The Floating Lab: Standard Operational Procedure for Collecting and Filtering Seawater Samples from Operating Ferries for Environmental DNA Analysis

Alessia Rota; Elena Valsecchi

doi:10.3791/67366

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

المختبر العائم: الإجراء التشغيلي القياسي لجمع عينات مياه البحر وترشيحها من العبارات العاملة لتحليل الحمض النووي البيئي

DOI: 10.3791/67366

August 1, 2025

Alessia Rota^1,2,3, Elena Valsecchi^1,2

¹Department of Earth and Environmental Sciences,University of Milano-Bicocca, ²Marine Research and Higher Education Center (MaRHE Center), ³National Biodiversity Future Centre (NBFC)

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

نقدم هنا بروتوكولا جديدا لاسترداد الحمض النووي البحري من خلال جمع عينات مياه البحر وترشيحها من العبارات العاملة والسفن التجارية الأخرى.

Abstract

الأدوات الجينية لاسترداد المعلومات من آثار الحمض النووي البيئية راسخة لكل من توصيف التنوع البيولوجي المستهدف والواسع تصنيفيا. ومع ذلك ، في السياق البحري ، قد يظل جمع عينات الحمض النووي الإلكتروني من المناطق التي يصعب الوصول إليها ، كما هو الحال في المياه السحيقة أو البحرية ، قيدا. يمكن أن يشكل استخدام العبارات المجدولة أو السفن التجارية التي تعبر مساحات شاسعة من البحر المفتوح منصات انتهازية قيمة لجمع العينات البيئية. المزايا لا حصر لها ، من إمكانية جمع البيانات في أي حالة جوية وفي أي وقت من اليوم إلى قابلية التكرار بمرور الوقت ، كونها الطرق ثابتة ، ومع انخفاض تام في التكاليف وانبعاثات الوقود. وقد أظهر العمل السابق أن هذا النهج ممكن وناجح. ومع ذلك ، فإن عملية الحصول على عينات من بطون هذه السفن البحرية الكبيرة قد لا تكون فورية. يوضح هذا العمل بكل التفاصيل كيف يمكن إعداد وترتيب وتنفيذ جمع وتصفية مياه البحر من السفن الكبيرة.

Introduction

في العقود الماضية ، نما تحليل الحمض النووي البيئي (eDNA) ، أي الكشف عن المواد الوراثية التي تتركها الكائنات الحية في البيئة ، بسرعة كأداة مراقبة واعدة لمجتمعات المياه العذبة البحرية. توفر هذه التقنية الجزيئية إمكانية تحديد أصناف متعددة في وقت واحد داخل عينة واحدة (نهج الترميز الشريطي) ، مما يسمح باكتشاف المجتمعات البيولوجية التي تعيش أو تعبر المنطقة التي تم أخذ عينات^{منها 1}^،²^،³^،⁴^،⁵.

في الوقت الحالي ، يتمثل التحدي الحقيقي في الوصول إلى مواقع أخذ العينات ، حيث غالبا ما يكون من غير المجدي اقتصاديا و / أو لوجستيا جمع العينات عبر نطاقات جغرافية كبيرة ، مما يؤدي إلى عدم أخذ عينات من المناطق البحرية عادة مقارنة بالمناطق الساحلية التي يسهل الوصول إليها⁶. يسمح استخدام العبارات أو السفن التجارية الأخرى بقطع عينات قابلة للتكرار بدرجة عالية ، لأنها تتبع طرق شحن محددة تكون ثابتة عادة خلال الموسم وتغطي مساحات كبيرة⁷^،⁸. علاوة على ذلك ، فإن استخدام طرق العبارات كوسيلة لأخذ العينات يسمح بجمع العينات في أي وقت من اليوم وخلال كل موسم ، بغض النظر عن الطقس وظروف البحر ، إلى جانب تقديم العديد من المزايا الأخرى (الشكل التكميلي 1). أثبتت الدراسات الأولية جدواها ودقتها لتقييم مؤشرات التنوع^{البيولوجي 9}^،¹⁰. يمكن جمع عينات المياه من غرفة محرك العبارة عبر أنبوب اشتقاق يعترض مياه التبريد البحرية في اتجاه المنبع للمحركات. LIFE-CONCEPTU MARIS (الحفاظ على CEtaceans و Peseaic Sea TUrtles in Med: Managing Actions for Recovery in Sustainability) هو أول مشروع تم فيه وضع إثبات المفهوم هذا موضع التنفيذ على نطاق واسع: فهو يهدف إلى جمع 500 عينة (على مدى عامين) ، وينطوي على إشراك ليس شركة واحدة بل عدة شركات عبارات والعديد من شركات النقل ، السماح بتسليط الضوء على أي قضايا حرجة وتحسين استراتيجيات أخذ العينات للتكيف بشكل أفضل مع السياقات الأكثر تنوعا التي قد تواجهها على متن الطائرة. نصف أدناه خصائص المشروع لمكوناته المتعلقة بجمع عينات الحمض النووي البيئية البحرية على نطاق واسع (للاطلاع على وصف المشروع ، قم بزيارة https://webgate.ec.europa.eu/life/publicWebsite/project/details/5707).

ينطوي قرار القيام بحملة أخذ العينات باستخدام عبارة مجدولة على بعض الإجراءات التي يجب اتخاذها قبل أخذ العينات الفعلي ، وهو الجانب الذي يتم تناوله مباشرة في هذا العمل. هنا ، نذكر بإيجاز الإجراءات التي يجب أن تسبق أخذ العينات على متن السفينة من أي سفينة تجارية.

