مقالة منهجية

نموذج التئام الجروح الحروق الشبيه برقعة الشطرنج للفئران على أساس جهاز التسخين الرقمي

2.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67375

⸱

ديسمبر 27, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Oral Diseases & National Center for Stomatology & National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, 2Department of Endodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University

في هذه المقالة

ملخص

يتم تقديم بروتوكول مبسط لإنشاء نموذج التئام جروح الحروق في الفئران باستخدام جهاز تسخين رقمي. تسهل المواقع التجريبية الشبيهة برقعة الشطرنج التي تم إنشاؤها على الجلد مزيدا من التحليل الوظيفي لمقايسة التئام الجروح.

الملخص

تعد إصابات الحروق الشديدة من بين أكثر الحالات المؤلمة والمنهكة جسديا ، حيث تؤثر على كل جهاز أعضاء تقريبا وتؤدي إلى مراضة ووفيات كبيرة. نظرا لتعقيدها وتورط أعضاء متعددة ، تم إنشاء نماذج حيوانية مختلفة لتكرار جوانب مختلفة من إصابة الحروق. تختلف الطرق المستخدمة لإنتاج الأسطح المحترقة بين النماذج الحيوانية التجريبية. تصف هذه الدراسة نموذجا بسيطا وفعالا من حيث التكلفة وسهل الاستخدام لعمل حروق متسقة كاملة السماكة باستخدام جهاز تسخين رقمي. تم تطبيق طرف هذا الجهاز على ظهر الفئران لمدة 10 ثوان عند 97 درجة مئوية لإنشاء حرق يشبه رقعة الشطرنج وفحص التئام الجروح تحت علاج ضمادة تجريبية. تم جمع عينات الجلد للتحليل النسيجي ، بما في ذلك تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وتلوين ماسون. تم تقييم التئام الجروح من خلال تحليل منطقة الجرح والفحص المجهري للتسلل الالتهابي وإعادة الظهارة وتكوين الأنسجة الحبيبية. يمكن أن يكون نموذج إصابة حروق الفئران بمثابة أداة أساسية في دراسة الفيزيولوجيا المرضية للإصابات الحرارية وتقييم التدخلات العلاجية.

المقدمة

تعتبر الحروق من الإصابات الخطيرة للجلد ، والتي تسببها التعرض للحرارة والكهرباء والمواد الكيميائية والتعرضللإشعاع 1،2. يمكن تصنيفها إلى أربع درجات حسب عمق الإصابة ، بدءا من البشرة إلى السماكة الكاملة للجلد ، وحتى العضلات والعظام. يمكن أن تؤدي الحروق الصغيرة إلى تكوين ندبات وتزيد من خطر الإصابة بالعدوى. لا تسبب مساحة كبيرة من إصابات الحروق أضرارا موضعية فحسب ، بل تحفز أيضا اضطرابات القلب والكلى والأعضاء أو الأنظمة الأخرى في الجسم من خلال الالتهابات الشديدة والطويلة الأمد والاستجابات المناعية ، مما يؤدي إلى عواقب جهازية خطيرة وارتفاع معدلاتالمراضة 3. يرافق معظم الناجين من إصابات الحروق إعاقات جسدية طويلة الأمد وضيق عاطفي وانخفاض نوعيةالحياة 4،5. لذلك ، من المهم دراسة العملية المرضية للحروق وآليات تجديد الأنسجة المحروقة.

تشارك في الاستجابات المناعية ، وتجديد الأنسجة ، والتوازن المنهجي ، لم تستطع الدراسات المختبرية التحقيق بشكل شامل في العملية المرضية لالتئام جروح الحروق. وهكذا ، على مدى العقدين الماضيين ، من أجل استكشاف التدخلات العلاجية المحتملة ، تم تطوير نماذج حيوانية مختلفة لشفاء جروح الحروق لتكرار السمات المختلفة لإصابة الحروق6،7. عادة ما تنتج جروح الحروق على السطح الظهري للخنازير والجرذان والفئران والأرانب الأخرى بعد إزالة الشعر. يمكن أن يستمر وقت الاحتراق لمدة 3 ثوان إلى 30 ثانية لتشكيل ضرر حراري جزئي إلى كامل السماكة مع نطاق من 5٪ إلى 30٪ من إجمالي مساحة سطح الجسم (TBSA) 8. لا توجد حاليا نماذج موحدة لهذه الأساليب في أبحاث الحروق بسبب التباين الكبير في التقنيات المستخدمة. تختلف الطرق المستخدمة لإنتاج الأسطح المحترقة بين النماذج الحيوانية التجريبية ، بما في ذلك لهب الغاز9 ، وحمام الإيثانول المحترق10 ، واللوح / القضيب المعدني المفرد المسخنمسبقا 11،12 ، والماء المغلي أو الساخن13،14. ومع ذلك ، فإن تقنية إحداث الحروق وعمق الحروق الناتج غالبا ما تكون غير متسقة وسيئة الوصف في الدراسات السابقة ، وهو أمر بالغ الأهمية في تحديد شدة الحرق وطريقة علاج الحروق.

