يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تسخير قوة شحنات الحمض النووي الريبي الصغير في حويصلات صغيرة خارج الخلية يتم إطلاقها من أقسام الدماغ البشري المجمدة حديثا

1.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67379

⸱

نوفمبر 8, 2024

 ,  ,  , 
1Translational Medicine Laboratory, Biomedical Research and Innovation Centre, University of Salford

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نضع بروتوكولا باستخدام كميات قليلة من أقسام أنسجة المخ المجمدة حديثا وطريقة طرد مركزي عالية السرعة يمكن الوصول إليها إلى جانب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم للحصول على حويصلات صغيرة خارج الخلية كمصادر للمؤشرات الحيوية microRNA (miRNA) للاضطرابات العصبية.

الملخص

تعتبر الحويصلات الصغيرة خارج الخلية (sEVs) وسطاء حاسمين للاتصال بين الخلية والخلية ، حيث تنقل شحنات متنوعة مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية (microRNA و mRNA و DNA). تتمتع شحنة microRNA sEV بفائدة محتملة كمؤشر حيوي قوي غير جراحي للأمراض نظرا لقدرة sEV على اجتياز الحواجز البيولوجية (على سبيل المثال ، الحاجز الدموي الدماغي) ويمكن الوصول إليها من خلال سوائل الجسم المختلفة. على الرغم من العديد من الدراسات حول المؤشرات الحيوية sEV في سوائل الجسم ، إلا أن تحديد الأنسجة أو المجموعات السكانية الفرعية الخاصة بالخلايا sEV لا يزال يمثل تحديا ، خاصة من الدماغ. تعالج دراستنا هذا التحدي من خلال تكييف الأساليب الحالية لعزل المركبات الكهربائية الصغيرة من كميات قليلة من أقسام الدماغ البشري المجمدة باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC).

بعد الموافقة الأخلاقية ، تم تقطيع ما يقرب من 250 ميكروغرام من أنسجة المخ البشرية المجمدة حديثا (التي تم الحصول عليها من بنك مانشستر للدماغ [المملكة المتحدة]) من 3 أنسجة مانحة واحتضانها في محلول الكولاجيناز من النوع 3 / Hibernate-E ، مع التحريك الوسيط ، متبوعا بخطوات الطرد المركزي والترشيح التسلسلي. بعد ذلك ، تم عزل sEVs باستخدام طريقة SEC وتميزت باتباع إرشادات MISEV. قبل عزل الحمض النووي الريبي من داخل هذه sEVs ، تمت معالجة المحلول باستخدام Proteinase-K و RNase-A لإزالة أي RNA خارج الخلية غير sEV. تم فحص كمية وجودة الحمض النووي الريبي ومعالجتها بشكل أكبر لتجارب تسلسل qPCR والحمض النووي الريبي الصغير.

تم تأكيد وجود sEVs من خلال تحليل تتبع الجسيمات النانوية الفلورية (fNTA) واللطخة الغربية لعلامات السطح (CD9 ، CD63 ، CD81). تم تأكيد توزيع الحجم (50-200 نانومتر) بواسطة NTA والفحص المجهري الإلكتروني. تراوح تركيز الحمض النووي الريبي الإجمالي داخل sEVs المحللة من 3-9 نانوغرام / ميكرولتر وتم استخدامه للقياس الكمي بنجاح بواسطة qPCR للميكرو RNAs المرشحة المختارة. قدم تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير على MiSeq بيانات عالية الجودة (Q >32) مع 1.4-5 مليون قراءة لكل عينة.

تتيح هذه الطريقة عزلا وتوصيفا فعالا للمركبات الكهربائية من الحد الأدنى من أحجام أنسجة المخ ، مما يسهل أبحاث المؤشرات الحيوية غير الغازية ويبشر بدراسات المؤشرات الحيوية العادلة للمرض ، وتقديم رؤى حول الأمراض التنكسية العصبية والاضطرابات الأخرى المحتملة.

المقدمة

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي واحدة من اللاعبين الرئيسيين في الاتصال بين الخلايا في جميع الكائنات متعددة الخلايا1. EVs عبارة عن جزيئات غشائية ثنائية الطبقة دهنية مشتقة من الخلايا يمكن أن تسهل نقل مجموعة متنوعة من أحمال البضائع ، مثل البروتينات والدهون والأحماض النووية ، إلى الخلايا المتلقية. يمكن أن يكون للمركبات الكهربائية نطاق حجم واسع يتراوح من 30 نانومتر إلى 1 ميكرومتر<. لذلك ، فقد تورطوا في انتشار وتفاقم الأمراض التنكسية العصبية وحالات أخرى مثل مرض الزهايمر (AD) والخرف الجبهي الصدغي (FTD) ومرض باركنسون (PD) والسرطانات2،3. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يمكن العثور على المركبات الكهربائية المركبة في مجموعة من السوائل الحيوية مثل الدم والسائل النخاعي (CSF) واللعاب وحتى البول ، فإن استخدامها المفيد يمكن أن يمتد إلى مجال المؤشرات الحيوية والتشخيصات غير الغازية. على سبيل المثال ، قد تشير أبحاث AD إلى استخدام نسب البروتين الممرض للسوائل الحيوية ، مثل tau / Aβ ، أو حتى Aβ42 / Aβ404.

إحدى الشحنات المعروفة من sEVs هي microRNA (miRNA) ، وهي مجموعة من جزيئات الحمض النووي الريبي الصغيرة غير المشفرة التي يبلغ طولها حوالي 22 نيوكليوتيد والتي ترتبط بمناطق 3'-UTR من mRNA وعادة ما تنظم سلبا تعبير البروتين. تشارك miRNAs في العديد من الأدوار الخلوية ، كما أنها متورطة في التسبب في الأمراض المختلفة ، بما في ذلك السرطانات والأمراض التنكسية العصبية. أجرى Cheng et al. تحليل تسلسل عالي الإنتاجية لتوقيعات تعبير sEV miRNA المشتقة من المصل من مرضى AD5. بمجرد أن يقترن بسجلات التصوير العصبي وعوامل الخطر المعروفة للعمر والجنس وعرض أليل APOE ε4 ، وجد أن النتائج تتنبأ بمرض الزهايمر بحساسية 87٪ وخصوصية 77٪. علاوة على ذلك ، حددت الأبحاث اثنين من miRNAs السائل الدماغي النخاعي (miR-151a-3p ، let-7f-5p) و 3 miRNAs منخفضة التنظيم (miR-27a-3p ، miR-125a-5p و miR-423-5p) التي يمكن أن تشخص المرحلة المبكرة من PD6. مع الأمراض المرضية ، قد تسبق الحالة المرضية بعض الأعراض المميزة للأمراض ، بينما في التنكس العصبي ، يحدث تراكم السمات المميزة المرضية في وقت أبكر بكثير من التدهور المعرفي.

من المحتمل أن تكون MicroRNAs مؤشرا حيويا أكثر فعالية من البروتينات ، نظرا لوظائفها المتنوعة ، وتنظيمها اللاجيني عالي الترتيب. باستخدام أنسجة المخ ، يمكن للباحثين تحديد توقيعات miRNA محددة مشتقة من الدماغ (BDsEV) للأمراض وأنواعها الفرعية. على سبيل المثال ، يمكن أن تقدم sevs ذات العلامات العصبية والدبقية شحنة miRNA مختلفة ، ويمكن أن يؤدي التحليل إلى طرق أكثر دقة للكشف عن المرض. علاوة على ذلك ، يقترح أن تلعب BDsEVs دورا كبيرا في الانتشار عبر المشابك للبروتينات المسببة للأعصاب7. اقترحت التقارير السابقة الترسيب المناعي وتدرج الكثافة (تدرج السكروز) الطرد المركزي الفائق للحصول على مركبات كهربائية من أنسجة المخ المجمدةحديثا 8،9. ومع ذلك ، تتطلب هذه الأساليب بنية تحتية محددة مع طرق الطرد المركزي الفائق والتنقية النهائية للحصول على عينات sEV عاليةالجودة 10. واقترحت التقارير الأحدث عدة تعديلات وتحسينات على النهج11،12،13; ومع ذلك ، على الرغم من ذلك ، لا يزال عزل ودراسة الحمض النووي الريبي الميكرو المشتق من sEV من الأنسجة البشرية غير مطبق على نطاق واسع. يهدف النهج الموصوف في هذا البروتوكول إلى توفير بروتوكول مكرر خطوة بخطوة لدراسة sev المشتقة من الدماغ لتعزيز إمكانية الوصول إلى هذه التقنية. أنشأنا بروتوكولا باستخدام كميات قليلة من أنسجة المخ ، حيث عزلنا المركبات الكهربائية النقية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم وعرضنا بيانات تسلسل عالية الجودة من الجيل التالي من شحنة الحمض النووي الريبي الصغير لهذه المركبات الكهربائية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على العمل أخلاقيا من قبل بنك مانشستر للدماغ (مرجع REC 09 / H0906/52) ومن قبل لجنة الأخلاقيات في جامعة سالفورد (معرف التطبيق: 3408).

