يصف البروتوكول الحالي طريقة لحث تشتت الأحداث في المرحلة الثالثة (الأحداث ما قبل الدااور ، JIII.) من الجراب الزيليلوفيلوس في التشفير من خلال التنظيم التناضحي لأيونات كلوريد البوتاسيوم (KCl). يمكن أن توفر هذه الطريقة الدعم الفني للبحث في آليات مقاومة الإجهاد ل B. xylophilus.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إحداث دخول المرحلة الثالثة من الأحداث المشتتة من الجراب الزاحفي إلى التشفير من خلال التنظيم التناضحي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
Cryptobiosis هي حالة تفقد فيها الكائنات الحية كل مياهها الداخلية تقريبا وتدخل في التكاثر المائي تحت ضغط بيئي شديد. يمكن أن تدخل الأحداث المشتتة في المرحلة الثالثة (الأحداث قبل dauer ، 
) من الجراب الزيليوفيلوس إلى داء التشفير من خلال الجفاف وتنتعش عند الإماهة عندما تتحسن الظروف البيئية. التنظيم التناضحي أمر بالغ الأهمية لبقائهم على قيد الحياة في هذه العملية. في هذه الدراسة ، عينات من B. xylophilus تم جمعها من Pinus massoniana الميت بسبب مرض ذبول الصنوبر في نينغبو بمقاطعة تشجيانغ ، الصين. بعد الغمر في محلول كلوريد البوتاسيوم بنسبة 8٪ (KCl) ، دخل B. xylophilus في حالة التشفير الحيوي بعد الجفاف التدريجي بسبب زيادة الضغط الاسموزي الخارجي عن طريق تبخر الماء الطبيعي. B. xylophilus يمكن أن يقاوم الإجهاد في درجات الحرارة المنخفضة عند -20 درجة مئوية. B. xylophilus يمكن أن ينتعش عند الإماهة ، بمعدل بقاء 92.1٪. يمكن أن تنظم هذه العملية دخول B. xylophilus إلى داء الكريتوبيات ، مما يمكنهم من مقاومة البيئات القاسية. هذه الطريقة الموضحة في دراستنا بسيطة وموثوقة ، وتوفر الدعم الفني لدراسة آليات مقاومة الإجهاد ل B. xylophilus.
المقدمة
مرض ذبول الصنوبر هو أحد أشد أمراض الغابات في الصين1. تشكل الديدان الخيطية لخشب الصنوبر Bursaphelenchus xylophilus (B. xylophilus) تهديدا كبيرا لأنواع الصنوبر مثل Pinus massoniana (P. massoniana) عن طريق التكاثر داخل المضيف ، مما يؤدي إلى الذبول السريع والموت. في ظل ظروف بيئية غير مواتية بعد وفاة المضيف ، قد تدخل الأحداث الإنجابية ل B. xylophilus إلى الأحداث قبل dauer (). تبحث هذه الأحداث عن ناقلات الحشرات لمواصلة نقلها وانتشارها ، مما يتسبب في نفوق غابات الصنوبر على نطاقواسع 2.
Cryptobiosis هي حالة تفقد فيها الكائنات الحية كل مياهها الداخلية تقريبا وتدخل الحيوية المائية تحت ضغط بيئي شديد3. في هذه العملية ، تجف الكائنات الحية تدريجيا ، مما يؤدي إلى توقف الحركة ، وانخفاض التمثيل الغذائي ، ودورة حياة معلقة4. في ظل ظروف مناسبة ، يمكنهم التعافي عند الجفاف. يمكن Cryptobiosis الكائنات الحية من مقاومة البيئات القاسية ، مثل درجات الحرارة المنخفضة ، وإطالة عمرها5. تم العثور على الديدان الخيطية التي نجت في داء التشفير لمدة 30,000 عام في التربة الصقيعية في القطب الجنوبي6.
أظهرت الدراسات السابقة أن الديدان الخيطية يمكن أن تتكيف مع العديد من الضغوطات اللاأحيائية - مثل درجة الحرارة المنخفضة والجفاف والضغط التناضحي المرتفع - أثناء الجفاف عن طريق ضبط نفاذية سطحها7. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للديدان الخيطية تجعيد أجسامهم لتقليل مساحة السطح وتقليل معدل فقدان الماء. على سبيل المثال ، ينظم Caenorhabditis elegans التوازن التناضحي ، مما يسمح للأيونات والجزيئات الصغيرة بالمرور بحرية عبر بشرتها ، بينما لا تستطيع الجزيئات الأكبر8. B. xylophilus يعرض أيضا cryptobiosis. خلال مراحل الجفاف والإماهة من داء الكريبتوبيوسيس ، يعد التنظيم التناضحي ضروريا للتحكم في تبادل المواد عبر البشرة ، مما يجعله محوريا للدخول أو التعافي من داء التشفير9.
تقدم هذه الدراسة طريقة لإحداث داء التشفير في B. xylophilus من خلال التنظيم التناضحي. هذه الطريقة بسيطة وفعالة وموثوقة للغاية ، وتوفر الدعم الفني للبحث عن آليات مقاومة الإجهاد ل B. xylophilus.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. مجموعة B 
. xylophilus
- مجموعة من الأقراص المصابة من المتصورة ماسونيانا
ملاحظة: امتثلت جميع الإجراءات للتدابير الإدارية للمنطقة الوبائية لمرض ذبول الصنوبر والخشب المصاب وغيرها من اللوائح المعمول بها. تم اختيار غابة P. massoniana المصابة ب B. xylophilus في مقاطعة شيانغشان بمدينة نينغبو بمقاطعة تشجيانغ كموقع للعينة. P. massoniana ، الذي مات من مرض ذبول الصنوبر ، تم سقطه داخل موقع العينة.- اجمع جذوع الأشجار المستديرة (بسمك 5 سم) من الأجزاء العلوية والوسطى والسفلية من الجذع الرئيسي للأشجار المقطوعة.
- قطعي جذوع الأشجار المستديرة المجمعة من P. massoniana إلى شرائح بسمك 0.5-1 سم ، ثم قصيها إلى شرائح صغيرة بطول 2-3 سم.
- ضع الشرائط الخشبية الصغيرة في أكياس محكمة الغلق واحفظها في المختبر لاستخدامها مرة أخرى.
- استخراج B. xylophilus
- قم بتوصيل أنبوب مطاطي بالطرف الضيق لقمع زجاجي طويل العنق بقطر تقريبي يبلغ 15 سم. قم بتأمين الأنبوب المطاطي باستخدام قرص. ضع القمع المجمع على حامل قمع.
- لف الشرائط الخشبية الصغيرة بالكامل في طبقة واحدة من المناديل الورقية ثم ضعها في القمع. أضف الماء المقطر إلى القمع حتى تغمر جميع الشرائط الخشبية.
ملاحظة: بعد الوقوف لمدة 12-24 ساعة ، هاجرت الديدان الخيطية من الشرائط الخشبية واستقرت في الجزء السفلي من القمع10. منع المناديل الورقية حطام الخشب من الاستقرار مع السماح للديدان الخيطية بالمرور. - حرر pinchcock في الجزء السفلي من القمع ببطء ، واترك 2000-5000 ميكرولتر من الخليط يتسرب إلى طبق بتري (قطره 5 سم) للفحص المجهري وتحديد المورفولوجي.
- حدد B. xylophilus من خلال مراقبة ميزات مثل الأنماط ، ومصابيح المريء المتوسطة ، وقطرات الدهون ، وأشكال الذيل "الشبيهة بالإصبع"11.
- تحت المجهر ، انقل الفرد B. xylophilus إلى شريحة عن طريق شفط 10 ميكرولتر من السائل مع ديدان خيطية واحدة باستخدام ماصة 10 ميكرولتر في كل مرة. كرر هذه العملية 30 مرة لجمع ما يقرب من 300 ميكرولتر من الخليط الذي يحتوي على الديدان الخيطية.
- بعد استخراج B. xylophilus ، قم بتعقيم الشرائط الخشبية المتبقية والمواد الخشبية المصابة لمنع المزيد من التلوث.
2. التحكم في عملية التنظيم التناضحي
- تحضير خليط التنظيم الاسموزي
- تحضير محلول مائي 8٪ KCl.
- باستخدام ماصة، أضف 10 ميكرولتر من المحلول المائي 8٪ KCl إلى الشريحة التي تحتوي على خليط B. xylophilus، مما ينتج عنه حوالي 310 ميكرولتر من خليط من الديدان الخيطية ومحلول KCl.
- تنظيم زيادة الضغط الاسموزي والجفاف من B. xylophilus
- ضع الشريحة على مرحلة المجهر ، مما يسمح للماء بالتبخر بشكل طبيعي. سيزيد تدريجيا من الضغط الاسموزي للبيئة المحيطة ، مما يتسبب في جفاف الديدان الخيطية على مدى 30-60 دقيقة تقريبا.
ملاحظة: يحتاج المشغل فقط إلى الانتظار حتى يتبخر الماء بشكل طبيعي حتى تترسب بلورات KCL وتراقب حالة الديدان الخيطية تحت المجهر. يستغرق حوالي 30-60 دقيقة حتى يتبخر 310 ميكرولتر من الخليط بشكل طبيعي حتى تترسب بلورات KCL. - راقب عملية الجفاف (على سبيل المثال ، تجعيد الجسم ، التجميع ، إلخ) من B. xylophilus تحت المجهر. عندما يتبخر الماء تماما وتترسب بلورات KCl ، يتوقف B. xylophilus عن الحركة ويدخل في داء الكريبتوبيوس.
- ضع الشريحة على مرحلة المجهر ، مما يسمح للماء بالتبخر بشكل طبيعي. سيزيد تدريجيا من الضغط الاسموزي للبيئة المحيطة ، مما يتسبب في جفاف الديدان الخيطية على مدى 30-60 دقيقة تقريبا.
- علاج الإجهاد في درجات الحرارة المنخفضة للكريبتوبيوتيك B. xylophilus
- ضع المشفرات الحيوية B. xylophilus في بيئة درجة حرارة ثابتة تبلغ -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
- ضع المشفرات الحيوية
- تنظيم انخفاض الضغط التناضحي وإعادة الجفاف من B. xylophilus
- أضف ما يقرب من 300 ميكرولتر من الماء المقطر حول الأحداث التي خضعت للمعالجة بدرجة حرارة منخفضة بواسطة الماصة. عملية الجفاف ، التي تستمر لمدة 30-60 دقيقة ، تقلل تدريجيا من الضغط الاسموزي للبيئة المحيطة بها.
- راقب عملية الجفاف ل B. xylophilus (على سبيل المثال ، تمدد الجسم ، استئناف الحركة ، إلخ) تحت المجهر. احسب معدل البقاء على قيد الحياة بعد 24 ساعة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في محلول 8٪ KCl ، عندما تبخر الماء ، B. xylophilus أظهر في البداية "تجعيدا" ملحوظا بينما ظل متحركا (الشكل 1 أ). بمجرد أن يتبخر الماء تماما ، توقفت الديدان الخيطية عن الحركة وتتجعد ، مع أسطح مكتئبة وقطرات دهنية متراكمة (الشكل 1 ب) ، مما يشير إلى دخولها إلى حالة التشفير الحيوي. عند إضافة الماء المقطر إلى البيئة المحيطة بها ، تم ترطيب الديدان الخيطية وإحيائها (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الدراسة ، B. xylophilus تم جمعه من P. massoniana الميت في نينغبو بمقاطعة تشجيانغ. وتجدر الإشارة إلى أن B. xylophilus تم اختياره من مجموعة مختلطة من الأطوار المختلفة. على وجه التحديد ، جذوع الأشجار المستديرة ذات الكثافة العالية من B. xylophilus ، تليها فحص
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم تمويل هذا البحث من قبل صندوق البحوث الأساسية للمؤسسة العلمية المركزية للمصلحة العامة التابع للمختبر الرئيسي الحكومي لعلم الوراثة والتربية على الأشجار (رقم المنحة CAFYBB2020ZY001-2) ، ومشاريع أبحاث المؤسسات (202404016-4320) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC 32271896).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| شريحة زجاجية | بيولاند | جي إس 7101-7525 | 75 مم &مرات ؛ 25 مم &مرات ؛ 1 ملم |