تهدف هذه الدراسة إلى تطوير نموذج حيواني بسيط وفعال من حيث التكلفة وسهل الاستخدام لخلق حروق متسقة كاملة السماكة في سيناريوهات سريرية محاكاة. في هذا البروتوكول ، استخدمنا جهاز تسخين رقمي مناسب للتحكم في عمق الحرق عن طريق ضبط درجة الحرارة المطبقة على الجلد. يمكن تبديل طرف هذا الجهاز إلى أحجام مختلفة لإحداث حروق حرارية بنطاقات متفاوتة من TBSA. يسمح ذلك بإنشاء جرح حروق يشبه رقعة الشطرنج على ظهر الفأر ، مما يتيح مقارنة العديد من العلاجات التجريبية والعلاجات الضابطة داخل نفس. لاحظنا وسجلنا عملية إغلاق الجرح. تم حصاد عينات الجلد للتقييم النسيجي (تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوسين (H & E) وتلوين ماسون ثلاثي الألوان) في مراحل مختلفة من التئام الجروح. يقلل هذا النهج من عدد المستخدمة في التجربة ، وبالتالي يقلل من التكاليف الاقتصادية مع كونه أكثر توافقا مع أخلاقيات. ستزود هذه الدراسة الباحثين بالأدوات الأساسية لتسهيل تطوير علاجات جديدة لإصابات الحروق والكشف عن الآليات الفيزيولوجية المرضية لالتئام جروح الحروق.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات الحيوانية في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة الأخلاقية لكلية غرب الصين لطب الأسنان بجامعة سيتشوان (WCHSIRB-D-2024-499). تم استخدام أربعة وعشرين فأرا C57BL / 6 يبلغ من العمر ثمانية أسابيع (أنثى ، وزن الجسم 25-30 جم) في هذه الدراسة. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير المعدات والفأر قبل إصابة الحروق

  1. احصل على ووضعها في أقفاص لمدة 7 أيام عند وصولها للسماح لها بالتأقلم مع البيئة.
  2. تعقيم منطقة العمل عن طريق الرش والمسح بنسبة 70٪ من الإيثانول (v / v). قم بتغطية طاولة العمليات بضمادات ماصة جراحية معقمة.
  3. اضبط درجة حرارة جهاز التسخين الرقمي على 97 درجة مئوية. يتكون جهاز التسخين من ثلاثة أجزاء (الشكل 1).
    ملاحظة: يمكن ضبط درجة الحرارة من 50-450 درجة مئوية من خلال وحدة التحكم في درجة الحرارة (الشكل 1 أ). يتم استخدام قاعدة الحامل لوضع الطرف (الشكل 1 ب) ، والذي يمكن تفكيكه (الشكل 1 ج) لاستبدال أحجام الأدوات المختلفة. تطهير الطرف باليودوفور أو الكحول.
  4. قم بتخدير الفأر باستخدام 5٪ من الأيزوفلوران في 100٪ أكسجين في غرفة الحث لمدة 3 دقائق (معدل التدفق: 4 لتر / دقيقة) حتى يتباطأ التنفس. تقييم عمق التخدير باستخدام اختبار قرصة إصبع القدم.
    ملاحظة: قد يؤدي استنشاق الأيزوفلوران إلى النعاس وإلحاق الضرر بنظام القلب والأوعية الدموية. من الضروري ارتداء معدات واقية والتعامل معها داخل غطاء الدخان في منطقة جيدة التهوية.
  5. بمجرد تخدير الفأر بعمق ، انقله إلى وسادة ساخنة في وضع الانبطاح للحفاظ على الدفء ومنع انخفاض حرارة الجسم أثناء التعافي من التخدير. قلل الأيزوفلوران إلى 1. 5٪ أكسجين للصيانة عبر مخروط الأنف.
  6. ضع جل التشحيم على كلتا عيني الفأر بقطعة قطن لمنع جفاف القرنية.

2. إحداث إصابة حروق كاملة السماكة

ملاحظة: تظهر العملية العامة لتحريض الحرق وتحليله في الشكل 2.

  1. احلق جلد الفأر باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية على مساحة يبلغ طولها حوالي 5 سم وعرضها 4 سم من الرقبة إلى الذيل. اعمل بلطف لتجنب إصابة الجلد عند الحلاقة (الشكل 3 ج).
  2. استخدمي قضيبا قطنيا لوضع كريم مزيل الشعر على منطقة الجلد المحلوقة لمدة 3 دقائق (الشكل 3 د).
    ملاحظة: تجنب وضع كريم إزالة الشعر على أجزاء أخرى من الماوس لمنع الحروق التي يصعب اكتشافها. تسبب الكريم في حدوث طفح جلدي إذا تم استخدامه لأكثر من 5 دقائق. تختلف المدة الدقيقة للفعالية المثلى بين المنتجات ويجب أن يحددها المشغل.
  3. امسحي الكريم باستخدام شاش رطب حتى لا يتم اكتشاف الكريم والشعر. تطهير المنطقة الجراحية بمقشر الكلورهيكسيدين متبوعا ب 70٪ إيثانول (v / v) ثلاث مرات لكل منهما. نظف وجفف المنطقة بشاش معقم.
  4. استخدم طرف ماصة معقم سعة 1 مل بقطر 9 مم (الشكل 3 أ) مغموس في حبر معقم لتحديد مواقع الجرح المرغوبة بدقة. يتميز الجلد الظهري للفأر بتضاريس غير متساوية. يعد تحديد منطقة الجرح بعيدا عن الحبل الشوكي للفئران أمرا ضروريا لضمان التكرار.
  5. قم بتغطية الجلد بستارة معقمة مشذبة مسبقا ، مع ترك منطقة الجراحة خالية (الشكل 3). ارتد قفازات مقاومة للحرارة وتحقق من درجة حرارة جهاز التسخين الرقمي. قبل وبعد تحريض الحرق ، قم بتعقيم طرف الجهاز بنسبة 70٪ من الإيثانول (v / v).
  6. ضع طرف جهاز التسخين على وسط مواقع الجرح الموجودة (97 درجة مئوية لمدة 10 ثوان) لإنشاء ستة جروح مستديرة بقطر 4 مم (الشكل 3 ب). الفاصل الزمني بين الحروق المجاورة هو 0.5-1 سم. تحديد عدد الحروق حسب التصميم التجريبي.
    ملاحظة: الحرق ناتج بشكل رئيسي عن التوصيل الحراري. لذلك ، ليس من الضروري ممارسة الضغط على القضيب ، أي إبقائه ملامسا للجلد عن طريق الجاذبية أثناء تحريض الحرق. كانت هناك ستة حروق للتصميم التجريبي. هذا هو الحد الأقصى لعدد جروح الحروق التي يمكن بناؤها وفقا للجهاز الذي استخدمناه ومساحة ظهر الفأر. يمكن تحقيق تكرارات متعددة من نفس المجموعة التجريبية على هذا الأساس.

3. رعاية وقياس ما بعد الحرق

  1. ضع الثلج على جرح الحروق لمدة 5 دقائق لتقليل الألم المحتمل لإدارة الألم (الشكل 3G).
  2. قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران ، وإزالة مخروط الأنف بعد إصابة الحروق. انقل الماوس إلى وسادة تدفئة حتى يتحرك الماوس بشكل طبيعي (على سبيل المثال ، لا يجلس أو يرتجف).
  3. ضع كل فأر في قفص استرداد لمنعهم من خدش بعضهم البعض. قم بتليين بعض كريات الطعام عن طريق إضافة 5-10 قطرات من ماء الشرب إلى كل حبيبات وضعها على أرضية القفص لتسهيل التغذية.
    ملاحظة: تعقيم الأقفاص بالرش والمسح بنسبة 70٪ من الإيثانول (vol / vol). يجب استبدال الفراش بانتظام للحفاظ على دفء الفئران وامتصاص البول.
  4. يتم تطبيق البوبرينورفين (0.1 ملغ/كغ) تحت الجلد في مكان ذيلية مرتين يوميا لمدة 3 أيام، مع ضمان 8 ساعات على الأقل بين الحقن.
  5. نظف جميع الجروح بشاش معقم مبلل بالمحلول الملحي بعد 24 ساعة من تحريض الحروق. امسح الجلد بالشاش واستخدم كمية صغيرة من الجل المضاد للبكتيريا (TKH hydrogel) باستخدام حقنة لتغطية جرح الحروق12،14. كرر هذا الإجراء في الأيام 3 و 7 و 10 بعد ذلك.
  6. استخدم ضمادة شفافة ومسامية لتغطية الجروح. يجب أن يغطي حجم الضمادة حوالي 1 سم حول الجرح ويجب ألا يغطي المنطقة دون إزالة الشعر.
    ملاحظة: قم بتغيير ضمادة الجرح مرة واحدة على الأقل كل يومين. قد يؤدي الاستخدام المطول للضمادة دون استبدال إلى عدوى الجرح بتكوين القيح ، مما يؤدي إلى تأخر التئام الجروح.
  7. طوال فترة المتابعة ، قم بقياس الوزن كل 2-3 أيام. بشكل عام ، يجب التضحية بالفئران التي تفقد 15٪ -20٪ من وزن جسمها الأولي وإزالتها من التجربة.

4. جمع الجروح

  1. في 0 و 3 و 7 و 10 و 14 يوما ، ضع علامة على الجرح بطرف طرف ماصة معقمة سعة 1 مل ، وقم بتسجيله بكاميرا رقمية.
  2. القتل الرحيم للفئران عن طريق جرعة زائدة من التخدير وخلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة من المؤسسة).
    ملاحظة: كن حذرا أثناء خلع عنق الرحم لتجنب الشد المفرط ، مما قد يؤدي إلى تلف جروح الظهر.
  3. باستخدام المقص ، اعزل موقع الجرح والجلد المحيط به ، بما في ذلك العضلات الأساسية (1 سم × 1 سم). استعد لثلاث عينات على الأقل لكل مجموعة.
  4. ثبت عينات الجلد في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 24 ساعة وتخزينها في 4 درجات مئوية. يجب أن يكون حجم التثبيت 30 ضعف حجم الأنسجة15،16.
    ملاحظة: PFA خطير. تأكد من العمل في منطقة جيدة التهوية واستخدام معدات الحماية المناسبة.

5. تقييم التئام الجروح

  1. اغسل مناديل الجرح مرتين باستخدام PBS وانشرها بورق ترشيح ، والذي يجب قصه بحجم مناسب (الشكل 2H). نظرا لوجود بعض المحتوى المخاطي داخل طبقة الأنسجة تحت الجلد ، فإنه يلتصق بسطح ورق الترشيح دون حركة أو تجعيد الأنسجة.
    1. ضع ورق الترشيح والعينة في كاسيت مناديل لتجفيف البارافين للحصول على عينات من الأنسجة الملساء نسبيا ثم قم بتضمين الأنسجة15،16. تخزين العينات في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قم بتمديد الأنسجة قدر الإمكان وتجنب أي طي ، حيث ستصبح هذه الطيات دائمة بعد التثبيت.
  2. قم بقص العينات المضمنة في البارافين إلى أقسام بسماكة 5 ميكرومتر وشرائح البقع عبر H & E و Masson trichrome لتقييم مدى الأنسجة الحبيبية ، وتكوين الأوعية الدموية ، وترسب الكولاجين ، مما يوفر دليلا لتقييم المراحل المختلفة وتطور التئام الجروح17،18.
  3. التقط صورا لجميع العينات باستخدام مجهر بهدف 40x.
  4. استخدم برنامجا متوافقا لتحليل قسم الجلد الملطخ ، بما في ذلك البشرة والأدمة والأنسجة تحت الجلد وحالة العضلات.

النتائج

في هذا البروتوكول ، تم إنشاء جروح حروق تشبه رقعة الشطرنج بمدة حرق تبلغ 10 ثوان عند 97 درجة مئوية بواسطة جهاز التسخين الرقمي (الشكل 1). طرف الجهاز مصنوع من النحاس النقي المعروف بالتوصيل الحراري الممتاز وقدرات التسخين السريع. القبضة التي يحملها المجرب مصنوعة من مادة البولي كربونات ، والتي توفر مقاومة للحرارة وعدم القابلية للاشتعال. بالمقارنة مع اللوحة / القضيب المعدني المفرد المسخن مسبقا أو طرق الغليان أو الماء الساخن ، يظهر هذا الجهاز أداء أمان فائقا ويقلل من وقت التخدير في الفئران ، وبالتالي تقصير مدة التجربة الإجمالية.

تظهر العملية العامة لتحريض الحروق وتحليلها في الشكل 2. كان لكل ستة جروح حروق في الظهر ، مرتبة كما هو موضح في الشكل 2E. تم تقييم حجم الجرح في هذه ، وتم حصاد عينات الجلد للتحليل النسيجي ، بما في ذلك تلطيخ H & E و Masson ثلاثي الألوان في أيام ما بعد الحرق 1 و 3 و 7 و 10 و 14 على التوالي.

كان كل جرح حرق دائريا الشكل بمساحة متساوية بالإضافة إلى عمق موحد بعد تحريض الحرق. تحول لون حافة إصابة الحروق من الأبيض الشمعي إلى الأحمر ، مصحوبا بمنطقة فرط الدم بسبب الاستجابة الالتهابية الفورية للإصابة. بالإضافة إلى ذلك ، زاد حجم جرح الحروق بشكل طفيف خلال 72 ساعة بعد الحرق (الشكل 4 أ).

كشف التحليل المجهري للأجزاء الملطخة بثلاثية الألوان من الجروح H&E و Masson (الشكل 4 ب) عن تدمير كامل لطبقة البشرة وتلف السماكة الكاملة للأدمة ، مما يؤثر على كل من الدهون تحت الجلد والعضلات. أشار الفحص النسيجي إلى أن عملية التئام الجروح كانت في المرحلة الالتهابية في اليوم 3 ، والتي تتميز بتوسع الأوعية وتسلل كبير للخلايا الالتهابية. لوحظ انخفاض ملحوظ في مساحة الجرح في اليوم السابع بعد الحرق مقارنة باليوم 3 ، كما هو موضح في الصور المجهرية للعينات. تتشكل الأنسجة الحبيبية والقلب والأوعية الدموية ، وتترسب ألياف الكولاجين بكثافة في اليوم 14 ، مما يعني أن التئام الجروح يدخل مرحلة إعادة التشكيل. تعافت الجروح دون عدوى واضحة طوال عملية الشفاء.

بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم قدرات التئام الجروح عن طريق تحديد بيانات التئام الجروح وتحليل تتبع الجروح (الشكل 5). لوحظ أن تعافي الجروح قد تم تعزيزه في الجروح التي تم علاجها باستخدام هيدروجيل ببتيد TKH12،14 ، كما يتضح من مناطق الجرح الأصغر بكثير في الأيام 7 و 10 و 14.

أكد الفاصل الزمني بين الجروح المجاورة (الشكل 6) ، سواء كان عرضيا أو طوليا ، عدم وجود فرق مقارنة بالجلد غير المحترق. كانت البشرة والأدمة والأنسجة تحت الجلد سليمة ، ولم يكن هناك تسلل للخلايا الليمفاوية ولا توسع للأوعية. عملية التئام الجرحين لا تتداخل مع بعضها البعض. لذلك ، يمكن استخدام أدوية أو ضمادات مختلفة لعلاج الجروح على أساس النموذج لتقييم التأثير في الجسم الحي.

figure-results-1
الشكل 1: جهاز تسخين رقمي لتحريض الحرق. جهاز التسخين الرقمي المستخدم في إحداث إصابات الحروق. (أ) يسمح جهاز التحكم في درجة الحرارة بإعدادات درجة حرارة تتراوح من 50-450 درجة مئوية. (ب) يتم استخدام قاعدة الحامل لتثبيت طرف الاحتراق. (ج) يمكن تبديل طرف الجهاز إلى أحجام مختلفة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تخطيطي لنموذج الجرح الشبيه برقعة الشطرنج. مخطط تفصيلي خطوة بخطوة لإعادة إنتاج نموذج الجرح الشبيه برقعة الشطرنج الموصوف في المقالة. (أ) يستخدم فأر يبلغ من العمر 8 أسابيع كنموذج لتجارب التئام الجروح. (ب) تتم إزالة الشعر من منطقة الجرح المحددة. (ج) يتم تمييز مواقع الجرح الستة باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل. (د) يتم استخدام جهاز تسخين رقمي لإنشاء ستة جروح حروق في وسط كل موقع محدد (E). (و) صورة مقربة للظهر بعد تحريض الحرق. (ز) يتم حصاد عينات الجلد (حوالي 1 سم × 1 سم) في الأيام 3 و 7 و 10 و 14. (ح) يتم تسطيح عينات الجلد باستخدام ورق الترشيح ونقلها إلى علب التضمين. (I) يتم إجراء تجفيف البارافين ، و (J) يتم تقسيم العينات إلى سمك 5 ميكرومتر. (ك) يتم تلطيخ الأقسام باستخدام الهيماتوكسيلين واليوزين (H & E) ، وثلاثي الألوان في ماسون. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: عملية تحريض إصابة الحروق بسماكة كاملة. (أ) يبلغ قطر طرف الماصة سعة 1 مل و(ب) طرف جهاز التسخين الرقمي 9 مم و4 مم على التوالي. (ج) يتم حلق المنطقة الظهرية للفأر بماكينة حلاقة كهربائية. (د) يتم وضع كريم إزالة الشعر لمدة 3 دقائق. (ه) يتم تنظيف منطقة الحلاقة وتجفيفها، ويتم تمييز نقاط الجرح برأس ماصة معقم سعة 1 مل. (F) يتم تطبيق جهاز التسخين الرقمي عند 97 درجة مئوية لمدة 10 ثوان لإنشاء ستة جروح حروق. (ز) يتم وضع الثلج على جروح الحروق لإدارة الألم. (ح) يظهر الجزء الخلفي من الفأر بالكامل جروح الحروق الستة كاملة السماكة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4: صور تمثيلية لجروح الحروق والتحليل النسيجي. (أ) صور لجروح الحروق في الأيام 3 و 7 و 10 و 14 ، تظهر تطور الشفاء. (ب) تظهر الصور النسيجية الملطخة ب H & E و Masson ثلاثي الألوان التئام الجروح وتجديد الجلد. أشرطة المقياس = 200 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-5
الشكل 5: تباين حجم الجرح بمرور الوقت. (أ) التباين في حجم الجرح في المعالجة بالهيدروجيل TKH بمرور الوقت ، تم تحليله باستخدام برنامج ImageJ. (ب) يتم تقديم بيانات تتبع الجرح المقابلة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6: جروح الحروق المجاورة والتحليل النسيجي. (أ) صور تمثيلية لجروح الحروق المجاورة في اليوم 1. (ب) عينات الجروح المجاورة التي تم حصادها للتحليل النسيجي في اليوم 3 (محاطة بدائرة باللون الأحمر). (ج) يستخدم ورق الترشيح لتسطيح عينات الأنسجة قبل جفاف البارافين. (د) تحليل H & E و Masson ثلاثي الألوان للجروح المجاورة. قضبان المقياس: 1 مم و 200 ميكرومتر (مكبرة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

بالنسبة لدراسات الحروق ، تركز النماذج المختبرية عادة على التأثيرات المثبطة للعوامل المضادة للميكروبات المحلية أو المضادات الحيوية على البكتيريا المرتبطة بالحروق ، مثل المكورات العنقودية الذهبية و Pseudomonas aeruginosa19 ، بالإضافة إلى تأثير المواد الحيوية المختلفة (مثل الإيلاستين والحرير وضمادات الهيدروجيل14،20) على الخلايا الالتهابية بعد الحرق (مثل العدلات والضامة) أو الخلايا الجذعية (مثل الخلايا الجذعية الوسيطة). عادة ما يتم إجراء هذه التجارب في بيئات يتم التحكم فيها بشكل مصطنع ، وقد تظهر الخلايا المزروعة في المختبر خصائص وسلوكيات نمو تختلف عن تلك الموجودة في الجسم الحي ، والتي قد تفشل في تكرار العمليات الفسيولوجية لالتئام جروح الحروق بشكل كامل ، مثل التفاعلات من خلية إلى خلية وتأثير المصفوفة خارج الخلية. لهذه الأسباب ، تعتبر النماذج الحيوانية للحروق ضرورية لتوضيح الآليات المرضية بعد الحرق وتقييم الأساليب العلاجية الجديدة. تمر عملية التئام الجروح في الفئران والبشر بأربع مراحل متداخلة ولكنها متميزة: الالتهاب ، والانتشار ، وإعادة تكوين الظهارة ، وإعادة التشكيل21،22. هناك العديد من المزايا البيولوجية لاستخدام الفئران كموضوعات تجريبية ، بما في ذلك توافر العديد من الكواشف الخاصة بالفئران وجدوى إنشاء نماذج معدلة وراثيا للتحقيق في مسارات الإشارات الجزيئية المشاركة في عملية الاسترداد. هذا يجعل الفئران واحدة من أكثر النماذج الحيوانية استخداما للبحث عن الحروق والتئام الجروح.

