مقالة منهجية

تداخل الحمض النووي الريبي اليرقي في دودة القز Bombyx mori من خلال توصيل الجسيمات النانوية للشيتوسان / dsRNA

2.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67360

⸱

أكتوبر 4, 2024

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Guangzhou University

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول لتوصيل الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA في يرقات دودة القز Bombyx mori للحث على إسكات الجينات من خلال الابتلاع.

الملخص

دودة القز ، بومبيكس موري ، هي حشرة اقتصادية مهمة لها آلاف السنين من التاريخ في الصين. وفي الوقت نفسه ، فإن دودة القز هي الحشرة النموذجية ل Lepidoptera مع تراكم جيد للأبحاث الأساسية. وهي أيضا أول حشرة في حرشفيات الأجنحة مع تسلسل الجينوم الكامل وتجميعه ، مما يوفر أساسا متينا للدراسة الوظيفية للجينات. على الرغم من أن تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) يستخدم على نطاق واسع في الدراسة الوظيفية للجينات العكسية ، إلا أنه مقاوم للحرارة في ديدان القز وأنواع حرشفيات الأجنحة الأخرى. تم إجراء أبحاث ناجحة سابقة متعلقة بالحمض النووي الريبي لتوصيل الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة (dsRNA) من خلال الحقن فقط. لا يتم الإبلاغ أبدا عن توصيل dsRNA من خلال التغذية. في هذه المقالة ، نصف الإجراءات خطوة بخطوة لتحضير الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA ، والتي يتم تغذيتها ليرقات دودة القز عن طريق الابتلاع. يتضمن البروتوكول (أنا) اختيار المرحلة المناسبة من يرقات دودة القز ، (ثانيا) تخليق dsRNA ، (ثالثا) تحضير جزيئات الشيتوزان / dsRNA النانوية ، و (رابعا) تغذية يرقات دودة القز بجسيمات شيتوزان / dsRNA النانوية. يتم تقديم نتائج تمثيلية ، بما في ذلك تأكيد النسخ الجيني ومراقبة النمط الظاهري. تغذية dsRNA هي تقنية بسيطة ل RNAi في يرقات دودة القز. نظرا لأن يرقات دودة القز سهلة التربية وكبيرة بما يكفي للعمل ، فإنها توفر نموذجا جيدا لإثبات الحمض النووي الريبي اليرقات في الحشرات. بالإضافة إلى ذلك ، تحفز بساطة هذه التقنية المزيد من مشاركة الطلاب في البحث ، مما يجعل يرقات دودة القز نظاما وراثيا مثاليا للاستخدام في الفصول الدراسية.

المقدمة

دودة القز ، بومبيكس موري ، هي حشرة تم تدجينها منذ أكثر من 5000 عام في الصين. نظرا لقدرتها على إنتاج الحرير ، تعد دودة القز حشرة اقتصادية مهمة في الزراعة وتربية دودة القز الصينية. تأتي دودة القز في المرتبة الثانية بعد ذبابة الفاكهة كحشرة نموذجية. كحشرة نموذجية في حرشفيات الأجنحة ، من السهل تربية دودة القز ، مع حجم جسم كبير والكثير من المسوخ. وفي الوقت نفسه ، فإن دودة القز هي أول حشرة حرشفيات الأجنحة مع تسلسل جينومها الكامل1. تتوفر أيضا الكثير من قواعد البيانات التي توفر معلومات عن الجينوم2 ، والنسخ3 ، وعلامة التسلسل المعبر عنها (EST) 4 ، والحمض النووي الريبي غير المشفر5 ، والقمر الصناعيالصغير 6 للجمهور. الحقائق المذكورة أعلاه تجعل دودة القز نموذجا مثاليا للبحث الجيني.

تداخل الحمض النووي الريبي (RNAi) هو عملية خلوية ترتبط فيها جزيئات الحمض النووي الريبي مزدوج الشريطة (dsRNA) وتقطع الحمض النووي الريبي المرسال التكميلي (mRNA) ، وبالتالي تحقيق تأثير إسكات الجين المستهدف. هذه الآلية موجودة بشكل طبيعي في البكتيريا للدفاع ضد غزو الفيروسات7. في وقت لاحق ، وجد أن الحمض النووي الريبي محفوظ في والنباتات والميكروبات. نظرا لتأثير الإسكات القوي الخاص بالتسلسل ، يتم استخدام RNAi في البحث الأساسي لمعالجة التعبير الجيني ودراسة وظيفة الجينات. يتم تحقيق الحمض النووي الريبي من خلال توصيل dsRNA إلى الخلايا.

