافة إلى البروتوكولات الخاصة بالأنواع ، يتم تضمين المعلومات والاستراتيجيات التي يمكن استخدامها لتكييف وتعميم هذه البروتوكولات للمجتمعات المخصصة ، على النحو المحدد من خلال احتياجات القارئ.

ونظرا لمرونة منصة الاستزراع المشترك الموصوفة هنا، تم وصف بروتوكولات لعدد من الأنواع غير المتجانسة المختلفة التي تم الإبلاغ عنها سابقا في الزراعة المشتركة مع البكتيريا الزرقاء المفرزة للسكر. على سبيل المثال ، يتم توفير بروتوكول خطوة بخطوة للاستزراع المشترك ل Synechococcus elongatus PCC 7942 مع الخميرة المختبرية الشائعة خميرة الخميرة . ومع ذلك ، تتضمن المقالة أيضا بروتوكولات مناسبة لفحص أداء الثقافات المشتركة التي تحتوي على أنواع نموذجية أخرى ، بما في ذلك شكل الخميرة من Ustilago maydis.

تركز المقالة على مجموعة أساسية من البروتوكولات اللازمة لإنشاء ثقافة مشتركة للبكتيريا الزرقاء / غيرية التغذية وإجراء التوصيف الأساسي لأداء هذه الاتحادات المختلطة بمرور الوقت. على وجه التحديد ، يتم التأكيد على القياس الخلوي للخلية المفردة وطرق عد الجسيمات المناسبة لإجراء تعداد دقيق للأنواع المختلفة ، بالإضافة إلى أساليب الفحص المجهري لتقييم مورفولوجيا الخلية. والغرض من هذه البروتوكولات هو أن تكون أساسا للتكيف مع الاحتياجات والمعدات المتاحة. والأهم من ذلك، يتم تقديم الملاحظات التقنية والاعتبارات الأخرى المهمة لإنشاء ورصد الثقافات المشتركة داخل المختبر. أخيرا ، يتم تضمين أمثلة على البدائل غير المسجلة الملكية لتحليلات البيانات لملفات FCS⁶ الأولية باستخدام حزم Python. باختصار ، الهدف هو جعل تقنيات الزراعة المشتركة القائمة على البكتيريا الزرقاء في متناول جمهور علمي أوسع.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يحتوي هذا البروتوكول على تعليمات مفصلة حول كيفية إعداد وتحديد المزارع المشتركة لأنواع الخميرة النموذجية غير المتجانسة التي تفرز السكر وتحديدها. بشكل عام ، ينطبق البروتوكول على أي نوع من أنواع الخميرة قابلة للتلاعب الجيني.

1. إنشاء مزارع مشتركة تجمع بين البكتيريا الزرقاء الضوئية والخمائر غير المتجانسة

الاستعدادات للزراعة المشتركة: الوسائط وما قبل الزراعة
ملاحظة: قم بإعداد جميع الوسائط ومحاليل المخزون باستخدام مياه فائقة النقاء. يجب تنظيف جميع الأواني الزجاجية (أكواب القياس ، والأسطوانات المتدرجة ، وزجاجات التخزين ، وقوارير الزراعة) وتعقيمها. يمكن تخزين الوسائط المعقمة في درجة حرارة الغرفة (RT). يجب أن يكون هناك جهاز متوافق مع متطلبات الزراعة ذاتية التغذية الضوئية متاحا.
1. قم بإعداد وسط الاستزراع المشترك قبل 3-4 أيام على الأقل من البدء المقصود للاستزراع المشترك. معظم وصفات وسائط الزراعة المشتركة هي اختلافات في وسط BG-11^{الشائع 7} المستخدم في الزراعة الروتينية للعديد من الأنواع النموذجية للبكتيريا الزرقاء. يستخدم هذا البروتوكول وسيط CoYBG-11 الذي تم الإبلاغ عنه سابقا كمثال (⁸; انظر الجدول 1). الأوتوكلاف (121 درجة مئوية ، 20 دقيقة) أو تعقيم المرشح (حجم المسام 0.22 ميكرومتر) الوسط المحضر ، حسب الاقتضاء.
  ملاحظة: راجع قسم المناقشة للحصول على اقتراحات حول تكييف وسيط مناسب لأزواج الأنواع الأخرى.
2. تحضير الكواشف الجزيئية: لتحريض تعبير cscB وتصدير^{السكروز 9}^،¹⁰^،¹¹ ، قم بإعداد مخزون 1 متر من الأيزوبروبيل-β-ثيوغالاكتوسيد (IPTG).
  ملاحظة: استخدام المضادات الحيوية أثناء الزراعة المشتركة دون المستوى الأمثل ، ولكن إذا كانت جميع السلالات تحمل أشرطة مقاومة ، فيمكن استخدامها. في هذه الحالة ، قم بإعداد مخزونات المضادات الحيوية وفقا لاحتياجات السلالات المستخدمة.
3. تحضير زراعة مسبقة للبكتيريا الزرقاء: قبل 3 أيام على الأقل من بدء الزراعة المشتركة ، قم بنقل الخلايا من زراعة مسبقة للسلالة المفرزة للسكر من البكتيريا الزرقاء التي تنمو في وسط BG-11 إلى قارورة محيرة طازجة تحتوي على وسط CoY^BG-11 (الجدول 1).
  ملاحظة: تم الآن تعديل أنواع وسلالات متعددة من البكتيريا الزرقاء لإفراز السكريات. للحصول على مراجعة شاملة للسلالات المتاحة في وقت كتابة هذه السطور ، انظر⁴. يسرد هذا المرجع أيضا الأنواع غير المتجانسة التغذية (انظر 1.1.4) التي تم الإبلاغ عنها سابقا عن الزراعة المشتركة للبكتيريا الزرقاء.
  1. قم بقياس OD₇₅₀ للزراعة المسبقة. احسب الحجم المطلوب للزراعة المسبقة لتحقيق هدف OD₇₅₀ من 0.3 (C₁) باستخدام المعادلة V₁ = C₂ x V₂ / C₁ حيث C₂ = الهدف OD ، V₂ = الحجم المستهدف ، و V₁ = الحجم المطلوب للزراعة المسبقة. على سبيل المثال ، عند تلقيح مزرعة 30 مل (V₂) ، تكون الكمية x من المزرعة السائلة المراد استخدامها هي V₁ (مل) = (0.3 × 30) / (قياس OD₇₅₀).
    ملاحظة: الكثافة البصرية هي تقريب لكثافة الخلية وتعتمد على ظروف النمو وتشكل الخلية. لذلك ، من الضروري للباحثين استخدام طرق لربط الكثافة الضوئية بأعداد الخلايا المطلقة (انظر الأقسام 2.1 و 2.2 و 2.3) للتقييم المناسب لأداء الزراعة المشتركة. بالنسبة للبكتيريا الزرقاء ، لا ينبغي استخدام الأطوال الموجية للضوء داخل الطيف النشط ضوئيا (أي 400-700 نانومتر) لتحديد الكثافة البصرية لأنها تمتصها الكلوروفيل والأصباغ الأخرى. لذلك ، يتم استخدام الأطوال الموجية ذات اللون الأحمر البعيد بشكل روتيني (على سبيل المثال ، 750 نانومتر).
  2. احتضان الثقافة المخففة في حاضنة ضوئية مناسبة. حضانة نموذجية
    شروط البكتيريا الزرقاء النموذجية هي كما يلي: 30 درجة مئوية ، 150 دورة في الدقيقة (رمي 25 مم) ، 2٪ CO2 مساحة رأس ، ~ 200 ميكرولتر فوتونات ^m-2 · ^s-1 إضاءة LED ، 75٪ رطوبة.
    ملاحظة: يوصى بشدة بتناول مكملات ثاني أكسيد الكربون₂ لتحسين كمية السكروز المنبعثة.
  3. كرر عملية التخفيف هذه كل يوم لمدة 3 أيام على الأقل قبل إعداد الزراعة المشتركة للتأكد من أن البكتيريا الزرقاء في نمو أسي. سيساعد ذلك على تحسين الاتساق في أداء الثقافة المشتركة بين تجارب الأيام المختلفة.
4. قبل يومين على الأقل من بدء الثقافة المشتركة ، قم بإعداد ثقافة مسبقة غير متجانسة. كما لوحظ ، تم زراعة عدد من أنواع الخميرة والسلالات الفرعية سابقا في زراعة مشتركة مع البكتيريا الزرقاء⁸^،¹²^،¹³.
  1. نقل الخلايا في تخفيف 1: 100 (250 ميكرولتر) من مزرعة سائلة للأنواع غير المتجانسة التي تنمو في مرق زراعة غني (انظر الجدول 1) إلى 50 مل من وسط CoY^BG-11 مكمل ب 20 جم / لتر من السكروز في قارورة محيرة سعة 250 مل.
  2. احتضن طوال الليل بنفس درجة حرارة ظروف الزراعة المستخدمة لشريك البكتيريا الزرقاء.
5. تحقق من OD₆₀₀ قبل 24 ساعة على الأقل من الوقت المقصود لتلقيح الاستزراع المشترك للتأكد من أن السلالة غير المتجانسة قد نمت بشكل كاف لتلبية الاحتياجات التجريبية (انظر 1.2): يخفف في وسط جديد للحفاظ على النمو الأسي إذا لزم الأمر.
التطعيم والصيانة للاستزراع المشترك
ملاحظة: راجع قسم المناقشة للاطلاع على اعتبارات حول نسبة التلقيح بين الكائنات الحية الدقيقة الضوئية وغير المتجانسة.
1. لتلقيح الثقافة المشتركة ، قم بإثراء كلا الثقافات المسبقة عن طريق الطرد المركزي.
  1. احسب حجم تعليق الخلية المركزة لتحقيق كثافة البداية المطلوبة لكلا النوعين باستخدام المعادلة القياسية C₁ x V₁ = C₂ x V₂، حيث C₁ = OD للثقافة المخصبة. على سبيل المثال ، لعمل 25 مل من مزرعة S. elongatus مع OD₇₅₀ يبدأ من 0.5 (من مزرعة محورية 1.5 OD) و S. cerevisiae مع OD₆₀₀ يبدأ من 0.05 (من ثقافة axenic 0.7 OD) ، بناء على المعادلة أعلاه ، 8.33 مل من S. elongatus بدء الثقافة ، 1.79 مل من ثقافة غير متجانسة المخصبة ، و 14.88 مل من وسط CoY^BG-11 .
  2. الطرد المركزي للثقافات باستخدام 13,000 × جم لمدة 10 دقائق في RT. في ظل ظروف معقمة ، صب المادة الطافية والتخلص منها.
    ملاحظة: يمكن استخدام قوة الطرد المركزي النسبية الأقل (RCF ؛ xg) لتحبيب S. cerevisiae لأنها خلايا أكبر (2x-3x مرات) مقارنة ب S. elongatus ، ولكن احرص على أن يصبح المادة الطافية شفافة. لجمع الكتلة الحيوية للبكتيريا الزرقاء ، يمكن أيضا استخدام أقل من 13,000 × g ، ولكن الأمر يتطلب وقتا أطول للطرد المركزي (على سبيل المثال ، يمكن استخدام 4,000 × جم لمدة 20 دقيقة).
  3. أعد تعليق حبيبات البكتيريا الزرقاء في 25 مل من وسط CoY^BG-11 المعقم. استخدم نفس ظروف الطرد المركزي كما كان في السابق ، بعد ذلك ، تخلص من المادة الطافية وصبها.
  4. كرر هذه العملية مرتين ل S. elongatus و 4 مرات أخرى ل S. cerevisiae.
    ملاحظة: من المهم غسل حبيبات البكتيريا الزرقاء وغير المتجانسة (S. cerevisiae) لإزالة المكونات المتوسطة المتبقية. نظرا لأن S. cerevisiae كان ينمو في وجود السكروز سابقا ، فإن الكمية المتزايدة من خطوات الغسيل ستضمن إزالة السكر المتبقي المحتمل.
  5. بمجرد التحقق من OD ، اجمع بين أحجام S. elongatus و S. cerevisiae في قارورة محيرة سعة 250 مل في ظروف معقمة وأضف CoY^BG-11 إلى الحجم النهائي البالغ 50 مل. تمييع من مخزون 1 M المحضر مسبقا من IPTG إلى تركيز نهائي يبلغ 1 ملي مولار (هذا لحث البكتيريا الزرقاء على تصدير السكروز إلى الوسائط). للحصول على مزرعة 50 مل ، استخدم 50 ميكرولتر من مخزون 1 M IPTG.
    ملاحظة: عادة ما تكون القوارير المحيرة أفضل لأنها توفر تهوية وخلطا أفضل للبكتيريا الزرقاء.
  6. ضع القارورة من الخطوة السابقة إلى 200 ميكرولتر فوتونات · م ^-2 · ثانية ^-1 إضاءة LED مكملة ب 2٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز مداري عند 150 دورة في الدقيقة (رمي 25 مم) و 75٪ رطوبة.
    ملاحظة: يمكن أن تختلف الشروط المذكورة أعلاه وتحتاج إلى تحسينها بناء على النتيجة التجريبية.
  7. راقب نمو المزرعة عن طريق أخذ عينات معقمة (1 مل) كل 12 ساعة أو 24 ساعة (انظر القسم 2). اختياريا ، استخدم العينات لإجراء الفحص المجهري القياسي للخلايا الحية وتحديد وحدات تكوين المستعمرات (CFU¹⁴) لخلايا الخميرة على وسط مناسب لتتبع مورفولوجيا الخلية واللياقة البدنية ومراقبة كمية الخلايا غير المتجانسة الحية وكذلك التلوث.
    ملاحظة: لا ينصح باستخدام CFUs كطريقة لمراقبة كثافة الخلايا الدقيقة لأنواع البكتيريا الزرقاء ، والتي يمكن أن تتعرض لضغط كبير في الانتقال من الزراعة في الوسط السائل إلى الصلب. لذلك ، يجب اختيار صفائح أجار ذات وسط غني مناسب لنمو نوع (أنواع) شركاء الخميرة ، مثل مستخلص الخميرة بسكر العنب الببتون (YEPD)¹⁵.