هذا جانب لا ينبغي إغفاله والذي يحدد نجاح حملة التحصيل. شركات الشحن هي كيانات تجارية وليست بحثية ، وبالتالي فهي ليست ، ولا يشترط أن تكون على دراية بأهداف وغايات البحث العلمي المراد إجراؤه على متن الطائرة. وهذا يعني ضمنا مرحلة أولية مهمة وحساسة يجب فيها نقل أهداف المشروع العلمي المقترح ، والتي يمكن أن تكون متعددة التخصصات ، وتحفيزها من قبل الإدارة العليا لشركة الشحن نفسها. في الحالة المحددة لمشروع CONCEPTU MARIS ، أصبح ذلك ممكنا بفضل علاقة استمرت عقودا من الزمن شاركت فيها شركات الشحن بالفعل في مشاريع المراقبة البصرية (على سبيل المثال ، مقاطع الخط الثابت [FLT]⁷) ، والتي حددت علاقة التقدير المتبادل اللازمة للتمكن من الحصول على الضوء الأخضر للوصول إلى غرف المحركات التي لا غنى عنها لنهج أخذ العينات الذي يغطيه هذا العمل.

ونوع نظام أخذ العينات المعتمد في مشروع CONCEPTU MARIS ذو شقين: تؤخذ العينات في محطات أخذ العينات الثابتة (FSS، انظر أدناه) وبمناسبة مشاهدة الحيتانيات "النادرة". تمثل هذه الأنواع الأقل رؤية خلال مقاطع FTL¹¹ ، وهي: الدلفين الشائع (Delphinus delphis) ، حوت منقار Cuvier (Ziphius cavirostris) ، الحوت التجريبي (Globicephala melas) ، دلفين Risso (Grampus griseus) ، حوت العنبر (Physeter macrocephalus) وحوت الزعانف (Balaenoptera physalus). يتم جمع عينة مياه إضافية فقط عندما تحدث رؤية الأنواع النادرة التي أبلغ عنها فريق التعداد البصري (فريق FLT) قبل أكثر من نصف ساعة أو بعد أحد FSSs. العينات التي يتم إجراؤها بالتزامن مع المشاهدات ستكون بالضرورة نهارية.

يتم تحديد محطات أخذ العينات الثابتة (FSSs) ، التي يظل موقعها الجغرافي ثابتا خلال الرحلات البحرية ، ويتم الاتفاق عليها مع فريق العمل بأكمله. يتم اختيار المواقع الجغرافية ل FSS وفقا ل 1) وجود موقع ذو أهمية بيولوجية بناء على بيانات الرصد / الأدبيات السابقة ؛ 2) الأولوية التي تعطى للنقاط التي تشير إلى تغيرات الموائل على خرائط قياس الأعماق (مثل حافة الجرف القاري) ؛ 3) تغطية متجانسة لممرات الشحن المعينة ، وبالتالي اختيار مواقع أخذ العينات على بعد متساوي تقريبا (حوالي 35-45 ميلا بحريا) ، من أجل تغطية الطريق بأكمله والتنبؤ بجمع العينات الليلية أيضا.

ولضمان أخذ عينات متجاورة في أوقات مختلفة من اليوم ووجود وقت كاف بين عينتين متتاليتين لإكمال معالجة العينات، ينصح بأخذ عينات من أجهزة الخدمة الثابتة الساتلية المجاورة، واحدة في الرحلة الخارجية والأخرى في رحلة العودة. وهذا يعني أنه إذا تم ترقيم الخدمة الثابتة الساتلية وفقا للترتيب الزمني الذي تم أخذ عينات به ، فلن تظهر بترتيب متتابع على الخريطة. على سبيل المثال، إذا تم تحديد 6 FSSs، أخذ عينات من 3 في الرحلة الخارجية و 3 في رحلة العودة. "سيكون ترتيبهم على طول الطريق على الخريطة هو PortAFSS1-FSS6-FSS2-FSS5-FSS3-FSS4-PortB ، مع مسح محطات أخذ العينات الثلاث بخط مائل (FSS4 و FSS5 و FSS6) في رحلة العودة (انظر الشكل 1).

ولكل خدمة ساتلية واحدة رقم تعريف فريد (أي أن أيا من الخدمة الثابتة السالية المحددة على مسارات مختلفة لا يشترك في نفس رقم التعريف). يتم تعيين الترقيم في المرة الأولى التي يتم فيها أخذ عينات من الخدمة الثابتة السامة، وسيتبع ذلك الترقيم المتتالي. ولذلك، في نهاية المشروع، ستكون الخدمة الثابتة الساتلية ذات العدد المنخفض هي تلك التي تم اختبارها لعدة سنوات أو التي تتوافر عنها أقدم البيانات.

تتكون كل عينة من حوالي 13 لترا من مياه البحر التي تم جمعها في كل محطة أخذ عينات. يتم صب مياه البحر مباشرة من أنبوب اشتقاق العبارة إلى حاويات "Bag-in-in-The-Box" (BiB) ، وهي الأكياس البلاستيكية المغلفة بالرقائق المعقمة ، حتى معالجة العينة (انظر أدناه). تم توضيح خصائص ومزايا نظام أخذ العينات في الحقيبة (BiBSS) بالتفصيل بواسطة Valsecchi et al. (2021) ⁹ ويتم الإبلاغ عنها أيضا هنا في الشكل 2 للراحة.

Protocol

1. الاستعداد في المختبر

قائمة مراجعة العتاد
1. راجع قائمة التحقق الخاصة بالعناصر التي سيتم أخذها على متن الطائرة لكل من جمع العينات وترشيح العينات. يظهر في الملف التكميلي 1. سيتم شرح كل عنصر واستخدامه في الأقسام أدناه.
2. طباعة نسخة من الملف التكميلي 1 وتعبئتها قبل المغادرة لحملة أخذ العينات.
إعداد نظام أخذ العينات في الحقيبة
1. قم بإعداد الأكياس في الصندوق في المختبر ، تحت غطاء الدخان إن أمكن ، قبل الصعود إلى الطائرة. أغلق الفتحات الثلاث (تلك الموجودة على الكيس ، وجزء من الغطاء الذي يغلق الكيس ، والمخرج من الصنبور) بغشاء مانع للتسرب (الشكل 3 ، جدول المواد).
2. قم بلف الأكياس ، مع فصل الغطاء وإغلاقه من الداخل ، بإحكام وأغلقه بشريط لاصق لمنع إعادة فتحه أثناء النقل (الشكل 3).
3. قم بإجراء هذه العملية عن طريق التأكد من عدم دخول الهواء إلى الكيس أثناء مناورة الختم المذكورة أعلاه ، (1) لتجنب التلوث المحتمل الذي يحمله الهواء الذي يدخل الكيس و (2) لمنع الكيس المطوي من أن يصبح أكبر حجما (إذا كان يحتوي على هواء).

2. الاستعداد على متن الطائرة

التنسيق مع أفراد الطاقم
1. بمجرد الصعود على متن الطائرة ، شارك نقاط أخذ العينات المحددة مع القبطان وطاقمه بحيث يتم الإشارة إلى الأوقات التي تكون فيها العبارة أقرب إلى كل نقطة تم اختيارها على أنها "محطة أخذ عينات ثابتة" (FSS).
2. قم بتدوين وقت أخذ العينات لكل FSS وسرعة الإبحار الحالية (أو المتوسطة ، إن وجدت) للعبارة لهذا المسار: يسمح هذا بتقدير الامتداد (كم) لامتداد البحر الذي تم أخذ عينات منه.
3. نظرا لأن العبارة لا تمر أبدا على نفس النقطة بالضبط ، فقم بتصحيح إحداثيات كل مجموعة عينات من مياه البحر بعد أخذ العينات الفعلية.
  ملاحظة: الفاصل الزمني الدقيق لأخذ العينات هو أهم البيانات لتحديد المنطقة البحرية التي تم أخذ عينات منها بالفعل. لذلك ، من المفيد طباعة خريطة للنقاط التقريبية حيث يتم الإبلاغ عن إحداثيات أخذ العينات الفعلية (على سبيل المثال ، في الملف التكميلي 2).
4. إذا سمحت الشركة بالوصول إلى غرفة المحرك ، فاطلب مرافقتك إلى الغرفة.
5. ارتد معدات الحماية الشخصية (PPE) قبل دخول غرفة المحرك. هنا ، البيئة غير مضيافة (ضوضاء تصم الآذان ودرجات حرارة مرتفعة) ومليئة بالنقاط الخبيثة المحتملة (سلالم شديدة الانحدار ، فجوات كبيرة في الأرضيات). بمجرد الحصول على إذن لدخول غرفة المحرك ، قم بتجهيزها بجميع معدات السلامة الأساسية ، مثل أحذية الأمان والخوذة وسماعات الرأس لحماية السمع.
6. إذا تم توفير سطح الترشيح من قبل شركة الشحن (ينصح عادة بالحصول على طاولة قابلة للطي خاصة بها) ، فتحقق من إمكانية تعقيم هذه المنطقة بين العينات باستخدام محلول مبيض بنسبة 10٪.
الاستقرار في غرفة المحرك
1. نظرا لوجود العديد من مداخل مياه البحر على متن السفن ، تعرف على مدير غرفة المحرك ، مما يسمح بحد أدنى من المسار للمياه المأخوذة عبر أنابيب السفينة لتقليل تلوث عينة الماء بالمواد والكائنات الحية التي يمكن العثور عليها في الأنابيب.
2. بمجرد تحديد أنسب نقطة / مدخل لجمع مياه البحر الواردة ، اسأل الموظفين عما إذا كان يمكن إبقاء صنبور جمع العينات مفتوحا قليلا طوال مدة الرحلة البحرية من أجل شطف الأنبوب المستخدم لجمع العينات باستمرار بالمياه "المحلية". تخلص من مياه البحر التي تتدفق باستمرار من الصنبور في الآسن.

3. جمع عينات المياه (في غرفة المحرك)

ملاحظة: يوضح الشكل 4 مراحل جمع عينات مياه البحر.

التحضير لجمع المياه
1. أحضر جميع المعدات اللازمة (الجزء الأول ، قائمة مراجعة الملف التكميلي 1 ) إلى غرفة المحرك. اذهب إلى غرفة المحرك قبل 15 دقيقة على الأقل من وقت أخذ العينات المخطط له لتعقيم المنطقة التي يتم فيها التعامل مع المضايل باستخدام محلول مبيض بنسبة 10٪.
2. إذا لم يتم ترك الصنبور المخصص مفتوحا طوال الرحلة البحرية ، فافتحه لجمع عينات مياه البحر ، واترك الماء يعمل لمدة 5 دقائق على الأقل (يتم التخلص من الماء في الآسن) قبل السحب الفعلي (الشكل 4 أ).
3. تحضير محطة التصفية.
  ملاحظة: هناك العديد من التدابير في إعداد محطة الترشيح التي يمكن أن تحسن بشكل كبير من كفاءة الترشيح (انظر الخطوة 4.3): 1) استخدم قوارير تفريغ عالية السعة (2 لتر أو 4 لتر أو 5 لتر ، اعتمادا على الحجم المراد سحبه). هذا ، بالإضافة إلى توفير الوقت اللازم لتفريغ القارورة بين 1 لتر والقارورة التالية ، يقلل من التعامل مع أسطوانة الترشيح ، وبالتالي أي تلوث ؛ 2) يمكن للمرء استخدام قوارير مرشح متعددة مرتبة في سلسلة ، وهو مقياس يسمح بالترشيح المتزامن لعينات متعددة (أكياس). يوصى بهذا الإجراء في أنظمة أخذ العينات الضيقة ، حيث يوجد بخلاف ذلك خطر عدم وجود الوقت اللازم لمعالجة الأكياس قبل الوصول إلى ميناء الإرساء.
4. استخدم علامة دائمة لإعداد وتسمية BiB بالكتابة عليها: 1) رمز التعريف الأبجدي الرقمي الفريد للعينة على جانبي BiB (مهم بشكل خاص إذا لم تتم معالجة BiB على الفور على متن الطائرة وتم ترشيحها على الأرض) 2) التاريخ ؛ 3) الوقت المحدد لبدء ملء BiB.
جمع المياه
1. قم بإزالة فيلم الختم من فتحة BiB وابدأ في ملئه حتى يمتلئ تماما (حوالي 13 لترا) (الشكل 4 ب).
2. عندما يكون الكيس ممتلئا تقريبا ، قم بإزالة فيلم الختم من الغطاء ، ولكن ليس من فتحة الصنبور: حافظ على طبقة الختم حول الصنبور آمنا (علامة تبويب بلاستيكية حمراء) حتى الترشيح (الشكل 4C). أغلق المريلة بالغطاء ، واضغط عليه بإحكام حتى يغلق تماما.
3. لاحظ الوقت المحدد الذي يكتمل فيه جمع العينات: فهو يسمح بحساب المدة الإجمالية (الدقائق) لجمع العينات.
بعد جمع المياه
1. اكتب باستخدام العلامة الدائمة على BiB الوقت المحدد الذي تكتمل فيه جمع العينات وأبلغ عن جميع البيانات في نموذج جمع العينات / الترشيح (الملف التكميلي 2).
2. انقل BiB المملوء إلى غرفة التخزين أو إلى منطقة الترشيح (مساحة مخصصة في غرفة المحرك نفسها أو في المقصورة).
3. نقل جميع البيانات الموجودة في نموذج جمع العينات / الترشيح (الملف التكميلي 2).
  ملاحظة: يوضح الملف التكميلي 2 ورقة جمع العينات / الترشيح التي سيتم إكمالها على متن الطائرة بجميع أجزائها.
  1. بالنسبة للجزء المتعلق بجمع العينة (الأخضر) ، أدخل أوقات البدء والانتهاء لأخذ عينات مياه البحر من غرفة المحرك.
  2. ثانيا ، بعد التشاور مع أفراد الطاقم أو سجلات GPS ، أدخل الإحداثيات الجغرافية بالنسبة لبداية ونهاية أخذ العينات وسرعة الإبحار. يتيح لك ذلك حساب طول الجزء البحري الذي تم أخذ عينات منه لاحقا.
    ملاحظة: فيما يتعلق بالجزء المتعلق بالترشيح (الأزرق) ، سيتم الإشارة إلى ما إذا كان الترشيح يحدث على متن الطائرة أو لاحقا على الأرض: سيتم الإشارة إلى أوقات الترشيح لكل مرشح من المرشحات الثلاثة.

4. ترشيح عينة مياه البحر

الاستعداد للترشيح
ملاحظة: من هذه النقطة فصاعدا ، يمكن إدارة عملية الترشيح وفقا لبروتوكولات مختلفة بناء على الأهداف المحددة للمشروع البحثي. يسمح البروتوكول الموصوف هنا بالترشيح الفعال لكمية كبيرة من مياه البحر (أكثر من 10 لترات) مباشرة على متن السفينة ، وتجنب قيود الحجم المتأصلة في المجموعات أو البروتوكولات التجارية الأخرى شائعة الاستخدام. عندما يكون ذلك ممكنا ، قم بتصفية عينات المياه على متن الطائرة: يمكن أن يتم الترشيح إما في غرفة المحرك نفسها أو في المقصورة ، ويفضل أن تكون بالقرب من غرفة المحرك. من المستحسن دائما تصفية عينات مياه البحر فور جمعها ، للحد من تدهور الحمض النووي الإلكتروني وللراحة ، وبالتالي تجنب النزول بكميات كبيرة من مياه البحر المراد معالجتها. إذا لم يكن ذلك ممكنا ، يمكن تخزين العينات في حاويات الكيس في الصندوق ونقلها ليتم تصفيتها لاحقا.
1. في المساحة المخصصة للترشيح على متن الطائرة (في غرفة المحرك أو المقصورة المخصصة) ، استعد لكل شيء مدرج في الجزء الثاني من قائمة الفحص في الملف التكميلي 1 وقم بتجميع نظام الترشيح كما هو موضح في الشكل 5.
2. قم بإعداد أسطوانة الترشيح (جدول المواد) كما هو موضح في الشكل 6 والشكل 7. استخدم أسطوانة جديدة لكل محطة ، أو زوجا جديدا من الملقط الذي يستخدم مرة واحدة ، أو زوجا من الملقط المعقم.
  ملاحظة: يمكن استخدام أسطوانة واحدة عدة مرات لتصفية العينات من نفس الموقع. ومع ذلك ، يجب تعقيمها باستخدام مبيض بنسبة 10٪ ، متبوعة بشطف المياه العذبة ، قبل تركها لتجف في الهواء في المختبر ثم تعبئتها بشكل فردي ليتم تخزينها حتى الحملة التالية.
3. قبل البدء في الترشيح ، املأ سجل بيانات جمع العينات / الترشيح (الملف التكميلي 2). يعد ذلك ضروريا لتتبع عدد اللترات المعالجة وقياس وقت الترشيح (مما يدل على كمية الجسيمات في العينة). بمجرد تنشيط مضخة التفريغ ، ابدأ المؤقت لقياس وقت التصفية.
الترشيح على متن الطائرة
1. من أجل تقليل مخاطر التلوث (خاصة عند معالجة عدة أكياس في وقت واحد ، انظر أدناه) ، قم بعزل تدفق المياه المراد ترشيحها من البيئة المحيطة عن طريق وضع غلاف عازل - كيس بلاستيكي - بين الصنبور وأسطوانة الترشيح (انظر الشكل 7).
  ملاحظة: هذا إجراء احترازي مهم لأن حساسية التقنيات المستخدمة لتحليل الحمض النووي البيئي تجعل النهج عرضة بشكل خاص للتلوث البيئي (من المشغل أو التلوث المتبادل بين العينات).
2. قم بتنشيط مضخة التفريغ وتصفية ما يصل إلى 4 لترات من الماء لكل مرشح. حافظ على الأسطوانة ممتلئة دائما أثناء الترشيح لتجنب دخول الهواء إلى النظام وإبطاء عملية الترشيح.
  ملاحظة: بالنسبة لاختيار مسامية الغشاء ، فإن هذا يعتمد على الغرض من البحث والمجموعات التصنيفية المستهدفة وكمية المياه المراد معالجتها. تم تناول هذه المسألة في الأعمال السابقة⁹^،¹². حيث تمت مقارنة المرشحات ذات المسامية المختلفة. لدراسة الفقاريات واختيار معالجة 4 لترات من الماء لكل مرشح ، أثبت الغشاء الذي يبلغ مساميته 0.45 ميكرومتر أنه الحل الأفضل ، مما يسمح بمعالجة كميات كبيرة من الماء دون التسبب في فوضى المرشح بسبب تشبع المسام.
3. عندما يصل مستوى الماء المصفى داخل القارورة إلى علامة المستوى 4 لتر ، قم بإيقاف تشغيل مضخة التفريغ وإيقاف المؤقت ، والإبلاغ عن قيمة وقت التصفية في سجل البيانات.
  ملاحظة: من كل BiB سعة 12/13 لتر ، سيتم الحصول على 3 مكررات تقنية ، من 4 لتر لكل منها (تسمى A و B و C).
4. في هذه المرحلة ، باستخدام الملقط (وإذا لزم الأمر ، عود أسنان معقم للمساعدة في رفع حافة الفلتر) ، استرجع المرشح الأول (المرشح أ) من الأسطوانة ، كما هو موضح في الشكل 8 ، وتجنب أي ضرر محتمل للفلتر.
5. قم بطي الفلتر إلى نصفين (مع طي الجانب الذي احتفظ بالمادة البيولوجية على نفسه) ولفه بورق الألمنيوم ، واكتب على الفور رقم العينة ومعرف المرشح المتماثل (على سبيل المثال ، 15 أ) على الغلاف. قم بتخزينه في الفريزر الموجود على متن الطائرة حتى النزول.
6. قم بتركيب مرشح جديد (المرشح B) داخل أسطوانة الترشيح لمعالجة عينة أخرى سعة 4 لتر (الشكل 9). أفرغ القارورة وابدأ من جديد بتصفية التكرار الثاني حتى يتم تصفية 4 لتر بالكامل. استرد عامل التصفية B كما هو موضح وكرر نفس الخطوات للمرشح C.
الممارسات الجيدة
1. لتقصير أوقات الترشيح ، استخدم قارورة تفريغ كبيرة قادرة على استيعاب جميع المياه المفلترة المعالجة من خلال مرشح واحد (لذلك ، في هذه الحالة ، سعة 4 لتر على الأقل).
2. قلل أوقات الترشيح بشكل كبير عن طريق تصفية أكياس متعددة في وقت واحد عن طريق ترتيب جهاز الترشيح بالتوازي (أي قوارير تفريغ متعددة تخدمها مضخة واحدة).
  ملاحظة: في حملة CONCEPTU MARIS ، تم اعتماد كلتا الاستراتيجيتين (الشكل 10). لاحظ أن زيادة كفاءة التصفية إلى أقصى حد مهمة للغاية حيث يمكن أن يكون عدد العينات التي تم جمعها على طول المسار كبيرا. لذلك ، من الضروري معالجة الأكياس في وقت قصير لتجنب تراكم العينات مع خطر الاضطرار إلى إنزال الأكياس إذا لم يكن هناك وقت كاف لمعالجتها على متن الطائرة.
3. من أجل مراقبة حدوث الإيجابيات الكاذبة (التلوث) ، قم بتضمين "كيس فارغ" في إجراء الترشيح ، مرة واحدة على الأقل في كل رحلة بحرية ، يتم ترشيح كيسا مملوءا بمياه الشرب مأخوذة من زجاجات محكمة الغلق بالتوازي مع العينات. لا تتطلب عينة التحكم هذه تكرارات وتعامل مع هذا على أنه باقي العينات وتضمينه في تشغيل NGS.
تخزين الفلاتر ونقلها
1. بعد الترشيح ، قم بتخزين جميع المرشحات بين -4 درجة مئوية و -20 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة المعملية.
2. اجمع العينات من الفريزر الموجود على متن الطائرة قبل النزول مباشرة وقم بإعدادها للنقل في درجات حرارة منخفضة باستخدام مبردات قابلة للنقل ، كما هو موضح في الشكل 11.
  ملاحظة: إذا لم يتم ترشيح العينات على متن السفينة ، نقل أكياس مياه البحر بشكل أكثر أمانا إذا تم الاحتفاظ بها عموديا مع تثبيت الغطاء على الجانب العلوي ، مدعوما في أزواج داخل أكياس التسوق داخل الصناديق البلاستيكية لتسهيل النقل (الشكل 12).