في الحشرات ، هناك ثلاث طرق شائعة لتوصيل dsRNA ، وهي الحقن المجهري والتغذية والنقع8. في الوقت الحالي ، يتم إجراء تقارير الحمض النووي الريبي الناجحة في ديدان القز من خلال توصيل dsRNA العاري عن طريق حقن dsRNA9. تتمثل مزايا الحقن المجهري في التوصيل الفوري ل dsRNA في الهيموليمف والتحكم الدقيق في كمية dsRNA. ومع ذلك ، توجد أيضا بعض عيوب الحقن المجهري. على سبيل المثال ، يستغرق وقتا طويلا ، ويتطلب أجهزة حساسة. من المهم أيضا تحسين إبر الحقن وحجم الحقن وكمية dsRNA. لذلك ، تصبح هناك طريقة بديلة لتوصيل dsRNA إلى ديدان القز ضرورية. نظرا لأن الهيكل الخارجي للحشرة عبارة عن حاجز محكم للماء مصنوع من الكيتين ، نادرا ما يتم الإبلاغ عن نقع يرقات الحشرات لتحقيق الحمض النووي الريبي ، وهو ليس خيارا جيدا ل RNAi في الحشرات. تغذية dsRNA موفرة للعمالة وفعالة من حيث التكلفة وسهلةالتنفيذ 10. هذه الطريقة قابلة للتطبيق أيضا على فحص الجينات عاليالإنتاجية 11. ومع ذلك ، فقد وجد أن نوكلياز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي غير المحدد ، وهو BmdsRNase ، موجود في عصير الأمعاء الوسطى والأمعاء الوسطى ليرقات دودة القز12. يظهر أن هذا النوكلياز يهضم dsRNA ، ويفضلأن يكون 13. لذلك ، يبدو أن إطعام dsRNA العاري لدودة القز لإسكات التعبير الجيني أمر صعب.

في الآونة الأخيرة ، ثبت أن dsRNA المحمي بالجسيمات النانوية بديل جيد لزيادة كفاءة RNAi عن طريق تغذية14. الشيتوزان هو بوليمر غير مكلف وغير سام وقابل للتحلل الحيوي ، والذي يمكن تحضيره عن طريق إزالة الأسيتيل من الكيتين ، وهو بوليمر حيوي طبيعي وثاني أكثر البوليمرات وفرة بعد السليلوز15. نظرا لأن المجموعة الأمينية في الشيتوزان مشحونة بشكل إيجابي ومجموعة الفوسفات الموجودة على العمود الفقري ل dsRNA مشحونة سالبا ، يمكن تشكيل الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA عن طريق التجميع الذاتي لتعددالكتلات 16. تعتبر الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA فعالة في تحقيق الحمض النووي الريبي من خلال تغذية اليرقات في البعوض الزاعجة المصرية و Anopheles gambiae17 ، ودودة اللوز المرقطة بالقطن Earias vittella18 وسوس العنكبوت القرمزي Tetranychus cinnabarinus19.

من أجل تطوير منهجية لتوصيل dsRNA عن طريق التغذية في ديدان القز لاكتساب كفاءة ناجحة للحمض النووي الريبي ، يركز هذا التقرير على وصف الإجراءات خطوة بخطوة حول كيفية تحضير الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA وتغذية الجسيمات النانوية ليرقات دودة القز. هذه المنهجية غير مكلفة نسبيا وموفرة للعمالة وسهلة المتابعة ، والتي يمكن تكييفها لدراسات إسكات الجينات في الحشرات الأخرى. نحن نهدف إلى توفير بروتوكول أسهل لطريقة توصيل الحمض النووي الريبي الحمض النووي الريبي Lepidopteran بكفاءة أعلى من RNAi.

البروتوكول

1. أنواع دودة القز وتربيتها

  1. خلف ما لا يقل عن 120 يرقات دودة القز الحديثة من B. mori P50 سلالة بأوراق التوت الطازجة عند 25 ± 1 درجة مئوية ، والفترة الضوئية 12 ساعة ضوء: 12 ساعة مظلمة ، و 75٪ ± 5٪ رطوبة نسبية.

2. اختيار يرقات دودة القز

  1. اختر اليوم الأول من يرقات الطور الخامس لتجربة الحمض النووي الريبي. تنمو يرقات دودة القز بسرعة بعد اليوم 3 من الطور الخامس ، وهو مثالي لمقارنة الاختلافات في مظهر اليرقات.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام المراحل الأصغر ، مثل الطورالثالث أو الرابع ، لتجربة RNAi. ومع ذلك ، فإنه يتطلب علاجا مستمرا ل dsRNA حتى الطور الخامس ، وهو مكلف نسبيا وتكلفة المواد.