أنشأت الدراسة الحالية نموذجا للجرح يشبه رقعة الشطرنج لإصابة الحروق كاملة السماكة وقيمت فعالية ضمادة الهيدروجيل باستخدام هذا النموذج. تشير النتائج إلى أن هذا النموذج يمكنه مراقبة الأداء السريري للضمادات التجريبية بشكل فعال. داخل كل ، تم توزيع ستة جروح حروق بشكل متماثل على طول العمود الفقري. يمكن إنشاء جروح الحروق في مواقع متشابهة ولكن على فئران مختلفة. نظرا لمحدودية مساحة الجلد في الظهر وعدد الجروح ، أظهر التحليل النسيجي أن الجروح لم تتفاعل مع بعضها البعض ، مما يضمن تقييما مستقلا لكل ضمادة تجريبية في مواقع مختلفة على نفس ظهر الفأر ، مما يقلل من التحيز المتعلق بعملية التئام الجروح. بالإضافة إلى ذلك ، يستفيد هذا النموذج أيضا من التأكد من أن كل فأر يعمل كعنصر تحكم خاص به ، مما يجعل من الممكن مقارنة العلاجات التجريبية والضابطة على ظهر نفس الفأر ، مما يؤدي إلى انخفاض كبير في عدد والتكلفة التجريبية. نظرا للتأثيرات المتفاوتة للأدوية المختلفة على الصحة العامة للفئران ، إذا كان سيتم تطبيق أدوية متعددة على جلد نفس الفأر لعلاج الجروح المختلفة والمقارنة اللاحقة ، فقد يكون من الضروري ملاحظة والتحقق مما إذا كان تطبيق دواء واحد أو التطبيق المشترك للأدوية المختلفة سيؤثر على الصحة العامة للفأر. بالإضافة إلى ذلك ، يجب الانتباه إلى استقرار أو التصاق الأدوية المختلفة على سطح الجلد لمنع التلوث المتبادل للأدوية أو عدوى الجروح بسبب خدش الفأر أثناء عملية الشفاء.

يعد جمع عينات الجلد أمرا بالغ الأهمية للتحليل النسيجي اللاحق. سوف تتقلص حافة الأنسجة وتثني في المثبت دون أي علاج16. بعد جفاف البارافين ومقطع ، سيكون أيضا منحنيا أو حتى متداخلا جزئيا على الشريحة ، مما ينتج عنه صور قبيحة تحت المجهر ويحتمل أن يؤثر على مزيد من التحليل النسيجي ، مثل التحليل الإحصائي لطول الجرح أو سمكه. لذلك ، يمكن أن يؤدي استخدام ورق الترشيح لتسطيح الأنسجة إلى الحصول على قسم أكثر سلاسة على الشريحة ، مما يجعل الصورة النسيجية أنيقة ويسهل المزيد من التحليل الإحصائي. حاولنا أيضا استخدام مشابك الورق لإصلاح العينة قبل الجفاف ، مما ساعد على ضمان نعومة الأنسجة. ومع ذلك ، فإن تطبيق مشابك الورق قد يمارس ضغطا على الأنسجة المثبتة ، مما يؤدي إلى ضغط الأنسجة وتشوهها. لذلك ، عند استخدام هذه الطريقة ، لا يمكن تثبيت جزء جرح الحروق لتجنب التأثير على المراقبة.

يمكن أن تؤثر العديد من العوامل على عملية الشفاء ، بما في ذلك الألم والحكة والعدوىالبكتيرية 23. تعد الإدارة الفعالة لآلام الحروق أمرا بالغ الأهمية للتعافي وإعادة دمج المرضى الذين يعانون من إصابات الحروق. يمكن أن يؤدي عدم كفاية السيطرة على الألم إلى إعاقة عملية الشفاء ، مما يؤدي إلى تحديات جسدية ونفسية دائمة ، بالإضافة إلى الإقامة الطويلة في المستشفى24. بشكل عام ، يؤثر الألم على سلوك التغذية في الفئران. لذلك ، تم علاج كل جرح على الفور بالثلج بعد الحرق ، وحقن البوبرينورفين (0.1 مجم / كجم) تحت الجلد مرتين يوميا لمدة 3 أيام للتحكم في الألم. بالإضافة إلى ذلك ، تم تليين كريات الطعام ووضعها على أرضية القفص لتسهيل التغذية. في إعدادات المساكن الجماعية ، قد تخدش الفئران وتلعق جروح بعضها البعض ، مما قد يؤخر التئام الجروح أو يسبب العدوى. لذلك ، يصبح السكن الفردي للفئران ضروريا كإجراء وقائي. يمكن أن يؤدي استخدام ضمادة قابلة للتنفس لتغطية الظهر بعد تحريض الحروق إلى منع الفئران من خدش الجرح وتقليل خطر الإصابةبالعدوى 25. ومع ذلك ، من الضروري اختيار الضمادات بحكمة وقصها بالحجم المناسب للسماح بالحركة الطبيعية للفئران. يجب استبدال الضمادات على الفور في حالة سقوطها ، مع التوصية بتغييرها مرة واحدة على الأقل كل يومين. قد يؤدي الاستخدام المطول للضمادات إلى عدم كفاية امتصاص إفرازات الجرح.

على الرغم من أن نموذج الفأر له مزاياه الخاصة ، إلا أنه لا يزال غير قادر على محاكاة عملية التئام الجروح لدى البشر بشكل كامل. يشفى البشر في المقام الأول من خلال إعادة الظهارة والتحبيب. في المقابل ، يتميز جلد الفأر بطبقة فريدة من نوعها من العضلات الهيكلية الموجودة فقط في بلاتيزما الرقبة عند البشر7 ، لذلك يحدث التئام الجروح بشكل أساسي من خلال تقلص الجرح. بالإضافة إلى ذلك ، قد يمتلك جلد الفأر مجموعة غنية من الخلايا السلفية ، مما يسهل الشفاء السريع للجلد والتقرن26،27. تساهم هذه العوامل مجتمعة في تقليل وقت الشفاء بشكل كبير. في النماذج الحيوانية ، تم استخدام حلقات الجروح المضادة للتقلص للتخفيف من تأثير تقلص الجرح على عملية الشفاء وتقليد التئام الجروح الفسيولوجي الشبيه بالإنسان والذي يشفى بأنسجة التحبيب وإعادة الظهارة12،17،28.

يوفر التأسيس الناجح لنموذج إصابة حروق الفئران أداة قيمة لدراسة الفيزيولوجيا المرضية للإصابات الحرارية وتقييم التدخلات العلاجية المحتملة. تتوافق التغيرات النسيجية الملحوظة في أنسجة الجلد المحروقة مع السمات المميزة للإصابة الحرارية ، مما يسلط الضوء على موثوقية وصلاحية النموذج في تلخيص المظاهر السريرية للحروق.

بشكل عام ، يوفر نموذج إصابة حروق الفأر منصة قوية للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء تلف الأنسجة الناجم عن الحروق والالتهابات وعمليات التئام الجروح. قد تساهم الدراسات المستقبلية التي تستخدم هذا النموذج في تطوير مناهج علاجية جديدة تهدف إلى تحسين النتائج لمرضى الحروق وتقليل عبء المراضة والوفيات المرتبطة بالحروق.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (23ZYZYTS0120) ، ومنح مستشفى غرب الصين لطب الأسنان بجامعة سيتشوان (RD-03-202011) ، وبرنامج سيتشوان للعلوم والتكنولوجيا (2022NSFSC0614). تم إنشاء الأرقام باستخدام BioRender. كوم.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 مل طرف ماصةKIRGEN ، الولايات المتحدة الأمريكيةKG1333تستخدم لتحديد مواقع جرح الحروق
3M فيلم Tegaderm3M ، الولايات المتحدة الأمريكية1624WCN 6 سم × 7 سملغطاء الجرح بعد تحريض الحروق
4٪ بارافورمالدهايد (PFA)Biosharp ، الصينBL539Aتستخدم لإصلاح عينات الجلد
بوبرينورفينسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكيةPHR8955-50 مجملإدارة آلام الفئران
C57BL / 6 الفئرانتشنغدو داشو شركة التجريبية ، الصينلا شيءلإنشاء نموذج حرق
كريم إزالة الشعرVeet ، الصينو [مدش] ؛لإزالة الشعر الظهري للفئران
جهاز التسخين الرقميشنتشن كاببر شركة التكنولوجيا ، الصينNo.936Dلتحريض حرق الفئران
ماكينة حلاقة كهربائيةAUX ، الصينAUX-A5لإزالة الشعر الظهري لورق ترشيح الفئران
و [مدش] ؛و [مدش]تستخدم لكشف عينات الجلد
برنامجGraphPad &[مدش] ؛منشور GraphPad 9.5.0لتحليل منطقة جرح الحروق
قفازات مقاومة للحرارةو [مدش] ؛و [مدش]تستخدم لحمل طرف جهاز التدفئة الرقمية
هيماتوكسيلين وإيوسين وصمة عار كيتSolarbio,الصينG1120للتحليل النسيجي للشرائح
ImageJ البرمجيات&[مدش];ImageJ 1.54fلتحليل منطقة جرح الحروق
IsofluraneRWD ، الصينR510-22-10لتخدير الفئران
Tychrome Stain KitMasson Solarbio ، الصينG1340للتحليل النسيجي للشرائح مجهر
أوليمبوس ، اليابان & nbsp ؛يستخدم VS200 ASWلمسح H& E و Masson ملطخة الشرائح
كاسيت الأنسجةCITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.، LTD، الصين31050102Wلتجفيف الأنسجة البارافين وتضمين البارافين
مجموعة من

المراجع

  1. Mofazzal Jahromi, M. A., et al. Nanomedicine and advanced technologies for burns: Preventing infection and facilitating wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 123, 33-64 (2018).
  2. Burgess, M., Valdera, F., Varon, D., Kankuri, E., Nuutila, K. The immune and regenerative response to burn injury. Cells. 11 (19), 3073(2022).
  3. Arbuthnot, M. K., Garcia, A. V. Early resuscitation and management of severe pediatric burns. Sem Pediatr Surg. 28 (1), 73-78 (2019).
  4. Smolle, C., et al. Recent trends in burn epidemiology worldwide: A systematic review. Burns. 43 (2), 249-257 (2017).
  5. Jeschke, M. G., et al. Burn injury. Nat Rev Dis Primers. 6, 11(2020).
  6. Nomellini, V., Gomez, C. R., Gamelli, R. L., Kovacs, E. J. Aging and animal models of systemic insult: Trauma, burn, and sepsis. Shock. 31 (1), 11-20 (2009).
  7. Wong, V. W., Sorkin, M., Glotzbach, J. P., Longaker, M. T., Gurtner, G. C. Surgical approaches to create murine models of human wound healing. J Biomed Biotechnol. 2011, 969618(2011).
  8. Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. G. Animal models in burn research. Cell Mol Life Sci. 71 (17), 3241-3255 (2014).
  9. Katakura, T., Yoshida, T., Kobayashi, M., Herndon, D. N., Suzuki, F. Immunological control of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) infection in an immunodeficient murine model of thermal injuries. Clin Exp Immunol. 142 (3), 419-425 (2005).
  10. Dai, T., et al. Animal models of external traumatic wound infections. Virulence. 2 (4), 296-315 (2011).
  11. Tavares Pereira, D. D. S., Lima-Ribeiro, M. H. M., De Pontes-Filho, N. T., Carneiro-Leão, A. M. D. A., Correia, M. T. D. S. Development of animal model for studying deep second-degree thermal burns. J Biomed Biotechnol. 2012, 460841(2012).
  12. Gong, Y., et al. Exudate absorbing and antimicrobial hydrogel integrated with multifunctional curcumin-loaded magnesium polyphenol network for facilitating burn wound healing. ACS Nano. 17 (22), 22355-22370 (2023).
  13. Dahiya, P. Burns as a model of sirs. Front Biosci. 14 (13), 4962-4967 (2009).
  14. Yergoz, F., et al. Heparin mimetic peptide nanofiber gel promotes regeneration of full-thickness burn injury. Biomaterials. 134, 117-127 (2017).
  15. Rao, G., et al. Rat burn model to study full-thickness cutaneous thermal burn and infection. J Vis Exp. (186), e64345(2022).
  16. Yampolsky, M., Bachelet, I., Fuchs, Y. Reproducible strategy for excisional skin-wound-healing studies in mice. Nat Protoc. 19 (1), 184-206 (2024).
  17. Wang, C., et al. Engineering bioactive self-healing antibacterial exosomes hydrogel for promoting chronic diabetic wound healing and complete skin regeneration. Theranostics. 9 (1), 65-76 (2019).
  18. Papp, A., et al. The progression of burn depth in experimental burns: A histological and methodological study. Burns. 30 (7), 684-690 (2004).
  19. Barrett, J. P., et al. An in vitro study into the antimicrobial and cytotoxic effect of Acticoat dressings supplemented with chlorhexidine. Burns. 48 (4), 941-951 (2022).
  20. Lou, P., et al. Injectable self-assembling peptide nanofiber hydrogel as a bioactive 3D platform to promote chronic wound tissue regeneration. Acta Biomater. 135, 100-112 (2021).
  21. Gurtner, G. C., Werner, S., Barrandon, Y., Longaker, M. T. Wound repair and regeneration. Nature. 453 (7193), 314-321 (2008).
  22. Bielefeld, K. A., Amini-Nik, S., Alman, B. A. Cutaneous wound healing: Recruiting developmental pathways for regeneration. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2059-2081 (2013).
  23. Yildiz, S. C., Demir, C., Ayhanci, A. Examination of the effects of kefir on healing factors in a mice burn model infected with E. coli, S. aureus and P. aeruginosa using qRT-PCR. Burns. 49 (2), 425-431 (2023).
  24. Wang, Y., et al. Burn injury: Challenges and advances in burn wound healing, infection, pain and scarring. Adv Drug Deliv Rev. 123, 3-17 (2018).
  25. Chen, Y., et al. Research advances in smart responsive-hydrogel dressings with potential clinical diabetic wound healing properties. Mil Med Res. 10 (1), 37(2023).
  26. Ito, M., et al. Stem cells in the hair follicle bulge contribute to wound repair but not to homeostasis of the epidermis. Nat Med. 11 (12), 1351-1354 (2005).
  27. Ito, M., et al. Wnt-dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding. Nature. 447 (7142), 316-320 (2007).
  28. Chen, K., et al. Pullulan-collagen hydrogel wound dressing promotes dermal remodeling and wound healing compared to commercially available collagen dressings. Wound Repair Regen. 30 (3), 397-408 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة