مقالة منهجية

ضربة قاضية فعالة للجينات في الكبد عن طريق الحقن داخل الطحال للنمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة 8 (AAV8) - الحمض النووي الريبي الصغير لدبوس الشعر

1.5K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67376

⸱

نوفمبر 1, 2024

 , 
1Institute of Biosciences and Technology, Texas A&M University Health Science Center, 2Department of Translational Medical Sciences, College of Medicine, Texas A&M University Health Science Center

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول كيف يحقق الحقن داخل الطحال للحمض النووي الريبي الصغير الذي يتم تسليمه بواسطة AAV8 نفس كفاءة الضربة القاضية للجين في الكبد مثل حقن الوريد البابي ، مما يمثل إجراء أبسط مع انخفاض بكثير في معدل الوفيات والمضاعفات في الفترة المحيطة بالجراحة وبعد الجراحة.

الملخص

الكبد هو عضو رئيسي يؤدي وظائف التمثيل الغذائي الأساسية. يوفر تطوير طريقة فعالة وآمنة للقضاء على التعبير الجيني في الكبد أداة مهمة لتحديد وظيفة الجينات في الفيزيولوجيا المرضية للكبد. في هذه الدراسة ، نصف طريقة للحقن داخل الطحال من النمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة 8 (AAV8) المصممة للتعبير عن الحمض النووي الريبي الصغير لدبوس الشعر (shRNA) ضد الجين المستهدف المعني ، النيوكليوستمين (NS). حقق الحقن داخل الطحال ل AAV8 الذي يعبر عن shRNA الذي يستهدف NS(AAV8-shNS1) نفس كفاءة الضربة القاضية ل NS في الكبد كما فعل حقن الوريد البابي ، مقارنة بحقن AAV8 الذي يعبر عن تسلسل متقطع shRNA (AAV8-shScr). علاوة على ذلك ، أدى حقن فيروس AAV8-shRNA إلى الحد الأدنى من التفاعلات الالتهابية في حمة الكبد. الأهم من ذلك ، أن بروتوكول الحقن داخل الطحال هذا لم يكن متطلبا من الناحية الفنية وتسبب في الحد الأدنى من النزيف في موقع الحقن ، وهو السبب الرئيسي للوفيات في الفترة المحيطة بالجراحة وبعد الجراحة عند إجراء حقن الوريد البابي. تشير هذه الدراسة إلى طريقة محسنة وآمنة نسبيا لتحقيق ضربة قاضية فعالة للجينات في الكبد.

المقدمة

الكبد هو عضو حيوي يقوم باستقلاب العناصر الغذائية والمواد الكيميائية ، ولكنه أيضا يتعرض باستمرار للإهانات السامة للخلايا والمسرطنة. في حين أن الكبد البالغ قادر على إعادة النمو بعد الإصابة ، فإن قوته التجديدية تتأثر بشدة بعمر1. حتى الآن ، فإن الخيار العلاجي الوحيد للمرضى الذين يعانون من أمراض الكبد المزمنة في المرحلة النهائية أو تلف الكبد الحاد الهائل هو زراعة الكبد ، والتي تطرح العديد من التحديات الخاصةبها 2. لفهم الفيزيولوجيا المرضية الجزيئية للكبد بشكل أفضل من خلال استجواب وظائف الجينات ذات الأهمية ، تم تطوير التلاعب الجيني للتطبيق في الجسم الحي ، بما في ذلك الضربة القاضية بوساطة RNAi والحذف المستهدف بواسطة Cre recombinase في وجود مواقع loxP3. يمكن تسليم كاسيت التعبير Cre وبناء shRNA بواسطة المركبات الفيروسية.

النمط المصلي للفيروس 8 المرتبط بالغدة (AAV8) هو ناقل قوي لتوصيل الجينات إلى أنواع الأنسجة الانتقائية (على سبيل المثال ، الكبد والعضلات الهيكلية والقلب والدماغ والبنكرياس) بكفاءة عالية واستجابة التهابية منخفضة4،5. لاستهداف أعضاء الجسم الداخلية ، يتم إدخال AAV8 عادة عن طريق حقن وريد الذيل ، حيث تنتقل الجزيئات الفيروسية أولا عبر الرئة قبل الوصول إلى الدورة الدموية الجهازية. في المقابل ، يسمح لهم حقن الوريد البابي بالوصول إلى الكبد أولا قبل أن ينتشر عبر الرئة ، وهو مصدر محتمل للعزل والتخفيف. ومع ذلك ، فإن حقن الوريد البابي يمثل تحديا تقنيا وغالبا ما يكون معقدا بسبب النزيف الناجم عن العملية وارتفاع معدل الوفيات. لتحقيق ضربة قاضية فعالة للجينات (KD) في الكبد مع تجنب مشكلة ارتفاع معدل الوفيات في الفترة المحيطة / بعد الجراحة ، اختبرنا طريقة للحقن داخل الطحال ل AAV8 التي تحمل shRNA هندسيا يستهدف النيوكليوستمين (NS) (AAV8-shNS1) وقارنا كفاءته في KD بتلك الخاصة بحقن الوريد البابي AAV8-shNS1.

NS هو بروتين غني بالخلايا الجذعية / السلفية تم اكتشافه أولا في الخلايا الجذعية العصبية ولاحقا في عدة أنواع أخرى من الخلايا الجذعية والسرطانات6،7. تظهر الأهمية البيولوجية ل NS من خلال النمط الظاهري الجنيني المبكر المميت لفئران NS-knockout (NSKO) في الجسم الحي3،8 والاضطراب الناجم عن NSKD للتجديد الذاتي في المختبر9،10. في البالغة ، توجد مستويات عالية من تعبير NS في الخصية والعديد من الأنسجة التي تخضع للتجدد ، بما في ذلك الخلايا الظهارية المصطبغة بالنيوت بعد استئصال العدس وخلايا العضلات بعد بتر الأطراف11 ، بالإضافة إلى تجديد أنسجة الثدييات ، مثل خلايا عضلة القلب في الفئران بعد إصابة القلب12 وخلايا الكبد بعد إصابة الكبد (على سبيل المثال ، CCl4) أو الاستئصال الجراحي (على سبيل المثال ، استئصال الكبد الجزئي)13،14. علاوة على ذلك ، ثبت أن NS يلعب أدوارا مهمة في تطور أورام الثدي والكبد والفم15،16،17. ميكانيكيا ، ثبت أن NS يعزز التجديد الذاتي من خلال حماية الجينوم المتماثل من تلف الحمض النووي18،19. ومع ذلك ، نظرا للنمط الظاهري الجنيني القاتل المبكر للخط الجرثومي NSKO ، هناك حاجة إلى طريقة تجريبية لإدخال NSKD مؤقتا بعد الانتهاء من نمو الأنسجة لتحديد أنشطتها البيولوجية في الأعضاء البالغة.

في هذه المقالة ، نستخدم NS كمثال على ذلك لتوضيح إنشاء واختبار طريقة جين الكبد في الجسم الحي KD التي تتسم بالكفاءة وذات معدل وفيات منخفض ناتج عن الإجراءات.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع التجارب على التي تم إكمالها في هذه الدراسة والموافقة عليها من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامه (IACUC) في مركز العلوم الصحية بجامعة تكساس إيه آند إم في هيوستن (رقم الموافقة: 2021-0264-IBT) وتم إجراؤها وفقا والامتثال لجميع الإرشادات التنظيمية والمؤسسية ذات الصلة. تم استخدام إناث الفئران C57BL / 6J (4-5 أشهر ، وزن الجسم 23-30 جم). تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. AAV8- تصميم وإنتاج shRNA

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى Sands et al.4 للحصول على التفاصيل الإجرائية.

  1. إحساس التصميم وقليل النوكليوتيدات shRNA المضادة للإحساس التي تستهدف تسلسلا طويلا مكونا من 21 نيوكليوتيد داخل منطقة الترميز للجين محل الاهتمام. في هذه الحالة ، تم استخدام NS للفأر (shNS1) وتسلسل مختلط من 21 نيوكليوتيد كتحكم سلبي (shScr) (الشكل 1 أ ، اللوحة السفلية).
  2. قم بتضمين تسلسل حلقة جذعية من TTCAAGAGA ، ونهاية حادة 5 بوصات ، ونهاية متماسكة متوافقة مع XhoI مقاس 3 بوصات ، وتسلسل إحساس مستهدف خاص بالجين ل 5'-GAA CTA AAA CAG CAG CAG AAA-3 '(shNS1) أو تسلسل مشوش من 5'-TCT CGC TTG GGC GAG AGT AAG-3 '(shScr).
  3. الفوسفوريلات والتلدين كل زوج من قليل النوكليوتيدات.
  4. هضم ناقل نقل الجينات AAV ، AV5-siRNA-GFP (الشكل 1 أ ، اللوحة العلوية) ، مع HpaI و XhoI ، وإزالة الفوسفوريلات ، والهلام لتنقية جزء الناقل.
  5. ربط قليل النوكليوتيدات الملدنة في ناقل منقى بالهلام.
  6. تحويل منتجات الحمض النووي المربوطة إلى بكتيريا DH5α المختصة بكفاءة الاستنساخ الفرعي.
  7. اختر المستنسخة المفردة عن طريق مقاومة الأمبيسلين وقم بزراعة 100 مل من أجل التحضير الصغير للبلازميد. تأكد من الاستنساخ الصحيح عن طريق التسلسل وإعداد البلازميدات باستخدام المجموعة الخالية من السموم الداخلية المتوفرة تجاريا (باتباع تعليمات الشركة المصنعة).
  8. قم بتعبئة فيروسات AAV8 عن طريق نقل ناقل نقل AV5 والنمط المصلي Rep/Cap 8 والبلازميدات المساعدة AdF6 إلى خلايا 293T باستخدام كاشف الإرسال iMFectin. تم نقل ما مجموعه 40 × 15 سم وحصادها / هضمها بعد 3 أيام من التعدين.
  9. استعادة AAV8 المرتبط بالخلايا عن طريق تحلل الخلايا وترسيب AAV8 المفرز بالوسائط بنسبة 40٪ PEG. بعد الهضم ، اجمع بين فيروسات AAV8 في محللة الخلية والوسط ، وتنقيها على تدرج يوديكسانول متقطع ، وركز في وحدات الطرد المركزي لقطع الوزن الجزيئي (1،00،000 ميجاوات).
  10. قم بقياس عيار AAV8 بواسطة نقطة النهاية المطلقة qPCR باستخدام الاشعال: WPRE-172 (5'- TTTATGAGGAGTTGGCCC-3') و WPRE-392 (5'- CAACACCACGGAATTGTCAG-3').

2. الحقن داخل الطحال من AAV8 (الشكل 1 ب ، 1 ج) 

  1. ضع الفئران C57BL6 / J في غرفة تخدير مملوءة ب 2٪ من الأيزوفلوران والأكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). بعد فقدان الوعي ، انقل الفئران إلى المنطقة الجراحية المعقمة في وضع الاستلقاء الجانبي الأيمن. حافظ على التخدير بنسبة 2٪ من الأيزوفلوران مع توصيل الأكسجين عبر مخروط الأنف.
  2. تعقيم موقع الشق ب 2٪ كلورهيكسيدين متبوعا بنسبة 80٪ إيثانول. استخدم مقصا طبيا مقاس 6.3 بوصة لعمل شق 15 مم على جدار البطن العلوي الأيسر ، متبوعا بشق 10 مم في الصفاق.
  3. قم بتعريض الطحال برفق باستخدام الملقط وثبته في مكانه باستخدام شاش مبلل يوضع أسفل العضو.
  4. امزج بلطف وحقن فيروسات AAV8 (50 ميكرولتر) على مدى 30 ثانية في الطحال باستخدام إبرة 30 جم مع وضع الطرف على عمق 3 مم تحت السطح (الشكل 1 ب). غطي موقع الحقن بقطعة من قطعة قطن وضغطي لمدة 1 دقيقة.
  5. خياطة الصفاق بخياطة أمعاء كرومية قابلة للامتصاص 4-0.
  6. أغلق جدار البطن والجلد بخياطة حريرية 4-0.
  7. ضع الفئران في قفص نظيف فوق وسادة حرارية كهربائية وراقبها حتى الشفاء.

3. حقن الوريد البابي ل AAV8

  1. تخدير الفئران C57BL6 / J عن طريق استنشاق الأيزوفلوران (2٪) ممزوجا بالأكسجين (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا).
  2. إجراء شق البطن4،13 من خلال شق خط الوسط (~ 1 بوصة) على الجلد ثم في الصفاق.
  3. ضع وسادة شاش معقمة مبللة بمحلول ملحي معقم على الجانب الأيسر من الفأر واستخدم قطعة قطن معقمة لسحب الأمعاء الغليظة والدقيقة برفق. ضع الأمعاء فوق شاش مبلل وقم بتغطيته بقطعة لتجنب ملامسة الجلد أو الجفاف.
  4. حقن فيروس AAV في الوريد البابي بإبرة معقمة 32 جم بحجم 50 ميكرولتر. أدخل الإبرة 3-5 مم في وريد المنفذ بزاوية أقل من 5 درجات. اسمح للدم بالتدفق عبر الإبرة لمدة 5 ثوان لتجنب التدفق العكسي.
  5. ضع طرف قطعة قطن معقمة أعلى موقع الحقن بضغط برفق حتى إغلاق الوريد بالكامل وعدم حدوث نزيف (حوالي 5 دقائق) لتجنب النزيف.
  6. ضع الأعضاء الداخلية برفق مرة أخرى في تجويف البطن.
  7. أغلق جدار البطن والجلد بخياطة حريرية 4-0.

4. تحليل qRT-PCR

  1. استخرج الحمض النووي الريبي من 50-100 مجم من أنسجة الكبد4،13 باستخدام كاشف عزل الحمض النووي الريبي المتاح تجاريا باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  2. قم بتجميع 1st strand cDNAs من إجمالي الحمض النووي الريبي باستخدام سداسيات عشوائية و M-MLV للنسخ العكسي20،21.
  3. حدد قيم ΔC (t) بين الجين المستهدف والجينات المرجعية باستخدام نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أحادي اللون والكاشف الأخضر SYBR الفائق المزيج بعد التقارير المنشورةسابقا 22،23.
  4. قم بقياس قيم ΔΔC (t) من أربعة تكرارات بيولوجية وثلاثة تكرارات تقنية (ن = 12). اضبط Tm على 60 درجة مئوية لجميع التفاعلات. تأكيد النتائج باستخدام جينين مرجعيين ، Rps3 و Rplp0.
  5. تسلسلات التصميم التمهيدي على النحو التالي: Ns ، 5'-gtc tga tct agt acc aaa gg-3 'و 5'-ggg aaa cca atc act cca ac-3 '; Rps3 و 5'-atg gcg gtg cag att tcc aa-3 'و 5'-cat tct gtg tcc tgg tgg c-3 '; Rplp0 و 5'-ctg aag tgc tcg aca tca ca-3 'و 5'-agt ctc cac aga caa tgc ca-3'.

النتائج

كفاءات الجين KD في الكبد عن طريق داخل الطحال مقابل. حقن الوريد البابي ل AAV8-shRNA
تم تخفيف المخزونات الفيروسية AAV8 إلى تركيز عمل يبلغ 2E + 12 نسخة جينوم (gc) لكل مليلتر (gc / mL). تم حقن الفئران الفردية ب 1E + 11 gc من AAV8-shNS1 أو AAV8-shScr (50 ميكرولتر) عن طريق حقن داخل الطحال أو الوريد البابي. بعد أسبوعين من الحقن ، تم جمع أنسجة الكبد لعزل الحمض النووي الريبي ، وتخليق 1st-strand (كدنا) ، وتحليل qPCR. أظهرت النتائج أن طريقة الحقن داخل الطحال حققت إحصائيا نفس كفاءة NSKD (20.8٪ ± 4.4٪) كما فعلت طريقة حقن الوريد البابي (16.3٪ ± 3.6٪) باستخدام Rsp3 و Rplp0 كمرجع داخلي (الشكل 2). والجدير بالذكر أنه يمكن إكمال إجراء الحقن داخل الطحال في غضون 15 دقيقة دون أي وفاة تقريبا بسبب الإجراء ، في حين أن طريقة حقن الوريد البابي تتطلب عادة 25-30 دقيقة مع الكثير من الممارسة وارتبطت بمعدل وفيات أعلى (~ 25٪ -30٪ معدل وفيات).

الاستجابة الالتهابية للأنسجة
تم جمع أنسجة الكبد من الفئران التي تتلقى حقن الوريد البابي أو الحقن داخل الطحال ل AAV8-shScr (الشكل 3 أ) أو AAV8-shNS1 (الشكل 3 ب) ومقارنتها بالفئران الضابطة (الشكل 3 ج). تم فحص التفاعلات الالتهابية بواسطة تلطيخ H&E4. أظهرت النتائج أنه لم تثير AAV8-shScr ولا AAV8-shNS1 تفاعلات التهابية ملحوظة في حمة الكبد مقارنة ب PBS المحقون إما عن طريق الحقن داخل الطحال (Spl) أو طريقة حقن الوريد البابي (PV) (الشكل 3A-C).

figure-results-1
الشكل 1: رسوم توضيحية لتصميم AAV8-shRNA وإجراء الحقن داخل الطحال. (أ) (أعلى) رسم تخطيطي لبلازميد AV5-siRNA-GFP المصمم لصنع النمط المصلي للفيروس المرتبط بالغدة 8 (AAV8) لتجارب ضربة قاضية في الجسم الحي . يحتوي AV5-siRNA-GFP على تسلسل shRNA مدفوع بمحفز CMV و EGFP. (أسفل) تركيبات الحمض النووي الريبي الصغيرة لدبوس الشعر مصممة لاستهداف تسلسلات 21 نيوكليوتيدات على NS للفأر (shNS1) أو تسلسل 21 نيوكليوتيدات مختلط (Scr). (ب) مخطط سير عمل تخطيطي في إجراء حقن AAV8 داخل الطحال. (ج) وجهات نظر تدريجية للإجراء الجراحي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: كفاءات ضربة قاضية بوساطة AAV8-shRNA للنوكليوستمين (NS) في الكبد عن طريق حقن الطحال مقابل حقن الوريد البابي. فحوصات qRT-PCR لتعبير NS في عينات الكبد التي تم حصادها من الفئران بعد أسبوعين من تلقي حقن داخل الطحال (Spl) أو الوريد البابي (PV) من AAV8-shScr أو AAV8-shNS1 (1E + 11 gc). تظهر الرسوم البيانية النتائج بالرجوع إلى ضابطين داخليين ، Rps3 (A) و Rplp0 (B). تظهر القضبان متوسط ± SEM لأربعة مكررات بيولوجية ، لكل منها ثلاثة تكرارات تقنية PCR. * ص < 0.01 ؛ ** ص < 0.001 ؛ ص < 0.0001. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: أنسجة أنسجة الكبد بعد الحقن داخل الطحال أو حقن الوريد البابي ل PBS أو AAV8-shScr أو AAV8-shNS1. تلطيخ H&E لأنسجة الكبد في أسبوعين بعد الحقن داخل الطحال (Spl) أو حقن الوريد البابي (PV) من AAV8-shScr (A) أو AAV8-shNS1 (B) ، مقارنة بالعينات الضابطة غير المحقونة AAV8 (C). قضبان المقياس: 100 ميكرومتر. تظهر اللوحات اليمنى مناظر مكبرة للإدخالات الداخلية في اللوحات اليسرى. قضبان المقياس: 50 ميكرومتر. تم فحص ستة إلى تسعة أقسام من حيوانين مختلفين في كل مجموعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

الجين KD عن طريق التوصيل الفيروسي إما لبناء التعبير عن shRNA في خلفية من النوع البري24،25 أو بناء Cre المعبر عن إعادة التركيب في خلفية floxed26 هي طريقة قوية لاستجواب وظيفة الجينات في الجسم الحي بطريقة محفزة يتم التحكم فيها بالوقت. يجب أن تحقق طريقة التوصيل المثالية لدراسات KO / KD الجيني في الجسم الحي كفاءة عالية ل KO / KD في العضو المعني ، بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يكون الإجراء نفسه سهلا تقنيا مع الحد الأدنى من الوفيات في الفترة المحيطة / بعد الجراحة.

بالنسبة للأعضاء الداخلية مثل الكبد ، يمكن إدخال الجزيئات الفيروسية عن طريق الحقن من خلال وريد الذيل27 أو الوريد البابي28،29 أو عن طريق الحقن المباشر في الطحال (الحقن داخل الطحال) 30،31. يدخل الوريد البابي والحقن داخل الطحال جزيئات فيروسية في الدورة الدموية البابية ، والتي تصب في الكبد قبل دخول الوريد الأجوف السفلي وبعد ذلك الدورة الدموية الرئوية. في المقابل ، فإن الجسيمات الفيروسية التي يتم إدخالها من خلال حقن وريد الذيل تتجاوز الدورة الدموية البابية وتدخل الدورة الدموية الرئوية قبل الوصول إلى الدورة الدموية الجهازية. بالنسبة للأعضاء التي تتلقى الدورة الدموية البابية ، مثل الكبد ، توفر الوريد البابي والحقن داخل الطحال ميزة توصيل الجسيمات الفيروسية مباشرة إلى تلك الأعضاء دون التعرض لخطر عزل الرئة أو تخفيفها في الدورة الدموية الجهازية. بالنسبة للأعضاء التي لا تتلقى الدورة الدموية البابية ، مثل الدماغ ، قد يكون حقن وريد الذيل أكثر فائدة لعدم تعريض الجزيئات الفيروسية للكبد قبل الوصول إلى الدورة الدموية الرئوية وبعد ذلك الدورة الدموية الجهازية.

في هذه الدراسة ، قمنا بحقن AAV8-shNS1 بجرعة 1E + 11 gc لكل ، مما أعطى كفاءة أفضل للكويتات مقارنة ب 1E + 10 gc ولكنه حقق نفس تأثير KD كما فعل 5E + 11 gc عن طريق الحقن داخل البوابة (البيانات غير معروضة). عند جرعة 1E + 11 gc ، بمقارنة طريقة حقن الوريد البابي وطريقة الحقن داخل الطحال ، لم يتم العثور على فرق إحصائي بين هذه الطرق في كفاءة NSKD في الكبد ، مما يحقق كفاءة 70٪ -80٪ دينار كويتي. يمكن أن يستمر تأثير الجين KD ل AAV8 المحقون بالوريد البابي في الكبد لمدة تصل إلى ستة أسابيع بطريقة تعتمد علىالبناء 23. والجدير بالذكر أن المضاعفات المرتبطة بالإجراء، مثل النزيف الناجم عن العملية والتصاق الثرب / الصفاق، فضلا عن الصعوبة الفنية، أقل بكثير وأقل بالنسبة لطريقة الحقن داخل الطحال مقارنة بطريقة حقن الوريد البابي. نتيجة لذلك ، يتم إجراء حقن الوريد البابي مرة واحدة ، بينما يمكن إجراء الحقن داخل الطحال بشكل متكرر32. أخيرا ، كانت الاستجابات الالتهابية قليلة أو معدومة في حمة الكبد التي تتلقى إما حقن الوريد البابي أو الحقن داخل الطحال من AAV8-shScr أو AAV8-NS1. ومع ذلك ، فإن النتيجة الأخيرة لا تستبعد احتمال أن تؤدي العيارات العالية للغاية من AAV إلى استجابات التهابية تربك النتائج التجريبية. لذلك ، يجب تحديد جرعة AAV المثلى تجريبيا ومتوازنة بين كفاءة KD والتفاعل الناجم عن AAV8 وقد تختلف بين الجينات و / أو التسلسلات المستهدفة المختلفة. في الختام ، توضح هذه النتائج أن الحقن داخل الطحال ل AAV8-shRNA هو طريقة عالية الكفاءة وآمنة نسبيا وبسيطة لتحقيق جين KD في الجسم الحي في الكبد.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل جائزة أبحاث الباحث الفردي (RP200081) لمعهد أبحاث الوقاية من السرطان في تكساس (CPRIT) إلى RYT.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وحدات الطرد المركزي لمرشح AmiconMilliporeSigmaUFC9100الترشيح الفائق السريع
AV5-siRNA-GFP   ؛Addgene #124972البلازميد
المختص DH5α البكتيريا Invitrogen# 18265-017سلالة مختصة كيميائيا للاستنساخ   ؛
HpaI نيو إنجلاند بيولابسR0105إنزيم تقييد
كاشف تعداء iMFectin GenDepotI7100-101
M-MLV النسخ العكسي  PromegaM1708بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي الريبي 
نظام الكشف عن PCR أحادي اللون في الوقت الحقيقي MyiQ   ؛Bio-RadBUN9740RADqRT-PCR
مجموعة أوميغا الخالية من السموم الداخلية  BioteckD6915-03البلازميد الحمض النووي ميدي الإعدادية 
سداسي عشوائية Invitrogen48190-011
كاشف أخضر Supermix SYBR  Bio-Rad1708882تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
T4 DNA LigasePromegaM1801
TRIzol Reagent Life Technologies15596-018تقييد الحمض النووي الريبي الكلي عالي
الجودة XhoINew England BiolabsR0146
عزل إنزيم

المراجع

  1. Wang, J., et al. Epigenome-wide analysis of aging effects on liver regeneration. BMC Biol. 21 (1), 30(2023).
  2. Jindal, A., Jagdish, R. K., Kumar, A. Hepatic regeneration in cirrhosis. J Clin Exp Hepatol. 12 (2), 603-616 (2022).
  3. Meng, L., et al. Nucleostemin deletion reveals an essential mechanism that maintains the genomic stability of stem and progenitor cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (28), 11415-11420 (2013).
  4. Sands, M. S. Aav-mediated liver-directed gene therapy. Methods Mol Biol. 807, 141-157 (2011).
  5. Tenney, R. M., Bell, C. L., Wilson, J. M. AAV8 capsid variable regions at the two-fold symmetry axis contribute to high liver transduction by mediating nuclear entry and capsid uncoating. Virology. 454-455, 227-236 (2014).
  6. Tsai, R. Y., Mckay, R. D. A nucleolar mechanism controlling cell proliferation in stem cells and cancer cells. Genes Dev. 16 (23), 2991-3003 (2002).
  7. Tsai, R. Y., Meng, L. Nucleostemin: A latecomer with new tricks. Int J Biochem Cell Biol. 41 (11), 2122-2124 (2009).
  8. Zhu, Q., Yasumoto, H., Tsai, R. Y. Nucleostemin delays cellular senescence and negatively regulates trf1 protein stability. Mol Cell Biol. 26 (24), 9279-9290 (2006).
  9. Qu, J., Bishop, J. M. Nucleostemin maintains self-renewal of embryonic stem cells and promotes reprogramming of somatic cells to pluripotency. J Cell Biol. 197 (6), 731-745 (2012).
  10. Lin, T., Meng, L., Li, Y., Tsai, R. Y. Tumor-initiating function of nucleostemin-enriched mammary tumor cells. Cancer Res. 70 (22), 9444-9452 (2010).
  11. Maki, N., et al. Rapid accumulation of nucleostemin in nucleolus during newt regeneration. Dev Dyn. 236 (4), 941-950 (2007).
  12. Siddiqi, S., et al. Myocardial induction of nucleostemin in response to postnatal growth and pathological challenge. Circ Res. 103 (1), 89-97 (2008).
  13. Lin, T., Ibrahim, W., Peng, C. -Y., Finegold, M. J., Tsai, R. Y. A novel role of nucleostemin in maintaining the genome integrity of dividing hepatocytes during mouse liver development and regeneration. Hepatology. 58 (6), 2176-2187 (2013).
  14. Shugo, H., et al. Nucleostemin in injury-induced liver regeneration. Stem Cells Dev. 21 (16), 3044-3054 (2012).
  15. Lin, T., et al. Nucleostemin reveals a dichotomous nature of genome maintenance in mammary tumor progression. Oncogene. 38 (20), 3919-3931 (2019).
  16. Wang, J., et al. Nucleostemin modulates outcomes of hepatocellular carcinoma via a tumor adaptive mechanism to genomic stress. Mol Cancer Res. 18 (5), 723-734 (2020).
  17. Crawford, M., Liu, X., Cheng, Y. L., Tsai, R. Y. Nucleostemin upregulation and stat3 activation as early events in oral epithelial dysplasia progression to squamous cell carcinoma. Neoplasia. 23 (12), 1289-1299 (2021).
  18. Lin, T., Meng, L., Wu, L. J., Pederson, T., Tsai, R. Y. Nucleostemin and gnl3l exercise distinct functions in genome protection and ribosome synthesis, respectively. J Cell Sci. 127 (10), 2302-2312 (2014).
  19. Tsai, R. Y. Balancing self-renewal against genome preservation in stem cells: How do they manage to have the cake and eat it too. Cell Mol Life Sci. 73 (9), 1803-1823 (2016).
  20. Meng, L., Hsu, J. K., Tsai, R. Y. Gnl3l depletion destabilizes mdm2 and induces p53-dependent G2/m arrest. Oncogene. 30 (14), 1716-1726 (2011).
  21. Huang, G., Meng, L., Tsai, R. Y. P53 configures the G2/m arrest response of nucleostemin-deficient cells. Cell Death Discov. 1, e15060(2015).
  22. Liu, X., Wang, J., Wu, L. J., Trinh, B., Tsai, R. Y. L. IMPDH inhibition decreases TERT expression and synergizes the cytotoxic effect of chemotherapeutic agents in glioblastoma cells. Int J Mol Sci. 25 (11), 5992(2024).
  23. Liu, X., Wang, J., Li, F., Timchenko, N., Tsai, R. Y. L. Transcriptional control of a stem cell factor nucleostemin in liver regeneration and aging. PLoS One. 19 (9), e0310219(2024).
  24. Mayra, A., et al. Intraperitoneal AAV9-shRNA inhibits target expression in neonatal skeletal and cardiac muscles. Biochem Biophys Res Commun. 405 (2), 204-209 (2011).
  25. Cohen, A., et al. Virus-mediated shRNA knockdown of prodynorphin in the rat nucleus accumbens attenuates depression-like behavior and cocaine locomotor sensitization. PLoS One. 9 (5), e97216(2014).
  26. Jeon, Y., et al. Topbp1 deficiency causes early embryonic lethality and induces cellular senescence in primary cells. J Biol Chem. 286 (7), 5414-5422 (2011).
  27. Smith, T. A., et al. Adenovirus-mediated expression of therapeutic plasma levels of human factor IX in mice. Nat Genet. 5 (4), 397-402 (1993).
  28. Nakai, H., Iwaki, Y., Kay, M. A., Couto, L. B. Isolation of recombinant adeno-associated virus vector-cellular DNA junctions from mouse liver. J Virol. 73 (7), 5438-5447 (1999).
  29. Jung, S. C., et al. Adeno-associated viral vector-mediated gene transfer results in long-term enzymatic and functional correction in multiple organs of Fabry mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2676-2681 (2001).
  30. Hurford, R. K., Dranoff, G., Mulligan, R. C., Tepper, R. I. Gene therapy of metastatic cancer by in vivo retroviral gene targeting. Nat Genet. 10 (4), 430-435 (1995).
  31. Sarkar, R., Xiao, W., Kazazian, H. H. Jr A single adeno-associated virus (AAV)-murine factor viii vector partially corrects the hemophilia a phenotype. J Thromb Haemost. 1 (2), 220-226 (2003).
  32. Czekaj, P., et al. Optimization of methods for intrasplenic administration of human amniotic epithelial cells in order to perform safe and effective cell-based therapy for liver diseases. Stem Cell Rev Rep. 20 (6), 1599-1617 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

AAV8 Nucleostemin RNA

مقالات ذات صلة