3. تخليق dsRNA

  1. تحديد جزء هدف dsRNA: حدد تسلسل الترميز للجين المستهدف وقم بمواءمته مع الجينات المتجانسة الأخرى لتحديد المنطقة المحفوظة. تصميم بادئات خاصة بالجينات في المنطقة غير المحفوظة لتضخيم جزء الهدف dsRNA اللاحق. بالنسبة لتجارب الحمض النووي الريبي في الحشرات ، يكون الجزء المستهدف النموذجي dsRNA بشكل عام 400-600 نقطة أساس. يمكن أن يكون الحد الأدنى للحجم 200 نقطة أساس.
    ملاحظة: لتحسين الكفاءة والمعدل الناجح لتجارب RNAi ، يمكن استخدام بعض الأدوات المستندة إلى الويب لتصميم هدف dsRNA ، مثل مهندس dsRNA (https://dsrna-engineer.cn/).
  2. إنتاج قالب منتج PCR: أضف محفز بوليميراز T7 RNA (5'-TAATACGACTCACTATAGG-3') إلى الطرف 5 من أي من التمهيدي المصمم أعلاه. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي لتضخيم جزء هدف dsRNA. قم بتشغيل جل الاغاروز بنسبة 1٪ في 1x TAE للتحقق من منتج PCR واحد بالحجم المتوقع. بعد ذلك ، قم بتنقية منتج PCR باستخدام مجموعة تنقية (جدول المواد) واستخدمه للنسخ اللاحق.
    ملاحظة: لتخزين منتج PCR المستهدف على المدى الطويل والحصول على عوائد عالية ، يقترح ربط منتج PCR بالبلازميد. يجب أن يكون البلازميد خطيا قبل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
  3. توليد dsRNA: استخدم نظام T7 RNAi (جدول المواد) لتوليد dsRNA. قم بإعداد التفاعل عن طريق إضافة المكونات في درجة حرارة الغرفة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. امزج التفاعل عن طريق سحب العينة برفق واحتضانه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: لزيادة العائد إلى أقصى حد ، يمكن تمديد الحضانة عند 37 درجة مئوية حتى 2-6 ساعات. بالنسبة للقوالب التي تحتوي على بنية ثانوية أو غنية ب GC ، يمكن إجراء الحضانة عند 42 درجة مئوية بدلا من ذلك لتحسين إنتاجية dsRNA.
  4. التلدين لتشكيل dsRNA: احتضان التفاعل عند 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تبرد ببطء إلى درجة حرارة الغرفة (~ 20 دقيقة). سيؤدي ذلك إلى تلدين dsRNA.
  5. معالجة DNase و RNase: ماصة 1 ميكرولتر من محلول RNase المرفق إلى 199 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز لصنع محلول RNase مخفف حديثا. أضف 1 ميكرولتر من محلول RNase المخفف حديثا و 1 ميكرولتر من DNase الخالي من RQ1 RNase المزود لكل حجم تفاعل 20 ميكرولتر ، واخلطه برفق ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ستتم إزالة الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة (ssRNA) وقالب الحمض النووي في التفاعل بعد هذا العلاج.
  6. ترسيب الكحول: أضف حجما واحدا من الأيزوبروبانول أو 2.5 حجما من الإيثانول بنسبة 95٪ مع حجم 0.1 من أسيتات الصوديوم 3 M (درجة الحموضة 5.2) إلى التفاعل. امزج التفاعل عن طريق الدوامة واحتضانه على الجليد لمدة 5 دقائق لتشكيل كتلة غائمة. تدور بأقصى سرعة في جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق لجمع حبيبات بيضاء في الجزء السفلي من الأنبوب. تخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات ب 0.5 مل من الإيثانول البارد 70٪ لإزالة الملح المتبقي. قم بإزالة الإيثانول بعد الغسيل. اترك الحبيبات تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أعد تعليق الحبيبات بالماء الخالي من النوكلياز في 2-5 مرات من حجم التفاعل الأولي. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية أو -70 درجة مئوية.
    ملاحظة: لا ينبغي تجفيف حبيبات dsRNA بشكل مفرط ، لأن هذا قد يجعل من الصعب إعادة التعليق بالكامل. لضمان إعادة التعليق الكافي ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 2 مجلد.
  7. فحص كمية وجودة dsRNA: قم بتخفيف dsRNA في الماء الخالي من النوكلياز بنسبة 1: 100 إلى 1: 300. حدد تركيز dsRNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. لتحديد كمية dsRNA ، اضرب التركيز في الحجم. لتقييم جودة dsRNA ، استخدم الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز. قم بإعداد جل الاغاروز بنسبة 1٪ في 1x TAE وقم بتخفيف dsRNA في الساعة 1:50 بالماء الخالي من النوكلياز. استخدم 5 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المخفف لكل حارة وقم بتلطيخ الجل في 0.5 مجم / مل من بروميد الإيثيديوم لمدة 15 دقيقة على الأقل للتصور.
    ملاحظة: يهاجر dsRNA بشكل أبطأ من dsDNA.

4. تحضير الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA

  1. اصنع 100 ملي مولار من أسيتات الصوديوم (0.1 ملي كلوديوم2ساعةو 3درجةحرارة 2 و 0.1 م من حمض الأسيتيك ، ودرجة الحموضة 4.5 في الماء منزوع الأيونات) و 100 ملي مولار من كبريتات الصوديوم (100 ملي مولار Na2SO4 في الماء منزوع الأيونات) في درجة حرارة الغرفة.
  2. إذابة الشيتوزان التجاري (من قشور الجمبري ، ≥75٪ منزوعة الأسيتيل. جدول المواد) في 100 ملي مولار أسيتات الصوديوم عازلة لعمل محلول كيتوزان 0.02٪ (وزن / حجم).
  3. قم بإذابة 20 ميكروغرام من dsRNA في 50 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز وأضفه إلى 50 ميكرولتر من 100 ملي مولار من كبريتات الصوديوم لعمل محلول 100 ميكرولتر dsRNA.
  4. أضف 100 ميكرولتر من محلول الشيتوزان إلى 100 ميكرولتر من محلول dsRNA. في الوقت نفسه ، قم بإعداد عنصر تحكم عن طريق إضافة 100 ميكرولتر من محلول الشيتوزان إلى 100 ميكرولتر من 50 ملي كبريتات الصوديوم. اخلطي وسخني الخلطات على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.
  5. دوامة الخليط على الفور مع دوامة عالية السرعة لمدة 30 ثانية للسماح بتكوين الجسيمات النانوية.
  6. الطرد المركزي الخليط عند 13,000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق للحصول على حبيبات بيضاء. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل. دع الحبيبات تجف في الهواء في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
  7. تحديد تركيز dsRNA في المادة الطافية باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير الحجم (جدول المواد). استخدم المادة الطافية من عنصر التحكم كفارغة. اضرب التركيز في الحجم لحساب الكمية الإجمالية ل dsRNA المتبقية في المادة الطافية. احسب النسبة المئوية ل dsRNA المغلفة في الجسيمات النانوية بالكمية المتبقية في المادة الطافية مقسومة على الكمية الأولية ل dsRNA.
    ملاحظة: على الرغم من أنه يمكن الاحتفاظ بالجسيمات النانوية لمدة 4-37 درجة مئوية لمدة 15 يوما على الأقل قبل الاستخدام14 ، يقترح استخدام الجسيمات النانوية في أسرع وقت ممكن.

5. تغذية يرقات دودة القز بجسيمات الشيتوزان / dsRNA النانوية

  1. اختر يرقات دودة القز المبتدئة الخامسة (أي اليوم 1 من الطور الخامس) من نفس الحجم لتجربة التغذية. ضع اليرقات بشكل فردي في كل بئر من صفيحة مكونة من 6 آبار قبل إغلاق الغطاء وتتضور جوعا لمدة 24 ساعة.
  2. اشطف أوراق التوت الطازجة بالماء منزوع الأيونات وجففها بورق مطبخ نظيف. يجب أن تكون أوراق التوت جافة بدون قطرات ماء. مقطعة إلى أقراص أوراق التوت 1 سم × 1 سم.
  3. قم بإذابة الجسيمات النانوية للشيتوزان/dsRNA في ماء خال من النوكلياز عند 500 نانوغرام/ميكرولتر قبل الاستخدام. تمييع الجسيمات النانوية للكيتوزان (المحضرة في 4.4) بنفس الحجم من الماء الخالي من النوكلياز. تحضير dsRNA العاري إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر في ماء خال من النوكلياز.
  4. استخدم الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA لتجربة ضربة قاضية من RNAi ، وهي الجسيمات النانوية للشيتوزان كعنصر تحكم فارغ / سلبي. استخدم dsRNA العاري لمقارنة الاختلافات مع الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA.
  5. قم بتغطية 10 ميكرولتر من الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA والشيتوزان والحمض النووي الريبي العاري على سطح كل قرص ورقة ، على التوالي. جفف محلول الجسيمات النانوية ومحلول dsRNA بالهواء على أقراص الأوراق في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
  6. قم بإطعام كل يرقة بقرص أوراق واحد مطلي بالجسيمات النانوية أو مغلفة ب dsRNA يوميا. توفير أقراص الأوراق المطلية بالجسيمات النانوية أو المغلفة ب dsRNA لليرقات بشكل مستمر لمدة 5 أيام. يمكن توفير أوراق التوت الطازجة بعد أن تأكل اليرقات قرص الأوراق المطلي بالكامل كل يوم.
  7. في اليوم 6 ، قم بتخدير اليرقات على الجليد حتى لا تتحرك وقم بتشريح اليرقات لأخذ العينات. قطع الصدر بالمقص على طبق بتري نظيف. اسحب الأمعاء الوسطى باستخدام ملقط. قم بإزالة المحتوى الموجود في الأمعاء الوسطى واغسل الأمعاء الوسطى في طبق بتري آخر مليء بالماء الخالي من النوكلياز. قم بتخزين الأمعاء الوسطى في أنبوب سعة 1.5 مل واحتفظ به عند -70 درجة مئوية.

6. تأكيد إسكات الجينات

  1. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qRT-PCR) لحساب القياس الكمي النسبي للنسخ المكتوب. مطلوب ما لا يقل عن ثلاث مكررات بيولوجية وثلاث مكررات تقنية لكل تكرار بيولوجي. يوصى باستخدام جينين مرجعيين على الأقل لتطبيع النسخة النسبية. تم اختبار جين Bombyx Toll9-2 (BmToll9-2). قم بتقييم كفاءة إسكات الجينات من خلال مقارنة متوسط قيمة النسخة النسبية بالمجموعة الضابطة وتحويلها إلى نسبة مئوية.
    ملاحظة: يمكن العثور على حالة تضخيم qRT-PCR والمعلومات التمهيدية وحساب النسخ النسبي في منشورنا الأخير20.
  2. تحليل النمط الظاهري للحمض النووي الريبي لتقييم تأثير إسكات الجينات. راقب حجم اليرقات والشرانق. التقط صورا يوميا لتسجيل المظاهر.
    ملاحظة: يمكن أن يؤثر الحمض النووي الريبي على التشكل والتحول وعلم وظائف الأعضاء والسلوك. تعتمد مراقبة الأنماط الظاهرية المرتبطة ب RNAi على الجينات المستهدفة.

النتائج

لتقييم كفاءة الحمض النووي الريبي ، تم اختيار جين مناعي يستهدف BmToll9-2 للتحليل. يتميز جين BmToll9-2 جيدا في المختبر ، ويؤدي إسكات الجينات عن طريق حقن dsRNA إلى يرقات أخف وزنا وأصغر في منشورنا الأخير20. لتأكيد فعالية الحمض النووي الريبي عن طريق الابتلاع من خلال الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA ، تم استخدام جسيمات الشيتوزان النانوية كعنصر تحكم ، وتمت مقارنة dsRNA العاري في نفس الوقت.

بالمقارنة مع التحكم ، فإن جزيئات الشيتوزان النانوية بدون dsRNA ، dsRNA العاري الذي يستهدف جين BmToll9-2 لا يظهر أي تأثير إسكات. إن تغذية جزيئات الشيتوزان / dsRNA النانوية في دودة القز تمنع النسخة بشكل كبير ، مع ضربة قاضية بنسبة 79٪ (الشكل 1). يشير تثبيط النسخة النسبية إلى أن جين BmToll9-2 قد تم إسكاته بنجاح من خلال ابتلاع الشيتوزان / dsRNA.

تؤثر ضربة قاضية لجين BmToll9-2 بشكل كبير على نمو دودة القز. عند مراقبة اليرقات ، تكون يرقات BmToll9-2 الصامتة أصغر من يرقات التحكم (الشكل 2 أ). عند مقارنة الشرانق ، تكون شرانق BmToll9-2 الصامتة أصغر أيضا (الشكل 2 ب). تظهر الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA تأثيرات RNAi ناجحة في كل من النسخ والنمط الظاهري في دودة القز.

figure-results-1
الشكل 1: نسخة نسبية من BmToll9-2 بعد ابتلاع الجسيمات النانوية الشيتوزان / dsBmToll9-2 في B. موري يرقات الطور الخامس. مستويات mRNA النسبية ل BmToll9-2 في اليرقات التي تتغذى على جسيمات الشيتوزان النانوية كتحكم ، وجسيمات dsRNA عارية ، وجسيمات شيتوزان / dsRNA النانوية. تم تمثيل البيانات كوسيلة ± الانحراف المعياري لثلاثة تكرارات بيولوجية. لكل تكرار بيولوجي ، كانت هناك ثلاث نسخ متماثلة تقنية. تشير الأحرف المختلفة على القضبان إلى اختلافات كبيرة بناء على تحليل ANOVA أحادي الاتجاه. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مراقبة النمط الظاهري بعد التغذية بالجسيمات النانوية الشيتوزان / dsBmToll9-2. تستخدم جزيئات الشيتوزان النانوية كعنصر تحكم. (أ) ظهور يرقات دودة القز بعد ابتلاع الجسيمات النانوية. (ب) ظهور شرانق دودة القز بعد ابتلاع الجسيمات النانوية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