مركب كيميائي	BG-11 (تركيز ملغم/لتر)	CoY BG-11 (تركيز مجم / لتر)
نانو₃	1500	1500
ك₂[هب]₄	40	40
MgSO₄ · 7 ساعات₂س	75	75
[ككل]₂ · 2 ساعة₂س	36	36
حامض الستريك	6	6
سترات الأمونيوم الحديديك	6	6
EDTA (ملح ثنائي الصوديوم)	1	1
نا₂ثاني أكسيد الكربون₃	20	20
تكوين المعادن النزرة
H₃BO₃	2.86	2.86
ZnSO₄ · 7 ساعات₂س	0.222	0.222
شركة (رقم₃)₂ · 6 ساعات₂ص	0.0494	0.0494
MnCl₂ · 4 ساعة₂O	1.81	1.81
[كوسو]₄ · 5 ساعات₂ص	0.079	0.079
NaMoO₄ · 2 ساعة₂O	0.39	0.39
زائد
هيبسو	7160	7160
قاعدة نيتروجين الخميرة (YNB) ، بدون أحماض أمينية ، مع كبريتات الأمونيوم	–	360⁸, 1200¹³
عامل المعايرة بالتحليل الحجمي 8.3	كوه	كوه
KPO₃	–	118
السكروز (للمتجانسة فقط	–	13690

الجدول 1: تكوين وسائط BG-11 و CoY^BG-11. يتم اشتقاق تركيزات قاعدة الخميرة والنيتروجين في CoY^BG-11 من الموارد المنشورة⁸^،¹²^،¹³.

2. أدوات ومنهجية لمراقبة نمو الثقافات المشتركة

ملاحظة: هذا البروتوكول هو مبدأ توجيهي لتحليل ومراقبة الزراعة المشتركة ، من التقنيات البسيطة ولكن المكثفة مثل الفحص المجهري وغرف العد إلى التطبيقات عالية الإنتاجية مثل عدادات الجسيمات وقياس التدفق الخلوي أحادي الخلية. بصرف النظر عن الثقافة المشتركة الفعلية ، ينصح بتضمين الثقافات المحورية للكائنات الحية الدقيقة المفردة للسماح بإجراء تحليل شامل. كنقطة انطلاق عامة للتحليلات ، حدد OD للثقافات. في هذا القسم ، يتم تفصيل منهجيات مختلفة يمكن استخدامها لتحويل المقاييس النسبية لكثافة الخلية (أي OD) إلى قيم مطلقة لعدد الخلية لكل حجم. غالبا ما يستخدم قياس OD₇₅₀ لتحديد كثافة الخلايا لمزارع البكتيريا الزرقاء (بسبب امتصاص الأطوال الموجية 400-700 نانومتر) ، بينما يستخدم OD₆₀₀ للكائنات غير المتجانسة. يوفر كلا القياسين قيما إرشادية تقريبية بوحدات عشوائية. لاحظ أن القيم يمكن أن تختلف بشدة بين الأدوات.

القياس الكمي المجهري مع غرف العد
ملاحظة: غرف العد (أي Neubauer (المحسن) / مقاييس الدم) هي وسيلة بسيطة وغير مكلفة لتحديد تكوين الثقافات المشتركة المكونة من خلايا يمكن تمييزها بسهولة شكليا ، i.e.، من خلال أشكال خلاياهم (الشكل 1 أ). يتكون من شريحة مجهر زجاجي سميك وزجاج غطاء. إذا تم وضع زجاج الغطاء بشكل صحيح أعلى الشريحة ، فإنه ينشئ غرفتين دقيقتين للحجم مع شبكات محفورة (الشكل 1 ب-د). من خلال حساب مساحة محددة من الشبكة ، يمكن حساب تركيز الخلية للتعليق. غرف العد متوفرة في أعماق مختلفة. اعتمادا على سمك الخلية ، يجب اختيار عمق الغرفة المناسب. للخلايا الفطرية مثل U. maydis أو S. cerevisiae, عمق 0.1 مم يعمل بشكل جيد. عمق الغرفة هذا كبير جدا بالنسبة للخلايا الصغيرة مثل البكتيريا الزرقاء ، والخلايا تطفو في الغرفة. الغرفة التي يبلغ عمقها 0.02 مم مناسبة لكل من البكتيريا الزرقاء والثقافات المشتركة للبكتيريا الزرقاء والفطريات.
1. تأكد من خلو غرفة العد وزجاج الغطاء من الغبار والخلايا.
  ملاحظة: يوصى بالتنظيف باستخدام 70٪ (حجم / حجم) من الإيثانول والأنسجة الخالية من النسالة مباشرة قبل الاستخدام.
2. لوضع زجاج الغطاء بشكل صحيح ، حركه على قضيبي الدعم بقليل من الضغط ، ولكن كن حذرا لتجنب الكسر.
  ملاحظة: مطلوب غطاء زجاجي سميك محدد لهذا التطبيق (راجع دليل الغرفة). نظرا لأن زجاج الغطاء ينكسر أحيانا أثناء التجميع ، فمن الجيد أن يكون لديك بدائل في متناول اليد.
3. عندما يتم وضع زجاج الغطاء بشكل صحيح ، لاحظ ما يسمى بحلقات نيوتن (الشكل 1 ب) بين السطحين الزجاجيين ، وأن زجاج الغطاء لا ينزلق بعد الآن.
  ملاحظة: غالبا ما يؤدي التنفس اللطيف على زجاج الغطاء قبل التجميع إلى تحسين النتيجة.
4. امزج تعليق الخلية جيدا وقم بتطبيق بضعة ميكرولترات (~ 2-10 ميكرولتر حسب عمق الغرفة) من تعليق الخلية على حافة الغرفة واتركه يمتلئ تماما عن طريق القوة الشعرية. استخدم تخفيفا مناسبا لتعليق الخلية للسماح بالعد الموثوق به ، على سبيل المثال ، مما ينتج عنه 20 إلى 200 خلية لكل مربع كبير (الشكل 1D ، مستطيل أحمر).
5. استخدم هدفا مناسبا (على سبيل المثال ، 10x) من المجهر الضوئي (المجال الساطع أو وضع تباين الطور) وركز على خطوط شبكة غرفة العد. يتم توفير الاتجاه بواسطة الشبكة. ابدأ في عد الخلايا في المربعات المناسبة لحجم الخلية المحدد.
  ملاحظة: استخدم أداة مساعدة فنية مثل عداد محمول باليد أو تطبيق هاتف ذكي مناسب للعد (على سبيل المثال ، "عداد الأشياء" العام أو تطبيقات مقياس كثافة الدم المتخصصة التي توفر ميزات مفيدة للغاية). حدد قاعدة لعد الخلايا الموجودة على حدود الشبكة لتجنب العد المزدوج. على سبيل المثال، يمكن حساب الخلايا الموجودة على الحدود العلوية واليسرى لكل مربع مع استبعاد الخلايا الموجودة على الحدود اليمنى والسفلية. توجد قواعد بديلة¹⁶. إذا تم استخدام المجهر الفلوري ، فيمكن أيضا تمييز الخلايا بناء على علامات التألق الذاتي أو الفلورسنت.
6. بعد العد ، على سبيل المثال ، جميع المربعات الأربعة الكبيرة في الزوايا ، حدد القيمة المتوسطة لكل نوع خلية. باستخدام هذه القيم المتوسطة ، مساحة المربع المستخدم وعمق الغرفة المحددة (راجع معلومات الشركات المصنعة) ، احسب تركيزات الخلية (انظر النتائج التمثيلية).
  ملاحظة: اعتمادا على حجم الخلية ، يمكن استخدام مربعات مختلفة للعد. بالنسبة لخلايا الخميرة والبكتيريا الزرقاء ، تعمل المربعات الأربعة الكبيرة في الزوايا بشكل جيد (الشكل 1D ، مستطيل أحمر).
7. بعد الاستخدام ، قم بتنظيف الغرفة مع مراعاة متطلبات العينات (على سبيل المثال ، تعطيل الكائنات المعدلة وراثيا بشكل مناسب).
القياس الكمي باستخدام عدادات الجسيمات
ملاحظة: اعتمادا على خصائص الخلايا في الثقافة المشتركة ، يمكن تطبيق عداد الجسيمات لتحديد أرقام خلايا الشركاء. لتطبيق هذه الطريقة ، يجب أن تختلف الخلايا بشدة في حجمها ؛ على سبيل المثال ، يمكن تحقيق التمييز بين الخلايا البكتيرية والخميرة. يجب تضمين الثقافات المحورية للكائنات الدقيقة المفردة للاتحاد للسماح بتفسير النتائج. يجب تحليل المزارع المشتركة التي تؤوي خلايا ذات أحجام متشابهة أو أكثر من شريكين بالمنهجية الموضحة في القسمين 2.1 أو 2.3.
1. التحضيرات
  1. اضبط OD للثقافة على 0.1 وقم بتخفيف العينة 1,000 ضعفا باستخدام مخزن مؤقت قياس متساوي التوتر (استشر دليل الجهاز) بحجم إجمالي قدره 10 مل. قم بإعداد ثلاث نسخ فنية من جميع العينات.
  2. حدد حجم المسام المناسب للشعيرات الدموية للتجربة.
    ملاحظة: يجب أن يكون حجم المسام ضمن نطاق أصغر الخلايا في الزراعة المشتركة ، ولكن يجب أن يشمل أيضا الخلايا الأكبر. لا تذهب صغيرة جدا لأن المسام قد تسد بسبب تراكم الخلايا ، والذي يمكن أن يحدث بسبب انقسام الخلايا. تختلف أحجام المسام المتاحة. على سبيل المثال ، تبدأ الشعيرات الدموية التي يبلغ حجمها 45 ميكرومتر في اكتشاف الخلايا التي يبلغ قطرها 0.7 ميكرومتر. (U. maydis و S. cerevisiae 3.5 ميكرومتر -5.5 ميكرومتر ، S. elongatus / Synechocystis sp. ~ 1-2.5 ميكرومتر).
2. القياس الكمي للخلايا في عداد الجسيمات
  1. ابدأ تشغيل الجهاز. في النهاية ، قم بإجراء اختبار ذاتي لمراقبة الجودة (راجع دليل الجهاز المحدد).
  2. قم بتحميل العينات في أكواب العينة ، وقم بتأمين الغطاء ، واخلط العينة عن طريق إمالة الكوب قليلا.
    ملاحظة: حاول تجنب الرغوة والفقاعات. استخدم دائما كوبا واحدا لكل قياس. يمكن تنظيف الأكواب وإعادة استخدامها عدة مرات. تخلص من الأكواب إذا كان هناك أي بقايا لا يمكن إزالتها. إذا بقيت العينة في الكوب لفترات أطول ، امزجها مرة أخرى قبل القياس.
  3. سجل في نطاق 0-30 ميكرومتر نظرا لأن مجاميع الخلايا يحتمل أن تكون أكبر من الخلايا المفردة.
    ملاحظة: أولا ، استخدم كل من الثقافات المحورية لشركاء الزراعة المشتركة للحصول على فكرة عن حجم الخلايا وتحديد ما إذا كان يمكن تمييزها بحجمها.
  4. بعد التقييم ، حدد تكوين الثقافة المشتركة بنفس الطريقة.
القياس الكمي للاتحاد باستخدام قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية
ملاحظة: قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية هو طريقة عالية الإنتاجية يمكن استخدامها لتحديد أعداد الخلايا للشركاء الفرديين في الثقافة المشتركة ، بالنظر إلى أنه يمكن تمييز الشركاء حسب الحجم / خصائص تشتت الضوء و / أو التألق. الأهم من ذلك ، من أجل إنشاء الطريقة ، هناك حاجة إلى الثقافات المحورية لشركاء الزراعة المشتركة لتحليل خصائصها في مقياس الخلوي وضبط بوابات السكان وفقا لذلك. بالنسبة للسلالات التي تحمل مراسلا فلوريا ، هناك حاجة إلى سلالات بدون مراسل الفلورسنت كعناصر تحكم سلبية. سيسهل الإلمام الأساسي بتطبيقات مقياس الخلايا التنفيذ الناجح للبروتوكول أدناه¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^,²⁰^,²¹. في هذا المثال ، يتم تحليل خليط اصطناعي من 3 كائنات دقيقة (انظر النتائج التمثيلية): Synechocystis (معبرا عن مراسل العصارة الخلوية فلوروفور ، mVenus) والخميرة S. cerevisiae و U. maydis. من أجل تمييز دقيق ل S. cerevisiae و U. maydis، تم إدخال علامات التألق في شكل بروتين فلورسنت أخضر سيتوبلازمي (GFP) (U. maydis eGFP) والبروتين الفلوري الأحمر (RFP) mKate2 (S. cerevisiae mKate2) باستخدام تقنيات الاستنساخ الجزيئي الأساسية. إذا كان ذلك ممكنا ، يجب تفضيل السلالات ذات التكامل الجيني للمراسلين لتجنب متطلبات ضغوط الاختيار المستمرة.
1. تحضير العينة
  1. قم بقياس OD للثقافات في مرحلة نمو معينة ليتم تحليلها.
  2. اضبط OD للعينات على نطاق مناسب للقياس. استخدم OD₇₅₀ تقريبيا من 0.05-0.5 للبكتيريا الزرقاء و OD₆₀₀ من 0.2-1.5 للخميرة باستخدام وسط الاستزراع الطازج (الحجم النهائي: 500 ميكرولتر على الأقل). بالنسبة للثقافات المشتركة ، استهدف OD₇₅₀ بين ~ 0.1 و 0.5 وسجل عامل التخفيف. للحساب، قم بتطبيق الصيغة الواردة في الخطوة 1.1.3.1. سيضمن ذلك بقاء عدد الخلايا في نطاق يتراوح من 1,000 إلى 10,000 خلية / ثانية بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة (أي ما يعادل 6,000 - 60,000 خلية / ميكرولتر).
    ملاحظة: للتخفيف ، يمكن استخدام الوسائط أو المخزن المؤقت بدون التألق الذاتي والجسيمات (على سبيل المثال ، BG-11). كن حذرا مع الوسائط التي تحتوي على مكونات معقدة مثل مستخلص الخميرة التي قد تظهر كجزيئات في القياس.
  3. انقل 300 ميكرولتر من كل معلق خلية عينة إلى بئر فردي في صفيحة 96 بئر (بئر دائري قياسي ، شفاف ، قاع مسطح).
    ملاحظة: بدلا من ذلك، انقل 0.5-2 مل إلى أنبوب فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) إذا تم استخدام وضع العينة شبه التلقائي بدلا من وضع قارئ اللوحة.
2. قياس القياس الخلوي
  1. ابدأ تشغيل مقياس الخلوي وقم بتنفيذ برنامج بدء التشغيل ومراقبة الجودة (QC) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. قم بتحميل (لودر لوح أو أخذ عينات شبه أوتوماتيكية) وقم بتشغيل العينات. ابدأ بعينات التحكم باستخدام المزارع المحورية لكل شريك في الاستزراع المشترك لتحديد كل نوع بناء على خصائصه قبل السعي إلى فصلها في عينة استزراع مشترك.
  3. المخططات النقطية المفتوحة و/أو الرسوم البيانية للانبعاث والانبعاث (على سبيل المثال، الانتثار الأمامي [FSC] أو الانتثار الجانبي [SSC] الارتفاع [-H] أو المنطقة [-A]) ذات الصلة بالعينات.
  4. ابحث عن مجموعة (مجموعات) الخلايا المطلوبة واضبط العتبة لاستبعاد الضوضاء التقنية والجسيمات الصغيرة من الوسط.
    ملاحظة: يوصى بالبحث عن مجموعة الخلايا في FSC-H عبر عرض FSC أو FSC-H عبر مخطط نقطة SSC-H وضبط المقياس من الخطي إلى اللوغاريتمي للخلايا الصغيرة مثل البكتيريا (عادة 1-3 ميكرومتر). قم بتعيين العتبة في قناة FSC-H أو SSC-H. بالنسبة للخلايا التي يقل قطرها عن 1 ميكرومتر ، استخدم SSC البنفسجي (VSSC) في الليزر البنفسجي عند 405 نانومتر للحصول على دقة أفضل.
  5. اضبط الكسب لكل قناة ذات أهمية يدويا إلى نطاق 25-2,500. اضبط المكاسب بحيث يكون التحكم السلبي (على سبيل المثال ، بدون علامة الفلورسنت) في نطاق 1 × 10^2-1 × 10³ ويكون التحكم الإيجابي (على سبيل المثال ، مع علامة الفلورسنت) في نطاق 1 × 10^5-1 × 10⁶ للحصول على أفضل فصل والبقاء ضمن نطاق 1 × 10^1-1 × 10⁷.
    ملاحظة: يمكن أيضا الاحتفاظ بالمكاسب القياسية من مراقبة الجودة كمرجع جيد.
  6. لتحديد تركيز الخلية في العينة ، سجل حجم عينة محدد باستخدام وظيفة التسجيل (على سبيل المثال ، 10 ميكرولتر بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة). لاحقا ، اقسم عدد الخلايا الفردية المقاسة لهذا الحجم على الحجم المسجل للحصول على عدد الخلايا لكل ميكرولتر لكل مجموعة سكانية.
    ملاحظة: ضع عامل التخفيف الأولي في الاعتبار عند حساب تركيز الخلية في المزرعة / العينة.
3. البوابات / اختيار مجموعات الخلايا
  ملاحظة: بغض النظر عن الجهاز المستخدم لتشغيل القياسات ، يمكن إجراء التحليل والبوابة في برنامج تشغيل مقياس الخلوي أو برنامج التحليل التجاري كما هو موضح أدناه²². بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي باستخدام برامج غير مملوكة بكفاءة باستخدام العديد من الأدوات مفتوحة المصدر مثل FlowCytometryTools²³ أو FlowKit، باستخدام FlowUtils²⁴ الحزم في بايثون. بروح العلم المفتوح ، يشترك هذا البروتوكول في JupyterNotebook النموذجي الذي يعرض استخدام هذه الحزم لاستكشاف البيانات الأساسية. بالطبع ، يمكن أن تكون البرامج البديلة مناسبة بنفس القدر لإجراء المعلوماتية الحيوية لقياس التدفق الخلوي²⁵.
  1. حدد مجموعات خلايا معينة عن طريق رسم بوابات حولها في مخطط نقطي أو تعيين فاصل أو مقاطع خطية حول القمم في الرسم البياني (الشكل 4).
    ملاحظة: يمكن استخدام وظيفة البوابة التلقائية للبرنامج كمرجع.
  2. افصل إشارات الكائنات الضوئية والكائنات غير المتجانسة بناء على التألق الذاتي للكائن الضوئي (الناجم بشكل أساسي عن الكلوروفيل) في المنطقة الحمراء من الطيف. مثال: استخدم الرسم البياني لقناة APC-H (الإثارة (على سبيل المثال) عند 638 نانومتر ، الانبعاث (em.) عند 660/10 نانومتر) وقم بتعيين فاصل رأسي بين الذروة اليمنى (التغذية الضوئية = السكان الإيجابي للتألق الذاتي للكلوروفيل) والذروة / الذروة اليسرى (غير متجانسة التغذية = السكان السلب للتألق الذاتي للكلوروفيل) (الشكل 4 أ).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام علامات الفلورسنت للتمييز بين شريكين (أو أكثر) من الشركاء الضوئيين داخل نفس الثقافة (على سبيل المثال ، mVenus ل Synechocystis).
  3. افصل بين الكائنين الحائين غير المتجانسين بناء على علامات الفلورسنت أو خصائص التشتت (FSC ، SSC ، إن أمكن).
    ملاحظة: لا ينطبق الفصل بناء على خصائص التشتت إلا إذا كانت الخلايا ، على سبيل المثال ، تحتوي على حجم خلية أو مورفولوجيا مختلفة تؤدي إلى تغييرات مرئية في التشتت (على سبيل المثال ، Synechocystis: خلايا كروية بقطر ~ 1.5-3 ميكرومتر مقابل U. maydis الخلايا الممدودة بطول 10 ميكرومتر وقطر حوالي 1-2 ميكرومتر²⁶).
  4. مثال: استخدم الرسم البياني لقناة FITC-H (على سبيل المثال: 488 نانومتر ، em.: 525/40 نانومتر) يعرض فقط السكان "غير المتجانسين" للتمييز بين الخلايا غير المتجانسة التي تحتوي على GFP (على سبيل المثال ، U. maydis eGFP) وتلك التي لا تحتوي على GFP (على سبيل المثال ، S. cerevisiae RFP / mKate2) (الشكل 4 ب). بدلا من ذلك ، استخدم الرسم البياني لقناة PC5.5-H (على سبيل المثال: 561 نانومتر ، em.: 710/50 نانومتر) يعرض فقط السكان "غير المتجانسين" للتمييز بين الخلايا غير المتجانسة التي تحتوي على RFP (على سبيل المثال ، S. cerevisiae RFP / mKate2) وتلك التي لا تحتوي على RFP (على سبيل المثال ، U. maydis GFP) (الشكل 4 ج).
    ملاحظة: ضع في اعتبارك أن نوعين مختلفين (أو أكثر) من الخلايا يمكن أن "يلتصقا" ببعضهما البعض أثناء القياس. يمكن بسهولة اكتشاف هذه "المزدوجات" أو "المضاعفات" في المخططات النقطية لكل من علامات الفلورسنت (على سبيل المثال ، APC-H على FITC-H لتحديد مزدوجات الموجهة الضوئية والشريك غير المتجانس الذي يحمل علامة GFP).
  5. لتحليل البيانات الأساسية في Python ، اتبع الإرشادات الواردة في Jupyter (https://git.rwth-aachen.de/computational-life-science/cytoflow).
    ملاحظة: يدعم دفتر الملاحظات هذا ثلاث خطوات لتحليل البيانات. ط) استيراد البيانات: استيراد ملفات FCS. ب) إجراء مراقبة الجودة: تحقق من سلامة البيانات وعدد الأحداث. ج) تصور البيانات: استخدم المخططات مثل الرسوم البيانية والمخططات المبعثرة ومخططات الكثافة لتصور البيانات. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض الإجراء الخاص بكيفية أداء البوابات لعزل المجموعات السكانية ذات الأهمية التي تتكاثر الشكل 4 .
    لتسهيل تحليل الثقافات المشتركة في المشاريع طويلة الأجل ، يوصى الباحث باستخدام الطرق المذكورة أعلاه لحساب أعداد الخلايا وإنشاء منحنيات قياسية لمقارنة قيم OD بعدد الخلايا المطلق. الكثافة البصرية هي قياس نسبي يمكن أن يختلف بناء على الأنواع والإجهاد وظروف النمو ومقياس الطيف. لذلك ، فإن إنشاء المنحنيات القياسية "الداخلية" ضروري للتحويل الدقيق لقيم OD إلى أرقام الخلايا.

figure-protocol-1
الشكل 1: القياس الكمي المجهري للخلايا التي يمكن تمييزها شكليا. (أ) غرفة عد نيوباور. (ب) تشير حلقات نيوتن إلى الوضع الصحيح لزلة الغطاء الخاصة. (ج) تصوير تخطيطي لبنية الغرفة مع التجويف المركزي للحجم المحدد لعد الخلايا. (د) تتكون شبكة غرفة عد نيوباور المصورة من تسعة مربعات كبيرة بحجم 1 مم² (أحمر). تنقسم المربعات الأربعة الكبيرة في الزوايا إلى 16 مربعا (أزرق). ينقسم المربع المركزي الكبير إلى 25 مربعا جماعيا بحجم 0.04 مم² (برتقالي). يتكون كل مربع مجموعة من أصغر 16 مربعا (أخضر). تم إنشاء الرقم بناء على معلومات الشركات المصنعة المتاحة للجمهور. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إنشاء الثقافات المشتركة للتغذية الضوئية S. elongatus والخمائر غير المتجانسة
لقد أبلغنا سابقا عن نتائج مفصلة من الزراعة المشتركة ل Synechococcus elongatus PCC 7942 مع مجموعة متنوعة من السلالات الفرعية من S. cerevisiae. للحصول على وصف شامل لنتائج الزراعة المشتركة مع هذا الزوج من البكتيريا الزرقاء / الخميرة ، انظر⁸. من أجل الإيجاز والدقة ، لا يتم إعادة إنتاج هذه النتائج هنا. باختصار ، تشير النتائج السابقة إلى عدد من الاعتبارات المهمة لإنشاء الثقافات المشتركة للبكتيريا الزرقاء والخميرة على المدى الطويل. مصدر القلق الأساسي ، أن قدرة الخميرة على البقاء في ظل الظروف التي توفر فيها البكتيريا الزرقاء الأشكال الوحيدة للكربون الثابت تعتمد بشدة على الكفاءة التي يمكن أن تستخدم بها سلالة الخميرة السكروز. S. cerevisiae السلالات التي تم تطويرها أو هندستها لاستقلاب السكروز بشكل أكثر كفاءة²⁷^،²⁸ كانت أكثر عرضة للبقاء على قيد الحياة من الانتقال إلى وضع نمو الزراعة المشتركة ، وحققت كثافة خلايا أعلى ، وأظهرت متانة أعلى في تجارب الزراعة المشتركة للبكتيريا الزرقاء طويلة الأجل (من أيام إلى أسابيع^{) 8}. كانت المرحلة الأولى من تلقيح الاستزراع المشترك مهمة بشكل خاص لصلاحية الخميرة ، على الأرجح بسبب ضغوط تخفيف الثقافة ، وتبديل تكوين الوسائط ، و / أو سحب مصدر كربون أكثر تركيزا. ولذلك، فإن الجهود المبذولة لتسهيل الانتقال من وسط نمو أكثر ثراء إلى الحد الأدنى من توافر الكربون عند بدء الاستزراع المشترك يمكن أن تحسن الأداء التجريبي واتساقه (انظر الخطوة 1.2.1.1.1). بالإضافة إلى ذلك ، S. cerevisiae أظهرت استجابات إجهاد تتفق مع فرط التأكسج عند تلقيحها في مزارع كثيفة من S. elongatus ، بما يتفق مع تكوين O₂ كمنتج ثانوي أساسي لعملية التمثيل الضوئي الأكسجينية. لذلك ، فإن الجهود المبذولة لمنع فرط نمو شريك البكتيريا الزرقاء و / أو دورات الضوء المتناوبة "ليلا ونهارا" يمكن أن تزيد بشكل كبير من صلاحية S. cerevisiae في الثقافات المشتركة طويلة الأجل. راجع قسم المناقشة للحصول على ملخص إضافي للظواهر الشائعة في الثقافات المشتركة بالنسبة لعينات التحكم المحورية.

رصد نمو الثقافات المشتركة باستخدام منهجيات مختلفة
في القسم التالي ، يتم وصف القياس الكمي النموذجي لاتحاد ثلاثي مختلط بشكل مصطنع من Synechocystis والخميرة S. cerevisiae و U. maydis باستخدام ثلاث طرق مختلفة. بالنسبة للخليط ، تم تحديد OD₇₅₀ (للبكتيريا الزرقاء) و_{OD 600} (للبكتيريا غير المتجانسة) للمزارع المفردة وتعديلها إلى OD 0.1. تم خلط الثقافات المفردة بنسبة 1: 1: 1 باستخدام الكثافة البصرية (التي تختلف عن عدد الخلايا ، انظر أعلاه). لتسهيل تمييز الخمائر في مقياس الخلايا ، سلالات مراسل من S. cerevisiae FY1679-O1B²⁹ تنتج بشكل أساسي mKate2 السيتوبلازمي (النمط الجيني: URA3Δ / pTDH3:: mKate2 ؛ سلالة: S. cerevisiae mKate2³⁰) و U. maydis سلالة AB33³¹ تنتج بشكل أساسي eGFP (النمط الجيني: pep4Δ / pRpl40 :: egfp ؛ سلالة: U. maydis eGFP³²) استعملت. وتجدر الإشارة إلى أن سلالة البكتيريا الزرقاء كانت مجهزة ببلازميد تكاثري يعزز التعبير التأسيسي والقوي لنسخة البروتين الفلوري الأصفر mVenus (Synechocystis sp. PCC 6803 pSHDY-Pcpc560-mVenus ، سلالة Synechocystis mVenus ، على غرار³³) بالإضافة إلى ذلك ، يظهر التألق الذاتي القوي النموذجي بسبب وجود آلات التمثيل الضوئي.

القياس الكمي المجهري باستخدام غرف العد: يمكن بسهولة تمييز جميع أنواع الخلايا في الخليط الاصطناعي المستخدم من ثلاثة كائنات دقيقة مجهريا (الشكل 2 أ): Synechocystis و S. cerevisiae يتم تمثيلها بخلايا كروية تختلف اختلافا كبيرا في قطرها (Synechocystis: قطر تقريبي من 1.5-3 ميكرومتر ، S. cerevisiae: قطر حوالي 3-6 ميكرومتر) ، في حين أن خلايا U. maydis لها مورفولوجيا ممدودة على شكل سيجار وطولها لا يقل عن 10 ميكرومتر (الشكل 2 أ). تسمح هذه السمات المورفولوجية الواضحة بالقياس الكمي الدقيق لكل شريك في الخليط. كمثال توضيحي ، 37 و 18 و 36 و 21 S. cerevisiae يتم عد الخلايا في المربعات الأربعة الكبيرة ، على التوالي (الشكل 2 ب). القيمة المتوسطة هي 28 خلية. نظرا لأن المربع الكبير من مقياس الدم المستخدم تبلغ مساحته 1 مم² وعمق الغرفة 0.02 مم ، ينتج عن هذا 28 خلية لكل 0.02 ميكرولتر. هذا يعادل 1,400 خلية / ميكرولتر ، أي ما يعادل 1.4 × 10⁶ خلايا / مل. تم حساب أنواع الخلايا الأخرى ، وتم تحديد التركيزات وفقا لذلك (الشكل 2 ج ، الجدول 2).

figure-results-1
الشكل 2: القياس الكمي المجهري لاتحاد ثلاثي يتكون من Synechocystis والخمائر S. cerevisiae و U. maydis. (أ) صورة تباين تفاضلي مجهري (DIC) لخليط مدمج صناعيا من الكائنات الحية الدقيقة المشار إليها. يمكن تمييز جميع الأنواع بسهولة من خلال مورفولوجيتها. شريط المقياس: 10 ميكرومتر. (ب) نتائج العد النموذجية لمزيج مجمع بشكل مصطنع من السلالات المشار إليها بناء على الثقافات المحورية مع OD 0.1. تم تحليل المربعات الأربعة الكبيرة عند حواف الشبكة (علامة حمراء في الشكل 1 د). (ج) تم استخدام متوسط قيمة الخلايا المختلفة التي تم عدها في المربعات الأربعة لحساب تركيز الخلايا في المعلق باستخدام المعادلة التالية: متوسط القيمة / (عمق الغرفة [0.02 مم] × حجم المربع المحسد [1 مم²] × 1,000). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

القياس الكمي باستخدام عدادات الجسيمات: تحدد عدادات الجسيمات عدد الجسيمات في المعلق حسب حجمها. في مجموعة البيانات المثالية، تم استخدام عداد جسيمات بحجم شعري 45 ميكرومتر. نظرا لأن الخلايا الملازمة العنقودية و U. maydis تظهر أبعادا متشابهة ، فلا يمكن تمييزها في عداد الجسيمات ، بينما يمكن فصل خلايا Synechocystis الأصغر بوضوح. ومن ثم ، يظهر تحليل الثقافات الفردية قمم في مواضع متطابقة تشير إلى 3 إلى 6 ميكرومتر للخميرة (الشكل 3 أ). أثناء القياس ، يتم تطبيق ضغط سلبي ، مما يؤدي إلى دخول الخلايا إلى الشعيرات الدموية. يؤدي هذا إلى تغيير المقاومة الكهربائية لفترة وجيزة بحيث يمكن للجهاز تحديد حجم الجسيمات بناء على التغيير. في الثقافة المختلطة ، يمكن اكتشاف قمتين متميزتين ، إحداهما مرتبطة بخلايا البكتيريا الزرقاء الأصغر والأخرى تمثل جزءا مشتركا من نوعي الخميرة (الشكل 3 ب). الأهم من ذلك ، بالإضافة إلى القمم التي تعكس الخلايا الحية ، تم اكتشاف قمم إضافية عند حوالي 1 ميكرومتر (الشكل 3) ، بما يتوافق مع حطام الخلية والجزيئات الأصغر. يمكن أن تكون الإشارات التي قد تظهر بأقطار أكبر من المتوقع ناتجة عن تجمعات الخلايا. وتجدر الإشارة إلى أن شكل القمم يعكس تجانس الخلايا: تظهر الذروة الحادة خلايا متجانسة للغاية ، وهو أمر غير مرجح للثقافة المشتركة. في الثقافة المشتركة ، من المتوقع أن ترى ذروة واسعة جدا أو حتى قمتين إذا كان شركاء الثقافة المشتركة مختلفين بشكل واضح في الحجم. بالنسبة للثقافات المحورية للفطريات غير المتجانسة ، قد تكون الذروة ذروة متوسطة عريضة.

figure-results-2
الشكل 3: القياس الكمي لاتحاد ثلاثي يتكون من Synechocystis mVenus والخمائر S. cerevisiae mKate2 و U. maydis eGFP باستخدام عداد الجسيمات. (أ) المخرجات المرئية لتحليلات الثقافات المحورية للسلالات الثلاث كما هو موضح في الرسوم البيانية (عداد الخلية مع 45 ميكرومتر شعري). (ب) ملف إخراج مرئي نموذجي لتحليل الاتحاد الثلاثي الاصطناعي باستخدام ظروف متطابقة. لا يدعم عداد الجسيمات التمييز بين نوعي الخميرة اللذين يمثلهما الذروة الثانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

القياس الكمي باستخدام القياس الخلوي أحادي الخلية: باستخدام مقياس التدفق الخلوي أحادي الخلية ، يمكن بسهولة تمييز مجموعات الخلايا المختلفة بناء على خصائص التألق (التلقائي) وتشتت الضوء. يمكن تمييز الخلايا الضوئية (Synechocystis) عن الخلايا غير المتجانسة (U. maydis و S. cerevisiae) بناء على التألق الذاتي الأحمر لأصباغ التمثيل الضوئي التي يتم قياسها في قناة APC-H (الشكل 4 أ). بناء على هذا الفصل الأولي للخلايا الضوئية والخلايا غير المتجانسة ، يمكن تمييز مجموعتين غير متجانسة التغذية بناء على علاماتهما الفلورية eGFP في قناة FITC-H و mKate2 في قناة PC5.5 (الشكل 4 ب ، ج). في مخطط نقطي يوضح خصائص التشتت لجميع المجموعات السكانية الثلاثة (FSC-H و FSC-Width) ، يمكن أيضا تمييز المجموعات السكانية ببعض التداخلات الطفيفة فقط للسكان (الشكل 4 د).

بهذه الطريقة ، تم تحليل 10 ميكرولتر من العينات المخففة بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة ، مما يسمح بقياس ما يقرب من 70,000 خلية في 1 دقيقة. يمكن تخصيص ما يقرب من 60٪ من هذه الخلايا إلى Synechocystis (4.23 × 10⁶ خلايا / مل) ، بينما تم توزيع 40٪ المتبقية بالتساوي بين U. maydis (1.35 × 10⁶ خلايا / مل) و S. cerevisiae (1.36 × 10⁶ خلايا / مل ، الشكل 4E ، الجدول 2).

figure-results-3
الشكل 4: القياس الكمي لاتحاد ثلاثي يتكون من البكتيريا الزرقاء Synechocystis mVenus والخمائر U. maydis eGFP و S. cerevisiae mKate2 باستخدام قياس التدفق الخلوي أحادي الخلية. أمثلة على المخططات التي تم الحصول عليها بعد قياس ثقافة مختلطة من Synechocystis mVenus (أخضر داكن) و U. maydis eGFP (أخضر فاتح) و S. cerevisiae mKate2 (أحمر) بنسبة 1/3 OD₇₅₀ / 1/3 OD₆₀₀ / 1/3 OD₆₀₀ على مقياس الخلوي (A) يظهر رسما بيانيا لعدد الأحداث والتألق في قناة APC-H (على سبيل المثال: 638 نانومتر ، EM.: 660/10 نانومتر) لجميع الخلايا المستخدمة للتمييز بين الخلايا الضوئية والخلايا غير المتجانسة بناء على تألقها الذاتي. (ب) رسم بياني لعدد الأحداث والفلورة في قناة FITC-H (على سبيل المثال: 488 نانومتر ، em.: 525/40 نانومتر) لجميع الخلايا غير المتجانسة المستخدمة للتمييز بين U. maydis eGFP و S. cerevisiae mKate2 الخلايا بناء على خصائصها المضان الأخضر. (ج) رسم بياني لعدد الأحداث والمضان في قناة PC5.5-H (على سبيل المثال: 561 نانومتر ، em.: 710/50 نانومتر) لجميع الخلايا غير المتجانسة المستخدمة للتمييز بين U. maydis eGFP و S. cerevisiae mKate2 الخلايا بناء على خصائصها الفلورية الحمراء. (د) مخطط نقطي لإشارات التشتت في عرض FSC عبر قناة FSC-H المستخدمة لتحديد مجموعات الخلايا بدون خصائص الفلورة. (ه) الإحصاءات السكانية بما في ذلك عدد الأحداث والنسب المئوية والوسائل الحسابية والانحرافات المعيارية (SD) لقنوات التألق ذات الصلة. تم تحديد الكمية الإجمالية للخلايا ، جنبا إلى جنب مع حجمها وتألقها ، بحجم 10 ميكرولتر بمعدل تدفق 10 ميكرولتر / دقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لتصور مخرجات طرق القياس الكمي المختلفة بشكل مقارن ، يتم عرض أرقام الخلايا المحددة في الجدولين التاليين (الجدول 2 والجدول 3). التركيزات النهائية للخلايا التي تم تحديدها باستخدام الطرق الثلاث الموصوفة سابقا هي في نطاق مماثل لجميع الطرق. يوفر مقياس الخلوي أعلى حجم عينة ، يليه عداد الجسيمات والقياس الكمي المجهري ، مع انخفاض بمقدار ترتيب واحد تقريبا من حيث الحجم بين الطرق.

الثقافة المشتركة 1:1:1	مقياس الضوء	مقياس الخلوي		عداد الجسيمات		غرفة عد الفحص المجهري
الكائن الحي	التطوير_{التنظيمي 750/600}	عدد الخلايا	الخلايا / مل	عدد الخلايا	الخلايا / مل	عدد الخلايا	الخلايا / مل
خميرة الخميرة mKate2	0.0333	13,618	1.36 س 10⁶	1,546*	2.58 س 10⁶*	112	1.40 س 10⁶
Ustilago maydis eGFP	0.0333	13,541	1.35 س 10⁶	1,546*	2.58 س 10⁶*	89	1.11 س 10⁶
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus	0.0333	42,330	4.23 س 10⁶	3,094	5.16 س 10⁶	271	3.39 س 10⁶

الجدول 2: مقارنة بين طرق القياس الكمي المختلفة: الثقافة الاصطناعية المختلطة. لاحظ أن U. maydis و S. cerevisiae لا يمكن تمييزهما باستخدام عداد الجسيمات (*).

ثقافة واحدة	مقياس الضوء	مقياس الخلوي		عداد الجسيمات		غرفة عد الفحص المجهري
الكائن الحي	التطوير_{التنظيمي 750/600}	عدد الخلايا	الخلايا / مل	عدد الخلايا	الخلايا / مل	عدد الخلايا	الخلايا / مل
خميرة الخميرة mKate2	0.1	38,936	3.89 س 10⁶	1,928	3.21 س 10⁶	403	4.03 س 10⁶
Ustilago maydis eGFP	0.1	36,927	3.69 س 10⁶	2,465	4.11 س 10⁶	307	3.07 س 10⁶
Synechocystis sp. PCC 6803 mVenus	0.1	127,864	1.28 س 10⁷	8,186	1.36 س 10⁷	428	1.07 س 10⁷

الجدول 3: مقارنة بين طرق القياس الكمي المختلفة: المعايرة مع الثقافات المفردة / المحورية.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إنشاء التعامل مع الكائنات الحية الدقيقة في الثقافات المحورية المفردة في سياق المختبر لعقود من الزمن للعديد من النماذج الميكروبية. ومع ذلك ، على الرغم من أن الشكل السائد للحياة في الطبيعة هو المجتمعات الميكروبية ، إلا أن الجمع بين شريكين أو أكثر في وعاء زراعة واحد أقل رسوخا ، والتحديات تمثل من خلال الفجوات في المعرفة والمنهجية الحالية. كما أنه من الصعب التنبؤ بسلوك الخلايا في المجتمع ، حيث تنشأ التفاعلات الناشئة وتبادل المستقلب بين الخلايا ، مما يؤثر بشدة على مصير الثقافة المشتركة³⁴^،³⁵. ومن ثم، فإن إنشاء الاستزراع المشترك ليس تافها، بما في ذلك على مستوى تعريف وسائط النمو، وتحديد ظروف النمو المشتركة، والتبادل بين الأنواع لمستقلبات/الإشارات النزرة، وتكوين الاستزراع المشترك الناتج بمرور الوقت. يسمح التقدم المحرز في السنوات الماضية في تجميع البكتيريا الزرقاء الضوئية التي تفرز السكر مع شركاء غير متجانسة التغذية الآن باستنتاج القواعد والمنهجية الأولى التي يمكن أن توفر دليلا إرشاديا مفيدا لتصميم أزواج الزراعة المشتركة الجديدة. بناء على هذه المعرفة ، في الجزء الأول من هذا البروتوكول ، يتم توفير إرشادات خطوة بخطوة لتجميع المزارع المشتركة التي تحتوي على بكتيريا سيانوبكتيريا إفراز السكروز وواحدة أو أكثر من الخميرة.

أحد الاعتبارات الحاسمة عند محاولة إنشاء استزراع مشترك بين الميكروبات غير ذات الصلة هو تكوين وسط نمو مشترك يلبي جميع متطلبات المغذيات لنوعين أو أكثر. نظرا لضيق المساحة ، لا يمكن توفير بروتوكول مفصل بالكامل لهذه العملية هنا ، والذي قد يتطلب أيضا درجة عالية من التخصيص في بعض الحالات ، ولكن بدلا من ذلك يوضح ما يلي اعتبارات مهمة يجب وضعها في الاعتبار. يتضمن أحد الأساليب الأولية المباشرة مقارنة وسط نمو البكتيريا الزرقاء النموذجي (على سبيل المثال ، BG11 ؛ انظر الجدول 1) مع أي وسائط دنيا ثابتة مكونة للأنواع غير المتجانسة ذات الأهمية. يعد استكمال وسط البكتيريا الزرقاء القياسي بأي مكونات مفقودة موجودة في الوسط الأدنى غير المتجانس التغذية نقطة انطلاق جيدة للاختبار الأولي⁸^،³⁶. ضع في اعتبارك أنه نظرا لأن الحد الأدنى من الوسائط غالبا ما يتم استكماله بمصدر كربون عضوي كبير للنمو غير المتجانس (على سبيل المثال ، 1٪ -4٪ جلوكوز) ، فغالبا ما يتم تصميمها لدعم كثافة خلايا غير متجانسة أعلى مما يرجح تحقيقه في تجارب الزراعة المشتركة الأولية. وبالمثل ، يمكن أن تعمل بعض المكونات المتوسطة الشائعة أيضا كمصدر للكربون العضوي بشكل مستقل عن التمثيل الضوئي الذي يوفره شريك البكتيريا الزرقاء (على سبيل المثال ، السترات) ، مما قد يعقد التحليل اللاحق للبكتيريا الزرقاء / الثقافات المشتركة غير المتجانسة. لذلك ، قد لا يكون من الضروري استكمال الحد الأدنى من وسط البكتيريا الزرقاء بالتركيز الكامل للعناصر المفقودة عند تصميم وسط الزراعة المشتركة. على سبيل المثال ، تختلف العديد من الكائنات الحية في كفاءتها في استخدام أشكال مختلفة من النيتروجين البيئي (على سبيل المثال ، N₂ ، نترات ، نتريت ، يوريا) وقد تكون غير قادرة تماما على استخدام بعض مصادر النيتروجين الأكثر أكسدة. وبالمثل ، قد تتطلب العديد من الميكروبات مكملات الفيتامينات الأساسية (على سبيل المثال ، فيتامين ب₁₂) أو العوامل المساعدة أو الأحماض الأمينية الأساسية لأنها تفتقر إلى مسارات التخليق الحيوي الكاملة للتخليق المباشر لهذه المركبات. لهذه الأسباب ، قد يكون من العملي للغاية البدء ببساطة عن طريق "دمج" الحد الأدنى من الوسط القائم لشريك البكتيريا الزرقاء (على سبيل المثال ، BG11) جنبا إلى جنب مع وسيط أدنى محدد جيدا من غير المتجانسة (على سبيل المثال ، تعريف اصطناعي [SD]). يمكن استخدام دورات لاحقة من إزالة / تقليل المكونات الزائدة عن الحاجة بشكل متكرر لتحسين الوسط وتقليل وفرة أي مركبات قد تكون مثبطة لنمو أحد الشركاء. تتمثل نقطة البداية المفيدة في تخزين الوسط عند درجة حموضة محايدة أو أساسية قليلا ، حيث تميل هذه الظروف إلى أن تكون الظروف المفضلة لمعظم أنواع نماذج البكتيريا الزرقاء.

في هذه المرحلة ، غالبا ما يكون من المفيد إجراء اختبارات أولية لنمو التغاير المدعوم في وسط الزراعة المشتركة الجديد عند توفير فائض من السكروز. بالطبع ، عند اختيار متصفح غير متجانس محتمل ، من المهم اختيار واحد قادر على تقويض المصدر (المصادر) الأساسي للكربون العضوي الذي سيتم توفيره من قبل شريك البكتيريا الزرقاء. من المفيد أن نلاحظ هنا أن السكروز ، باعتباره الكربوهيدرات السائدة التي يتم توفيرها في العديد من المزارع البكتيرية الزرقاء / غيرية التغذية^{الهندسية 4} ، ليس كربوهيدرات تستخدم عالميا من قبل الميكروبات غير المتجانسة مثل الجلوكوز: يجب ترميز ناقلات السكروز المخصصة بواسطة الأنواع غير المتجانسة أو قد تكون الإنفرتيز خارج الخلية ضرورية لتحويل السكروز إلى فركتوز وجلوكوز غالبا ما يتم التعرف عليهما بواسطة الناقلات ذات التقارب^{العالي 8}. من الملاحظات المهمة التي يتم الإبلاغ عنها بشكل شائع من قبل العديد من المختبرات التي تبحث في المجتمعات الميكروبية المختلطة أن التآزر والتناقضات ذات الترتيب الأعلى تظهر بين الشركاء الضوئيين وغير المتجانسين⁴^،⁸^،¹³. على سبيل المثال ، قد تتيح المستقلبات الأخرى التي تفرز بشكل طبيعي (على سبيل المثال ، الأحماض العضوية ، والأشكال المخفضة من النيتروجين) أو العوامل المساعدة (على سبيل المثال ، siderophores) معدلات نمو أعلى لأحد الشريكين أو كليهما عند زراعتها في نفس الوسط بالنسبة للضوابط المحورية. على العكس من ذلك ، تم الإبلاغ عن أن المنتجات الثانوية الأيضية التي يحتمل أن تكون ضارة ، مثل فرط أكسجة الوسط عن طريق تقسيم ماء التمثيل الضوئي ، تسبب تثبيط النمو بين الأنواع لأحد الشريكين أو كليهما⁸. لذلك ، يمكن أن توفر أدوات التحكم المحورية معيارا مفيدا ، ولكن قد يختلف أداء الزراعة المشتركة عن التوقعات بسبب هذه الخصائص الناشئة.

اعتمادا على الشريك غير المتجانس وقدرات S. elongatus على إفراز السكروز (بناء على مستوى الحث ، تركيز IPTG المستخدم) ، يجب اختبار نسب مختلفة لكلا الكائنين. يعتمد نجاح الثقافات في المقام الأول على قدرة S. elongatus على الحفاظ على نمو الشريك غير المتجانس (أي هل يمكن أن ينتج مصدرا كافيا للكربون). في حين أن فرط نمو السلالة غير المتجانسة عادة ما يكون محدودا بسبب نقص الكربون العضوي المقدم في تكوين وسط الزراعة المشتركة ، يمكن للبكتيريا الزرقاء أن تتجاوز البكتيريا غير المتجانسة ، مما قد يؤدي إلى تفاعلات مثبطة ناشئة (على سبيل المثال ، ظروف فرط التأكسج⁸^،¹³). عند محاولة تحديد النسب المناسبة لكثافة الخلايا للبكتيريا الزرقاء: الخميرة ، فإن القاعدة التقريبية الجيدة هي أن شريك البكتيريا الزرقاء يمكنه دعم حجم خلية متساو للخلايا غير المتجانسة المصاحبة. نظرا لأن الخمائر حقيقية النواة تميل إلى أن يكون لها أحجام خلايا أكبر بكثير من البكتيريا الزرقاء التي تفرز السكروز ، فقد يعني هذا على الأرجح أن كثافة خلايا البكتيريا الزرقاء ستكون أعلى بكثير (على سبيل المثال ، 50-100 ضعف ل S. cerevisiae) في حالة مستقرة. لذلك ، فإن نقطة البداية الجيدة عند إنشاء استزراع مشترك جديد مع ظروف المختبر والأنواع الخاصة بالباحث هي حساب متوسط حجم الخلية لكل من البكتيريا الزرقاء والخميرة (بناء على القيم المنشورة ؛ على سبيل المثال ، انظر^{B10NUMB3R5 37}) لتقدير النسبة الحجمية. يمكن زرع القوارير الأولية بهذه النسبة من الخلايا. لاستكشاف مساحة الحل ، قد يرغب الباحث في الحفاظ على تركيز البكتيريا الزرقاء ثابتا (على سبيل المثال ، OD₇₅₀= 0.3) مع تغيير تركيز خلايا الخميرة لأعلى أو لأسفل بترتيب من حيث الحجم تقريبا بزيادات بناء على الإنتاجية المسموح بها من قبل مساحة الزراعة الضوئية المتاحة للباحث. بالطبع ، تعتمد هذه "القاعدة الأساسية" الحجمية على المعدل الذي يكون به الشريك الضوئي قادرا على إفراز عمليات التمثيل الضوئي العضوية (على سبيل المثال ، السكروز) التي يمكن استخدامها من قبل الشريك غير المتجانس. بمجرد تهيئة ظروف الزراعة المشتركة ، فإن المراقبة الدقيقة لأداء النمو لكلا الشريكين بمرور الوقت ستوفر بيانات قيمة فيما يتعلق بنسب الأنواع المثالية ، خاصة إذا كان من الممكن الحفاظ على الاستزراع المشترك المبكر لأيام إلى أسابيع ، مما يسمح للباحث بتحديد نسبة الحالة المستقرة التي تم الوصول إليها بالقرب من نهاية الاستزراع المشترك. يمكن استخدام هذه المعلومات عند اختيار كثافة التلقيح الأولية لكل نوع شريك في التجارب اللاحقة لمساعدة الاستزراع على الوصول بسرعة أكبر إلى نسبة الأنواع المثالية المحددة ذاتيا.

في الجزء الثاني من البروتوكول ، يتم توفير تعليمات مفصلة لتحليلات الثقافة المشتركة. يعد القياس الكمي الموثوق به للثقافات المشتركة أمرا أساسيا لتنفيذها بنجاح: يعد النمو (أو على الأقل النشاط الأيضي) للشريك المفرز للكربون المطبقة الضوئية أمرا ضروريا للحفاظ على الكائنات غير المتجانسة. في حين أن نسبة البكتيريا الزرقاء: غيرية التروفة المستخدمة في تلقيح الثقافة قد لا تكون دائما حاسمة للتحسين ، نظرا لأن المزارع المشتركة طويلة الأجل تميل إلى التقارب نحو نسب مستقرة ، فقد يكون من المهم دمج طرق للتحقق من النمو غير المقيد لأي من الشريكين من خلال تخفيف الثقافة أو تغليف نوع واحد أو أكثر³⁶^،³⁸^،³⁹^،⁴⁰. كما ذكرنا أعلاه ، قد تكون المنتجات الثانوية للشريك البكتيريا الزرقاء مثبطة للمتجانسة بتركيزات عالية (على سبيل المثال ، O₂) ، وقد تكون بعض منتجات التمثيل الغذائي غير المتجانس ضارة أيضا بصحة البكتيريا الزرقاء. تستخدم معظم الثقافات المشتركة المنشورة غير متجانسة التغذية التي لها معدل نمو أسرع من معظم أنواع البكتيريا الزرقاء النموذجية. لذلك ، يميل معدل النمو غير المتجانس إلى أن يكون مقيدا بإمدادات الكربون العضوي التي تنتجها البكتيريا الزرقاء. ومع ذلك ، فإن تحديد ديناميكيات وفرة الأنواع بمرور الوقت هو قيمة حاسمة لتوضيح الإخفاقات في الاستقرار وتحسين الثقافات المشتركة القوية في الزراعة طويلة الأجل.

يتم توفير بروتوكولات القياس الكمي باستخدام غرف العد وعدادات الجسيمات وقياس التدفق الخلوي أحادي الخلية. جميع التقنيات هي أدوات قيمة لتوصيف الثقافات المشتركة ، مع متطلبات ومزايا وقيود مختلفة. غرف العد قابلة للتطبيق على نطاق واسع جدا للقياس الكمي للزراعة المشتركة ، بشرط أن يتم تمييز جميع الشركاء في المزرعة بصريا من خلال أشكال الخلايا أو غيرها من الخصائص. الميزة الكبيرة هي السعر المنخفض لهذا الجهاز ، بحيث يمكن تحقيقه بشكل أساسي لكل مختبر. إلى جانب المعلومات حول تكوين الزراعة المشتركة ونسبة الشركاء المختلفين ، يمكن الحصول على انطباع عن مورفولوجيا الخلية ولياقتها جنبا إلى جنب ، ويمكن اكتشاف الملوثات المحتملة. ومع ذلك ، فإن تطبيق غرفة العد يستغرق وقتا طويلا للغاية ، ويأتي مع عبء عمل مرتفع ، ولا يمكنه سوى دعم إنتاجية منخفضة.

توفر كل من عدادات الجسيمات وقياس التدفق الخلوي أحادي الخلية فوائد هائلة للإنتاجية العالية والمعالجة المريحة والموفرة للوقت. بينما يعتمد عداد الخلية على اختلافات واضحة في أحجام الخلايا للشركاء في الزراعة المشتركة ، يمكن للقياس الخلوي أحادي الخلية أيضا تمييز ملصقات التألق ، مما يؤدي إلى القدرة على تحديد الثقافات المشتركة مع أكثر من عضوين من نفس الحجم أو حتى طفرتين مختلفتين من نفس الكائن الحي بناء على علامات فلورسنت مختلفة. في المثال المقدم لتجميع اصطناعي ل Synechocystis مع S. cerevisiae و U. maydis ، تم استخدام مراسلي التألق داخل الخلايا mKate2 و eGFP للتمييز بين الخميرة. يمكن أيضا استخدام نفس المراسلين الفلوريين للتمييز بين سلالتين معدلتين وراثيا من نفس الكائن الحي (على سبيل المثال S. cerevisiae) والتي لا يمكن فصلها بناء على خصائص تشتت الضوء وحدها. تم تنفيذ استراتيجيات مماثلة لتتبع اتحادات البكتيريا^{الاصطناعية 41}. اعتمادا على نوع الخلية ، وعدد الشركاء في الاتحاد ، ونطاقهم المحتمل من التألق الذاتي (الكتل) ، يحتاج اختيار علامات الفلورسنت إلى مزيد من الاهتمام لتجنب تداخل الصفات الطيفية ، لا سيما بالنظر إلى خصائص الفلورسنت الذاتي للبكتيريا الزرقاء. ⁴²

نحن ندعو هنا إلى كيفية الالتزام بالمبادئ التوجيهية ل FAIR من حيث تخزين البيانات العلمية وإدارتها ومشاركتها. FAIR هو اختصار يرمز إلى Findable و Accessible و Interoperable و Reuseable⁴³. نظرا لأن هذه المبادئ تكتسب قبولا أوسع ، فإنها تعد بتغيير مشهد البحث البيولوجي ، وتعزيز نهج أكثر انفتاحا وتعاونا وكفاءة لإدارة البيانات واستخدامها. في حين يمكن ضمان المكونات الهامة لإمكانية الوصول من خلال إيداع البيانات في سياق البحث المشروح (ARC) ⁴⁴ ، فمن المهم تمكين إعادة إنتاج خطوات معالجة البيانات باستخدام برامج الوصول المفتوح. تخزن ملفات FCS الأولية كلا من البيانات والبيانات الوصفية (معلومات حول الليزر وأجهزة الكشف ، بما في ذلك الأطوال الموجية والمرشحات وما إلى ذلك) حول تجارب قياس التدفق^{الخلوي 45}. يمكن تحميلها وقراءتها خارج البرامج الاحتكارية التي تسمح بتحليل البيانات المتطور، على سبيل المثال، يتوفر عدد من الحزم للعمل مع البيانات الأولية داخل بيئة Python. توضح الحزمة المطورة كيفية تحميل ملفات .fcs الأولية التي تحتوي على بيانات قياس الخلايا خارج البرنامج الاحتكاري وقراءتها وتصورها باستخدام إحدى الحزم العديدة المتاحة في Python²³. إن استخدام البرامج المفتوحة كما هو موضح أعلاه يلغي الحاجة إلى رسوم ترخيص باهظة الثمن المرتبطة بالبرمجيات الاحتكارية، ويوفر تحكما كاملا في معالجة البيانات (على سبيل المثال، التحويل، والتعويض، والبوابات) ويسمح أيضا بدمج العديد من الأدوات في مكان واحد.

من المزايا الإضافية القيمة لاستخدام القياس الخلوي أحادي الخلية جنبا إلى جنب مع فارز الخلايا فرصة أيضا لجمع خلايا من نوع مميز بواسطة FACS. يمكن أن يكون هذا ذا قيمة كبيرة لتطبيق أي تقنيات -omics للحصول على رؤى مفصلة حول تفاعل الأنواع داخل الثقافة المشتركة ، مثل RNASeq أو التمثيل الغذائي. الجانب السلبي الواضح لهذه الأجهزة هو أسعارها المرتفعة ، لذا فإن القدرة على تحمل التكاليف وتوافرها لهذه الأجهزة قد تكون قيدا واضحا في بعض المختبرات.

ومن المثير للاهتمام أن المقارنة المباشرة للطرائق المعروضة للقياس الكمي للشركاء الثلاثة في اتحاد كشفت عن توافق جيد جدا بين التقنيات المختلفة ، مما يشير إلى أن الخليط الذي تم تجميعه بناء على قياسات OD يتم قياسه كميا بشكل موثوق به بواسطة جميع الطرق الموصوفة. ومن المثير للاهتمام أن العدد الإجمالي للبكتيريا الزرقاء كان أعلى بحوالي 3-4 مرات من عدد نوعي الخميرة ، وهي ظاهرة من المحتمل أن تكون بسبب حجم خليتهما الأصغر. وتتماشى هذه الملاحظة تماما مع المعارف العامة بأن النماذج التنظيمية لا توفر معلومات عن أعداد الخلايا الفعلية دون معايرة⁴⁶. ومع ذلك ، أظهرت الخمائر عددا على مستوى مماثل (الجدول 2 والجدول 3). بالإضافة إلى ذلك ، توضح المقارنة مع القياس الكمي للثقافات الفردية أن جميع الطرق الثلاث هي أدوات موثوقة للتمييز بين أنواع الخلايا ، باستثناء عداد الجسيمات الذي لم يفصل بين نوعي الخميرة.

في جوهرها ، من الواضح أن تطبيقات قياس الخلايا أحادية الخلية هي أقوى أداة لمراقبة تكوين الثقافات المشتركة ، مما يسمح بعد 1,000-10,000 خلية في الثانية. هذا صحيح بشكل خاص إذا زاد عدد الشركاء إلى أكثر من اثنين أو إذا كان الشركاء متشابهين في الشكل و / أو القطر. والجدير بالذكر أن هناك الكثير من البدائل التي تسمح بمراقبة الثقافات المشتركة. يمكن ، على سبيل المثال ، تتبع نمو الميكروبات ذات العلامات الفلورية في المزارع المشتركة بشكل مستمر عن طريق قياس الفلور أو المفاعلات الحيوية^{الدقيقة 47}. ومع ذلك ، غالبا ما تقتصر هذه على ثقافة مشتركة بين شريكين وتتطلب تصميما تجريبيا دقيقا ، على سبيل المثال ، في اختيار علامات التألق. يعد تسلسل Amplicon (تسلسل 16S rRNA) وتقنيات التسلسل الأخرى من الجيل التالي جنبا إلى جنب مع المعلوماتية الحيوية المتطورة خيارا آخر لتوصيف المجتمعات الاصطناعية⁴⁸^،⁴⁹^،⁵⁰. هذه التقنيات مناسبة للأساليب عالية الإنتاجية ويمكن أن تعالج التفاعلات الراسخة في المزارع طويلة الأجل أو الأسئلة التطورية أو تتبع الطفرات مع شركاء ميكروبيين متعددين.

مجتمعة ، توفر الثقافات الميكروبية المشتركة المبسطة المصممة بشكل عقلاني نهجا قويا "من الأسفل إلى الأعلى" لاستجواب الديناميكيات بين الأنواع التي قد يكون من الصعب التعامل معها داخل المجتمعات متعددة الأنواع التي تهيمن على العالم الطبيعي⁵¹^،⁵²^،⁵³. هنا ، يتم توفير بروتوكول مبسط يمكن تكييفه بسهولة من قبل المجتمع العلمي لإنشاء وتحليل أزواج جديدة من البكتيريا الزرقاء والشركاء غير المتجانسين. من الواضح أن هناك حاجة إلى الكثير من البحث للاستفادة من الرؤى الأساسية المحتملة التي يمكن اكتسابها من الثقافات الميكروبية الاصطناعية المشتركة وكذلك لتحديد ما إذا كانت الاتحادات الميكروبية المصممة صناعيا يمكن أن تتطابق مع الإمكانات المنسوبة إليها غالبا في الأدبيات الخاصة بتطبيقات التكنولوجيا الحيوية.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من قبل Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG ، مؤسسة البحوث الألمانية) - SFB1535 - معرف المشروع 458090666 (المشروع B03 إلى KS و AM و IA) ، و Major Research Instrumentation INST 208 / 808-1. تزور دائرة تنمية المجتمع حاليا HHU دوسلدورف كزميل مركاتور في SFB1535. تم تقديم دعم إضافي ل EJK من قبل جوائز المؤسسة الوطنية للعلوم #1845463 و #2334680.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
10x Ph1 الهدف	Carl Zeiss AG	46 04 01-9904
525/40 نانومتر مرشح ممر	النطاق Beckman Coulter، Inc.	A01-1-0051	مرشح FITC (في ليزر 488 نانومتر)
660/10 نانومتر مرشح ممر النطاق	الترددي Beckman Coulter، Inc.	A01-1-0055	قناة APC (في ليزر 638 نانومتر)
710/50 نانومتر مرشح ممر النطاق	الترددي Beckman Coulter، Inc.	قناة B71092	PC5.5 (في ليزر 561 نانومتر)
Accuvettes ل Multisizer 4e	Beckman Coulter، Inc.	A35473	عينة أكواب مع أغطية أنبوب
الفتحة 30 & mu ؛ M for Multisizer 4e	Beckman Coulter، Inc.	C92760	Capillary
Autoclave	Lab Associates	EQM-ARBP	لتعقيم المواد
قوارير محيرة ROTILABO & reg ؛ ، رقبة مستقيمة ، 250 مل	Carl Roth GmbH + Co. KG	LY95.1
BG11 / CoYBG11 مكونات	موردين مختلفين		انظر الجدول 1 ؛
معقم أعلى	زجاجة Sigmaaldrich	Z222593	إلى الوسائط المعقمة إذا كنت لا ترغب في استخدام الأوتوكلاف
الشعيرات الدموية 45 & m	Omni Life Science	OLS 5651738
CASY Cell Counter Model TTC	Schaerfe Systems
CASY أكواب	Omni Life Science	OLS 5651794
CASYclean	Omni Life Science	OLS 5651786	محلول التنظيف
CASYton	حل Omni Life Science	OLS 5651808	Isotonic Solution
أنابيب الطرد المركزي (50 مل)	Sigmaaldrich	CLS430828
CO_{2< / sub>}	BOC	270182-L	لتزويد البكتيريا الزرقاء الثقافات المحورية والثقافات المشتركة
CONTRAD & reg ؛ 70	Beckman Coulter، Inc.	81911	محلول تنظيف عميق
غطاء زجاجي 20 مرة; 26 × 0.4 مم	VWR International GmbH	631-1190	غطاء زجاجي لعد غرفة
الكوفيت	Sarstedt	67.742
البكتيريا الزرقاء BG-11 محلول المياه العذبة	Merck KGaA	C3061
CytExpert Software v. 2.6	Beckman Coulter، Inc.		برنامج تطبيق مقياس الخلايا
CytoFLEX غمد السائل	Beckman Coulter، Inc.	B51503	مقياس خلوي سائل شيت
CytoFLEX S	Beckman Coulter، Inc.	منظف BE51180
DxH ل Multisizer 4e	Beckman Coulter، Inc.	628022	محلول التنظيف
جهاز طرد مركزي أنبوب Eppendorf (صغير)	Labstac	CEN16-15	لجهاز طرد مركزي أقل من 2 مل من ثقافة
Ethanol	Carl Roth GmbH + Co. KG	K928.1
أنابيب FACS	Beckman Coulter، Inc.	2523749	أنابيب للوضع شبه التلقائي
FlowClean Cleaning Agent ، 500 مل	Beckman Coulter، Inc.	C48093	محلول نظيف يومي
أسطوانات متدرجة	Sigmaaldrich	Z131121	لإعداد وسائل الإعلام
HEPPSO	Merck KGaA	R426725
Infors MultiTron photoincubator	Infors AG		ضوء LED أبيض
IPTG	Merck KGaA	I6758	تحضير aliquots ، وتخزينها في -20 درجة ؛ C ، ذوبان الجليد والحفاظ على الجليد ؛
Isoton II ل Multisizer 4e	Beckman Coulter، Inc.	8448011	محلول متساوي التوتر
Kaluza v. 2.2	Beckman Coulter، Inc.	B16406	برنامج تحليل بيانات القياس الخلوي
KimWipes	VWR International GmbH	115-2221	مناديل خالية من الوبر
KOH	Merck KGaA	221473
KPO_{3< / sub>}	Noah Chemicals	7790-53-6
أكواب قياس	VWR	213-3747
لوحة اختبار دقيقة ، 96 بئر ، غطاء سهل الارتداء ، قاعدة مسطحة ، PS ، شفافة	SARSTEDT AG & Co. KG	82.1581.001
قاعدة مجهر	Carl Zeiss AG	47 09 18-9902 / 16
رأس Microsope	Carl Zeiss AG	47 30 14
Milli-Q نظام تنقية المياه	Merck Millipore	C85358
Mulitisizer 4e عداد الجسيمات	Beckman Coulter، Inc.	B23005	بديل لعداد الخلايا CASY
تم تحسين Neubauer ، العمق 0.02 مم	غرفة العد	المساعدة في ألمانيا
Neubauer ، العمق 0.1 مم	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	640010	العد
جاهزة للاستخدام يوميا لمراقبة الجودة Fluorospheres	Beckman Coulter، Inc.	C65719	مرجع لزجاجات مراقبة الجودة
SCHOTT	Dutscher	90347	للتخزين
Specord & reg ؛ 200 Plus مقياس الطيف	الضوئي التحليلي Jena GmbH		OD600 / 750
السكروز	Merck KGaA	84100
أجهزة الطرد المركزي على سطح الطاولة (كبيرة)	Labstac	CEN18-06R	تجمع قاعدة النيتروجين الخميرة للكتلة الحيوية
، بدون أحماض أمينية ، بدون كبريتات الأمونيوم	Thermo Fisher Scientific Inc.	11743014