Representative Results

عند تنفيذ البروتوكول كما هو موضح، سيجمع المشغل عددا من المرشحات التي تساوي عدد FSS مضروبا ل 3 نسخ متماثلة. يحتفظ كل مرشح بآثار بيولوجية (الحمض النووي البيئي) على أحد الجانبين. تعتمد الخطوات التحليلية اللاحقة لاستخراج الحمض النووي الإلكتروني بشدة على سؤال البحث والهدف والهدف. على سبيل المثال ، في الدراسة التجريبية التي أجراها Valsecchi et al.9 ، سمح بروتوكول جمع الحمض النووي الإلكتروني الموصوف بتصميم مسح منهجي للحيوانات البحرية الضخمة. باستخدام نهج الترميز الشريطي واختيار علامتين مختلفتين خاصة بالفقاريات لتحليلها ، كان من الممكن اكتشاف العديد من أنواع الفقاريات (أسماك teleost ، elasmobranchs ، والحيتانيات). سمحت لنا هذه النتائج باستنتاج الوفرة النسبية للأنواع (الشكل 13) وتوزيعها المكاني ، وبالتالي إعادة بناء تكوين مجتمع الفقاريات على طول المسار الذي تم أخذ عينات منه وهيكله الغذائي9. هذا مجرد مثال لأن الحمض النووي البيئي البحري الذي تم الحصول عليه من خلال هذا النهج يمكن استخدامه لتحليل أي مجموعة من الكائنات الحية (الفطريات والبكتيريا واللافقاريات والعوالق النباتية) على الفور أو بعد سنوات (يمكن إيداع الحمض النووي الإلكتروني الذي تم جمعه في بنوك خاصة لتحليله في المستقبل).

الشكل 1: مثال على اختيار محطة أخذ العينات الثابتة وتسلسل النقاط المحددة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2: مزايا نظام أخذ العينات في الحقيبة (BiBSS) في مسوحات الحمض النووي الإلكتروني البحرية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 3: تحضير الكيس في الصندوق. (أ) الحقائب كما تم تسليمها من قبل المورد. (ب) تفاصيل الغطاء على الكيس عند التسليم. (ج) افتح الغطاء لتغليف جميع الفتحات بغشاء مانع للتسرب. (D-F) التفاصيل والترتيب الذي يجب أن تكون فيه الفتحات الثلاث مختومة بغشاء مانع للتسرب. (ح) كيف ينبغي إغلاق الفتحات الثلاث قبل لف الكيس. (ز) قم بتغطية النظام الآمن الأحمر بالكامل ، حيث يحتاج هذا الجزء إلى الحماية من جمع العينات إلى ترشيح العينات. (I) طريقة وضع المكونين (فتح الكيس والغطاء) ، قبل لف الكيس. (L) الطريقة التي يجب أن تبدو بها الحقيبة الملفوفة. (م) سلسلة من BiB الجاهزة للصعود إلى الطائرة، ويعتمد العدد على عدد FSS المتوقع للمسار (مع الأخذ في الاعتبار العينات الإضافية المحتملة بالتزامن مع المشاهدات). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: مراحل جمع عينات مياه البحر في غرفة المحرك. (أ) خط أنابيب مخصص لجمع عينات مياه البحر: يتم فتح الصنبور ، ويتم تشغيل المياه لمدة 5 دقائق على الأقل (ويتم التخلص من المياه) قبل السحب الفعلي. (ب) عندما يكون الكيس ممتلئا تقريبا ، تتم إزالة فيلم الختم من الغطاء. (ج) مرييل ب مغلق بالغطاء. (د) لاحظ أنه لا تتم إزالة فيلم الختم من الطرف حتى الترشيح. (ه) اضغط على الغطاء بإحكام على فتحة BiB حتى المحطة الثانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: تحضير BiB للترشيح. (أ) كيس عينة مياه البحر. (ب)يتم وضع كل كيس في صندوق من الورق المقوى المعدل (1) مع فتحة (2) في الأسفل لإيواء صنبور الكيس. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تحضير أسطوانة الترشيح. (أ) قم بفك غلاف أسطوانة الترشيح. (ب) قم بإزالة الغطاء السفلي. (ج) أسطوانة بدون غطاء. (د) سدادة السيليكون لقارورة الفراغ مع محول لأسطوانة الترشيح. (ه) تأكد من أن السدادة تتناسب تماما مع قارورة التفريغ. (و) قم بإزالة السدادة. (ز) ضع الأسطوانة على المحول. (H) ضع السدادة المعقدة + أسطوانة الترشيح على قارورة التفريغ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 7: تصفية عزل الأسطوانة. (أ) ضع كيسا بلاستيكيا نقيا حول الصنبور وثبته برباط كابل بلاستيكي (أحمر). (ب) املأ الأسطوانة وابدأ الترشيح عن طريق تنشيط مضخة التفريغ الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 8: استعادة الفلتر المعالج. (أ) احصل على زوج جديد من الملقط المعقم الذي يمكن التخلص منه. (ب-د) قم بإزالة الجانب الجانبي للأسطوانة للسماح بالوصول الحر إلى الفلتر الذي تمت فيه معالجة 4 لترات من مياه البحر للتو. (ه، و) استخدم الملقط المعقم الذي يمكن التخلص منه لرفع الفلتر وإزالته من أسطوانة الترشيح ، مع التأكد من ترك القرص الماص الذي يدعم الفلتر أثناء الترشيح في الجزء السفلي. (G-I) ضع الفلتر الذي تمت إزالته للتو على لوح ألومنيوم ، وقم بطيه على نفسه لتشكيل نصف قمر ، مع إغلاق الجانب الذي يحتوي على الفلتر على نفسه. (ي) قم بتسمية المغلف الذي يحتوي على المرشح على الفور ، مع تذكر تحديد نموذج التعليمات البرمجية وتسلسل المرشح (A أو B أو C) وتاريخ التصفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 9: استبدال مرشح جديد. (AC) احصل على مرشح معقم جديد من غلافه المغلق. (د ، ه) ضع المرشح الجديد على قاعدة دعم أسطوانة المرشح. (ف-ح) أغلق الأسطوانة وعزل نظام الترشيح مرة أخرى عن البيئة المحيطة. (ط) استئناف الفلترة لمدة 4 لتر أخرى؛ كرر العملية مع المرشح الثالث حتى يتم ترشيح 12لتر من كل عينة (BiB). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 10: يمكن للقوارير ذات الحجم الكبير المجمعة في سلسلة أن تزيد بشكل كبير من كفاءة التصفية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 11: تخزين المرشحات ونقلها. (AC) ضع الفلتر مع المرشحات الأخرى التي تمت تصفيتها بالفعل في كيس بلاستيكي محكم الإغلاق (للحد من ملامسة أي ملوثات) قبل وضعه في الفريزر الموجود على متن الطائرة. (D-H) قبل النزول مباشرة ، ضع الكيس البلاستيكي الذي يحتوي على المرشحات بين كتلتين أو أكثر من كتلتي التبريد وضع كل شيء في كيس أكثر برودة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 12: نقل عينات مياه البحر (إذا لم يتم إجراء الترشيح على العبارة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 13: مثال على نتائج الترميز الشريطي التي تم الحصول عليها من عينات eDNA التي تم جمعها من قوارب العبارات. للحصول على البيانات ، راجع Valsecchi et al. 2021. 9. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1: المزايا الرئيسية لاستخدام العبارات كمنصة انتهازية لأخذ العينات. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 1: قائمة مرجعية للعناصر التي سيتم أخذها على متن الطائرة لكل من جمع العينات (أعلاه) وفلترة العينات (القسم أدناه). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

الملف التكميلي 2: ورقة أخذ العينات / الترشيح. لكل عينة (مشفرة في المربع الأزرق الفاتح) ، يشار إلى الإحداثيات الجغرافية للنقطة التي بدأ فيها جمع المياه ، ومدتها ، والبيانات التي تم جمعها أثناء الترشيح (أي مدة التصفية). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف.

Discussion

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

Disclosures

Acknowledgements

نشكر بشدة أولئك الأشخاص الذين سمحوا باختبار وتطوير الطريقة المعروضة هنا ، وهم أنتونيلا أركانجلي (ISPRA) ، التي كانت تدير مشروع FLT لعقود من الزمن حيث تتم مراقبة الحيتانيات المتوسطية (وغير المتوسطية) بصريا باستمرار بالاعتماد على شبكة كثيفة من العبارات والذين آمنوا بالاقتراح الطموح للبحث عن الحمض النووي في الطرق التي تقطعها العبارات. كريستينا بيزوتي, من العبارات من كورسيكا وسردينيا, الذين قبلوا التحدي بحماس, مما أعطانا الدعم اللوجستي لاختبار المنهجية لأول مرة على حاملة من أسطولهم, (الترحيب أيضا بطاقم صانعي الفيديو الذين قاموا بالتصوير); فولفيو مافوتشي ، للتعامل مع الشركات البحرية المختلفة من أجل إصدار تصاريح لجمع العينات على متن السفينة. نشكر روبرتو لومباردو ، الذي بدأ مشروع أطروحة الماجستير في استكشاف eDNA والعبارات. أخيرا ، نشكر الشركات البحرية التي سمحت لنا بالصعود إلى eDNA وأخذ عينات منه فيما يتعلق بمشروع LIFE-CONCEPTU MARIS لأن هذا أتاح لنا الفرصة لاختبار طريقتنا على العديد من السفن المختلفة عبر البحر الأبيض المتوسط: خطوط Grimaldi و Minoan Lines و Tirrenia و Balearia و Corsica و Sardinia Ferries و Grandi Navi Veloci (GNV). ويقدم مشروع LIFE-CONCEPTU MARIS الجاري تمويله الاتحاد الأوروبي دليلا على مفهوم تكرار النهج على نطاق واسع، إلى جانب تمويل إنتاج منشور الفيديو هذا الذي سيسمح للبروتوكول التشغيلي الموحد (SOP) بأن يكون على نطاق واسع في مجتمع علمي أكبر وللجمهور. نشكر ماتيا نوتشيولا وفرانشيسكو توماسينيلي (Triton Research) على تقديم بعض اللقطات من البروتوكول. أخيرا ، نشكر جميع الأطقم التي تفاعلت معنا وساعدت في أخذ العينات في السنوات الخمس الماضية.

