تحليل تدفق الخلايا لتعبير عوامل الأنسجة في الصفائح الدموية البشرية

Marta Brambilla; Alessia Becchetti; Kevin Nallio; Marina Camera

doi:10.3791/67356

مقالة منهجية

تحليل تدفق الخلايا لتعبير عوامل الأنسجة في الصفائح الدموية البشرية

DOI:

10.3791/67356

⸱

نوفمبر 22, 2024

Marta Brambilla¹ , Alessia Becchetti¹ , Kevin Nallio¹ , Marina Camera¹^,²

¹Centro Cardiologico Monzino IRCCS, ²Department of Pharmaceutical Sciences, Università degli Studi di Milano

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المقالة بروتوكول قياس نسبة الصفائح الدموية الموجبة لعامل النسيج (TF) باستخدام قياس تدفق الدم الكامل، مع تقييم البروتين: (1) داخل الخلايا في ظروف الراحة، و(2) على سطح الخلية، في كل من حالة الراحة والنشطة. كما يتم توفير إرشادات لتقييم الصفائح الصفائح الموجبة ل TF في البلازما الغنية بالصفائح الدموية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تخزن مجموعة فرعية من الصفائح الدموية البشرية المتداولة عامل الأنسجة (TF) داخل الخلية، وهو المنشط الرئيسي لسلسلة تخثر الدم وتكوين الخثات. عند تنشيط الصفائح الدموية، يتعرض الفصائل الخالية من الصفائح الدموية على غشاء الخلية، حيث يرتبط ب FVII، مما يؤدي في النهاية إلى توليد الثرومبين. وبالنظر إلى أن (1) مستويات الصفائح الدموية الموجبة للقميص الدموي تزداد في بيئات سريرية مختلفة، مما يساهم في النمط الظاهري الأولي للمريض، و(2) يمكن للأدوية المختلفة تعديل تعبير الصفائح الدموية المرتبطة بالصفائح الدموية، فإن طريقة موحدة لتقييم الصفائح الدموية الإيجابية للصفائح الدموية ذات قيمة كبيرة، حيث كان تقييمها مثيرا للجدل في الماضي. هنا، نضع بروتوكولا لقياس نسبة الصفائح الدموية الموجبة للصفائح الدموية باستخدام قياس تدفق الخلايا في الدم الكامل والبلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP)/الصفائح الدموية المغسولة. يهدف هذا البروتوكول إلى توفير تعليمات مفصلة لقياس نسبة الصفائح الدموية الموجبة ل TF من خلال تقييم البروتين (1) داخل الخلية في ظروف الراحة، و(2) على سطح الخلية، في كل من حالة الراحة والنشطة. يوفر القسم الأول معلومات أساسية لإجراء سحب الدم بشكل صحيح لضمان عدم تأثير الإجراءات التحليلية المسبقة على النتائج. بعد ذلك، يركز البروتوكول على إجراءات تحضير العينات ووضع العلامات لتحليل قياس التدفق الخلوي. تم توضيح خطوات مفصلة لتحفيز الخلايا، ووضع العلامات، والتثبيت، والنفاذية - عند الحاجة - إلى حد الضرورة. وأخيرا، تم وصف تعليمات إعدادات قياس تدفق الخلايا لتحديد عدد الصفائح الدموية بشكل صحيح وتحليل الأحداث الإيجابية ل TF. وأخيرا، تشمل الطريقة إجراء تحضير PRP إذا كان من المقرر قياس الصفائح الصفائح الموجبة ل TF في الصفائح المعزولة. ونظرا لأن مجموعة فرعية فقط من الصفائح الدموية تحتوي على TF، فمن المهم التأكد من عدم فقدان هذه الصفائح أثناء خطوات الطرد المركزي المطلوبة للحصول على PRP.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عامل النسيج (TF)، وهو بروتين جليكوبروتين عابر للغشاء ومنشط رئيسي لسلسلة تجلط الدم، يعبر عنه بواسطة مجموعة فرعية، ~20٪-30٪، من الصفائح الدموية البشرية^{المتداولة 1}، خصوصا تلك التي تكون أكبر^{حجما 2}. عند تفعيل الصفائح الدموية بواسطة منبهات الصفائح الكلاسيكية مثل ثنائي الفوسفات الأدينوزيني (ADP) والثرومبين، تكشف الصفائح الصفائح الدموية النشطة وظيفيا على سطحها بطريقة تعتمد على التركيز، مما يسمح لها بالارتباط بالعامل VII/VIIa، مما يؤدي في النهاية إلى توليد الثرومبين 1,3,4,5,6. ومن الجدير بالذكر أنه في الحالات المرضية مثل مرض الشريان التاجي (CAD)⁷، وعدوى متلازمة الشرايين الحادة الشديدة - فيروس كورونا 2 (SARS-CoV-2)⁸ - والصداع النصفي مع الهالة المرتبطة بالثقبة البيضاوية الواضحة (MHA-PFO⁾⁹ والسرطان¹⁰ والإنتان¹¹ - يزداد عدد الصفائح الدموية الموجبة للشريان التاجي بشكل ملحوظ، مما يساهم في زيادة خطر الجلطات الملحوظة في هذه البيئات السريرية.

على الرغم من هذه الأدلة القوية، لا يزال اكتشاف الصفائح الدموية الموجبة للجدوى الخالية من الفصيحات موضوع نقاش داخل المجتمع العلمي ^6,12,13. تم اقتراح تحديات منهجية، بما في ذلك المتغيرات التحليلية المسبقة، وتحضير العينة، وخصوصية الأجسام المضادة، كأسباب محتملة للنتائج المتناقضة المبلغ عنها في الأدبيات 2,4,12,14. لذلك، من الضروري وضع اختبار موحد قائم على بروتوكول محدد جيدا لقياس الفصائل الدموية في الصفائح الدموية البشرية.

في هذا السياق، يعد قياس تدفق الدم الكامل هو التقنية الوحيدة التي تسمح بتحليل الصفائح الدموية الموجبة من الفصائل الدموية مع التعامل مع العينة بأقل قدر ممكن، وهو أمر بالغ الأهمية لتجنب فقدان هذه الفئة الفرعية.