مرشح تم تحسين غرفة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Roell, G. W., Zha, J., Carr, R. R., Koffas, M. A., Fong, S. S., Tang, Y. J. Engineering microbial consortia by division of labor. Microb Cell Factories. 18 (1), 35(2019).
Grandel, N. E., Reyes Gamas, K., Bennett, M. R. Control of synthetic microbial consortia in time, space, and composition. Trends Microbiol. 29 (12), 1095-1105 (2021).
Weiland-Bräuer, N. Friends or Foes-Microbial Interactions in Nature. Biology. 10 (6), (2021).
Santos-Merino, M., Yun, L., Ducat, D. C. Cyanobacteria as cell factories for the photosynthetic production of sucrose. Front Microbiol. 14, 1126032(2023).
Klähn, S., Hagemann, M. Compatible solute biosynthesis in cyanobacteria. Environ Microbiol. 13 (3), 551-562 (2011).
Dean, P. N., Bagwell, C. B., Lindmo, T., Murphy, R. F., Salzman, G. C. Introduction to flow cytometry data file standard. Cytometry. 11 (3), 321-322 (1990).
Rippka, R., Stanier, R. Y., Deruelles, J., Herdman, M., Waterbury, J. B. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. Microbiology. 111 (1), 1-61 (1979).
Hays, S. G., Yan, L. L. W., Silver, P. A., Ducat, D. C. Synthetic photosynthetic consortia define interactions leading to robustness and photoproduction. J Biol Eng. 11, 4(2017).
Ducat, D. C., Avelar-Rivas, J. A., Way, J. C., Silver, P. A. Rerouting carbon flux to enhance photosynthetic productivity. Appl Environ Microbiol. 78 (8), 2660-2668 (2012).
Thiel, K., et al. Redirecting photosynthetic electron flux in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 by the deletion of flavodiiron protein Flv3. Microb Cell Factories. 18 (1), 189(2019).
Song, K., Tan, X., Liang, Y., Lu, X. The potential of Synechococcus elongatus UTEX 2973 for sugar feedstock production. Appl Microbiol Biotechnol. 100 (18), 7865-7875 (2016).
Feng, J., et al. Generation and comprehensive analysis of Synechococcus elongatus-Aspergillus nidulans co-culture system for polyketide production. Biotechnol Biofuels Bioprod. 16 (1), 32(2023).
Li, T., et al. Mimicking lichens: incorporation of yeast strains together with sucrose-secreting cyanobacteria improves survival, growth, ROS removal, and lipid production in a stable mutualistic co-culture production platform. Biotechnol Biofuels. 10, 55(2017).
JoVE Science Education Database. Microbiology. Growth Curves: Generating Growth Curves Using Colony Forming Units and Optical Density Measurements. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
Yeast Extract-Peptone-Dextrose (YEPD). (9), Cold Spring Harb Protoc. (2015).
Zhang, M., et al. Improvement of cell counting method for Neubauer counting chamber. J Clin Lab Anal. 34 (1), e23024(2020).
Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies. Eu J Immunol. 47 (10), 1584-1797 (2017).
Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (third edition). Eu J Immunol. 51 (12), 2708-3145 (2021).
Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
Tung, J. W., et al. Modern flow cytometry: a practical approach. Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).
JoVE Science Education Database. Flow Cytometry. , JoVE. Cambridge, MA. (2023).
Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. Current trends in flow cytometry automated data analysis software. Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).
Yurtsev, E., Friedman, J., Gore, J. FlowCytometryTools: Version 0.4.5. , Available from: https://pypi.org/project/FlowCytometryTools/ (2021).
White, S., et al. FlowKit: A Python Toolkit for Integrated Manual and Automated Cytometry Analysis Workflows. Front Immunol. 12, 768541(2021).
O'Neill, K., Aghaeepour, N., Spidlen, J., Brinkman, R. Flow cytometry bioinformatics. PLoS Comput Biol. 9 (12), e1003365(2013).
Klement, T., Milker, S., Jäger, G., Grande, P. M., Domínguez de María, P., Büchs, P. Biomass pretreatment affects Ustilago maydis in producing itaconic acid. Microb Cell Factories. 11, 43(2012).
Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Sucrose utilization in budding yeast as a model for the origin of undifferentiated multicellularity. PLoS Biol. 9 (8), e1001122(2011).
Koschwanez, J. H., Foster, K. R., Murray, A. W. Improved use of a public good selects for the evolution of undifferentiated multicellularity. ELife. 2, e00367(2013).
Winston, F., Dollard, C., Ricupero-Hovasse, S. L. Construction of a set of convenient Saccharomyces cerevisiae strains that are isogenic to S288C. Yeast. 11 (1), 53-55 (1995).
Shcherbo, D., et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues. Biochem J. 418 (3), 567-574 (2009).
Brachmann, A., Weinzierl, G., Kämper, J., Kahmann, R. Identification of genes in the bW/bE regulatory cascade in Ustilago maydis. Mol Microbiol. 42 (4), 1047-1063 (2001).
Cormack, B. P., Valdivia, R. H., Falkow, S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). Gene. 173 (1 Spec), 33-38 (1996).
Behle, A., Saake, P., Germann, A. T., Dienst, D., Axmann, I. M. Comparative dose-response analysis of inducible promoters in cyanobacteria. ACS Synth Biol. 9 (4), 843-855 (2020).
Lindemann, S. R., et al. Engineering microbial consortia for controllable outputs. ISME J. 10 (9), 2077-2084 (2016).
Duncker, K. E., Holmes, Z. A., You, L. Engineered microbial consortia: strategies and applications. Microb Cell Factories. 20 (1), 211(2021).
Fedeson, D. T., Saake, P., Calero, P., Nikel, P. I., Ducat, D. C. Biotransformation of 2,4-dinitrotoluene in a phototrophic co-culture of engineered Synechococcus elongatus and Pseudomonas putida. Microb Biotechnol. 13 (4), 997-1011 (2020).
Milo, R., Jorgensen, P., Moran, U., Weber, G., Springer, M. BioNumbers-the database of key numbers in molecular and cell biology. Nucleic Acids Res. 38 (suppl_1), D750-D753 (2009).
Tóth, G. S., et al. Photosynthetically produced sucrose by immobilized Synechocystis sp. PCC 6803 drives biotransformation in E. coli. Biotechnol Biofuels Bioprod. 15 (1), 146(2022).
Weiss, T. L., Young, E. J., Ducat, D. C. A synthetic, light-driven consortium of cyanobacteria and heterotrophic bacteria enables stable polyhydroxybutyrate production. Metabol Eng. 44, 236-245 (2017).
Zhang, L., Chen, L., Diao, J., Song, X., Shi, M., Zhang, W. Construction and analysis of an artificial consortium based on the fast-growing cyanobacterium Synechococcus elongatus UTEX 2973 to produce the platform chemical 3-hydroxypropionic acid from CO2. Biotechnol Biofuels. 13, 82(2020).
Jorrin, B., et al. Stable, fluorescent markers for tracking synthetic communities and assembly dynamics. Microbiome. 12 (1), 81(2024).
Yokoo, R., et al. Live-cell imaging of cyanobacteria. Photosynth Res. 126, 36-46 (2015).
Wilkinson, M. D., et al. The FAIR guiding principles for scientific data management and stewardship. Sci Data. 3, 160018(2016).
Venn, B., et al. Fostering the democratization of research data by using the Annotated Research Context (ARC) as practical implementation. E-Science-Tage 2021: Share Your Research Data. , (2021).
Ortolani, C. The Cytometric File. Flow Cytometry Today: Everything You Need to Know about Flow Cytometry. , Springer. Cham. (2022).
Beal, J., et al. Robust estimation of bacterial cell count from optical density. Communi Biol. 3 (1), 512(2020).
Funke, M., et al. Microfluidic biolector-microfluidic bioprocess control in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 107 (3), 497-505 (2010).
Zhang, P., Spaepen, S., Bai, Y., Hacquard, S., Garrido-Oter, R. Rbec: a tool for analysis of amplicon sequencing data from synthetic microbial communities. ISME Commun. 1 (1), 73(2021).
Ezzamouri, B., Shoaie, S., Ledesma-Amaro, R. Synergies of systems biology and synthetic biology in human microbiome studies. Front Microbiol. 12, 681982(2021).
Zaramela, L. S., Tjuanta, M., Moyne, O., Neal, M., Zengler, K. synDNA-a synthetic DNA spike-in method for absolute quantification of shotgun metagenomic sequencing. mSystems. 7 (6), e0044722(2022).
Bittihn, P., Din, M. O., Tsimring, L. S., Hasty, J. Rational engineering of synthetic microbial systems: from single cells to consortia. Curr Opin Microbiol. 45, 92-99 (2018).
San León, D., Nogales, J. Toward merging bottom-up and top-down model-based designing of synthetic microbial communities. Curr Opin Microbiol. 69, 102169(2022).
Fedeson, D. T., Ducat, D. C. Symbiotic Interactions of Phototrophic Microbes: Engineering Synthetic Consortia for Biotechnology. Role of Microbial Communities for Sustainability. , Springer. Singapore. (2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تجميع وقياس المزارع المشتركة التي تجمع بين الخميرة غير المتجانسة والبكتيريا الزرقاء التي تفرز السكر الضوئية

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة