Method Article

نهج فحص عالي الإنتاجية لتقييم تقارب الملوثات البيئية بالمستقبلات النووية

DOI:

10.3791/67327

⸱

September 20th, 2024

 , 
1School of Public Health, Qingdao University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول نظام فحص عالي الإنتاجية يستخدم الاستقطاب الفلوري لمسبار فلورسنت معين مرتبط بمستقبل نووي كقراءة لفحص الملوثات البيئية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم الكشف عن مستويات متزايدة من المركبات في البيئة ، مما تسبب في تلوث واسع النطاق ويشكل مخاطر على صحة الإنسان. ومع ذلك ، على الرغم من حدوثها البيئي العالي ، إلا أن هناك معلومات محدودة للغاية فيما يتعلق بآثارها السمية. من الضروري تطوير طرق الفحص عالية الإنتاجية (HTS) لتوجيه الدراسات السمية. في هذه الدراسة ، تم تطوير مقايسة ربط المستقبلات والترابط باستخدام نظام HTS لتحديد فاعلية ربط الملوثات البيئية على المستقبلات النووية. يتم إجراء الاختبار باستخدام قارئ صفيحة دقيقة (أي صفيحة مكونة من 96 بئرا تحتوي على مواد كيميائية مختلفة) عن طريق قياس استقطاب التألق (FP) لمسبار فلورسنت معين. يتكون هذا الاختبار من أربعة أجزاء: بناء وتحويل النواقل المؤتلفة ، والتعبير عن بروتين المستقبل وتنقيته (مجال ربط الترابط) ، وربط مسبار المستقبلات ، والارتباط التنافسي للمواد الكيميائية بالمستقبل. تم تحديد فاعلية الارتباط لاثنين من الملوثات البيئية ، حمض السلفونيك المشبع بالفلور أوكتين (PFOS) وفوسفات ثلاثي فينيل (TPHP) ، مع مستقبلات غاما المنشطة بانتشار البيروكسيسوم (PPARγ) لتوضيح إجراء المقايسة. أخيرا ، تمت مناقشة مزايا وعيوب هذه الطريقة وتطبيقاتها المحتملة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم اكتشاف عدد كبير من المواد الكيميائية على نطاق واسع في البيئة والأجسام البشرية ، مما أثار مخاوف كبيرة بشأن تأثيرها على البيئة البيئية وصحة الإنسان1،2،3. على الرغم من حدوثها البيئي المرتفع ، إلا أن المعلومات المتعلقة بآثارها السمية نادرة. لذلك ، من الضروري تطوير طرق الفحص عالية الإنتاجية (HTS) لتسهيل تقييم السمية الكيميائية.

تم الإبلاغ عن العديد من طرق الفحص عالية الإنتاجية (HTS) لتقييم السمية الكيميائية ، مثل المقايسات الحيوية HTS المستخدمة في برامج Tox21 و ToxCast4،5. يمكن لهذه الطرق تحديد المواد السامة المحتملة بسرعة وتوفير معلومات قيمة عن آليات السمية الكيميائية. ومع ذلك ، تعتمد هذه المقايسات الحيوية HTS بشكل أساسي على الأنظمة القائمة على الخلايا ، والتي يمكن أن تكون معقدة ومكلفة. بالإضافة إلى ذلك ، تم أيضا استخدام طرق التسلسل عالية الإنتاجية لتقييم السمية الكيميائية ، ولكن تحقيق تقييم عالي الإنتاجية للمواد الكيميائية لا يزال يمثل تحديا6. طورت الدراسات السابقة فحوصات ربط تنافسية قائمة على استقطاب التألق (FP) لتحديد فاعلية الارتباط للعديد من الملوثات البيئية ، بما في ذلك مواد البير والبولي فلورو ألكيل (PFAS) 7،8،9 ، وثنائي الفينول A (BPA) 10،11 ، والجسيمات (PM) 12 ، مع المستقبلات النووية مثل المستقبلات المنشطة بانتشار البيروكسيسوم (PPAR) 7 ،8،9،10،13 ، مستقبلات فارنيزويد X (FXR) 11،12 ، ومستقبلات الغدة الدرقية (TR) 14،15. هذا النهج فعال وفعال من حيث التكلفة ويوفر رؤى ميكانيكية.

في هذه الدراسة ، تم وصف بروتوكول مقايسة ربط المستقبل والترابط بناء على الكشف عن استقطاب التألق (FP) لمسبار فلوري صغير. يتم توضيح مبدأ اختبار ربط المستقبلات القائم على FP في الشكل 1. عندما يتم إثارة جزيء فلورسنت صغير بواسطة الضوء المستقطب المستوي ، يصبح الضوء المنبعث مزيل الاستقطاب بدرجة عالية بسبب الدوران الجزيئي السريع. ومع ذلك ، عندما يرتبط المتتبع بمستقبل أكبر ، يتباطأ دورانه. يتم الكشف عن قيمة FP عالية عندما يرتبط المتتبع بالمستقبل الكبير ، بينما يتم ملاحظة قيمة FP منخفضة عندما يكون التتبع مجانيا. تم تنقية مستقبلات جاما المنشطة بمولد التكاثر البيروكسي (PPARγ) لربط المسبار بالمستقبل. تم استخدام Rosiglitazone (Rosi) وحمض البيرفلوروكتان سلفونيك (PFOS) وفوسفات ثلاثي فينيل (TPHP) للتنافس على ارتباط المسبار بالمستقبل. تم استخدام Rosi ، ناهض محدد ل PPARγ ، كعنصر تحكم إيجابي في فحوصات الربط التنافسي للمستقبلات. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحديد سلفونات الأوكتين المشبعة بالفلور و TPHP سابقا على أنها ناهضات ضعيفة ل PPARγ في الدراسات السابقة8،9،10،11،12،13،14،15،16،17. علاوة على ذلك ، فهي تنتمي إلى فئات هيكلية مختلفة من المركبات المعروفة بالتعرض البيئي وتتميز بمعدلات اكتشافها العالية نسبيا في البشر. تم استخدام هذه المركبات لزيادة التحقق من صحة التطبيق الواسع لمقايسة المنافسة الملزمة. يتكون الإجراء من أربع خطوات: بناء وتحويل النواقل المؤتلفة ، والتعبير عن بروتين المستقبل وتنقيته (مجال ربط الترابط) ، وربط مسبار المستقبلات ، والارتباط التنافسي للمواد الكيميائية بالمستقبل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاصيل الكواشف والمعدات مدرجة في جدول المواد.

1. بناء وتحويل النواقل المؤتلفة

ملاحظة: PPARγ هو عامل نسخ يعتمد على الترابط مع بنية مستقبلات نووية كلاسيكية ، ويتألف من مجال ربط الحمض النووي الذي ينظم الجينات المستهدفة ومجال ربط الترابط الذي يتم تنشيطه بواسطة الروابط. عند تنشيط الترابط ، يشكل PPARγ مغاير مع مستقبل نووي آخر ، مستقبل الريتينويد X (RXR) ، ويرتبط بعناصر استجابة PPARγ ، وبالتالي ينظم نسخ الجينات المستهدفة النهائية9،16.

  1. صمم الاشعال ل PPARγ-LBD (انظر الجدول 1) وتضخيم مقطع الحمض النووي PPARγ-LBD (انظر الجدول 2 والجدول 3).
  2. خطي متجه pET28a الذي يحمل علامة His×6 عن طريق هضمه باستخدام نوكليازات التقييد XhoI و BamHI18.
  3. استنساخ مقطع الحمض النووي PPARγ-LBD في متجه pET28a الذي يحمل علامة His×6 باستخدام مجموعة الاستنساخ المتوفرة تجاريا ، مما ينتج عنه البلازميد المؤتلف pET28a-PPARγ-LBD-6×His18.
  4. نقل البلازميد المؤتلف pET28a-PPARγ-LBD-6× له في BL21 (DE3) خلايا الإشريكية القولونية للتعبير عن البروتين18.
  5. أضف 5 ميكرولتر من الناقل المؤتلف إلى خلايا BL21 (DE3) المختصة ، واحتضن على الجليد لمدة 30 دقيقة ، وقم بإجراء صدمة حرارية عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، ثم عد على الفور إلى الجليد.
  6. أضف 900 ميكرولتر من وسط LB ، ورجها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة (160-200 دورة في الدقيقة) ، ثم جهاز الطرد المركزي عند ~ 3000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  7. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات البكتيرية في 100 ميكرولتر من وسط LB ، وانتشر على وسط صلب. اقلب الصفائح والثقافة عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة.
  8. حدد المستعمرات الفردية لتحديد التسلسل والتعبير اللاحق عن البروتين وتنقيته.

2. التعبير عن بروتين المستقبلات وتنقيته

  1. احتضان خلايا BL21 (DE3) المحولة في وسط 200 مل LB مكمل ب 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين على شاكر مداري (230 دورة في الدقيقة) لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بتحفيز الخلايا عندما يصل OD600 إلى 0.4-0.6 وحدات امتصاص عن طريق إضافة 10 ميكرومتر من الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) واحتضانه عند 16 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
  3. اجمع المعلق البكتيري وجهاز الطرد المركزي عند 8000 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 10 دقائق.
  4. قم بتحليل الخلايا في محلول تحلل قابل للذوبان سعة 20 مل (50 ملي مولار من NaH2PO4 ، 300 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، 10 ملي مولار من إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0) ، مع إضافة 200 ميكرولتر من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) و 200 ميكرولتر من الليزوزيم. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية باستخدام ماصة 5 مل ، ثم تابع صوتنة بنسبة 30٪ من الطاقة لمدة 20 دقيقة.
  5. أضف المخزن المؤقت للتحلل يساوي 5 أضعاف حجم العمود لموازنة عمود النيكل. كرر هذه العملية مرتين واتركها جانبا.
  6. جهاز الطرد المركزي التعليق البكتيري المونيكيد عند 8000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية للحصول على المحلل الطافي البكتيري (CL).
  7. قم بتحميل CL على عمود النيكل (لامتصاص البروتين) للحصول على التدفق (FT).
  8. اغسل العمود ب 5 أضعاف حجم عمود المخزن المؤقت للغسيل (50 ملي مولار من NaH2PO4 ، 300 ملي من كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار من إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0) للحصول على شطف الغسيل (W1-W6).
  9. اغسل العمود ب 1 مل من محلول الشطف (50 ملي مولار NaH2PO4 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم ، 250 ملي إيميدازول ، درجة الحموضة 8.0) لتصفية البروتين المستهدف والحصول على كسور البروتين (E1-E5).
  10. خذ 20 ميكرولتر من كل كسر (CL و FT و W1-W6 و E1-E5) وقم بتحليلها باستخدام SDS-PAGE18 مع تلطيخ Coomassie Brilliant Blue. يعمل PPARγ-LBD كبروتين 34.9 كيلو دالتون على هلام متغير الطبيعة.

3. اختبار ربط المستقبلات

ملاحظة: في هذا الاختبار ، تم استخدام C1-BODIPY-C12 كمسبار فلوري خاص بالموقع لإنشاء نظام ربط المستقبلات والترابط. C1-BODIPY-C12 ، وهو رابط محدد ل PPARγ ، هو نظير فلوري للأحماض الدهنية مع مجموعة BODIPY الفلورية المدمجة في الأحماض الدهنية في موضع C1.

  1. قم بتخفيف PPARγ-LBD البشري المنقى في المخزن المؤقت Tris-HCl (20 ملي مولار من تريس ، 100 ملي مولار من كلوريد الصوديوم ، الرقم الهيدروجيني 8.0) إلى نطاق تركيز من 1 نانومتر إلى 6400 نانومتر. أيضا ، قم بتخفيف مسبار C1-BODIPY-C12 في المخزن المؤقت Tris-HCl إلى تركيز 50 نانومتر.
  2. امزج محلول PPARγ-LBD المخفف (55 ميكرولتر لكل بئر) ومحلول المسبار C1-BODIPY-C12 (55 ميكرولتر لكل بئر) في صفيحة سوداء سعة 96 بئرا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  3. قم بقياس الاستقطاب الفلوري (FP) باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.
  4. ارسم قيم FP مقابل تركيز المستقبل ، وقم بملاءمة المنحنى باستخدام الربط المحدد بمعادلة منحدر التل باستخدام برنامج إحصائي ورسوم بيانية ، واحسب قيمةKD .

4. اختبار ملزم تنافسي

ملاحظة: في هذا الاختبار ، تم استخدام 800 نانومتر من مسبار PPARγ-LBD البشري و 50 نانومتر C1-BODIPY-C12 لربط المستقبلات. تم استخدام Rosiglitazone (Rosi) وفوسفات ثلاثي فينيل (TPHP) وحمض البيرفلوروكتان سلفونيك (PFOS) للتنافس مع ارتباط المسبار ب PPARγ.

  1. تمييع المركبات الثلاثة في المخزن المؤقت Tris-HCl ضمن نطاق تركيز من 0-200 ميكرومتر.
  2. تحضير محلول ربط المستقبل بالمسبار بتركيز نهائي يبلغ 800 نانومتر من PPARγ-LBD البشري و 50 نانومتر من مسبار C1-BODIPY-C12.
  3. امزج محلول ربط المستقبلات والمسبار (55 ميكرولتر لكل بئر) والمحلول المركب (55 ميكرولتر لكل بئر) في صفيحة سوداء سعة 96 بئرا. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  4. قم بقياس الاستقطاب الفلوري (FP) باستخدام قارئ الصفيحة الدقيقة.
  5. ارسم قيم FP كدالة لتركيز الترابط. احصل على التركيز المثبط نصف الحد الأقصى (IC50) لكل رابط من منحنى المنافسة باستخدام النموذج السيني الذي تتم معالجته بواسطة برنامج رسم بياني وتحليل.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التعبير عن البروتين وتنقية PPARγ-LBD
تم التعبير عن PPARγ-LBD بشكل غير متجانس في BL21 (DE3) كبروتين موسوم بالهيستيدين. تم اكتشاف البروتين في الكسور القابلة للذوبان ، وأظهر PPARγ-LBD المنقى نطاقا واحدا على SDS-PAGE بوزن جزيئي واضح يبلغ حوالي 34.9 كيلو دالتون (الشكل 2) ، بما يتفق مع الوزن الجزيئي المتوقع للبروتين.

ربط مسبار C 1-BODIPY-C12 ب PPARγ-LBD
في مقايسة ربط المستقبلات ، تم استخدام C1-BODIPY-C12 ، وهو حمض دهني مسمى BODIPY يمكن أن يرتبط ب PPARγ-LBD ، كمسبار مضان لدراسة فاعلية ربط الملوثات البيئية باستخدام hPPARγ-LBD. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، زادت قيم الاستقطاب الفلوري (FP) من 20 إلى 250 عند إضافة PPARγ-LBD ، مما يشير إلى ارتباط C1-BODIPY-C12 بالمستقبل. وصل منحنى الربط إلى التشبع عند 800 نانومتر PPARγ-LBD ، مع ثابت تفكك (Kd) يبلغ 253.5 نانومتر ± 10.05 نانومتر. لذلك ، تم اختيار 800 نانومتر PPARγ-LBD لمقايسات الربط التنافسية اللاحقة.

الارتباط التنافسي للملوثات البيئية ب PPARγ-LBD
تم استخدام Rosiglitazone (Rosi) ، وهو ناهض محدد ل PPARγ ، كعنصر تحكم إيجابي لإزاحة مسبار الفلورسنت في فحوصات ربط الترابط التنافسي. كما هو موضح في الشكل 3 ب ، منع روزي ارتباط مسبار C1-BODIPY-C12 ب PPARγ-LBD بطريقة تعتمد على الجرعة ، مع IC50 من 6.89 ميكرومتر ، مما يدل على جدوى الفحص. بعد ذلك ، تم تحديد الصلات المرتبطة بين TPHP و PPARγ LBD. كما هو مبين في الشكل 3 جيم و دال ، فإن TPHP و PFOS يثبطان أيضا ارتباط مسبار C1-BODIPY-C12 ب PPARγ-LBD بطريقة تعتمد على الجرعة ، مع قيم IC50 تبلغ 60.45 ميكرومتر و 37.27 ميكرومتر ، على التوالي.

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي لمقايسات الربط التنافسي القائمة على الاستقطاب الفلوري (FP). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل SDS-PAGE ل PPARγ-LBD المنقى. M هي علامة الوزن الجزيئي للبروتين. Cl هو محللة الخلية ، و FT هو جزء التدفق ، و W1-W6 هي محاليل الغسيل ، و E1 هي الشطف ، و E2-E4 هي بروتينات PPARγ-LBD المنقاة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: منحنى ربط المستقبلات القائم على الاستقطاب الفلوري (FP) ومنحنيات الربط التنافسية. (أ) منحنى الربط القائم على FP ل C 1-BODIPY-C12 ب PPARγ-LBD البشري. (ب-د) منحنيات الربط التنافسية القائمة على FP من Rosi و TPHP و PFOS إلى PPARγ-LBD البشري. تشير أشرطة الخطأ إلى الانحراف المعياري (SD) لثلاث تجارب مستقلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

معرفتسلسل
pET28a-PPARG-P1 البشريCAAATGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCC
pET28a-الإنسان PPARG-P2GTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGTACAAGTCCTTGTAGATCTC
تسلسل النوكليوتيدات PPARγ-LBDAGACGACATTCCCTCTAGAATAATTTTGTTTTTAACTTTAAGAAGGAGAT
ATACCATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCATCATCATCACACAGCAGCGGCCTG
GTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAA
TGGGTCGCGGATCCATGATCGACCAGCTGAATCCAGAGTCCGCTGAC
CTCCGGGCCCTGGCAAAAACATTTGTATGACTCATACATAAAGTCCTTCC
CGCTGACCAAAGCAAAGGCGAGGGCGATCTTGACACAGGAAAGACAACA
GACAAATCACCATTCGTTATCTATGACATGAATTCCTTAATGATGGGAGA
AGATAAAATCAAGTTCAAACACATCACCCCCCTGCAGGAGCAGAGCACACACACACACACACACACACA.
AGAGGTGGCCATCCGCATCTTTCAGGGCTGCCTCGCTGCCTCGCTCCGTGG
AGGCTGTGCAGGAGATCACAGAGTATGCCAAAAGCATTCCTGGTTTTG
TAAATCTTGACTTGAACGACCAAGTAACTCTCCTCAAATATGGAGTCCA
CGAGATCATTTACACAATGCTGGCCTCTCTTGATGAATAAAGATGGGGT
TCTCATATCCGAGGGCCAAGGCTTCATGACACAAGGGGGTTTCTAAAG
AGCCTGCGAAAGCCTTTTGGTGACTTTTTATGGAGCCCAAGTTTGAGT
TTGCTGTGAAGTTCAATGCACTGGAATTAGATGACAGCGACTTGGCAA
TATTTATTGCTGTCATTATTCTCAGTGGAGACCGCCCAGGTTTGCTGAA
TGTGAAGCCCATTGAAGACATTCAAGACAACCTGCTACAAGCCCTGG
AGCTCCAGCTGAAGCTGAACCCTGAACCCTGAGTCCTCACAGCTGTGTGTG
CCAAGCTGCTCCAGAAAATGACACAGACCACCACCACCAGATTGTCACGGA
ACACGTGCAGCTACTGCAGGTGATCAAGAAGACGGAAACCGACATG
AGTCTTCACCCGCTCCTGCAGGAGATCTACAAGGACTTGGACTGGGG
CTCGAGGCCACCCACCACCC

الجدول 1: تسلسل التمهيدي والنيوكليوتيدات لمجال ربط الترابط PPARγ.

أسماء الكواشف التجريبيةالحجم / الجرعة
pET28a-PPARG-P1 البشري1 ميكرولتر
pET28a-الإنسان PPARG-P21 ميكرولتر
2×فانتا ماكس ماستر ميكس12.5 ميكرولتر
(كدنا)2 ميكرولتر
ddH2O8.5 ميكرولتر

الجدول 2: نظام الكاشف التجريبي PCR.

أسماء التجاربدرجة الحرارةالوقت
التمسخ المسبق95 درجة مئوية3 دقائق
التمسخ95 درجة مئوية15 ثانية
الصلب65 درجة مئوية15 ثانية
امتداد72 درجة مئوية6 دقائق
دكان12 درجة مئوية--

الجدول 3: برنامج التفاعل التجريبي PCR.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد الاستقطاب الفلوري (FP) ، ورين البلازمون السطحي (SPR) ، والرنين المغناطيسي النووي (NMR) من التقنيات الشائعة المستخدمة لتقييم تفاعلات الارتباط المباشر بين البروتينات والمركبات19،20. تم استخدام FP على نطاق واسع في التحقيق في التفاعلات الجزيئية لاكتشاف الأدوية والفحص الكيميائي21،22،23. وبالمقارنة ، فإن فحوصات SPR و NMR باهظة الثمن وتستغرق وقتا طويلا ، مما يجعلها أقل ملاءمة لتطبيقات الفحص عالية الإنتاجية (HTS). يصف هذا البروتوكول طريقة تحليل المستقبلات والترابط القائمة على FP مع نظام الكشف عن الألواح متعددة الآبار ، مما يتيح HTS للمواد الكيميائية.

يعد اختيار المسبار المناسب لمقايسة ربط المستقبلات أمرا بالغ الأهمية. يجب أن يتكون المسبار من مكونين: رابط محدد للمستقبل النووي ومجموعة الفلورسنت. عادة ، يمكن الحصول على مثل هذه المجسات تجاريا ، كما يتضح من مسبار C1-BODIPY-C12 المستخدم في هذه الدراسة. C1-BODIPY-C12 هو نظير فلوري للأحماض الدهنية ، مع مجموعة الفلورسنت BODIPY المدمجة في الموضع C1 ، وهو رابط محدد ل PPARγ. إذا لم يكن مسبار الفلورسنت المتاح تجاريا خيارا ، فيجب تصنيعه كيميائيا عن طريق ربط مجموعة فلورية برابط محدد معروف.

يشتمل الهيكل الكلاسيكي للمستقبل النووي على مجال ربط الحمض النووي المسؤول عن تنظيم التعبير الجيني المستهدف ومجال ربط الترابط (LBD) ، والذي يقع عادة في الطرف C24 للمستقبل. تم العثور على موقع ربط المنظم المشترك بشكل عام داخل مجال وظيفة تنشيط النسخ للمستقبل النووي ، حيث يتفاعل مع عوامل التنظيم النوويالمشترك 25. يمكن لهذه المنظمات المساعدة إما تعزيز أو قمع نشاط النسخ للمستقبل ، وبالتالي تعديل التعبير الجيني. ينظم LBD ، الموجود في منطقة معينة من بروتين المستقبل ، التغيرات التوافقية للمستقبل عند ارتباط الترابط ، والذي بدوره ينشط أو يثبط نشاطه النسخي. نظرا لأن LBD هو مجال محدد جيدا وضروري للتعرف على روابط الجزيئات الصغيرة المحددةوربطها 24 ، فقد تم استخدام المستقبل LBD فقط في مقايسة الربط التنافسي للمستقبلات في هذه الدراسة. هذا النهج ، الذي تضمن التعبير عن مجال ربط الترابط ل PPARγ وتنقية ، قلل من تكاليف الفحص.

الكواشف المستخدمة في هذه الطريقة ، بما في ذلك المخازن المؤقتة لتنقية البروتين ، ومسبار C1-BODIPY-C12 ، و Tris-HCl ، متوفرة تجاريا وغير مكلفة ، وهي ميزة كبيرة للمقايس. يتم إجراء الكشف عن الاستقطاب الفلوري (FP) في لوحة متعددة الآبار (إما 96 بئر أو 384 بئر) ، مع وقت قراءة سريع يبلغ 3-5 دقائق لكل لوحة ، مما يعزز إنتاجية الاختبار وكفاءته. نهج ربط المستقبلات والترابط مرن للغاية ويمكن تكييفه بسهولة مع المستقبلات المختلفة ، بشرط توفر بروتينات المستقبلات. تعمل هذه القدرة على التكيف على توسيع نطاق البحث الذي يمكن إجراؤه باستخدام هذه الطريقة. بشكل عام ، فإن الجمع بين هذه المزايا - سهولة الاستخدام ، وكفاءة التكلفة ، والقدرة العالية على الإنتاجية ، والمعالجة السريعة ، والمرونة في التكيف مع المستقبلات - يجعل هذه الطريقة خيارا واعدا لفحص الملوثات البيئية السامة.

وتبين النتائج الحالية أن سلفونات الأوكتين المشبعة بالفلور وسلفونات اليوتين الطارئة يمكن أن ترتبط ب PPARγ، وهو ما يتفق مع النتائج السابقة من الالتحام الجزيئي ومقايسات الجينات المراسلة9،26. بالإضافة إلى ذلك ، تم استخدام الطريقة الموضحة في هذه المخطوطة لتقييم فاعلية الارتباط للعديد من الملوثات البيئية بالمستقبلات النووية. على سبيل المثال ، باستخدام مقايسة الربط التنافسي للمستقبلات القائمة على FP ، وفاعلية الارتباط ل 19 مادة لكل وبولي فلورو ألكيل (PFASs) و 7 مركبات بيسفينول أ (BPA) لمستقبلات الانتشار البيروكسيسوم β / δ (PPARβ / δ) 7،10 ، 12 PFASs إلى PPARγ9،13 ، 7 مركبات BPA و 3 مكونات جسيمات (PM2.5) لمستقبلات فارنيزويد X (FXR) 11 ، تم تحديد 12 و 8 إثيرات ثنائي الفينيل متعددة البروم (PBDEs) و 6 ثنائي الفينيل متعدد الكلور (PCBs) لمستقبلات الغدة الدرقية (TR) 14،15. تسلط هذه النتائج الضوء على إمكانات هذه الطريقة لفحص التفاعلات الملزمة بين الملوثات البيئية والمستقبلات النووية.

أبلغت الدراسات السابقة عن طرق فحص الاستقطاب الفلوري (FP) ل PPARγ التي تتضمن استخدام ترشيح الهلام لقياس الارتباط ، والذي يتطلب 1.5 ساعة على الأقل للكشف عن ارتباط مركب واحد23. في المقابل ، تسمح هذه الطريقة باكتشاف تقاربات الارتباط لما لا يقل عن 12 مركبا مع PPARγ في غضون 10 دقائق. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تسعير بعض مجموعات الفحص المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد) بأكثر من 3000 دولار لتنسيق 800 × 20 ميكرولتر. هذه الأساليب باهظة الثمن بشكل ملحوظ وتستغرق وقتا طويلا. تقدم هذه الدراسة تحسينات على هذه الطرق الحالية.

أحد القيود المحتملة لهذه الطريقة هو أن مسبار التألق يجب أن يكون رابطا للمستقبل ، ولا تتفاعل مجسات التألق مع الملوثات البيئية مباشرة. لذلك ، من الأهمية بمكان التأكد من أن المسبار والملوثات البيئية منفصلان في المحلول. بالإضافة إلى ذلك ، يعكس هذا الاختبار حالة في المختبر ولا يمكنه التقاط التفاعلات في الجسم الحي بشكل كامل ، حيث أن المستقبلات غير متجانسة في الجسم الحي27. وبالتالي ، في حين أن هذه الطريقة تعمل كأداة فحص سريعة ، فمن الضروري إجراء مزيد من التحقيق في تنشيط المستقبلات والآليات السمية ذات الصلة في الجسم الحي .

عيب آخر هو ظاهرة "التحول إلى اليمين" التي لوحظت في فحوصات الاستقطاب الفلوري (FP) عند تقييم تقارب الربط ، مما قد يؤدي إلى التقليل المنهجي من الصلات المقاسة. في الدراسات السابقة ، تم تقييم تقارب ربط روزيجليتازون مع PPARγ باستخدام مقايسة نقل طاقة الرنين الفلوري (TR-FRET) التي تم حلها بمرور الوقت (TR-FRET)28 ، وهي طريقة حساسة للغاية لقياس تقارب ارتباط مستقبلات الترابط. ومع ذلك ، فإن مقايسة TR-FRET تستغرق وقتا طويلا ومرهقة نسبيا ، وتتطلب حضانة محلول التفاعل لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة قبل اكتشافها. على الرغم من أن مقايسة FP تظهر حساسية أقل مقارنة بمقايسة TR-FRET ، إلا أنها أكثر ملاءمة للفحص عالي الإنتاجية للروابط البيئية التي ترتبط بالمستقبلات النووية. ومع ذلك ، قد يفتقد اختبار FP بعض الروابط البيئية الضعيفة. وبالإضافة إلى ذلك، في دراسات سابقة، تم تحديد تقارب ارتباط سلفونات الأوكتين المشبعة بالفلور مع سلفونات الأوكتين المشبعة بالفلور باستخدام غسيل الكلى التوازني (EqD)29، وهي طريقة أخرى شديدة الحساسية لقياس تقارب ارتباط مستقبلات الترابط. ومع ذلك ، تعتمد EqD على المعدات التحليلية باهظة الثمن (LC-MS / MS) ، مما يحد من تطبيقها ويمنع قدرات الفحص عالية الإنتاجية.

على الرغم من أن مقايسة الاستقطاب الفلوري (FP) تظهر ظاهرة "التحول الأيمن" ، والتي قد تؤدي إلى قيم IC50 محسوبة أعلى بشكل عام ، إلا أنها لا تؤثر على ترتيب التقارب النسبي أو تنبؤات تقييم المخاطر اللاحقة. علاوة على ذلك ، فإن اختبار FP فعال من حيث التكلفة وفعال من حيث الوقت وقادر على فحص مجموعة واسعة من المركبات للتأكد من تقاربها مع مستقبلات نووية متعددة. بشكل عام ، يسهل الفحص عالي الإنتاجية القائم على FP للروابط البيئية التعرف السريع على الملوثات البيئية السامة.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفان أنه لا يوجد تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 82103875).

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
C1< / sub>-BODIPY-C12< / sub> مسبارThermo Fisher Scientific ، الصين102209-82-3يرتبط ب PPAR & gamma ؛ -LBD وينبعث منه تألق.
Coomassie Brilliant Blue R-250Solarbio ، الصين6104-59-2وصمة عار العصابات البروتينية.
GraphPad prismDotmaticshttps://www.graphpad.com/features
imidazoleSolarbio ، الصينI8090قم بإعداد المخازن المؤقتة لعملية تنقية البروتين.
الأيزوبروبيل & بيتا ;-D-1-thiogalactopyranosideSolarbio, الصين367-93-1الحث على التعبير عن PPARγ-LBD
Microplate قارئBiotek , الولايات المتحدة الأمريكيةالتآزر H1 الكشف عن قيمة FP
كلوريدالصوديوم شنغهاي7647-15-5قم بإعداد مخازن مؤقتة لعملية تنقية البروتين.
NaH2PO4 · 2H2Oكاشف شنغهاي13472-35-0إعداد المخازن المؤقتة لعملية تنقية البروتين.
Ni NTA Beads 6FFSmart-Lifesciences ، تنقيةالبروتين SA005005الصين.
الأصل 8.5 OriginLab, نورثهامبتون, ماساتشوستس, الولايات المتحدة الأمريكية
حمض السلفونيك المشبع بالفلور أوكتين (PFOS)J& K Scientific Ltd ، الصين1763-23-1الملوثات البيئية المكتشفة
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Solarbio ، الصينP0100تمنع تدهور البروتين.
PPAR & gamma ;-Competitor AssayKit Thermo Fisher ScientificPV6136https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/PV6136
PPAR & gamma ;-LBD Ligand Screening Assay Kitكايمان600616https://www.caymanchem.com/product/600616
Rosiglitazone (Rosi)علاء الدين ، الصين122320-73-4ناهضات PPAR & gamma ؛
شاكرZHICHENG ، الصينZWY-211Cتوسيع الثقافة البكتيرية وتحريض تعبير البروتين
ثلاثي الفينيل الفوسفات (TPHP)ماكلين ، الصينT819317الملوثات البيئية المكتشفة
TrisSolarbio ، الصينT8230إعداد المخازن المؤقتة لعملية تنقية البروتين.
TryptoneOXOID Limited ، الصينLP0042Bتحضير وسط مرق Lysogeny (LB).
منظف بالموجات فوق الصوتيةكيمبرلي ، الصينLHO-1تعطيل البكتيريا لتحقيق التحلل الكامل
UreaSolarbio ، الصينU8020إعداد المخازن المؤقتة لعملية تنقية البروتين.
مستخلص الخميرةOXOID Limited ، الصينLP0021Bتحضير مرق Lysogeny (LB) متوسط.
كاشف

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).">Maddela, N. R., Ramakrishnan, B., Dueñas-Rivadeneira, A. A., Venkateswarlu, K., Megharaj, M. Chemicals/materials of emerging concern in farmlands: sources, crop uptake, and potential human health risks. Environ Sci Process Impacts. 24 (12), 2217-2236 (2022).
  2. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).">Naidu, R., et al. Chemical pollution: A growing peril and potential catastrophic risk to humanity. Environ Int. 156, 106616(2021).
  3. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).">Ryu, H., Li, B., De Guise, S., McCutcheon, J., Lei, Y. Recent progress in the detection of emerging contaminants PFASs. J Hazard Mater. 408, 124437(2021).
  4. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).">Alofe, O., et al. Determining the endocrine disruption potential of industrial chemicals using an integrative approach: Public databases, in vitro exposure, and modeling receptor interactions. Environ Int. 131, 104969(2019).
  5. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).">Bajard, L., et al. Endocrine disrupting potential of replacement flame retardants - Review of current knowledge for nuclear receptors associated with reproductive outcomes. Environ Int. 153, 106550(2021).
  6. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).">Chen, Q., Chou, W. C., Lin, Z. Integration of toxicogenomics and physiologically based pharmacokinetic modeling in human health risk assessment of perfluorooctane sulfonate. Environ Sci Technol. 56 (6), 3623-3633 (2022).
  7. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).">Li, C. H., Ren, X. M., Cao, L. Y., Qin, W. P., Guo, L. H. Investigation of binding and activity of perfluoroalkyl substances to the human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Environ Sci Process Impacts. 21 (11), 1908-1914 (2019).
  8. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).">Li, C. H., et al. Chlorinated polyfluorinated ether sulfonates exhibit higher activity toward peroxisome proliferator-activated receptors signaling pathways than perfluorooctanesulfonate. Environ Sci Technol. 52 (5), 3232-3239 (2018).
  9. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).">Li, C. H., Shi, Y. L., Li, M., Guo, L. H., Cai, Y. Q. Receptor-bound perfluoroalkyl carboxylic acids dictate their activity on human and mouse peroxisome proliferator-activated receptor γ. Environ Sci Technol. 54 (15), 9529-9536 (2020).
  10. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).">Li, C. H., Zhang, D. H., Jiang, L. D., Qi, Y., Guo, L. H. Binding and activity of bisphenol analogues to human peroxisome proliferator-activated receptor β/δ. Ecotoxicol Environ Saf. 226, 112849(2021).
  11. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).">Zhang, D., et al. Binding activity and risk assessment of bisphenols toward farnesoid X receptor pathway: In vitro and in silico study. Sci Total Environ. 869, 161701(2023).
  12. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).">Zhang, D., et al. Fine particulate matter disrupts bile acid homeostasis in hepatocytes via binding to and activating farnesoid X receptor. Toxicology. 506, 153850(2024).
  13. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).">Li, C. H., Ren, X. M., Guo, L. H. Adipogenic activity of oligomeric hexafluoropropylene oxide (perfluorooctanoic acid alternative) through peroxisome proliferator-activated receptor γ pathway. Environ Sci Technol. 53 (6), 3287-3295 (2019).
  14. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).">Qin, W. P., Li, C. H., Guo, L. H., Ren, X. M., Zhang, J. Q. Binding and activity of polybrominated diphenyl ether sulfates to thyroid hormone transport proteins and nuclear receptors. Environ Sci Process Impacts. 21 (6), 950-956 (2019).
  15. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).">Ren, X. M., Li, C. H., Zhang, J. Q., Guo, L. H. Binding and activity of sulfated metabolites of lower-chlorinated polychlorinated biphenyls towards thyroid hormone receptor alpha. Ecotoxicol Environ Saf. 180, 686-692 (2019).
  16. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).">Evans, N., et al. In vitro activity of a panel of per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS), fatty acids, and pharmaceuticals in peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) alpha, PPAR gamma, and estrogen receptor assays. Toxicol Appl Pharmacol. 449, 116136(2022).
  17. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).">Kim, S., et al. Triphenyl phosphate is a selective PPARγ modulator that does not induce brite adipogenesis in vitro and in vivo. Arch Toxicol. 94 (9), 3087-3103 (2020).
  18. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).">Matsumoto, H., Haniu, H., Komori, N. Determination of protein molecular weights on SDS-PAGE. Methods Mol Biol. 1855, 101-105 (2019).
  19. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).">Nguyen, H. H., Park, J., Kang, S., Kim, M. Surface plasmon resonance: A versatile technique for biosensor applications. Sensors (Basel). 15 (5), 10481-10510 (2015).
  20. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).">Hu, J., Kim, J., Hilty, C. Detection of protein-ligand interactions by 19F nuclear magnetic resonance using hyperpolarized water. J Phys Chem Lett. 13 (17), 3819-3823 (2022).
  21. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).">LeBlanc, E. V., Shekhar-Guturja, T., Whitesell, L., Cowen, L. E. Fluorescence polarization-based measurement of protein-ligand interaction in fungal cell lysates. Curr Protoc. 1 (1), e17(2021).
  22. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).">Huang, X., Aulabaugh, A. Application of fluorescence polarization in HTS assays. Methods Mol Biol. 1439, 115-130 (2016).
  23. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).">Seethala, R., et al. A rapid homogeneous fluorescence polarization binding assay for peroxisome proliferator-activated receptors alpha and gamma using a fluorescein-tagged dual PPARalpha/gamma activator. Anal Biochem. 363 (2), 263-274 (2007).
  24. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).">Hu, W., et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor gamma and disruption of progesterone synthesis of 2-ethylhexyl diphenyl phosphate in human placental choriocarcinoma cells: Comparison with triphenyl phosphate. Environ Sci Technol. 51 (7), 4061-4068 (2017).
  25. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).">Weatherman, R. V., Fletterick, R. J., Scanlan, T. S. Nuclear-receptor ligands and ligand-binding domains. Annu Rev Biochem. 68, 559-581 (1999).
  26. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).">Khazaee, M., et al. Perfluoroalkyl acid binding with peroxisome proliferator-activated receptors α, γ, and δ and fatty acid binding proteins by equilibrium dialysis with a comparison of methods. Toxics. 9 (3), 45(2021).
  27. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).">de Vera, I. M. S., et al. Synergistic regulation of coregulator/nuclear receptor interaction by ligand and DNA. Structure. 25 (10), 1506-1518.e4 (2017).
  28. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).">Hendrickson, O. D., Taranova, N. A., Zherdev, A. V., Dzantiev, B. B., Eremin, S. A. Fluorescence polarization-based bioassays: New horizons. Sensors (Basel). 20 (24), 7132(2020).
  29. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).">Liu, C., et al. Identification of a novel selective agonist of PPARγ with no promotion of adipogenesis and less inhibition of osteoblastogenesis. Sci Rep. 5, 9530(2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High Throughput ScreeningNuclear ReceptorsBinding AffinityEnvironmental PollutantsReceptor Ligand BindingFluorescence PolarizationMicroplate ReaderProtein ExpressionCompetitive BindingPPAR Gamma
Video Coming Soon

Related Articles