مقالة منهجية

الكشف عن بروتيوفورمات هيستون باستخدام الرحلان الكهربائي للجل 2D-TAU

DOI:

10.3791/67321

⸱

أكتوبر 18, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Research Center on Advanced Biochemistry and Molecular Biology, Department of Experimental and Clinical Medicine, Magna Græcia University of Catanzaro, 2Department of Pharmacy, Health and Nutritional Sciences, University of Calabria

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الطريقة استراتيجية بسيطة وسريعة لتوصيف البروتيون هيستون والتحقيق فيه.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخضع الهستونات لتعديلات ما بعد الترجمة المختلفة (PTMs) مثل المثيلة ، والأستيل ، والفسفرة ، والأسيلة ، والانتشار في كل مكان ، والتي تتحكم في ديناميكيات النيوكليوسوم وتحدد مصير الخلية. يتكون النيوكليوسوم ، وهو الوحدة الوظيفية للكروماتين ، من الحمض النووي ، وأربعة أزواج من الهستونات (H3 ، H4 ، H2A ، و H2B) التي تشكل اللب الكروي ، والرابط هيستون H1 ، الذي يعمل على استقرار بنية الكروماتين. تبرز ذيول الطرفية الأمينية (N) للهيستونات من المجالات الأساسية الكروية وتخضع لاختبارات PTMs مميزة تؤثر على مشهد الكروماتين. تشير بعض الأدلة إلى أن توازن هيستون PTM أمر بالغ الأهمية للحفاظ على جميع الأنشطة الفسيولوجية. يعد تحرير هيستون PTMs السبب الرئيسي للتكاثر الخلوي غير الطبيعي والغزو والورم الخبيث. لذلك ، يعد تطوير طرق لتوصيف PTMs من الهيستون أمرا بالغ الأهمية. هنا ، نصف تقنية فعالة لعزل وتحليل الأشكال الإسوية للهيستون. تسمح الطريقة ، التي تعتمد على الجمع بين فصلين متعامدين ، بإثراء الأشكال الإسوية للهيستون وتحديد قياس الطيف الكتلي التالي. تجمع هذه التقنية ، التي وصفها في الأصل Shechter et al. ، بين المواد الهلامية حمض اليوريا بولي أكريلاميد (TAU-GEL) ، والتي يمكنها فصل بروتينات الهيستون الأساسية بناء على الحجم والشحنة ، والمواد الهلامية دوديسيل كبريتات الصوديوم وبولي أكريلاميد (SDS-PAGE) ، والتي يمكنها فصل البروتينات حسب الوزن الجزيئي. والنتيجة هي خريطة ثنائية الأبعاد للأشكال الإسوية من الهيستون ، مناسبة للهضم داخل الهلام متبوعا بتحديد قياس الطيف الكتلي وتحليل اللطخة الغربية. والنتيجة هي خريطة ثنائية الأبعاد للأشكال الإسوية من الهيستون ، ومناسبة لكل من الهضم داخل الهلام متبوعا بتحديد قياس الطيف الكتلي وتحليل اللطخة الغربية. هذا النهج البروتيني هو طريقة قوية تسمح بإثراء شكل إسوي هيستون واحد وتوصيف PTMs هيستون الجديدة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يرتبط ظهور السرطان وتطوره ومقاومته الكيميائية بالأحداث الجينية والجينية ، بما في ذلك هيستون PTMs. تخضع الهستونات لمجموعة متنوعة من PTMs التي تنظم ديناميكيات الكروماتين وتملي مصيرالخلية 1.

النيوكليوسوم هو الوحدة الوظيفية للكروماتين وهو مركب جزيئي من الحمض النووي والبروتينات يسمح بتعبئة الحمض النووي في النواة. يتكون من أربعة أزواج من الهستونات (H3 و H4 و H2A و H2B) التي تشكل نواة النيوكليوسوم ، بالإضافة إلى الرابط هيستون H1 ، مما يساعد على استقرار بنية الكروماتين. تبرز ذيول الهيستونات الأمينية (N) الطرفية من مجالاتها الأساسية الكروية وتخضع لتعديلات محددة بعد الترجمة تؤثر على مشهد الكروماتين2.

حتى الآن ، ما لا يقل عن 23 فئة من PTMs هيستون. هذه PTMs عبارة عن تعديلات تساهمية تتكون بشكل أساسي من المثيلة ، الأستلة ، الفسفرة ، الارتباط بالجليكوزيل ، الكل في كل مكان ، SUMOylation ، و ADP-ribosylation3. بالإضافة إلى ذلك ، تم مؤخرا اقتراح علاقة وثيقة بين توازن epigenome وإعادة الأسلاك الأيضية ، وهو ما يفسر النمو المتسارع للعدد المحتمل من histones PTMs4،5،6،7،8،9،10،11،12،13. يتم تسمية Histone PTMs ، المودعة والممسوحة والمحولة بواسطة إنزيمات المعدل ، على التوالي باسم الكتاب والممحاة والقراء. إنها تؤثر على الخصائص الفيزيائية والكيميائية لبنية الكروماتين ، مما يؤثر على ملف تعريف التعبير الجيني ، بما في ذلك التعبير عن الجينات المثبطة للورم والجينات المسرطنة14،15،16.

يزداد عدد الأشكال البروتينية الهستونية عند دمجها في النيوكليوسوم كمتغيرات هيستون. هذه المتغيرات هي أشكال إسوية غير أليلية من الهستونات الكنسية ، وتضيف تعقيدا عن طريق تغيير الخصائص الكيميائية والفيزيائية للكروماتين. بالمقارنة مع الهستونات الكنسية ، فإن متغيرات الهيستون لها مجالات وظيفية تخضع لتعديلات فريدة بعد الترجمة أو تتفاعل مع مكونات كروماتين محددة ، مما يؤثر على ديناميكيات واستقرار النيوكليوسوم17.

في الخلايا السرطانية ، يؤثر تحرير هيستون PTMs والمتغيرات على ملف تعريف التعبير الجيني ، مما يؤدي إلى تكاثر خلوي غير طبيعي ، وغزو ، ورم خبيث ، وتنشيط مسارات مقاومة الأدوية3،18،19،20. يمكن أن تؤدي الطفرات داخل مجمعات إعادة تشكيل الهيستونات أو الكروماتين إلى تغيير النمط الظاهري للخلية ، مما يساهم في تحول الأورام. يعد تراكم التغيرات اللاجينية ، مثل مثيلة الهيستون ، عاملا رئيسيا في تنشيط مسارات مقاومة الأدوية21،22،23. تؤثر الطفرات داخل مجمع SWI / SNF ، الذي يتكون من 15 وحدة فرعية مشفرة بواسطة 29 جينا ، على أكثر من 20٪ من السرطانات البشرية عبر العديد من أنواع الأورام. في العقد الماضي ، تم تطوير استراتيجيات الأدوية القائمة على علم التراث (epi-drugs) ، وتمت الموافقة على العديد من الأدوية التي تستهدف السرطان بأنماط غير طبيعية لتعديل الهيستون من قبل إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) 23.

يعد تحليل بروتينات الهيستون أمرا صعبا للغاية ، مما يجعله مجالا متطلبا للدراسة. في الآونة الأخيرة ، أصبحت طرق قياس الطيف الكتلي هي الطريقة المفضلة لتوصيف ودراسة الأشكال البروتينية الهيستونية. ومع ذلك ، فإن ظروف الاستخراج الصارمة ، جنبا إلى جنب مع ضعف قابلية الذوبان لبعض المتغيرات وتماثل التسلسل العالي ، تجعل تحليلها صعبا.

في العقد الماضي ، تم تطوير العديد من الطرق القائمة على قياس الطيف الكتلي لتنميط الهيستون والتحقيقفيه 24،25،26،27. في هذه الدراسة ، نقدم طريقة فعالة من حيث التكلفة وموثوقة لإنشاء خريطة ثنائية الأبعاد للأشكال البروتينية الهيستونية ، والتي يمكن أن تعزز فرص اكتشاف تعديلات جديدة بعد الترجمة.

يجمع الرحلان الكهربائي 2D TAU بين الفصل في الظروف الحمضية مع SDS PAGE. في البعد الأول ، تعطي الحالة الحمضية للوسط شحنة موجبة صافية للبروتينات الأساسية. نظرا لأن الهستونات هي بروتينات أساسية للغاية ولها نقطة متساوية كهربية أعلى (pH) مقارنة بالوسط ، فإنها تصبح موجبة الشحنة وتهاجر تحت مجال كهربائي. في البعد الثاني ، يتم تغيير طبيعة الهستونات بواسطة SDS وفصلها بناء على وزنها الجزيئي. يمكن استخدام الخريطة ثنائية الأبعاد الناتجة كأداة لإثراء أشكال بروتينية محددة بدقة بقعة واحدة لتحليل قياس الطيف الكتلي والدراسات المناعية28،29. بعد الرحلان الكهربائي ، يمكن إزالة بقع TAU ثنائية الأبعاد وهضمها بالتربسين وتحليلها عن طريق قياس الطيف الكتلي. بدلا من ذلك ، يمكن مسح خريطة 2D TAU على مرشح النيتروسليلوز / PVDF والتحقيق فيها عن طريق التلوين المناعي27.

في هذا السياق ، قد تكون الأساليب استراتيجية لتحسين تحديد وتحليل التعديلات الجديدة بعد الترجمة المرتبطة بإعادة الأسلاك الأيضية30،31.

لقد قمنا بتحسين الطريقة الأصلية من خلال دمج خطوة صوتنة ، وهو أمر مفيد لتدهور الحمض النووي وتحسين قابلية ذوبان البروتين. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بإطالة خطوة الحضانة لاستخراج الهيستون ، من أجل الحصول على عينة بروتين عالية النقاء. علاوة على ذلك ، في بروتوكولنا ، قمنا بتشغيل البعد الأول بجهد منخفض لفترة أطول لتحقيق دقة أفضل. تم استخدام الجل الناتج للتحقيق في الهستونات الكنسية PTMs وتوصيف التعديلات الجديدة مثل الجليكيشن10،32.

بشكل عام ، قمنا بتطوير طريقة لاستخراج وتنقية الهستونات ، متبوعة بتحليل الأشكال البروتينية الهيستونية باستخدام خريطة ثنائية الأبعاد. يتضمن العمل أيضا إجراء للهضم داخل الهلام لتحليل قياس الطيف الكتلي وخطوات تحليل اللطخة الغربية ثنائية الأبعاد.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. استخراج هيستون

  1. قم بإجراء استخراج الهيستون من 1 × 106 خلايا على الأقل ، والتي تتجمع بنسبة 80٪. في هذه التجربة ، استخدمنا خطوط خلايا MCF-10A من ATCC. بعد الطلاء ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 1x. قم بتنفيذ جميع الخطوات على الجليد.
  2. قم بإعداد مخزن مؤقت لتحلل الخلية يحتوي على 10 ملي مولار Tris-HCl pH 8.0 و 1 ملي مولار KCl و 1.5 ملي ملي MgCl2. أضف 1 ملي مولار من ديثيوإريثريتول ومثبطات البروتياز والفوسفاتيز قبل الاستخدام مباشرة.
  3. أضف 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل الخلية إلى طبق بتري المحتوي على الخلية ، واكشط الخلايا واجمعها في أنبوب 1.5 مل ، ثم احتضن على دوار عند 300 دورة في الدقيقة ، 4 درجات مئوية لمدة ساعة.
  4. جهاز طرد مركزي عند 10,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق في جهاز طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا مع دوار لأنابيب 1.5 مل.
  5. اغسل الحبيبات ب 400 ميكرولتر من عازلة تحلل الخلية وأجهزة الطرد المركزي عند 10,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية. كرر خطوة الغسيل 3x.
    ملاحظة: استخدم جهاز طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا (4 درجات مئوية) مع دوار لأنابيب سعة 1.5 مل لجميع الخطوات. تعامل مع الحبيبات بعناية لتجنب فقدان المواد.
  6. أعد تعليق الحبيبات في 640 ميكرولتر من 0.2 م H2SO4 واحتضانها على دوار عند 300 دورة في الدقيقة ، عند 4 درجات مئوية ، لمدة 16 ساعة.
    تنبيه: حامض الكبريتيك مادة كيميائية خطرة. يرجى استخدامه تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  7. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد وقم بتخزينها حتى الخطوات التالية. تخلص من الحطام النووي.
  8. قم بترسيب الهستونات بإضافة 212 ميكرولتر من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك ، قطرة قطرة (التركيز النهائي ل TCA هو 33٪). امزج المحلول عن طريق قلب الأنبوب 10x. احتضن على الجليد ، في الظلام ، لمدة 16 ساعة.
    تنبيه: TCA مادة كيميائية خطرة. استخدم تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  9. هيستونات الحبيبات عن طريق الدوران في جهاز طرد مركزي مبرد مسبقا عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية بعناية واغسل الحبيبات 3x ب 200 ميكرولتر من الأسيتون البارد.
  10. أعد تعليق الحبيبات مع الأسيتون البارد ، ثم صوتنة عالية الطاقة 2x مع 3 دورات من 30 ثانية تشغيل / إيقاف ، بالتناوب مع توقف لمدة 10 دقائق على الجليد.
    ملاحظة: تم إجراء العملية باستخدام الموجات فوق الصوتية. هذه الخطوة ضرورية للتخلص من الحمض النووي الملفوف بالهيستون.
  11. جهاز طرد مركزي عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق ، وتخلص من الأسيتون ، وأعد تعليق العينة في 100 ميكرولتر من الماء المقطر المزدوج. حدد تركيز البروتين باستخدام طريقة فحص برادفورد ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة33.
    ملاحظة: بعد الطرد المركزي ، تبدو الحبيبات أحيانا بيضاء أو شفافة. يمكن أن يشير الراسب الأبيض وغير الشفاف إلى وجود ملوثات ملحية قد تضعف الفصل ثنائي الأبعاد. إذا كان الأمر كذلك ، كرر خطوات غسل الأسيتون حتى تصبح الحبيبات شفافة.
  12. قم بتجميد 70 ميكروغرام من الهستونات ، وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. اضبط المجفف على 30 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. تحقق من حجم الأنبوب وكرر الخطوة عند 30 درجة مئوية حتى يتم تجميد العينة بالكامل (بشكل عام ، 90 دقيقة ضرورية لتجميد العينة بالكامل). بعد 60 دقيقة ، تحقق من مستوى الصوت كل 10 دقائق لأن العملية تعتمد على العينة.
    ملاحظة: إذا كانت كمية بروتينات الهيستون منخفضة ، فابدأ من 2 × 106 خلايا. في هذه الحالة ، استخدم نفس حجم الكواشف المستخدمة ل 1 × 106 خلايا. تحقق من نقاء جميع المواد الكيميائية المستخدمة أثناء الإجراء ؛ يجب أن تكون جميع الكواشف من درجة HPLC.

2. الرحلان الكهربائي الكهربائي لمصغرة 2D هلام تريتون حمض اليوريا (TAU)

  1. قم بإعداد جل صغير TAU لنظام الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد العمودي المصغر كما هو موضح أدناه.
    1. تحضير جل الفصل: 6 م يوريا ، 15٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1) ، 5٪ حمض جليدي أسيتيك ، 0.25٪ تريتون X-100 (حجم / حجم) ، 0.4٪ TEMED (حجم / حجم) ، 0.1٪ APS (p / v). لتحضير المحلول ، قم بإذابة اليوريا في مادة الأكريلاميد / مكرر و 1 مل من الماء عالي النقاء مع تحريك لطيف في درجة حرارة الغرفة ؛ أضف المكونات الأخرى واضبط مستوى الصوت. للحصول على جل صغير TAU ، قم بإعداد 10 مل من المحلول. املأ ألواح الجل المحددة مسبقا بالمحلول ، وتجنب تكوين فقاعات الهواء على بعد 1.5 سم فقط من الأعلى. قم بتغطية المحلول ب 1 مل من الأيزوبروبانول لتسوية الجل.
    2. تحضير جل التكديس: 6 M Urea ، 6٪ أكريلاميد / بيساكريلاميد (29: 1) ، 5٪ حمض جليدي أسيتيك ، 0.25٪ Triton X-100 (حجم / حجم) ، 0.4٪ TEMED (حجم / حجم) ، 0.1٪ APS (p / v). لتحضير المحلول ، قم بإذابة اليوريا في مادة الأكريلاميد / مكرر و 1 مل من الماء عالي النقاء ؛ أضف المكونات الأخرى واضبطها على مستوى الصوت. املأ ألواح الجل بمحلول التكديس ، ضع مشطا جليا بسعة 10 آبار بين الألواح ، وأدخله حتى يأتي محلول الجل في منتصف أسنان المشط. اسمح للهلام بالبلمرة لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: أدخل المشط بعناية لضمان التكوين المنتظم للآبار.
  2. قم بإعداد 100 ميكرولتر من عينة TAU عن طريق إذابة 6 M من اليوريا ، و 5٪ من الحمض الجليدي الخليك ، والماء المقطر المزدوج. قم بإذابة العينة المجففة بالتجميد المحضرة في 30 ميكرولتر من عينة TAU.
  3. املأ الكاسيت الصغير بمخزن مؤقت يعمل TAU ، وتركيز نهائي لحمض الأسيتيك بنسبة 5٪. اشطف آبار TAU-gel بحقنة مملوءة بمحلول تشغيلي وقم بتحميل العينة في البئر باستخدام ماصة دقيقة.
  4. قم بتوصيل الغرفة الكهربائية بمصدر الطاقة ، مع وضع القطب الموجب (الأحمر) في الأسفل. انتبه ، عندما يكون IP > درجة الحموضة ، تكون البروتينات موجبة الشحنة ، وبالتالي فإن الهجرة تكون من القطب الموجب إلى القطب السلبي. قم بتشغيل الجل أولا عند 30 فولت لمدة 70 دقيقة ، ثم بجهد ثابت يبلغ 25 فولت لمدة 17 ساعة.
    ملاحظة: خلال هذا الوقت ، قم أحيانا بإيقاف تشغيل مصدر الطاقة وشطف آبار الجل باستخدام حقنة يمكن التخلص منها. انتبه لإزالة أي فقاعات من السطح السفلي للهلام باستخدام حقنة لتجنب فقدان العينة ووجود تلطيخ في البروتينات التي تم حلها.
  5. قم بإزالة الجل من ألواح الجل وقطع خط الاهتمام بمشرط نظيف. تعامل مع الجل بعناية لتجنب كسر الجل. نظرا لأن خط الاهتمام عديم اللون ، قم بتحميل العينة في البئر رقم 1 لتحديد مسار الاهتمام وقطعه بدقة.
    ملاحظة: للتحقق من الفصل على هلام MINI TAU ، قم بإعداد العينة وتشغيلها في نسختين. يمكن تلطيخ أحد هذه المواد الهلامية باستخدام Coomassie Brilliant Blue. تم الإبلاغ عن نمط الانفصال في الشكل 1 أ.
  6. اغسل الممر ب 15 مل من 0.5 M Tris-HCl pH 8.8 لمدة 15 دقيقة.
  7. تحضير 15 مل من المخزن المؤقت للتوازن 1 باستخدام 6 M Urea و 0.5 M Tris-HCl و pH 6.8 و 30٪ glycerol و 20٪ SDS و 2٪ Dithioerythritol. قم بإعداد 15 مل من المخزن المؤقت للتوازن 2 ، باستخدام 6 M Urea ، و 0.5 M Tris-HCl ، و pH 6.8 ، و 30٪ جلسرين ، و 20٪ SDS ، و 2٪ يودوأسيتاميد. تحضير المخزن المؤقت للتوازن 1 و 2 قبل الاستخدام مباشرة ؛ قم بتخزين المخزن المؤقت للتوازن 2 في الظلام.
  8. احتضان حارة الجل ، تحت تحريض لطيف ، في 10 مل من عازلة التوازن 1 لمدة 15 دقيقة ، ثم صبها. احتضن حارة الجل ، تحت التحريك اللطيف ، مع 10 مل من المخزن المؤقت للتوازن 2 لمدة 15 دقيقة في الظلام ، ثم صبها.
  9. قم بإعداد جل أكريلاميد SDS 15٪ باتباع الجدول 1. قم بإعداد لوحة الجل واملأها بمحلول الجل المحلل. املأ المحلول حتى يصبح على بعد 1.5 سم من نهاية صفيحة الهلام الطويلة. ضع 1 مل من الأيزوبروبانول على السطح لتسوية الجل والسماح له بالبلمرة.
  10. بعد بلمرة الهلام ، صب الأيزوبروبانول وجفف البئر باستخدام ورق كروماتوغرافيا السليلوز 3 مم. أدخل الممر الناتج من الخطوة 8 في بئر الجل.
  11. أغلق الممر إلى هلام المحلول القابل للحل بمحلول مانع للتسرب من 0.5٪ من نقطة انصهار منخفضة في 1x Tris / glycine / SDS و 5 ميكرولتر من 0.003٪ بروموفينول أزرق. اسمح ببلمرة هلام الاغاروز لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: تجنب تكوين فقاعات الهواء أثناء ختم الاغاروز لمنع تلطيخ الجل.
  12. ضع ألواح الجل في الكاسيت واملأها بمخزن مؤقت 1x Tris / glycine / SDS. مرري الجل على حرارة 120 فولت حتى تصل الصبغة الزرقاء البروموفينول إلى القاع. قم بإزالة الجل برفق من الألواح ، وتخلص من فائض الاغاروز ، وصمة عار الجل الفضي باستخدام إجراء متوافق مع قياس الطيف الكتلي أو لطخة للفحص المناعي.

3. تلطيخ الفضة 32

  1. تحضير الكواشف التالية - التثبيت: 50٪ ميثانول ، 5٪ حمض الأسيتيك ، 45٪ ماء منزوع الأيونات ؛ محلول الغسيل: 50٪ ميثانول ، 50٪ ماء منزوع الأيونات ؛ المحسس: 0.02٪ Na2S2O3 5H2O في الماء منزوع الأيونات ؛ كاشف الفضة: 0.1٪ نترات الفضة في الماء البارد (4 درجات مئوية) منزوع الأيونات ؛ المطور: 0.04٪ فورمالين و 2٪ Na2CO3 ، الفورمالديهايد (37٪) (أضف قبل الاستخدام مباشرة) 0.4 مل ماء منزوع الأيونات وملء ما يصل إلى 1000 مل ؛ كاشف التوقف: 5٪ حمض الخليك. محلول تخزين الجل: 1٪ حمض الأسيتيك.
    ملاحظة: نظرا لأن المواد الكيميائية المستخدمة في التلوين خطرة ، فقم بتنفيذ جميع الخطوات تحت غطاء الدخان الكيميائي.
  2. اتبع الإجراء الوارد في الجدول 2 مع مراعاة ما يلي. أداء جميع الحضانات مع التحريض اللطيف. تحضير كاشف التوقف قبل البدء في خطوة التطوير ؛ سيضمن ذلك تطوير الجل بكثافة مناسبة. خلال خطوة التطوير ، ستظهر البقع على شكل إشارات صفراء ستصبح بنية فاتحة في نهاية الحضانة. تعتمد شدة البقع المختلفة على كمية الأشكال البروتينية هيستون. الجل جاهز لاستئصال البقع والهضم داخل الهلام (الشكل 1 ب)

4. الهضم في الهلام

  1. تحضير الحلول التالية: 50 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم (NH4HCO3) / 50٪ (v / v) أسيتونيتريل ؛ 10 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) في 50 ملي NH4HCO3 ؛ 55 ملي مولار يودوأسيتاميد (IAA) في 50 ملي NH4HCO3 ؛ 0.1٪ TFA ؛ 50 ملي نيو هامش4HCO3 ، درجة الحموضة 8 ؛ HPLC الصف الأسيتونيتريل ؛ 1 مل أنابيب السيليكون.
    ملاحظة: للتحايل على تلوث الكيراتين البشري ، من الشعر أو الجلد ، استخدم قفازات نظيفة واعمل في منطقة نظيفة.
  2. استئصال بقع الهيستون ذات الأهمية من الجل الملون باستخدام مشرط نظيف وضعها في أنبوب سيليكون جديد (1.5 مل). احرص على استئصال بقعة واحدة ووضعها في أنبوب واحد لتجنب التلوث المتساوي الشكل.
  3. أضف إلى كل بقعة هلامية 250 ميكرولتر من 50 ملي مولار NH4HCO3/50٪ أسيتونيتريل واحتضنه تحت التحريك اللطيف في خلاط حراري في درجة حرارة الغرفة. صب المحلول وكرر هذه الخطوة 3x. ستظهر قطع الجل شفافة.
  4. تجفيف بقع الجل عن طريق إضافة الأسيتونيتريل (200 ميكرولتر). في هذه المرحلة ، ستأخذ قطع الجل لونا أبيض معتما.
  5. صب الأسيتونيتريل واتركه يجف في الهواء لمدة 10 دقائق. ستظهر قطعة الجل جافة في الأنبوب. الاختزال والألكلة ليسا ضروريين حيث تم تقليل بروتينات الهيستون وتؤلكل خلال خطوة التوازن.
  6. أعد ترطيب بقع الجل في 20 ميكرولتر من محلول التربسين (0.1 ملي حمض الهيدروكلوريك) أو حجم كاف لتغطية قطع الجل. ضع الأنابيب في الخلاط الحراري واحتضانها ، تحت تحريض لطيف ، عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات على الأقل حتى 16 ساعة.
  7. انقل المادة الطافية التي تحتوي على الببتيدات التربتية إلى أنبوب جديد. أضف 50 ميكرولتر من محلول الاستخراج (60٪ أسيتونيتريل ، 1٪ TFA) إلى قطع الجل وصوتنة 2x في حمام مائي بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  8. انقل المادة الطافية ، التي تحتوي على ببتيدات تربتيك إضافية ، إلى الأنبوب الجديد. استخدم مجفف التجفيد لتجفيف الببتيدات المستخرجة المجمعة. اضبط المجفف بالتجميد على 30 درجة مئوية وجفف المحلول ؛ ستظهر حبيبات مجففة بالتجميد في الأنبوب.
    ملاحظة: تعتمد هذه الخطوة على مستوى الصوت. بشكل عام ، 1 ساعة كافية ، لكن تحقق من الحجم كل 10 دقائق حتى تجف العينة تماما.
  9. أضف 15 ميكرولتر من 0.1٪ TFA إلى كل أنبوب واحتضانه برفق في خلاط حراري عند 25 درجة مئوية. انقل المادة الطافية إلى القارورة لتحليل LC-MS / MS.

5. 2DTAU لطخة الغربية

  1. قم بإعداد المخزن المؤقت للنقل ، 250 ملي مولار قاعدة تريس ، 92 ملي مولار جلايسين ، و 10٪ ميثانول باستخدام الماء المقطر المزدوج.
  2. قطع غشاء النيتروسليلوز وورق الترشيح إلى أبعاد الجل.
  3. قم بموازنة الجل وانقع الغشاء وورق الترشيح وأوراق الترشيح في مخزن النقل المؤقت لمدة 15 دقيقة. استخدم إما أغشية النيتروسليلوز أو PVDF. في حالة استخدام أغشية PVDF (ثنائي فلوريد البولي فينيلدين) ، قم بتنشيطها عن طريق النقع في 100٪ MetOH.
  4. قم بإعداد شطيرة الجل في الكاسيت لنقل شبه جاف على النحو التالي: قطب كهربائي سالب / ورق ترشيح / جل / غشاء نيتروسليلوز / ورق ترشيح / قطب موجب. قم بإزالة أي فقاعات هواء بين الجل والغشاء لضمان نتائج جيدة.
  5. ضع الكاسيت في وحدة شبه جافة وقم بتشغيل اللطخة عند 25 فولت لمدة 30 دقيقة. في النهاية ، قم بتفكيك شطيرة النشاف وتخزين الغشاء للفحص المناعي. تحقق من كفاءة النقل باستخدام تلطيخ بونسو. ضع علامة على الغشاء بعلامة في أعلى اليمين للحفاظ على اتجاه المرشح الصحيح.
  6. احتضان الأجسام المضادة الأولية والثانوية اعتمادا على التجربة (الشكل 2).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الشكل 1 أ ، من الممكن ملاحظة كيفية هجرة بروتينات هيستون في هلام 1D. هذه خطوة أولية مهمة لفهم وقت تشغيل البعد الأول. بمجرد تحديد الوقت المناسب للفصل ، قم بتشغيل البعد الثاني. تظهر الخريطة ثنائية الأبعاد للأشكال البروتينية الهيستونية نمطا طبوغرافيا مميزا (الشكل 1 ب). تمثل كل بقعة في الشكل 1 ب نوعا معينا من هيستون. راقب المنطقة الدقيقة من الجل حيث يمكن العثور على كل بروتين هيستون. تم الإبلاغ عن تحديد قياس الطيف الكتلي لكل بروتيوفورم هيستون في Perri et al.32. لذلك ، ترتبط كل بقعة في هذه الحالة بنوع هيستون معين. قد يشير وجود بقع إضافية ، إلى جانب البقع الكنسية ، إلى وجود تعديلات جديدة. يمكن الحصول على صور الهلام باستخدام قياس الكثافة ، ويمكن تحليل الصورة الناتجة باستخدام برنامج تحليل الصور.

تعتمد موثوقية خريطة 2D TAU على استدارة البقعة. إذا تم إجراء التشغيل بشكل صحيح ، فستظهر البقع كإشارات مميزة ولن تظهر خطوط أفقية ورأسية. على العكس من ذلك ، قد تتسبب الشوائب في العينة والمحاليل وتراكب الاغاروز في حدوث خطوط و / أو خطوط في الجل. ستؤثر جودة الجل على رقمنة الصورة والتحليل الكمي والنوعي التالي. علاوة على ذلك ، قد يؤثر على نجاح تحليل اللطخة الغربية وتحقيقات مرض التصلب العصبي المتعدد. للتحقق من موثوقية الطريقة ، قمنا بفحص غشاء النيتروسليلوز لأشكال هيستون البروتينية التي تم حلها باستخدام الجسم المضاد الأساسي أسيتيل ليسين (Ac-K2-100) Rabbit mAb32 (الشكل 2). تم استخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب HRP للكشف عن إشارات هيستون. كما هو متوقع ، باستخدام مقياس الكثافة ، من الممكن تحديد التعديل الغريب بعد الترجمة على كل متغير هيستون موجود في اللطخة.

figure-results-1
الشكل 1: 1D و 2D TAUgel. (أ) صورة تمثيلية للنمط الطبوغرافي الهستوني التي تم الحصول عليها باستخدام 1D TAUgel. (ب) صورة تمثيلية للنمط الطبوغرافي الهستوني التي تم الحصول عليها باستخدام 2D TAUgel. تم الإبلاغ عن تحديد البيانات بواسطة Perri et al. 32. كما هو متوقع ، تمثل كل بقعة شكلا بروتيا محددا من هيستون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: ممثل 2DTAU لطخة غربية. في الصورة ، من الممكن ملاحظة مستوى أستلة اللايسين في كل بروتيوفورم هيستون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكواشفالتركيز: 15٪
40٪ أكريلاميد / مكرر3.75
1.5 م تريس الرقم الهيدروجيني 8.82.5 مل
ماء MilliQ3.6 مل
10٪ SDS100 ميكرولتر
10٪ APS50 ميكرولتر
تيميد5 ميكرولتر

الجدول 1: حل تكوين محلول الجل.