في هذا المقال، نقترح بروتوكولا لقياس التنين السميك المرتبط بالصفائح الدموية باستخدام قياس تدفق الدم الكامل، حيث يقيم البروتين (1) داخل الخلية في ظروف الراحة و(2) على سطح الخلية في كل من الراحة والنشطة. كما يتم تقديم تعليمات إذا كان هناك حاجة لتقييم الصفائح الدموية الموجبة للصفائح الدموية في بلازما غنية بالصفائح الدموية (PRP).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات في المؤسسة (رقم 70/24، CE 18.06.24)، وتم الحصول على موافقة مكتوبة مستنيرة من جميع المتبرعين بالدم. سيرشد البروتوكول المستخدم عبر سبع خطوات رئيسية (الشكل 1). الخطوة الأولى تتعلق بإجراء أخذ عينات الدم. توضح الخطوتان 2 و3 بروتوكول تعرية الأجسام المضادة وتحضير العينة لتحليل تعبير الأجسام الخالية من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة داخل الخلية باستخدام جسم مضاد وحيد النسيلة (mAb) موسوم ب αCD142/HTF1 ب phycoerythrin (PE). تصف الخطوة 4 بروتوكول تقييم البروتين المكشوف على سطح الصفائح الدموية باستخدام طريقة تلوين غير مباشرة باستخدام αCD142/HTF1 mAb. بسبب العائق الفضائي للفلوروكروم، فإن mAb الموسوم ب PE المستخدم في التلوين داخل الخلايا لا يرتبط بالمجال التحفيزي للبروتين المكشوف على السطح. لذلك، يقترح بروتوكول للتلوين غير المباشر باستخدام mAB ثانوي موسوم ب Alexa Fluor 633. تفصل الخطوتان 5 و6 مراحل تحليل التدفق الخلوي. تحدد الخطوة الأخيرة إجراء تحضير البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) لتجنب فقدان المجموعة الفرعية الكبيرة من الصفائح الدموية. تفاصيل المواد والكواشف المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. انسحاب الدم

ملاحظة: يجب إجراء جمع دم الإنسان فقط بعد الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات.

جمع عينات دم عن طريق أخذ عينات من الأوردة الطرفية أو القنية الإبرية من ذراع غير متأثرة بحقن الأوردة الطرفية، ويفضل أن يكون ذلك من الوريد الأمامي.
1. لأخذ عينات وريدية محيطية، ضع الرباط الضواب، وبعد إدخال إبرة فراشة G19 في الوريد، قم بإزالتها لمنع تنشيط الصفائح الدموية (الشكل 2).
  ملاحظة: لا تستخدم إبرة فراشة أصغر من G21 لتجنب تنشيط الصفائح الدموية.
2. لأخذ عينات وريدية باستخدام إبرة-كانيولا، لا تضع الرباط الضواض في أي وقت أثناء العينة. إذا لزم الأمر، اغسل العينة بمحلول ملحي بنسبة 0.9٪ قبل أخذها. دائما تخلص من أول 5 مل من الدم قبل البدء في ملء الأنابيب.
اسحب 2 مل من الدم في مكنسة كهربائية EDTA (لاستخدامها في عد خلايا الدم). اخلط الأنبوب بلطف ثلاث مرات لضمان خلط كامل للدم مع مضاد التخثر.
سحب الدم في مكبس سترات الصوديوم بحجم 0.129 M لتحليل تعبير الصوتيليات المرتبطة بالصفائح الدموية. املأ المكنسة الكهربائية بعناية إلى المستوى المحدد للحفاظ على نسبة الدم إلى مضادات التخثر الصحيحة. قم بقلب الأنابيب بلطف خمس مرات لضمان خلط الدم مع مضاد التخثر، مما يمنع تكون الجلطات وتحلل الدم.
ملاحظة: يوصى باستخدام مضاد تخثر سترات 0.129 مولار لتحسين الكشف عن القناع السميك المرتبط بالصفائح الدموية مع نسخة HTF1 من αCD142 mAb. إذا كان من الضروري عزل الصفائح الدموية من الدم الكامل، استخدم مكعبا ثانيا بسعة 0.129 مليون سترات الصوديوم لتحضير بلازما غنية بالصفائح الدموية (PRP).
حافظ على المكنسة الكهربائية في حامل أنابيب. لا تهزها على الألواح الدوارة أو المائلة، وتجنب أنظمة النقل الهوائية. لا تضع عينات الدم في الثلاجة لمنع تنشيط الصفائح الدموية.
ملاحظة: يفضل معالجة عينات الدم خلال 15 دقيقة بعد الانسحاب إذا كان من المقرر قياس علامة تنشيط الصفائح الدموية المرتبطة بالحبيبات مع النسيج الصفائحي. وإلا، يجب معالجة العينات في موعد لا يتجاوز 3 ساعات من الجمع (الشكل 3).

2. معايرة الجسم المضاد المضاد للاستواء الفصيلي (لتقييم الأجسام الخالية من الطيور داخل الخلية)

ملاحظة: يتم تحديد النسيج السميك المخزن داخل الخلايا باستخدام مقياس PE-αCD142/HTF1 mAb.

معايرة الأجسام المضادة باستخدام الخرز
ملاحظة: يسمح استخدام الخرزات بتحديد الكمية الصحيحة من الأجسام المضادة المستخدمة (أي تركيز الأجسام المضادة الذي ينتج أكبر فصل بين ذروات التألق بين العينات الموجبة والسالبة). يتم إجراء هذا التحليل باستخدام عينتين، واحدة إيجابية حقا والأخرى سلبية حقا. لا يتم الإبلاغ عن تركيز الأجسام المضادة من قبل الشركة المصنعة (انظر جدول المواد)، لذا يتم معايرة الأجسام المضادة باستخدام خمس نقاط تخفيف.
1. قم بطرد المركزي بجسم مضاد عند 17,000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. لتحضير نقاط تخفيف الأجسام المضادة الخمس، يتم قذف 40 ميكرولتر من الجسم المضاد في أنبوب 1 و20 ميكرولتر من PBS في الأنابيب من 2 إلى 5. قم بأربعة تخفيف متتالية بنسبة 1:2 بنقل 20 ميكرولتر من الأنبوب 1 إلى الأنبوب 2 ثم الاستمرار في ذلك.
2. جهز أنبوب اختبار لكل حجم من الأجسام المضادة للاختبار. أضف قطرة واحدة من الخرزات السلبية وقطرة واحدة من الخرزات الإيجابية إلى كل أنبوب اختبار. أضف 20 ميكرولتر من كل تخفيف للأجسام المضادة إلى أنبوب الاختبار والدوامة فورا. حضن في الظلام ودرجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
3. أضف 1 مل من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة حموضة 7.4، إلى كل أنبوب ودوامة.
4. احصل على العينات على جهاز قياس التدفق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وسجل ملف بيانات يحتوي على 10,000 حدث في بوابة "الخرز". التركيز الأمثل للأجسام المضادة هو الذي يوفر أكبر فصل بين الذروات الموجبة والسالبة.
تعقيم الأجسام المضادة على الصفائح الدموية
ملاحظة: كقاعدة عامة، يجب التحقق من التركيز الأمثل للأجسام المضادة التي تم تحديدها باستخدام الخرزات على الخلايا المصبوغة - في هذه الحالة، الصفائح الدموية في الدم الكامل.
1. التثبيت
  1. اقلب مكبس الصوديوم سترات بلطف خمس مرات لخلط الدم مع مضاد التخثر جيدا. انقل 50 ميكرولتر من الدم إلى أنبوب بسعة 1.5 مل، أضف 950 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالديهايد (PFA)، اخلط برفق، وحضن العينة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. قم بطرد المركزي بالعينة عند 1,500 × جرام لمدة 5 دقائق مع الفرامل ودرجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإزالة المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة عن طريق التوصيل بلطف بأنبوب 1 مل من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg^{++، بدرجة}حموضة 7.4.
2. النفاذية
  1. جهز أنبوبا واحدا لكل حجم من الأجسام المضادة سيتم اختباره (اختبر الحجم المرتبط بمعايرة الخرزات مع تخفيف أعلى وأقل، مثل 10 ميكرولتر، 5 ميكرولتر، 2.5 ميكرولتر إذا كان الحجم المحدد 5 ميكرولتر) وأنبوب واحد للتحكم بالفلورة ناقص واحد (FMO).
  2. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من الدم الثابت في كل أنبوب وقم بطرد مركزه بضغط 1500 x g لمدة 5 دقائق مع الفرامل في درجة حرارة الغرفة.
  3. قم بإزالة السوبرناتان، وأعد تعليق الحبيبة في 100 ميكرولتر من 0.1٪ تريتون-PBS لنفخ العينات، وحضن الحبيبة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
3. التلوين
  1. قم بطرد الأجسام المضادة بقوة 17,000 × جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أضف حجم الأجسام المضادة المطلوبة إلى كل أنبوب اختبار كما هو محدد في 2.2.2.1 وامزج.
  2. حضن العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام ودرجة حرارة الغرفة.
  3. أضف 300 ميكرولتر من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة حموضة 7.4، إلى كل أنبوب وامزج. احصل على العينات من جهاز قياس التدفق الخلوي (انظر الخطوة 5).
  4. احسب مؤشر الصبغة وفقا للصيغة^{التالية 15}:
    
    حيث أن MFI_pos هو متوسط شدة التألق للأحداث الإيجابية، وMFI_السالي هو الانحراف المعياري للأحداث السلبية، وSD هو الانحراف المعياري للمجموعة السالبة.
  5. اختر أدنى تركيز للأجسام المضادة الذي يوفر أعلى مؤشر صبغة.
    ملاحظة: في الظروف التجريبية الحالية، يتم تحقيق أعلى مؤشر صبغة ل PE-αCD142/HTF1 mAb باستخدام 5 ميكرولتر من الأجسام المضادة.

3. تحضير العينة لتحليل تدفق الخلايا لتعبير التيار الفصيلي داخل الخلايا

تثبيت الدم الكامل والنفاذية
1. لتحليل الفصيلة الرمادية داخل الخلية، قم بتثبيت واختراق الدم الكامل وفقا للإجراء الموضح في الخطوة 2.
إجراء التلوين
ملاحظة: في البروتوكول التالي، يتم تحديد مجموعة الصفائح الدموية باستخدام صبغة αCD61-PerCP. يمكن استخدام علامات السكان الأخرى حسب تقدير المشغل.
1. جهز أنبوبا واحدا للتحكم في فلورية ناقص واحد (FMO) وأنبوبا واحدا لصبغ الفلورة التي. أضف 100 ميكرولتر من الدم الكامل الثابت والمنفاذ إلى كل أنبوب مع الأجسام المضادة المدرجة في الجدول 1.
2. حضن العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام ودرجة حرارة الغرفة.
3. أضف 300 ميكرولتر من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة حموضة 7.4، إلى كل أنبوب وامزج. خزن العينات الملونة في الظلام حتى تحليل قياس التدفق الخلوي (انظر الخطوة 5).
  ملاحظة: لحساب مصفوفة التعويض، جهز العينات كما هو موضح في الجدول 2.

4. تحضير العينة لتحليل قياس تدفق الخلايا لتعبير الصفائح الخالية المرتبطة بسطح الخلية في الصفائح الدموية الراحة، والمنشطة.

ملاحظة: للكشف عن النسيج القرمزي المرتبط بسطح الخلية، استخدم αCD142/HTF1 mAb غير المعنون (1 ملغ/مل) وIgG مضاد للماعز أليكسا فلور 633 (2 ملغ/مل) كجسم مضاد ثانوي لاكتشاف الإشارة. يستخدم أدينوزين 5'-ديفوسفات (ADP) كمنشط للصفائح الدموية لتحفيز تعرض الفوسفات على سطح الخلية. يستخدم جسم مضاد موسوم ب PE كمؤشر لعدد الصفائح الدموية لتقليل التسرب، وسيتم فحصه من خلال تعويض الإشارة.

تلوين التوسعة
1. قم بتخفيف αCD142/HTF1 mAb بنسبة 1:100 في 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة pH 7.4، للحصول على تركيز عمل 10 ميكروغرام/مل. قم بتخفيف مادة أليكسا فلور 633 المضادة للفئران IgG 1:10 في 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة حموضة 7.4، للحصول على تركيز عمل 200 ميكروغرام/مل.
2. جهز أنابيب العينات الثلاثة ووزع 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺+، بدرجة حموضة 7.4، كما هو موضح في الجدول 3.
3. يتم توزيع 7.5 ميكرولتر من αCD142/HTF1 mAb المخفف وإضافة 5 ميكرولتر من ADP (200 ميكرومول) للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 ميكرومولار ADP. اقلب مكنسة السيترات بلطف 5 مرات لخلط الدم ومضاد التخثر جيدا، ثم قم بتوزيع 5 ميكرولتر من الدم الكامل في كل أنبوب. اخلط العينات بلطف.
4. حضن العينات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تثبيت العينة
1. تثبيت كل عينة بإضافة 300 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالديهايد (PFA) وحضن العينات لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  ملاحظة: العينات الموسومة المثبتة ب 1٪ من PFA والمخزنة عند 4 درجات مئوية تبقى مستقرة لمدة تصل إلى 4 أيام.
2. أضف 300 ميكرولتر من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، مع pH 7.4، إلى كل أنبوب وجهاز طرد مركزي بقوة 1500 x g لمدة 5 دقائق مع الفرامل عند درجة حرارة الغرفة.
3. قم بإزالة المادة الفائقة وإعادة تعليق الحبيبة في 95 ميكرولتر من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة حموضة 7.4، عن طريق التوصيل اللطيف بالماصة.
التلوين بالجسم المضاد الثانوي
1. وزع 5 ميكرولتر من مادة Alexa Fluor 633 IgG المخففة وحضن العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام عند درجة حرارة الغرفة.
2. أضف 300 ميكرولتر من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، مع pH 7.4، إلى كل أنبوب وجهاز طرد مركزي بقوة 1500 x g لمدة 5 دقائق مع الفرامل عند درجة حرارة الغرفة. إزالة المادة الفائقة وأعد تعليق الحبيبة في 95 ميكرولتر من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة حموضة 7.4.
3. قم بتوزيع 5 ميكرولتر من αCD41-PE في كل أنبوب (انظر الجدول 4). حضن العينات لمدة 15 دقيقة في الظلام ودرجة حرارة الغرفة.
4. أضف 300 ميكرولتر من 1x PBS بدون Ca⁺⁺ و Mg⁺⁺، بدرجة حموضة 7.4، إلى كل أنبوب وامزج.
5. خزن العينات الملونة في الظلام حتى تحليل قياس التدفق الخلوي (انظر الخطوة 6).
  ملاحظة: لحساب مصفوفة التعويض، جهز العينات وفقا للخطوات 4.1-4.3 وكما هو موضح في الجدول 5 والجدول 6.

5. تحليل تدفق الخلايا لتعبير التيار الخلوي الزائل داخل الخلية

ملاحظة: الإجراء التالي يشير إلى الاقتناءات على جهاز قياس تدفق التدفق المرجعي؛ لذا، يجب اعتبار المواقع والمخططات المبلغ عنها تمثيلية. يمكن تطبيق البروتوكول على أي جهاز قياس تدفق خلوي عالي الحساسية من الجيل الجديد. شغل مقياس التدفق الخلوي قبل التقاط العينة بفترة كافية لضمان استقرار الليزر. غسل السائل وخلية التدفق جيدا، حيث أن الصفائح الدموية صغيرة، وقد يتداخل أي حطام خلوي مع رؤية تجمع الصفائح الدموية في منطقة التشتت الأمامية/منطقة التشتت الجانبي (مخطط نقاط FSC-A/SSC-A). قم بإجراء مراقبة الجودة باستخدام خرز QC وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وغسل السوائل مرة أخرى لإزالة أي خرزات متبقية.

إعداد الاستحواذ
1. أنشئ مخطط نقاط FSC-A/SSC-A على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث (الشكل 4A). أنشئ مخطط نقطتي CD61-A/SSC-A على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث (الشكل 4B).
2. اضبط كسب PE (Y-585) وPerCP (B690) حسب مراقبة الجودة اليومية. اضبط العتبة تقريبا إلى 2000 في SSC-H وإلى 1000 على PerCP (B690-H) لرؤية تجمع الصفائح الدموية. اضبط معدل التدفق على منخفض.
3. ارسم منطقة بين 10³ و10⁵ تسمى "CD61⁺" لتحديد عدد الصفائح الدموية.
4. احصل على ضوابط ذات صبغة واحدة لحساب مصفوفة التعويض ثم الحصول على العينات. سجل ملف بيانات يحتوي على 10,000 حدث داخل بوابة "CD61⁺" (الشكل 4D,E). ابدأ بتسجيل 5-10 ثوان بعد بدء جمع العينات.

6. تحليل قياس تدفق الخلايا لتعبير TF السطحي

اصنع مخطط نقاط FSC-A/SSC-A على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث (الشكل 5A)، ومخطط نقاط CD41-A/SSC-A على مقياس لوغاريتمي يعرض جميع الأحداث (الشكل 5B).
قم بضبط زيادة Alexa Fluor 633 وزيادة PE (Y-585) وفقا لمراقبة الجودة اليومية، وضبط العتبة تقريبا إلى 1000 في SSC-H وإلى 2500 على PE (Y585-H) لرؤية تجمع الصفائح الدموية كما هو موضح في الشكل 5B. اضبط معدل التدفق على منخفض.
ارسم منطقة بين 10⁴ و10⁵ تسمى "CD41⁺" لتحديد عدد الصفائح الدموية.
احصل على ضوابط ذات صبغة واحدة لحساب مصفوفة التعويض ثم الحصول على العينات. سجل ملف بيانات يضم 10,000 حدث داخل بوابة "CD41⁺" (الشكل 5D,E). ابدأ بتسجيل 5-10 ثوان بعد بدء جمع العينات.

7. تحليل الصفائح الدموية الموجبة ل TF في البلازما الغنية بالصفائح الدموية

تحضير بلازما غنية بالصفائح الدموية (PRP)
ملاحظة: يجب إجراء عزل الصفائح الدموية في درجة حرارة الغرفة لمنع تنشيط الخلايا. تأكد من أن درجة حرارة الكواشف والأجهزة بين 18 °م و22 °م. تجنب التوصيل السريع والهز القوي طوال الإجراء.
1. اخلط بلطف مكنسة الصوترات الصوديوم بسعة 0.129 M خمس مرات وقس عدد الصفائح الدموية مرتين على عداد خلايا الدم لحساب نسبة الصفائح المستشفة.
  ملاحظة: استخدم القيمة المتوسطة للحدتين كتركيز الصفائح الدموية.
2. قم بعمل جهاز الطرد المركزي بمكبس سترات الصوديوم بوزن 0.129 ميل على 100 × جم لمدة 10 دقائق بدون فرامل، في درجة حرارة الغرفة (الشكل 6). اجمع PRP الحاصل عليه، وانقله إلى أنبوب بولي بروبيلين بسعة 10 مل، وسجل الحجم الذي تم جمعه.
  ملاحظة: لا تستخدم أنابيب البوليسترين لتجنب تنشيط الصفائح الدموية.
3. عد الصفائح الدموية مرتين في PRP باستخدام عداد خلايا الدم واحسب نسبة تعافي الصفائح الدموية كما يلي:
  
  ملاحظة: إذا كان التعافي أقل من 65٪، فإن عدد الصفائح الدموية لا يمثل ذلك بالكامل في الدم الكامل. فكر في التخلي عن التحضير.
تحضير العينة لتحليل تدفق الخلايا لتعبير الألياف البيضاء داخل الخلايا والسطح في PRP
1. لتحليل تعبير الخلايا الخالية من الدم المرتبط بالسطح في PRP، استخدم نفس البروتوكول الموضح لتحليل الدم الكامل (انظر الخطوات 3-6).

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم وصف ملخص لتحليل تعبيرات الألياف الصلبية المرتبطة بالصفائح الدموية في مخطط التدفق الموضح في الشكل 1. تشمل الخطوات: (1) جمع الدم: جمع الدم من الوريد المحيطي البشري، ويفضل أن يكون من الوريد الأمامي، باستخدام إبرة الفراشة G19 أو إبرة-كانيولا بدون رباط ضاغط وباستخدام مكعبات تحتوي على مضادات تخثر. (2) معالجة العينات: معالجة العينات وفقا لنوع تقييم TF الذي سيتم إجراؤه. (3) وضع علامات على العينة: وضع علامات على العينات بأجسام مضادة محددة. (4) تحليل تدفق الخلايا الخلوية: تحليل العينات للكشف عن الألياف السطحية وداخل الخلية.

أثناء سحب الدم، يجب إيلاء اهتمام خاص لتجنب تنشيط الصفائح الدموية. لهذا الغرض، يتم اتباع تدقيقين: إزالة الرباط الضواقي بعد وقت قصير من إدخال الإبرة في الوريد، والتخلص من الدم في أول مكنسة كهربائية يتم سحبها. بدون استخدام الرباط الضيق، فإن مجموعة الصفائح الدموية، المعروضة في مخطط نقاط FSC-A/SSC-A، لها شكل نموذجي، كما هو موضح في الشكل 2A. وعلى العكس، مع استخدام العاصفة الضغطية، تؤدي الخصائص الفيزيائية لمجموعة الصفائح الدموية إلى شكل طويل يشبه الشكل الذي يلاحظ بعد التحفيز باستخدام منبه الصفائح الكلاسيكية مثل ADP (الشكل 2B,C).

أظهرت التجارب التي أجريت لتقييم استقرار تعبير الصفائح الدموية المرتبطة بالصفائح الدموية مع مرور الوقت أنه كان مستقرا لمدة 3 ساعات من جمع الدم (الشكل 3). عند الجمع بين قياس تعبير الصفائح الدموية مع مؤشر تنشيط الصفائح الدموية مثل P-selectin، ينصح بمعالجة عينة الدم في أسرع وقت ممكن لتجنب تقشر الصفائح الدموية.

لتحليل الدهون الخالية المخزنة داخل الخلية، يتم تثبيت الدم الكامل في 1٪ من PFA، ثم يتم اختراقه ب PBS-Triton، ثم يصبغ بجسم مضاد موسوم ب PE. يتم تحديد تجمع الصفائح الدموية على مخطط لوغاريتمي FSC-A/SSC-A (الشكل 4 A,D) وبواسطة صبغة αCD61 mAb (الشكل 4 B,E). أظهرت نتائج تحليل الصفائح الدموية داخل الخلايا لدى الأشخاص الأصحاء (n = 377) أن الصفائح الدموية موجودة ضمن 26.8٪ ± 4.8٪ من الصفائح الدموية المتداولة (الشكل 4F).

تم إجراء تحليل تدفق الخلايا لتعبير الألياف الطيبية المرتبط بالسطح في ظروف الراحة وبعد تحفيز الخلايا باستخدام ADP 10 ميكرومول. تم تحديد مجموعة الصفائح الدموية الكاملة، الموسومة ب αCD41 mAb، في مخطط لوغاريتمي FSC-A/SSC-A (الشكل 5A,B). أظهرت النتائج أنه في الأشخاص الأصحاء (n = 377)، يعبر عن TF ب 2.8٪ ± 1.4٪ من الصفائح الدموية أثناء الراحة (الشكل 5D-F) ويزداد حتى 24.5٪ ± 5.8٪ عند التنشيط (الشكل 5G-I). يعبر عن TF بواسطة مجموعة الصفائح الدموية ذات الحجم الأكبر (الشكل 5D، G، النقاط الخضراء). علاوة على ذلك، يبرز التحليل عبر تصوير التدفق الخلوي أن إشارة TF ترتبط فقط بαCD61 الإيجابية وليس بأحداث αCD45 الإيجابية (الشكل 7).

كما ذكر سابقا، يتم تخزين الصفائح الدموية في مجموعة فرعية من الصفائح الدموية تتميز بأكبر حجم داخل جميع السكان. لذلك، من المهم عدم فقدان هذا الجزء من الصفائح الدموية أثناء تحضير PRP. وفقا للمؤشرات المقدمة في قسم الطريقة (الخطوة 7)، من الممكن عزل مجموعة من الصفائح الدموية داخل PRP تمثل تلك الموجودة في الدم الكامل. كما هو موضح في الشكل 6، فإن رسم النقاط لتدفق الخلايا لمجموعة الصفائح الدموية التي تم الحصول عليها بواسطة 100 x جرام من الطرد المركزي في الدم الكامل مشابه جدا لمخطط الدم الكامل من حيث توزيع FSC (الشكل 6 A,B). وعلى النقيض من ذلك، باستخدام قوة أعلى ووقت طرد مركزي أطول، كما هو موضح غالبا في الأدبيات¹²^، ¹⁴^، فإن مجموعة الصفائح الدموية المستخرجة لديها مستوى أقل من الصفائح الدموية السليمة (الشكل 6C)، مما يشير إلى فقدان الصفائح الدموية الأكبر حجما، وهي تلك التي تكون عالية إيجابية لمقاومة الفصيح.

figure-results-1
الشكل 1: مخطط تخطيطي لتحليل تعبير الصفائح الدموية المرتبط بالصفائح الدموية وعزل الصفائح الدموية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-2
الشكل 2: مخططات الكثافة التمثيلية لمجموعة الصفائح الدموية التي تم تحليلها بواسطة قياس تدفق الدم الكامل. (أ) تحليل مجموعة الصفائح الدموية في عينة دم مأخوذة بدون رباط ضاغط أو (ب) باستخدام الرباط الضوابط. (ج) تم الإبلاغ عن صفائح الدموية التي تحفز بواسطة ADP للمقارنة. الخلايا البيضاء (WBC): خلايا الدم البيضاء؛ كريات الدم الحمراء: خلايا الدم الحمراء. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: استقرار تعبير الألياف الزرقاء المرتبطة بسطح الخلية مع مرور الوقت. تم تحليل تعبير الصفائح الدموية الطارئة المرتبط بالصفائح الدموية في 4 نقاط زمنية مختلفة بعد سحب الدم تم الإبلاغ عنه في المحور x كما يلي: T0 = مباشرة بعد جمع الدم؛ T1 = ساعة واحدة بعد جمع الدم; T2 = ساعتان بعد جمع الدم؛ T3 = 3 ساعات بعد جمع الدم. يتم الإبلاغ عن البيانات كمتوسط ± SD، n = 3. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: تحليل قياس تدفق الخلايا التمثيلي لألياف التدفق المخزنة داخل الخلية. يتم تحديد تجمع الصفائح الدموية (الأحمر) في الدم الكامل في مخطط نقطة FSC/SSC-A (A,D) وبواسطة صبغة αCD61 mAb (B,E). يتم تحليل تعبير TF باستخدام PE- αCD142/HTF1 mAb (نقاط خضراء). تستخدم مخططات الهيستوجرام لتحديد الأحداث السلبية (C) والإيجابية (F). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تحليل قياس خلوي التدفق التمثيلي للصفيحات الموجبة المرتبطة بالسطح. يتم وسم الدم الكامل الطازج ب αCD142/HTF1 mAb، ثم يثبت ب 1٪ من PFA ويصنف ب mAB الثانوي وαCD41 mA. يتم تحديد عدد الصفائح الدموية (الأحمر) في الدم الكامل في مخطط نقطة FSC/SSC-A (A,D,G) وبواسطة صبغة αCD41 mAb (B,E,H). يتم قياس تعبير الألياف في حالة الراحة (D-F) وبعد تحفيز ADP (G-I) عن طريق الوسم ب αCD142/HTF1 mAb (نقاط خضراء). يتم الإبلاغ عن مخططات مخططية تمثيلية لعينات سالبة (C) وإيجابية (F,I). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-6
الشكل 6: تأثير قوى الطرد المركزي المختلفة على تحضير PRP. (A-C) تحليل تدفق الخلايا لمجموعة الصفائح الدموية في الدم الكامل، PRP المحضر عند 100 x g و350 x g. النطاق المرجعي لعدد الصفائح الدموية على FSC-H/SSC-H يشار إليه بخطوط منقطة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-7
الشكل 7: تقييم تعبير الكرية البيضاء في الصفائح الدموية وكريات الدم من خلال تصوير قياس تدفق القلب. تعرض صور القنوات التمثيلية لبرايت فيلد (BF، رمادي)، عامل النسيج (TF، أخضر)، αCD61 (أحمر)، αCD45 (رمادي)، تلوين النوى ب Hoechst (ماجنتا)، والصورة المركبة (الدمج)، التي تم الحصول عليها بتكبير 60 مرة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

معرف الأنبوب العينة	تصحيح/تصحيح الدم الكامل (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
FMO	100	-	15
TF	100	5	15

الجدول 1: بروتوكول التلوين لتحليل تدفق الخلايا الخلوية لتعبير الألياف الخالية داخل الخلية.

معرف الأنبوب العينة	تصحيح/تصحيح الدم الكامل (μL)	αCD142-PE (μL)	αCD61-PerCP (μL)
غير ملطخة	100	-	-
αCD142-PE	95	5	-
αCD61-PerCP	85	-	15

الجدول 2: التحكم بصبغة واحدة لمصفوفة تعويض تعبير النسيج الفصيلة داخل الخلية.

معرف الأنبوب العينة	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	دم كامل طازج (μL)	PFA 1٪ (μL)
FMO	95	-	-	5	300
الراحة	87.5	7.5	-	5	300
تفعيل ADP	82.5	7.5	5	5	300

الجدول 3: بروتوكول التلوين لتحليل قياس التدفق الخلوي لتعبير TF السطحي.

معرف الأنبوب العينة	PBS 1x (μL)	أليكسا فلور 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
FMO	90	5	5
الراحة	90	5	5
تفعيل ADP	90	5	5

الجدول 4: بروتوكول تلوين الأجسام المضادة الثانوي لتحليل الأجسام الخالية المرتبطة بالسطح.

معرف الأنبوب العينة	PBS 1x (μL)	αCD142 (μL)	ADP (μL)	دم كامل طازج (μL)	PFA 1٪ (μL)
غير ملطخة	90	-	5	5	300
TF + أليكسا فلور 633 IgG	82.5	7.5	5	5	300
αCD41-PE	90	-	5	5	300

الجدول 5: تحضير مصفوفة التعويض لتحليل الفروع الخلفية داخل الخلية.

معرف الأنبوب العينة	PBS 1x (μL)	أليكسا فلور 633 IgG (μL)	αCD41-PE (μL)
غير ملطخة	100	-	-
TF + أليكسا فلور 633 IgG	95	5	-
αCD41-PE	95	-	5

الجدول 6: تحضير مصفوفة التعويض لتحليل الألياف الأرضية المرتبطة بالسطح.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المخطوطة بروتوكولات مفصلة لتقييم الصفائح الدموية الموجبة لتكوين الصفائح الدموية الموجبة من خلال قياس تدفق الدم الكامل، مع الأخذ في الاعتبار تحليل البروتين المعبر عنه داخل وعلى سطح الصفائح الدموية.

خلال العشرين سنة الماضية، تم ترسيخ وجود الصفائح الدموية في الصفائح الدموية البشرية بشكل جيد 1,2,3,4,5,17,18. تعبر مجموعة فرعية من الصفائح الدموية، تمثل 20٪-30٪ من إجمالي تجمع الصفائح الدموية^{المتداولة 2}، مما يعزز مفهوم التغاير في الصفائح الدموية الذي أصبح أكثر أهمية في المجال^19,20. ومن الجدير بالذكر أن الصفائح الصفائح الموجبة ل TF لها متوسط حجم صفائح معين، كما أظهر سابقا قياس تدفق التصوير^عالي الحساسية 2. من المهم جدا النظر في هذه الخاصية، خاصة عندما يجب تحليل تعبير الفصائل الدموية في الصفائح الدموية المعزولة عن مكونات خلايا الدم الأخرى. من الممكن بالفعل أن تؤدي خطوة الطرد المركزي المستخدمة لعزل الصفائح الدموية إلى فقدان الصفائح الدموية الكبيرة^{الحجم 2}. هذه المسألة التحليلية ربما تكون أحد الدوافع الرئيسية للجدل - الذي استمر حتى قبل بضع سنوات - حول وجود TF في الصفائح الدموية ^7,12,13. يعد قياس تدفق الدم الكامل نهجا مفيدا للغاية في هذا الصدد، حيث يسمح بتحليل جميع مجموعات الصفائح الدموية دون الحاجة إلى عزلها.

سبب ثان أثار النقاش حول وجود التلوين في الصفائح الدموية هو اختيار الجسم المضاد المضاد للبشرية من الصفائح الدموية المستخدمة في التحليل. هناك العديد من الأجسام المضادة المتوفرة تجاريا والتي استخدمت لتقييم الأجسام الزائدة المرتبطة بالصفائح الدموية وتتعرف على الحواتم المختلفة للبروتين. بعض الأجسام المضادة، مثل TF9-10H10 3,21,22 ونسخ VIC7 ^1,3، ترتبط بمنطقة غير وظيفية من TF دون التأثير على ارتباط FVII/FVIIa. تتعرف الأجسام المضادة الأخرى، بما في ذلك VD8 ^1,2,3 ونسخ HTF1¹⁸ - التي تستخدم في البروتوكولات الحالية - على الموقع التحفيزي للبروتين، مما يتنافس مع FVII/FVIIa على الارتباط ب TF، مما يمنع وظيفته في التخثر. من المهم ملاحظة أنه، اعتمادا على حالة الجليكوزيل في المجال خارج الخلوي وعلى تكوين الموقع التحفيزي ل TF²³، والذي يمكن تعديله في ظروف معينة (مثل تنشيط الخلايا أو المرض)، قد تكون بعض هذه الأجسام المضادة قادرة تفريقيا على التعرف على التعبير السطحي للجليكوزيل المرتبط بالصفائح الدموية المرتبطة بالصفائح الدموية. علاوة على ذلك، يمكن أن تؤثر ظروف التلوين، أي ما إذا كانت العينة التي سيتم تحليلها حديثة أو ثابتة و/أو منفذة، على تكوين الحواتم وبالتالي ارتباط المستضد بالأجسام المضادة¹⁴.

اعتبار آخر يستحق الانتباه هو اختيار الفلوروكروم المرتبط بالجسم المضاد. نظرا لأن الفلوروكروم منخفضة الانبعاث، مع استخدام مقاييس تدفق منخفضة الحساسية، قد لا تكون مناسبة لتمييز الإشارات الإيجابية المنخفضة. لهذا السبب، يفضل استخدام الأجسام المضادة الموسومة بالفلوروكروم الزاهي، مثل PE أو APC. من المهم ملاحظة، مع ذلك، أن الحجم الكبير لفلوروكروم مثل PE يمكن أن يعيق ارتباط الجسم المضاد الموسوم بالبروتين²⁴. لتجاوز هذه المشكلة، في البروتوكول الحالي، تم إجراء تلوين TF على السطح كوضع وسم غير مباشر مع αCD142/HTF1 mAb غير متقارن، ثم كشف باستخدام جسم مضاد ثانوي. العائق الهوائي الهوائي لا يؤثر على ارتباط αCD142/HTF1 mAb ب TF المخزن داخل الخلية حيث يكون الموقع التحفيزي أكثر سهولة لارتباط الأجسام المضادة. من الواضح أن تقييم التعبير السطحي للألياف الصلصية المرتبطة بالصفائح الدموية عن طريق الوسم المباشر مقارنة بالوسم غير المباشر، سيكون مفضلا - إذا أمكن - لتقصير وقت معالجة العينة. ومع ذلك، يجب أن يأخذ هذا النهج في الاعتبار القضايا الحرجة المذكورة أعلاه المتعلقة بقدرة ارتباط الأجسام المضادة التجارية المتوفرة بالصفائح الدموية الخالية من الصفائح، بسبب تكوين البروتين نفسه، أو ظروف التلوين، بالإضافة إلى العوائق العقيمة الناتجة عن الفلوروكرومات المختلفة المستخدمة. لذلك، لتجنب النتائج السلبية الكاذبة، يتطلب وضع العلامات المباشرة على الصفائح الدموية المرتبطة بالصفائح الدموية المعبر عنها على السطح عملية تحسين دقيقة إلزامية. هذه الجوانب هي موضوع دراسة جارية تهدف إلى تقييم كفاءة التلوين المباشر باستخدام نسخ الأجسام المضادة المتاحة تجاريا الموسومة بالفلوروكروم المستخدمة.

أظهرت عدة دراسات أن تعبير الفصيلة البيضاء مرتفع في حالات مرضية مختلفة تتميز بخطر مرتفع للجلطات 8,9,10,11,17. مؤخرا، تم تقديم أدلة على أن مستويات الصفائح الدموية الموجبة للغشاء السميك، التي تم قياسها بدقة من خلال تحليل قياس تدفق التومترية، يمكنها تحديد مرضى القلب الذين، رغم استجابتهم المثلى للعلاج الدوائي بالأسبرين ومضادات P2Y₁₂، يحافظون على خطر تخثر مرتفع²⁵. في الواقع، فإن الفروع الخالية المرتبطة بالصفائح الدموية نشطة وظيفيا وبالتالي قادرة على دعم جيل الثرومبين ^1,3,4. في هذا السياق، تعد القدرة على إجراء تحليل قياس تدفق الخلايا على بضعة ميكرولترات من الدم ميزة كبيرة تسمح بتوسيع تحليل النسيج السميكي المرتبط بالصفائح الدموية ليشمل البيئة السريرية. لهذا الغرض، يجدر بالذكر أن التحقق من قياس النضوض الخالية المرتبطة بالصفائح الدموية بواسطة قياس تدفق الخلايا كان هدف مشروع دولي نسقناه مؤخرا، بدعم من الجمعية الدولية للدموية والجلطة، لتقديم إرشادات منهجية لتقييمه.

على عكس العلامات الكلاسيكية الأخرى لتنشيط الصفائح الدموية، مثل تجمعات P-selectin والصفائح الدموية والصفائح الدموية، والتي يجب تحليلها مباشرة بعد أخذ عينات الدم لتجنب ظهور تشوهات، فإن تعبير الصفائح الدموية أكثر استقرارا بكثير. في الواقع، يمكن معالجة عينة الدم خلال بضع ساعات بعد سحب الدم دون أي تغيير كبير في تعبير الصفائح الدموية الخالية من الصفائح؛ علاوة على ذلك، فإن إمكانية تثبيت العينة ووضع العلامات/معالجتها لاحقا تجعل هذا التحليل مناسبا للعديد من المستشفيات والمختبرات. ومن الجدير بالذكر أنه، رغم أن البروتوكول الموصوف في هذه المخطوطة بسيط نسبيا في التنفيذ، إلا أن تقنية قياس التدفق الخلوي لا تزال تتطلب تدريبا تقنيا متخصصا. لهذا السبب، تتجه التكنولوجيا نحو تطوير أجهزة قياس خلوية أبسط بشكل متزايد مخصصة لاختبارات نقاط الرعاية.