المرحلة المناسبة مهمة لمراقبة النمط الظاهري للحمض النووي الريبي ، اعتمادا على الجينات المستهدفة. أظهرت نتائجنا الأولية أن Toll9-2 متورط في نمو دودة القز. يزداد حجم ووزن يرقات دودة القز بسرعة عند الطور الخامس21. لذلك ، يتم اختيار يرقات الطور الخامس كمرحلة لتجربة تغذية الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA. من الممكن أيضا اختيار يرقات الطور3 أو 4 لتجارب التغذية ومراقبة الاختلافات التنموية في الطور الخامس. ومع ذلك ، تتطلب تجارب تغذية الجسيمات النانوية تغذية مستمرة يوميا14. تتطلب تغذية اليرقات في مرحلة أصغر مزيدا من تحضير dsRNA ، وهو أغلى نسبيا. للأسباب المذكورة أعلاه ، نقترح اختيار يرقات دودة القز الحديثة من الطور الخامس كنقطة انطلاق لتجربة تغذية الجسيمات النانوية.

من المهم أيضا تحسين معلمات تغذية الجسيمات النانوية. تعد التغذية الثابتة للجسيمات النانوية لمدة 5-7 أيام لتحقيق الحمض النووي الريبي الفعال أمرا شائعا في الدراسات الحالية14،18،22،23. نظرا لأن dsRNA هو أغلى مكون في تجارب الحمض النووي الريبي ، يمكن تغذية الجسيمات النانوية لليرقات كل يومين ، مما قد يساعد في تقليل نصف تكلفة تحضير dsRNA. هناك طريقة أخرى لخفض التكلفة وهي تحسين كمية dsRNA المستخدمة في التغذية. في هذا البروتوكول ، يتم استخدام 5 ميكروغرام من الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA لكل يرقة ، وهي الجرعة العالمية لحقن الحمض النووي الريبي dsRNA في المختبر. بالنظر إلى أن 5 ميكروغرام من dsRNA هي جرعة عالية والتثبيط عن طريق تغذية الجسيمات النانوية مهم. يقترح تقليل كمية dsRNA في التجربة. ومع ذلك ، فإن تأثير المعلمتين المذكورتين أعلاه على كفاءة RNAi يحتاج إلى تقييم في التجارب المستقبلية.

يمكن تحسين نسبة الشيتوزان و dsRNA. في هذا البروتوكول ، يتم خلط 20 ميكروغرام من الشيتوزان في 100 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم مع 20 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي dsRNA في 100 ميكرولتر من كبريتات الصوديوم. في أول تقرير عن الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA ، يتم خلط 20 ميكروغرام من الشيتوزان في 100 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم مع 32 ميكروغرام من dsRNA في 100 ميكرولتر من كبريتاتالصوديوم 16. في بعض التقارير الأخرى ، يتم خلط 1 ميكروغرام من الشيتوزان في 100 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم مع 1 ميكروغرام من dsRNA في 100 ميكرولتر من كبريتات الصوديوم18،23. لذلك ، يمكن تحسين كمية الشيتوزان و dsRNA لتحقيق أفضل كفاءة تحميل للجسيمات النانوية وتأثير إسكات الحمض النووي الريبي الأمثل.

يجب النظر في تخزين الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA. يتم تحضير جزيئات الشيتوزان / dsRNA النانوية قبل تجربة التغذية ، ويقترح استخدامها على الفور. أظهر تقرير حديث أن الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA تم تخزينها عند 4 درجات مئوية و 24 درجة مئوية و 37 درجة مئوية لمدة 15 يوما ولا تزال مستقرة19. وبالتالي ، يمكن تحضير الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA مسبقا وتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في الثلاجة لأن dsRNA يكون أكثر استقرارا في درجات الحرارة المنخفضة.

إلى جانب dsRNA ، يمكن استخدام بعض الحمض النووي الريبي الصغير ، مثل الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) والحمض النووي الريبي القصير (shRNA) ، في تحضير الجسيمات النانوية لتجارب RNAi. على سبيل المثال ، تعمل جزيئات siRNA النانوية على تحسين مقاومة النبات ل Pseudomonas syringae24. تسبب تسليم الجسيمات النانوية shRNA في تأثير RNAi ناجح في حشرة الرائحة الكريهة ذات اللون البني الاستوائي الجديد Euschistus heros25. لذلك ، يمكن تطبيق الجسيمات النانوية على أي جزيئات RNA مستخدمة في تجربة RNAi.

يقال إن كفاءة الحمض النووي الريبي في حرشفيات الأجنحة ، بما في ذلك ديدان القز ، مقاومةللحرارة 26. يتم توصيل dsRNA فقط من خلال الحقن في ديدان القز ، وهو أمر يستغرق وقتا طويلا ويكلف العمالة. باستخدام طريقة توصيل الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA ، لوحظ تأثير إسكات كبير إما في النسخ أو النمط الظاهري في يرقات دودة القز والشرانق ، وهو أمر ممكن بسبب انخفاض تدهور dsRNA عن طريق حماية الشيتوزان19. هذه الطريقة موفرة للعمالة وسهلة الأداء ، والتي يمكن تكييفها مع الحشرات الأخرى. يمكن تطبيق سهولة هذا البروتوكول ليس فقط في البحث العلمي ولكن أيضا في التدريس في الفصول الدراسية والعرض والممارسة. طريقة توصيل الجسيمات النانوية هي اتجاه جديد للمكافحة الحيوية وإدارة الآفات في المستقبل27.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31501898) ، وبرنامج العلوم والتكنولوجيا في قوانغتشو (202102010465) ، ومشروع جودة التدريس وإصلاح التدريس في قوانغتشو للتعليم العالي (2022JXGG057) ، والمشروع البحثي للجنة التوجيهية للدورات التدريبية المفتوحة عبر الإنترنت لجامعات مقاطعة قوانغدونغ (2022ZXKC381).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أنبوب الطرد المركزي 1.5 ملسانجونF601620ل dsRNA أو تفاعل الجسيمات النانوية
10 & ل ماصةEppendorfP13473Gلشفط أو إعادة تعليق السائل
100 مو ؛ ل ماصةEppendorfQ12115Gلشفط أو إعادة تعليق السائل
2.5 & mu ؛ ل ماصةEppendorfP20777Gلشفط أو تعليق السائل
20 مو ؛ ل ماصةEppendorfH19229Eلشفط أو تعليق السائل
200 مو ؛ ل ماصةEppendorfH20588Eلشفط أو إعادة تعليق السائل
6 آبار Clear TC المعالجة لوحات الآبار المتعددةCostar3516لتربية دودة القز بشكل فردي
حمض الخليكعلاء الدينA116165لصنع TAE
Agarose MBBI Life SciencesA610013لهلام الاغاروز الكهربائي
الميزان التحليليSartoriusBSA224Sلوزن المكونات
الطرد المركزي SartoriusCentrisart A-14Cإلى أجهزة الطرد المركزي لتشكيل dsRNA أو الجسيمات النانوية
ChitosanSigma-AldrichC3646للاندماج مع dsRNA لتحضير الجسيمات النانوية
EDTASangonA500895لجعل TAE
Ethanolعلاء الدينE130059لصنع TAE ، أو لترسيب dsRNA
فريزرSiemensiQ300لتخزين dsRNA أو الجسيمات النانوية
GoTaq Green Master MixPromegaM712لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل
GoTaq qPCR Master MixPromegaA6002لتفاعل qRT-PCR
Isopropanol & nbsp ؛علاء الدينI112011لترسيب dsRNA
NanoDrop Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisherOneلتحديد تركيز مقياس الأس الهيدروجيني dsRNA
Sartorius& nbsp ؛ PB-10لإعداد المخازن المؤقتة
SanPrep Column PCR طقم تنقية المنتج SangunB518141لتنقية منتج PCR
أسيتات الصوديومSigma-AldrichS2889لصنع 100 ملي مولار عازلة أسيتات الصوديوم
كبريتات الصوديوم   ؛Sigma-Aldrichلصنع 100 ملي مولار كبريتات الصوديوم عازلة
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700لتخليق dsRNA
ThermoMixerEppendorfCلتوليد dsRNA أو تسخين الجسيمات النانوية
TrisSangonA501492لصنع TAE
Vortex   ؛IKAVortex 3لتحضير الجسيمات النانوية للشيتوزان / dsRNA
239313

المراجع

  1. Xia, Q., et al. A draft sequence for the genome of the domesticated silkworm (bombyx mori). Science. 306 (5703), 1937-1940 (2004).
  2. Kawamoto, M., Kiuchi, T., Katsuma, S. Silkbase: An integrated transcriptomic and genomic database for bombyx mori and related species. Database (Oxford). 2022, (2022).
  3. Yokoi, K., Tsubota, T., Jouraku, A., Sezutsu, H., Bono, H. Reference transcriptome data in silkworm bombyx mori. Insects. 12 (6), (2021).
  4. Mita, K., et al. The construction of an est database for bombyx mori and its application. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 14121-14126 (2003).
  5. Zhou, Q. Z., Zhang, B., Yu, Q. Y., Zhang, Z. Bmncrnadb: A comprehensive database of non-coding rnas in the silkworm, bombyx mori. BMC Bioinformatics. 17 (1), 370(2016).
  6. Prasad, M. D., et al. Silksatdb: A microsatellite database of the silkworm, bombyx mori. Nucleic Acids Res. 33 (Database issue), D403-D406 (2005).
  7. Ding, S. W. Rna-based antiviral immunity. Nat Rev Immunol. 10 (9), 632-644 (2010).
  8. Yu, N., et al. Delivery of dsRNA for RNAi in insects: An overview and future directions. Insect Sci. 20 (1), 4-14 (2013).
  9. Liang, Y., et al. Silencing of the immune gene bmpgrp-l4 in the midgut affects the growth of silkworm (bombyx mori) larvae. Insect Mol Biol. 32 (4), 340-351 (2023).
  10. Tian, H., et al. Developmental control of a lepidopteran pest Spodoptera exigua by ingestion of bacteria expressing dsrna of a non-midgut gene. PLoS One. 4 (7), e6225(2009).
  11. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific rna-mediated interference through ingested double-stranded rna in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2 (1), RESEARCH0002(2001).
  12. Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cdna encoding extracellular dsrnase and its expression in the silkworm Bombyx Mori. Insect Biochem Mol Biol. 37 (2), 176-183 (2007).
  13. Liu, J., Swevers, L., Iatrou, K., Huvenne, H., Smagghe, G. Bombyx mori DNA/rna non-specific nuclease: Expression of isoforms in insect culture cells, subcellular localization and functional assays. J Insect Physiol. 58 (8), 1166-1176 (2012).
  14. Christiaens, O., et al. Increased rnai efficacy in Spodoptera exigua via the formulation of dsrna with guanylated polymers. Front Physiol. 9, 316(2018).
  15. Dass, C. R., Choong, P. F. The use of chitosan formulations in cancer therapy. J Microencapsul. 25 (4), 275-279 (2008).
  16. Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae). Insect Mol Biol. 19 (5), 683-693 (2010).
  17. Zhang, X., et al. Chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae. J Vis Exp. (97), e52523(2015).
  18. Sandal, S., et al. Nanoparticle-shielded dsrna delivery for enhancing rnai efficiency in cotton spotted bollworm Earias vittella (lepidoptera: Nolidae). Int J Mol Sci. 24 (11), 9161(2023).
  19. Zhou, H., et al. Chitosan/dsrna polyplex nanoparticles advance environmental rna interference efficiency through activating clathrin-dependent endocytosis. Int J Biol Macromol. 253 (Pt 4), 127021(2023).
  20. Liu, J., et al. Immunological function of bombyx toll9-2 in the silkworm (Bombyx mori) larval midgut: Activation by escherichia coli/lipopolysaccharide and regulation of growth. Arch Insect Biochem Physiol. 116 (4), e22130(2024).
  21. Cheng, L., et al. Characterization of silkworm larvae growth and properties of silk fibres after direct feeding of copper or silver nanoparticles. Mater Design. 129, 125-134 (2017).
  22. Wang, K., et al. Comparison of efficacy of rnai mediated by various nanoparticles in the rice striped stem borer (Chilo suppressalis). Pestic Biochem Physiol. 165, 104467(2020).
  23. Gurusamy, D., Mogilicherla, K., Palli, S. R. Chitosan nanoparticles help double-stranded rna escape from endosomes and improve rna interference in the fall armyworm, Spodoptera frugiperda. Arch Insect Biochem Physiol. 104 (4), e21677(2020).
  24. Qi, J., et al. Rational design of ros scavenging and fluorescent gold nanoparticles to deliver sirna to improve plant resistance to Pseudomonas syringae. J Nanobiotechnol. 22 (1), 446(2024).
  25. Laisney, J., Loczenski Rose, V., Watters, K., Donohue, K. V., Unrine, J. M. Delivery of short hairpin rna in the neotropical brown stink bug, Euschistus heros, using a composite nanomaterial. Pestic Biochem Physiol. 177, 104906(2021).
  26. Terenius, O., et al. Rna interference in Lepidoptera: An overview of successful and unsuccessful studies and implications for experimental design. J Insect Physiol. 57 (2), 231-245 (2011).
  27. Kolge, H., Kadam, K., Ghormade, V. Chitosan nanocarriers mediated dsrna delivery in gene silencing for Helicoverpa armigera biocontrol. Pestic Biochem Physiol. 189, 105292(2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

dsRNA RNAi

مقالات ذات صلة