درجالوقت
تحديد 50٪ ميثانول / 5٪ حمض الأسيتيك1 ساعة
اغسل 30٪ إيثانول2 × 20 دقيقة
اغسل الماء منزوع الأيونات1 × 20 دقيقة
كاشف ثيوسلفات المحسس1 دقيقة
اغسل الماء منزوع الأيونات3 × 20 ثانية
نترات الفضة30 دقيقة
اغسل الماء منزوع الأيونات3 × 1 دقيقة
مطور تطوير25-30 دقيقة ملاحظة: قم بتطوير الجل حتى تظهر البقع (بنية فاتحة)
حل التوقف1 × 10 دقائق
اغسل الماء منزوع الأيونات2 × 5 دقائق
اغسل الماء منزوع الأيونات1 ساعة

الجدول 2: طريقة تلطيخ الفضة.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في العقد الماضي ، حدث ثورة في علاج مرضى السرطان من خلال تحديد التغيرات الجزيئية المختلفة التي تدفع تطور السرطان وتطوره. أهم تقدم في علم الأورام الحديث هو تطوير العلاج القائم على التحليل الجزيئي الشامل. لعبت التطورات التكنولوجية في علم الجينوم والبروتينات دورا حاسما في تحديد ملامح المؤشرات الحيوية المحددة للكشف المبكر والمراقبة والتشخيص ومراقبة الأدوية. يتم تعريف البروتينات على أنها تحليل مكمل البروتين الكامل لخلية أو أنسجة أو كائن حي في ظل حالة معينة ، ويشمل أيضا دراسة تفاعلات البروتين ، والتعديلات اللاحقة للترجمة ، والتوطين34. مجال محدد من البروتينات هو epi-proteomics ، والذي يتضمن دراسة منهجية لتعديلات ما بعد الترجمة من الهيستون. وقد تم ربط هذه بتطور وتطور السرطان35. تحدد الورقة طريقة لتحديد الأشكال الإسوية الهيستونية المحددة التي تساهم في النمط الظاهري الخلوي.

الخطوة الحاسمة للطريقة هي استخراج الهستونات بسبب ضعف قابليتها للذوبان وقاعدتها العالية. تتمثل قيوده الرئيسية في تعقيد الخريطة ثنائية الأبعاد وقلة عدد المتغيرات ، مما قد يجعل تحليل MS / MS صعبا.

بشكل عام ، تتمثل الفائدة الرئيسية لهذا النهج في أنه يمكن تنفيذه في أي مختبر ، ويمكن امتلاك جهاز هلام صغير مع الاحتياطات المناسبة. في هذا السياق ، نحن واثقون من أن هذه الطريقة قد تساعد عددا كبيرا من العلماء ، مثل أولئك الذين لا يستطيعون الاستفادة من مرفق كبير في مؤسستهم ، على تحديد علامات epi-proteome الجديدة ، بهدف تحسين المعرفة حول epi-proteome. علاوة على ذلك ، يمكن دمج هذه الطريقة مع قياس الطيف الكتلي ، والذي يمكن الاستعانة بمصادر خارجية كخدمة ، لاكتشاف الأشكال البروتينية الجديدة. يمكن استخدامه أيضا مع المقايسات المناعية لتأكيد التغييرات في تعديل محدد بعد الترجمة يتوفر له جسم مضاد تجاري.

تم استخدام الطريقة لدراسة التغييرات النموذجية في تعديلات الهيستون المتعلقة بتطور سرطان الثدي28ولفحص تعديلات H1 في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر36. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الطريقة بنجاح لقياس مستوى كربونيل الهيستون37 في الخلايا الليفية سريعة النمو واستكشاف تعديلات هيستون جديدة ، مثل جليكاسیون الهيستون وهيستون MARylation38.

من وجهة نظرنا ، نحن واثقون من أنه يمكن تطبيق هذه الطريقة بنجاح لتصنيف PTMs هيستون الجديد ، لا سيما تلك المرتبطة بالتنشيط غير الطبيعي لمسارات التمثيل الغذائي المحددة ، مثل الأستلة ، والمالونيل ، والمثيلة ، والدهون ، واللاكتيل ، والبوتيل ، وغيرها. في النهاية ، يمكن أن تكون الطريقة أيضا بمثابة أداة تحضيرية دقيقة لعزل الأشكال البروتينية الفردية وقد تسهل تحليل PTMs المرتبطة بالتمثيل الغذائي ، وبالتالي تعزيز فهمنا لهذا المجال الحاسم من البحث.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم العمل من قبل PRIN2022 و DS و CF و AC بدعم من PRIN2022 ، وتم دعم MLC من قبل برنامج الدكتوراه في علم الأورام الجزيئي ، مدرسة برنامج UMG PhD. تم دعم العمل أيضا من قبل مشروع PNRR INSIDE CUP: B83C22003920001

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1،4-DithioerythritolSIGMA- ALDRICHD8255 كاشف للصيانة & ناقص ؛ مجموعات SH في الولاية المخفضة ؛ يقلل من ثاني كبريتيدات كميا.
1,5 م عازلة Tris-HCL ، درجة الحموضة 8.8BIO-RAD161-0798حل جل المخزن
المؤقت 10x تريس / جلايسين / SDS & nbsp ؛BIO-RAD 1610772استخدم هذا المخزن المؤقت للتشغيل 10x Tris / glycine / SDS المخلوط مسبقا لفصل عينات البروتين بواسطة SDS-PAGE.
2-بروبانولSIGMA-ALDRICH335392-بروبانول (إيزوبروبانول) هو كحول ثانوي. تم اختباره كبديل للوقود لاستخدامه في خلايا الوقود المختلفة. تم استخدام مسحوق CuO المذاب في 2-propanol للتخليق بمساعدة الاستئصال بالليزر للغرويات Cu. تم استخدام تعليق 2-بروبانول مع Zn (NO3) 2 لتصنيع الفولاذ المقاوم للصدأ المطلي بثاني أكسيد التيتانيوم (P25-TiO2 / SS) المغلف بطبقة سميكة موحدة من P25-TiO2.تم استخدام هذا الأنود الضوئي لعملية التحلل الضوئي الكهروكيميائي (ECPC).
30٪ محلول أكريلاميد / مكرر   ؛BIO-RAD16101582.6٪ Crosslinker. كاشف نقاء الرحلان الكهربائي  
حمض الخليك الجليديCarlo Erba Reagennts401392حمض الخليك هو كاشف كيميائي مهم مع العديد من التطبيقات الصناعية.
AcetonePanreac Applichem211007.1214Acetone  هو مذيب ، يشتهر بتعدد استخداماته في مختلف تطبيقات المختبرات والتصنيع والتنظيف.
83640320AcetonitileVWRل HPLC   ؛   LC-MS الصف
AgaroseInvitrogen15510-027Agarose  هو a  عديد السكاريد غير المتجانس  كثيرا ما تستخدم في البيولوجيا الجزيئية.
بيكربونات الأمونيومSIGMA-ALDRICHA6141كحد أدنى 99,0٪
بيرسلفات الأمونيومSIGMA-ALDRICHA3678للبيولوجيا الجزيئية ، للرحلان الكهربائي ، & ge ؛ 98٪ 
Bioruptor plusDiagenodeB01020001 - B01020002- B01020003صوتي
DithiothreitolSIGMA- ALDRICHD9163-5Gعامل اختزال يستخدم لتقليل روابط ثاني كبريتيد في البروتينات.
طقم وصمة عار الفضة Dodeca BIO-RAD161-0480مجموعة البقع الفضية Dodeca سهلة الاستخدام للكشف عن مستويات البروتينات nonagram في المواد الهلامية بولي أكريلاميد.
GlycerolGE - علوم الحياة للرعاية الصحية171325010Lالجلسرين هو مركب ثلاثي بسيط ، يشارك في المساعدة في صب المواد الهلامية المتدرجة ومثبت البروتين ومكون التخزين العازل
وقف مثبطات الفوسفاتيز كوكتيل مثبط78428حالة فسفرة البروتينات أثناء وبعد تحلل الخلية أو استخراج بروتين الأنسجة ؛ كوكتيل للاستخدام الفردي (100X).   
وقف مثبط البروتياز  Thermo SCIENTIFIC78430Thermo Scientific Halt Protease Inhibitor Cocktail (100X) عبارة عن محاليل مخزون مركزة جاهزة للاستخدام من مثبطات الإنزيم البروتيني لإضافتها إلى العينات لمنع تحلل البروتين أثناء تحلل الخلايا واستخراج البروتين. كوكتيل للاستخدام الفردي (100X).   
حمض الهيدروكلوريكSIGMA-ALDRICHH1758الكاشف الحيوي ، للبيولوجيا الجزيئية
IodoacetamideSIGMA-ALDRICHI6125& ge ؛ 99٪ (NMR) ، بلوري
KClSIGMA-ALDRICHP9541كلوريد البوتاسيوم ، KCl ، هو   ؛ تستخدم بشكل عام في إجراءات المختبر. إن استخدامه كمخزن مؤقت لأقطاب الأس الهيدروجيني وكحل مرجعي لقياسات التوصيلية الكهربية راسخ.
خط خلية MCF10atccCRL-10317  خط الخلايا الظهارية الذي تم عزله في عام 1984 من الغدة الثديية لأنثى بيضاء تبلغ من العمر 36 عاما مع ثدي ليفي كيسي. تم إيداع هذا الخط الخلوي من قبل مؤسسة ميشيغان للسرطان.
MgCl2SIGMA-ALDRICH208337كلوريد المغنيسيوم مادة صلبة بلورية عديمة اللون.
N ، N ، N '، N'-TETRAMETHYLETHYLENE-DIAMINESIGMA-ALDRICHT9281للرحلان الكهربائي ، حوالي 99٪
عازلة ملحية للفوسفات 1XCorning153736311 × PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات) هو   ؛ أ مخزن  محلول ملح متوازن  تستخدم لمجموعة متنوعة من التطبيقات البيولوجية وزراعة الخلايا ، مثل غسل الخلايا قبل التفكك ، ونقل الخلايا أو الأنسجة ، وتخفيف الخلايا للعد ، وإعداد الكواشف.
سداسي سيانوفيرات البوتاسيومSIGMA-ALDRICH60299متقبل الإلكترون ، المستخدم في الأنظمة التي تنطوي على نقل الإلكترون ،
محلول SDS 20٪ (وزن / حجم)   ؛BIO-RAD161-0418كبريتات دوديسيل الصوديوم. كاشف نقاء الرحلان الكهربائي  
ثيوسلفات الصوديوم ، كاشف Plus 99٪SIGMA- ALDRICH21،726-3ثيوسلفات الصوديوم ، كاشف Plus 99٪
حامض الكبريتيكSIGMA-ALDRICH339741حمض الكبريتيك ، كاشف ، هو   ؛ حمض شديد التآكل يأتي على شكل سائل مصفر لزج قليلا. إنه قابل للذوبان في الماء وهو حمض ديبروتيكي. لها خصائص تآكل وتجفيف وأكسدة قوية جدا بالإضافة إلى كونها استرطابية.
حمض ثلاثي كلورو أسيتيكSIGMA-ALDRICHT6399-5Gحمض ثلاثي كلورو أسيتيك (TCA) هو   تستخدم ككاشف لترسيب البروتينات 1،2< / sup> والأحماض النووية 3< / sup>.  ؛
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكRiedel-de Ha & euml; n34957حمض ثلاثي فلورو أسيتيك
تريتون X-100SIGMA- ALDRICHT9284-1LTriton X-100 هو مادة خافضة للتوتر السطحي من مادة البولي أوكسي إيثيلين غير أيونية تستخدم بشكل متكرر لاستخراج البروتينات وإذابتها.
التربسين من البنكرياس الخنازيرSIGMA-ALDRICHT6567درجة البروتينات ، الكاشف الحيوي ، ثنائي الميثيل
UREASIGMA-ALDRICH33247اليوريا هو عامل فوضوي ويستخدم لتمسخ البروتين. يزعج الروابط الهيدروجينية في التركيب الثانوي والثالثي والرباعي للبروتينات. يمكن أن يزعج أيضا الترابط الهيدروجيني الموجود في البنية الثانوية للحمض النووي
.يحافظ الفوسفاتيز الحراري العلمي على

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Strahl, B. D., Allis, C. D. The language of covalent histone modifications. Nature. 403 (6765), 41-45 (2000).
  2. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  3. Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  4. Sun, L., et al. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  5. Kinnaird, A., et al. Metabolic control of epigenetics in cancer. Nat Rev Cancer. 16 (11), 694-707 (2016).
  6. Díaz-Hirashi, Z., et al. Metabolic reprogramming and signaling to chromatin modifications in tumorigenesis. Adv Exp Med Biol. 1219, 225-241 (2020).
  7. Panatta, E., et al. Metabolic regulation by p53 prevents R-loop-associated genomic instability. Cell Rep. 41 (5), 111568(2022).
  8. Scumaci, D., Zheng, Q. Epigenetic meets metabolism: novel vulnerabilities to fight cancer. Cell Commun Signal. 21 (1), 249(2023).
  9. Chiaradonna, F., Scumaci, D. Cancer metabolism as a new real target in tumor therapy. Cells. 10 (6), 1393(2021).
  10. Scumaci, D., et al. DJ-1 proteoforms in breast cancer cells: The escape of metabolic epigenetic misregulation. Cells. 9 (9), 1968(2020).
  11. Olivo, E., et al. Moving beyond the tip of the iceberg: DJ-1 implications in cancer metabolism. Cells. 11 (9), 1432(2022).
  12. Zheng, Q., Maksimovic, I., Upad, A., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications: a new link between metabolism and epigenetics. Protein Cell. 11 (6), 401-416 (2020).
  13. Maksimovic, I., David, Y. Non-enzymatic covalent modifications as a new chapter in the histone code. Trends Biochem Sci. 46 (9), 718-730 (2021).
  14. Lowe, B. R., et al. Histone H3 mutations: an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer. Cancers. 11 (5), 660(2019).
  15. Karsli-Ceppioglu, S. The epigenetic landscape of promoter genome-wide analysis in breast cancer. Sci Rep. 7 (1), 6597(2017).
  16. Yang, C., et al. Histone methyltransferase and drug resistance in cancers. J Exp Clin Cancer Res. 39 (1), 173(2020).
  17. Vardabasso, C., et al. Histone variants: emerging players in cancer biology. Cell Mol Life Sci. 71 (3), 379-404 (2014).
  18. Ilango, S., Paital, B., Jayachandran, P., Padma, P. R., Nirmaladevi, R. Epigenetic alterations in cancer. Front Biosci. 25 (6), 1058-1109 (2020).
  19. Liu, Y., et al. Histone H2AX promotes metastatic progression by preserving glycolysis via hexokinase-2. Sci Rep. 12 (1), 3758(2022).
  20. Nowsheen, S., et al. ZNF506-dependent positive feedback loop regulates H2AX signaling after DNA damage. Nat Commun. 9 (1), 2736(2018).
  21. Ribeiro-Silva, C., Vermeulen, W., Lans, H. SWI/SNF: Complex complexes in genome stability and cancer. DNA Repair. 77, 87-95 (2019).
  22. Yang, Y., Wang, Y. Role of epigenetic regulation in plasticity of tumor immune microenvironment. Front Immunol. 12, 640369(2021).
  23. Miranda Furtado, C. L., et al. Epidrugs: targeting epigenetic marks in cancer treatment. Epigenetics. 14 (12), 1164-1176 (2019).
  24. Thomas, S. P., et al. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  25. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  26. Kwak, H. G., Dohmae, N. Proteomic characterization of histone variants in the mouse testis by mass spectrometry-based top-down analysis. Biosci Trends. 10, 357-364 (2016).
  27. Sidoli, S., Simithy, J., Karch, K. R., Kulej, K., Garcia, B. A. Low resolution data-independent acquisition in an LTQ-Orbitrap allows for simplified and fully untargeted analysis of histone modifications. Anal Chem. 87, 11448-11454 (2015).
  28. Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
  29. Basak, S. K., Ladisch, M. R. Correlation of electrophoretic mobilities of proteins and peptides with their physicochemical properties. Anal Biochem. 226 (1), 51-58 (1995).
  30. Nuccio, A. G., Bui, M., Dalal, Y., Nita-Lazar, A. Mass spectrometry-based methodology for identification of native histone variant modifications from mammalian tissues and solid tumors. Methods Enzymol. 586, 275-290 (2017).
  31. Zhang, S., Roche, K., Nasheuer, H. P., Lowndes, N. F. Modification of histones by sugar β-N-acetylglucosamine (GlcNAc) occurs on multiple residues, including histone H3 serine 10, and is cell cycle-regulated. J Biol Chem. 286 (43), 37483-37495 (2011).
  32. Perri, A. M., et al. Histone proteomics reveals novel post-translational modifications in breast cancer. Aging. 11, 11722-11755 (2019).
  33. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  34. Omenn, G. S., et al. Research on the human proteome reaches a major milestone: >90% of predicted human proteins now credibly detected, according to the HUPO human proteome project. J Proteome Res. 19 (12), 4735-4746 (2020).
  35. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  36. Starkova, T. Y., et al. The profile of post-translational modifications of histone H1 in chromatin of mouse embryonic stem cells. Acta Naturae. 11 (2), 82-91 (2019).
  37. García-Giménez, J. L., et al. Histone carbonylation occurs in proliferating cells. Free Radic Biol Med. 52 (8), 1453-1464 (2012).
  38. García-Saura, A. G., Schüler, H. PARP10 multi-site auto- and histone MARylation visualized by acid-urea gel electrophoresis. Cells. 10, 654(2021).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS PAGE

مقالات ذات صلة