| قمع زجاجي طويل العنق | نانجينغ كانجلودا التكنولوجيا التجريبية | غير متاح | 150 مم |
| مجهر | فينيكس | إكس إس بي-35-1600 إكس | PH100-2B41L-IPL |
| طبق بتري | نانجينغ كانجلودا التكنولوجيا التجريبية | سل - 624935792745 | 50 مم &مرات ؛ 50 مم |
| بينتشكوك | نانجينغ كانجلودا التكنولوجيا التجريبية | السل - 624973311743 | 36 مم &مرات ؛ 11 مم ؛ &مرات; 55 ملم |
| ماصه | إيبندورف | 3123000012 | 10 – 100 & L |
| كلوريد البوتاسيوم (KCL) | علوم الحياة Solarbio | ص 9921 | 500 جرام |
| أنبوب مطاطي | نانجينغ كانجلودا التكنولوجيا التجريبية | السل - 624923457094 | 7 مم &مرات ؛ 5 ملم |
| معقم | بن جيانغ | https://detail.1688.com/offer/644766597053.html?_t=1730892390541&spm = a2615.7691456.co_0_0_wangpu _score_0_0_0_0_1_0_0000_0.0 | 75 لتر |
| المناديل الورقية | بصمة من القلب إلى القلب | م3 | 22.5 سم &مرات ؛ 21.5 سم |
المراجع
- Li, Y., Zhang, X. Analysis on the trend of invasion and expansion of Bursaphelenchus xylophilus. Forest Pest and Disease. 37 (5), 1-4 (2018).
- Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annu Rev Phytopathol. 51 (51), ?61(2013).
- Crowe, J. H., Cooper, A. F. Cryptobiosis. Sci Am. 225, 30-36 (1971).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis. Curr Biol. 25, 1107-1125 (2015).
- Browne, J., Tunnacliffe, A., Burnell, A. Anhydrobiosis: plant desiccation gene found in a nematode. Nature. 416 (6876), 38(2002).
- Shatilovich, A. V., et al. Viable nematodes from late Pleistocene permafrost of the Kolyma river lowland. Dokl Biol Sci. 480 (1), 100-102 (2018).
- Schottenfeld-Roames, J., Ghabrial, A. S. Osmotic regulation of seamless tube growth. Nat Cell Biol. 15 (2), 137-139 (2013).
- Erkut, C., et al. Trehalose renders the dauer larva of Caenorhabditis elegans resistant to extreme desiccation. Curr Biol. 21 (1), 1331-1336 (2012).
- Pan, L., et al. Third-stage dispersal juveniles of Bursaphelenchus xylophilus can resist low-temperature stress by entering cryptobiosis. Biology. 10 (8), 785(2021).
- Mao, X. F., Li, H. X., Chen, X. Y., Hu, F. Extraction efficiency of soil nematodes by different methods. Chinese J Ecol. 23 (3), 149-151 (2004).
- Pan, L., et al. Isolation and identification of pine wood nematode in Pinus koraiensis in Fengcheng, Liaoning province. Forest Pest and Disease. 38 (1), 4(2019).
- Pan, L., Cui, R., Li, Y., Feng, Y., Zhang, X. Investigation of pinewood nematodes in Pinus tabuliformis Carr. under low-temperature conditions in Fushun, China. Forests. 11 (9), 993(2020).
- Madin, K. A. C., Crowe, J. H. Anhydrobiosis in nematodes: Carbohydrate and lipid metabolism during dehydration. J Exp Zool. 3, 193(2010).
- Wharton, D. A. Anhydrobiosis: The model worm as a model. Curr Biol. 21 (15), 578-579 (2011).
- Li, Y., Zhang, X. High risk of invasion and expansion of pine wood nematode in the middle temperate zone of China. J Temperate Res. 1 (1), 4(2018).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