في الختام، يوفر البروتوكول المقترح طرقا للتحليل الصحيح لتحليل الألياف الصلصية المرتبطة بالصفائح الدموية، مع التأكيد على مزايا تقنية تحليل تدفق الخلايا لتحديدها. بالإضافة إلى ذلك، يسلط الضوء على المتغيرات التحليلية التي يمكن أن تؤثر على تحليل هذا البروتين، مع التركيز على الإجراءات التي يجب اتخاذها لتجنبها.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب مصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم دعم هذا العمل بمنحة من وزارة الصحة الإيطالية (ريسيركا كورينتي 2023 إلى م.س.).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
أدينوزين 5'-ديفوسفات (ADP)	سيغما-ألدرتش	A-2754	منشط الصفائح الدموية
أليكسا فلور 633 ماعز وألفا-فأر IgG	إنفيتروجين	A21052	الأجسام المضادة الثانوية
أنبوب بيوتيوب 10 مل	بيوسيغما	BSP048	لجمع PRP
إبرة الفراشة G19	حل PIC	02044019030010	لسحب الدم
برنامج CytExpert	بيكمان كولتر		تحليل بيانات قياس تدفق الخلايا
سايتوفليكس إس	بيكمان كولتر		مقياس التدفق الخلوي
أنابيب إيبندورف بحجم 1.5 مل	إبندورف	1,20,086	التعلق بالدم
إيمج ستريم إكس Mk II	سايتك للعلوم الحيوية		مقياس تدفق التصوير
كالوزا سوفتوير	بيكمان كولتر		تحليل بيانات قياس التدفق الخلوي
بارافورمالديهايد	مضادات حيوية – القسم كارلو إربا ريجيانتي	387507	لإصلاح الدم والصفائح الدموية
PerCP-α CD45	BD	345809	علامة تجمع الكريات البيضاء
PerCP-α CD61	BD	347408	علامة تغذية الصفائح الدموية
PE-α CD142	BD	550312	الأجسام المضادة لعامل الأنسجة المضاد للبشر
PE-α CD41	بيكمان كولتر	A07781	علامة تغذية الصفائح الدموية
محلول ملحي لمحلول الفوسفات (PBS) مرة واحدة بدون الكالسيوم والمغنيسيوم	جيبكو	10010-015	للأجسام المضادة وتخفيف العينات
نصائح Pipet 10 وmicro; L	جيلسون	F161630	لتحضير عينات
نصائح Pipet 1000 وmicro; L	جيلسون	F161670	لتحضير عينات
نصائح Pipet 200 وميكرو؛ L	جيلسون	F161930	لتحضير عينات
أنبوب دائري قاع 5 مل	كورنينغ	352052	لاكتساب جهاز قياس تدفق الخلايا
كلوريد الصوديوم 0.9٪	BD	306575	لغسل القنية الإبرية بعد سحب الدم
سيسميكس XN-450	داسيت		محلل خلايا الدم
ترايتون X-100	كارلو إربا ريجنتي	9002-93-1	لاختراق غشاء خلايا الدم
أنابيب سيترات فاكوتينر 0.129M	BD	363079	لجمع الدم
أنابيب Vacutainer K2 EDTA	BD	368857	لجمع الدم
محول Luer متعدد عينات Vacutainer	BD	367300	لسحب الدم
حامل Vacutainer لمرة واحدة الاستخدام	BD	364815	لسحب الدم
مجموعة خرز التقاط الأجسام المضادة من Versacomp	بيكمان كولتر	B22804	تعرية الأجسام المضادة
α CD142 (نسخة مستنسخة من HTF-1)	إنفيتروجين	16-1429-82	الأجسام المضادة لعامل الأنسجة المضاد للبشر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Camera, M., et al. Platelet activation induces cell-surface immunoreactive tissue factor expression, which is modulated differently by antiplatelet drugs. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 23 (9), 1690-1696 (2003).
Brambilla, M., et al. Do methodological differences account for the current controversy on tissue factor expression in platelets. Platelets. 29 (4), 406-414 (2018).
Zillmann, A., et al. Platelet-associated tissue factor contributes to the collagen-triggered activation of blood coagulation. Biochem Biophys Res Commun. 281 (2), 603-609 (2001).
Camera, M., Brambilla, M., Toschi, V., Tremoli, E. Tissue factor expression on platelets is a dynamic event. Blood. 116 (23), 5076-5077 (2010).
Panes, O., et al. Human platelets synthesize and express functional tissue factor. Blood. 109 (12), 5242-5250 (2007).
Camera, M. Response: functionally active platelets do express tissue factor. Blood. 119 (18), 4339-4341 (2012).
Brambilla, M., et al. Tissue factor in patients with acute coronary syndromes: Expression in platelets, leukocytes, and platelet-leukocyte aggregates. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 28 (5), 947-953 (2008).
Canzano, P., et al. Platelet and endothelial activation as potential mechanisms behind the thrombotic complications of COVID-19 patients. JACC Basic Transl Sci. 6 (3), 202-218 (2021).
Trabattoni, D., et al. Migraine in patients undergoing PFO closure: Characterization of a platelet-associated pathophysiological mechanism: The LEARNER study. JACC Basic Transl Sci. 7 (6), 525-540 (2022).
Falanga, A., Schieppati, F., Russo, D. Cancer tissue procoagulant mechanisms and the hypercoagulable state of patients with cancer. Semin Thromb Hemost. 41 (7), 756-764 (2015).
Tsantes, A. G., et al. Sepsis-induced coagulopathy: An update on pathophysiology, biomarkers, and current guidelines. Life (Basel). 13 (2), 350(2023).
Osterud, B., Olsen, J. O. Human platelets do not express tissue factor. Thromb Res. 132 (1), 112-115 (2013).
Bouchard, B. A., Krudysz-Amblo, J., Butenas, S. Platelet tissue factor is not expressed transiently after platelet activation. Blood. 119 (18), 4338-4339 (2012).
Basavaraj, M. G., Olsen, J. O., Osterud, B., Hansen, J. B. Differential ability of tissue factor antibody clones on detection of tissue factor in blood cells and microparticles. Thromb Res. 130 (3), 538-546 (2012).
Maecker, H. T., Frey, T., Nomura, L. E., Trotter, J. Selecting fluorochrome conjugates for maximum sensitivity. Cytometry A. 62 (2), 169-173 (2004).
Butenas, S., Bouchard, B. A., Brummel-Ziedins, K. E., Parhami-Seren, B., Mann, K. G. Tissue factor activity in whole blood. Blood. 105 (7), 2764-2770 (2005).
Camera, M., et al. Tissue factor and atherosclerosis: Not only vessel wall-derived TF, but also platelet-associated TF. Thromb Res. 129 (3), 279-284 (2012).
Siddiqui, F. A., Desai, H., Amirkhosravi, A., Amaya, M., Francis, J. L. The presence and release of tissue factor from human platelets. Platelets. 13 (4), 247-253 (2002).
Munnix, I. C., Cosemans, J. M., Auger, J. M., Heemskerk, J. W. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb Haemost. 102 (6), 1149-1156 (2009).
Heemskerk, J. W., Mattheij, N. J., Cosemans, J. M. Platelet-based coagulation: Different populations, different functions. J Thromb Haemost. 11 (1), 2-16 (2013).
Brambilla, M., et al. Human megakaryocytes confer tissue factor to a subset of shed platelets to stimulate thrombin generation. Thromb Haemost. 114 (3), 579-592 (2015).
Vignoli, A., et al. Tissue factor expression on platelet surface during preparation and storage of platelet concentrates. Transfus Med Hemother. 40 (2), 126-132 (2013).
Rao, L. V., Kothari, H., Pendurthi, U. R. Tissue factor encryption and decryption: facts and controversies. Thromb Res. 129 (Suppl 2), S13-S17 (2012).
Vira, S., Mekhedov, E., Humphrey, G., Blank, P. S. Fluorescent-labeled antibodies: Balancing functionality and degree of labeling. Anal Biochem. 402 (2), 146-150 (2010).
Brambilla, M., et al. Cell surface platelet tissue factor expression: Regulation by P2Y(12) and Link to residual platelet reactivity. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (10), 2042-2057 (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

تصحيح

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Flow Cytometry Analysis of Tissue Factor Expression in Human Platelets
Posted by JoVE Editors on 4/09/2026. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/67356-v

تحليل تدفق الخلايا لتعبير عوامل الأنسجة في الصفائح الدموية البشرية

في هذه المقالة

إشعار تصحيح

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

تصحيح

الوسوم

مقالات ذات صلة