Materials

أغشية مرشح قطرها 4.7 سم	Biosigma S.p.A.	https://www.biosigma.com/	أغشية التصفية 0.45 مو ؛ م المسامية ، معبأة بشكل فردي ؛
/5 لتر قوارير فراغ Duran		https://www.duran-bottle-system.com/	5 L قارورة زجاجية مع سدادة
وسادات ورقية ماصة	Advantec MFS، Inc.	https://www.advantecmfs.com/category/absorbent-pads-1	وسادات ماصة لورق الترشيح مقاس 47 مم.
حقيبة في صندوق (BiB)	G.M.V. مركز الأبحاث S.r.L.	https://www.gmvagricenter.it/	10 لتر أكياس في الصندوق مع صنبور
اسطوانات الترشيح	Sartorius AG	https://shop.sartorius.com/in/industrial-microbiology-filtration-devices/biosart-100-monitors/p/M_Biosart_100_Monitors #	Biostart 100 اسطوانات الشاشة ، مع 0.45 مو ؛ وشملت غشاء م
فيلم الختم	Merck	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/sigma/hs234526a?utm_source=bing&utm_medium = cpc & utm_campaign = الكل + product_ dsa_WW_٪ 28bing + ebizpfs٪ 29 & utm_id=626946489& utm_content= 1166583023365595& msclkid = d2b55b82440b1aef56fc3ca803c 6486f & utm_term = ٪ 2Fproduct ٪ 2F	4 بوصات × 125 قدما لفة فيلم ختم المختبر
مضخة فراغ	KNF Group	https://knf.com/en/us	مضخة تفريغ محمولة لابوبورت N. 96 ؛

References

Andruszkiewicz, E. A., et al. Biomonitoring of marine vertebrates in Monterey Bay using eDNA metabarcoding. PLoS One. 12 (4), e0176343 (2017).
Djurhuus, A., et al. Environmental DNA reveals seasonal shifts and potential interactions in a marine community. Nat Commun. 11 (1), 254 (2020).
DiBattista, J. D., et al. Environmental DNA can act as a biodiversity barometer of anthropogenic pressures in coastal ecosystems. Sci Rep. 10 (1), 8365 (2018).
Beng, K. C., Corlett, R. T. Applications of environmental DNA (eDNA) in ecology and conservation: Opportunities, challenges, and prospects. Biodivers Conserv. 29 (7), 2089-2121 (2020).
He, X., et al. eDNA metabarcoding enriches traditional trawl survey data for monitoring biodiversity in the marine environment. ICES J Mar Sci. 80 (5), 1529-1538 (2023).
Pawlowski, J., et al. The future of biotic indices in the ecogenomic era: Integrating (e)DNA metabarcoding in biological assessment of aquatic ecosystems. Sci Total Environ. 637 - 638, 1295-1310 (2018).
Arcangeli, A., Marini, L., Crosti, R. Changes in cetacean presence, relative abundance and distribution over 20 years along a trans-regional fixed line transect in the central Tyrrhenian sea. Mar Ecol. 34 (1), 112-121 (2013).
Matear, L., Robbins, J. R., Hale, M., Potts, J. Cetacean Biodiversity in the Bay of Biscay: Suggestions for environmental protection derived from citizen science data. Mar Policy. 103672, 109 (2019).
Valsecchi, E., et al. Ferries and environmental DNA: Underway sampling from commercial vessels provides new opportunities for systematic genetic surveys of marine biodiversity. Front Mar Sci. 8, 704786 (2021).
Boyse, E., Beger, M., Valsecchi, E., Goodman, S. J. Sampling from commercial vessel routes can capture marine biodiversity distributions effectively. Ecol Evol. 13 (2), e9810 (2023).
Arcangeli, A., et al. Testing indicators for trend assessment of range and habitat of low-density cetacean species in the Mediterranean Sea. Front Mar Sci. 10, 1116829 (2023).
Valsecchi, E., et al. Novel universal primers for metabarcoding environmental DNA surveys of marine mammals and other marine vertebrates. Environ DNA. 2 (4), 460-476 (2020).
Hunter, M. E., et al. Improving eDNA yield and inhibitor reduction through increased water volumes and multi-filter isolation techniques. Sci Rep. 9 (1), 5259 (2019).
Capo, E., et al. Effects of filtration methods and water volume on the quantification of brown trout (Salmo trutta) and Arctic char (Salvelinus alpinus) eDNA concentrations via droplet digital PCR. Environ DNA. 2 (2), 152-160 (2020).
Li, J., et al. The effect of filtration method on the efficiency of environmental DNA capture and quantification via metabarcoding. Mol Ecol Resour. 18 (5), 1102-1114 (2018).
Collins, R. A., Wangensteen, O. S., O'Gorman, E. J., Mariani, S., Sims, D. W., Genner, M. J. Persistence of environmental DNA in marine systems. Commun Biol. 1, 185 (2018).
Kelly, R. P., Gallego, R., Jacobs-Palmer, E. The effect of tides on nearshore environmental DNA. PeerJ. 6, e4521 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

المختبر العائم: الإجراء التشغيلي القياسي لجمع عينات مياه البحر وترشيحها من العبارات العاملة لتحليل الحمض النووي البيئي