Method Article

القياس الكمي لتعديل نشاط إنزيم الإيلاستاز من خلال التحليل اللوني

DOI:

10.3791/67331

⸱

January 17th, 2025

 ,  ,  , 
1Institute for Research, Development and Innovation in Health Biotechnology of Elche (IDiBE), Miguel Hernández University (UMH), 2CIBER, Pathophysiology of Obesity and Nutrition, CIBERobn, Carlos III Health Institute (CB12/03/30038)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول تطوير طريقة فحص اللونية لتحديد قدرة المركبات على تثبيط أو تنشيط نشاط الإيلاستاز.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب الإيلاستاز ، وهو بروتياز سيرين ، دورا أساسيا في تحلل الإيلاستين. الإيلاستين هو بروتين خارج الخلية يساعد في الحفاظ على مرونة الأنسجة في الرئتين والجلد والأوعية الدموية. يعد التنظيم الصارم لنشاط الإيلاستاز أمرا بالغ الأهمية لتوازن الأنسجة ، حيث يمكن أن يساهم خلل التنظيم في أمراض مثل انتفاخ الرئة والتجاعيد وتصلب الشرايين. أظهرت بعض المركبات ، مثل المواد الكيميائية النباتية التي تحدث بشكل طبيعي ، إمكانية التدخل العلاجي وجذبت اهتماما كبيرا. يعد توضيح التأثيرات المعدلة للمركبات المختلفة على الإيلاستاز ، سواء كانت مثبطة أو محفزة ، أمرا بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات علاجية وتجميلية جديدة تستهدف الاضطرابات المرتبطة بالإيلاستاز. طريقة مقبولة على نطاق واسع لقياس نشاط الإيلاستاز هي مقايسة الإيلاستاز اللونية. في هذا الفحص ، يتم استخدام ركيزة معينة لتكسير الإيلاستاز ، وإطلاق مركب أصفر يمكن اكتشافه ، p-nitroaniline (pNA). تعكس كمية pNA المنتجة نشاط الإيلاستاز في العينة ويمكن قياسها عن طريق قياس الألوان. يقدم هذا الاختبار العديد من الفوائد ، بما في ذلك البساطة والحساسية العالية والنتائج السريعة والقدرة على التكيف مع الاحتياجات البحثية المختلفة. يظل اختبار الإيلاستاز اللوني أداة قيمة لدراسة كيفية تأثير المركبات على نشاط الإيلاستاز. نظرا لسهولة استخدامه وفعاليته ، يعد هذا الاختبار حجر الزاوية في البحث في هذا المجال.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإيلاستاز هو إنزيم سيرين البروتياز الذي يلعب دورا مهما في تكسير الإيلاستين ، وهو بروتين يوفر مرونة لأنسجة مختلفة في الجسم ، بما في ذلك الرئتين والجلد والأوعية الدموية. يتم تنظيم نشاط الإيلاستاز بإحكام للحفاظ على توازن الأنسجة ، ويمكن أن يؤدي عدم التنظيم إلى حالات مرضية وجلدية مثل انتفاخ الرئة وتصلب الشرايين وتجاعيدالجلد 1.

هناك عدة أنواع من اللدائن ، ولكل منها خصائص ووظائف محددة. تعتبر الإيلاستاز العدلات ، التي تنتجها العدلات ، مهمة في الاستجابة المناعية والالتهابات. يمكن لهذه الإنزيمات أن تتحلل مجموعة متنوعة من البروتينات خارج الخلية وتشارك في الأمراض الالتهابية المزمنة

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير 0.2 M Tris قاعدة التفاعل المؤقت (RB)

  1. قم بوزن قاعدة Tris المقابلة باستخدام ميزان تحليلي.
  2. انقل قاعدة تريس إلى دورق وأضف الماء منزوع الأيونات باستخدام أسطوانة متدرجة.
  3. قلب المحلول باستخدام محرك مغناطيسي حتى تذوب قاعدة تريس تماما.
  4. اضبط الرقم الهيدروجيني إلى 8.0 عن طريق إضافة 4 نيوتن حمض الهيدروكلوريك بالتنقيط. استخدم مقياس الأس الهيدروجيني لمراقبة درجة الحموضة.
  5. بمجرد الوصول إلى الرقم الهيدروجيني المطلوب ، انقل المحلول إلى قارورة حجمية واملأها إلى عل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بمجرد اكتمال البروتوكول ، يمكن الحصول على بيانات الامتصاص اللازمة لإجراء الحسابات ذات الصلة وتحديد قدرة العينات على تعديل نشاط الإيلاستاز. يسلط الشكل 3 الضوء على موقع الآبار مع الضوابط والعينات المختلفة. في حالة العينات الملونة ، مثل تلك المستخدمة في هذا المثال ، من الضروري إضافة عناصر تحكم في الألوان لتقليل التداخل الطيفي الضوئي ، حيث يمكن أن يتداخل اللون مع قياس اللون الأصفر ل pNA عند 410 نانومتر.

بمجرد الحصول على نتائج الامتصاص ، تم حساب النسبة المئوية لتثبيط ك.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الطريقة الحالية ، يتم فحص التأثيرات المعدلة للمواد الكيميائية النباتية على إنزيمات الإيلاستاز باستخدام مقايسة اللون. يلعب الإيلاستاز ، وهو بروتياز سيرين ضروري لتدهور الإيلاستين ، دورا مهما في الحفاظ على مرونة الأنسجة في الأعضاء المختلفة. يوفر اختبار الإيلاستاز اللوني الموصوف في هذا العمل طريقة بسيطة وحساسة وسريعة لقياس نشاط الإيلاستاز.

في هذا السياق ، ركز الباحثون على المعدلات ، مثل المستخلصات النباتية والمواد الكيميائية النباتية النقية ، لقدرتها على تعديل .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والابتكار الإسبانية (MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 / FEDER ، UE ؛ المشاريع: RTI2018-096724-B-C21 و TED2021-129932B-C21 و PID2021-125188OB-C32) و Generalitat Valenciana (PROMETEO / 2021/059). تم دعم هذا العمل أيضا من قبل وكالة التمويل الرسمية للبحوث الطبية الحيوية التابعة للحكومة الإسبانية ، ومعهد الصحة كارلوس الثالث (ISCIII) من خلال CIBEROBN (CB12 / 03/30038) ، Agencia Valenciana de la Innovación: INNEST / 2022/103 ؛ الذي يشارك في تمويله صندوق التنمية الإقليمية الأوروبي. E.B.-C و M.H.-L. تم دعمها من خلال إعادة تأهيل نظام الجامعة الإسبانية لمنحة 2021/2023. ف. ج. - م. تم دعمه من قبل منح مارغ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
96 لوحة ثقافة الخليةالجيدة CorningIncorporated 3599قاع مسطح مع غطاء ،
تصوير خلايا البوليسترين متعدد الأوضاعAgilentBioTek Cytation 1يستخدم مع برنامج Gen5
Elastase من البنكرياس الخنازيرSigma-AldrichE7885CAS 39445-21-1 ؛ 25,9 كيلو دالتون
إيزوبروبانول 99.5٪فيشرAC184130010العلمي CAS 67-63-0 ؛ C3H8O; 60.10 جم / مول
N-Succinil- (Ala) 3-nitroanilideSigma-AldrichS4760CAS 52299-14-6 ؛ C19H25N5O8 ؛ 451.43 جم / مول
مقياس الأس الهيدروجيني HachLangesensION + PH31مع محرك مغناطيسي وحامل مستشعر
فينيل ميثان سولفونيل فلوريدسيجما ألدريتشP7626CAS 329-98-6 ؛ C7H7FO2S. 174،19 جم / مول
تريس للبيولوجيا الجزيئيةPanReac AppliChemA2264CAS 77-86-1 ؛ C4H11NO3. 121,14 جم / مول
قارئ

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Imokawa, G., Ishida, K. Biological mechanisms underlying the ultraviolet radiation-induced formation of skin wrinkling and sagging I: Reduced skin elasticity, highly associated with enhanced dermal elastase activity, triggers wrinkling and sagging. Int J Mol Sci. 16 (4), 7753-7775 (2015).
  2. Voynow, J. A., ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastase ActivityColorimetric AssayElastin DegradationEnzyme InhibitionSerine ProteasePlant ExtractsMicroplate ReaderTissue ElasticityAbsorbance MeasurementReaction Buffer

Related Articles