1. انهيار المصفوفة داخل الخلايا باستخدام الكولاجيناز على أقسام أنسجة المخ المجمدة

  1. قم بتقطيع 250 مجم من أنسجة المخ المجمدة إلى شرائح رفيعة (شظايا بسمك حوالي 0.4 مم) باستخدام مشرط معقم على طبق بارد وأضف 2 مل من محلول الكولاجيناز من النوع الثالث / السبات 75 U / m.
  2. احتضان كل عينة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. عند نقطة 5 دقائق ، اقلب كل عينة مرتين للخلط ؛ عند نقطة 10 دقائق، قم بعمل ماصة كل عينة ثلاث مرات برفق باستخدام شريط بلاستيكي قابل للتصرف سعة 10 مل.
  3. ضع كل عينة على الثلج وأضف 1x كوكتيل مثبط البروتياز و 1x مثبط الفوسفاتيز. هذا يوقف تفاعل الإنزيم وهو نقطة نهاية الهضم باستخدام الكولاجيناز من النوع الثالث.
  4. جهاز الطرد المركزي لكل عينة من أنسجة المخ عند 300× جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع كل مادة طافية وأجهزة طرد مركزي أخرى عند 2000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  5. اجمع كل مادة طافية مرة أخرى وقم بالتصفية من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. جهاز طرد مركزي كل مرشح عند 10 000 × جم لمدة 48 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  6. اجمع المادة الطافية وأضف المخزن المؤقت لهطول الأمطار بنسبة 2: 1 لكل عينة. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  7. جهاز الطرد المركزي لكل عينة عند 10 000 × غرام لمدة 96 دقيقة عند 4 درجات مئوية وإعادة تعليق الحبيبات في 100 ميكرولتر من PBS الخالي من الحويصلة خارج الخلية (EV).

2. إعداد أعمدة الكروماتوغرافيا لاستبعاد الحجم

  1. قبل الاستخدام ، قم بموازنة عمود SEC المعد مسبقا في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 15 دقيقة.
    ملاحظة: يجب إزالة الغطاء السفلي قبل الغطاء اللولبي.
  2. بعد التوازن ، قم بإزالة المخزن المؤقت للمادة الحافظة من أعلى العمود واغسل العمود مرتين باستخدام 250 ميكرولتر من PBS الخالي من EV. يتم ترك كل غسل PBS لدخول العمود من خلال الجاذبية.

3. عزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية باستخدام كروماتوغرافيا استبعاد الحجم

  1. أضف الحبيبات المعلقة إلى الجزء العلوي من عمود SEC وقم بالطرد المركزي للعمود عند 50 × جم لمدة 30 ثانية. تجاهل التدفق.
  2. أضف 180 ميكرولتر من PBS الخالي من EV إلى الجزء العلوي من عمود SEC وقم بالطرد المركزي للعمود عند 50 × جم لمدة دقيقة واحدة ، مما يسمح للمركبات الكهربائية القصيرة المشتقة من الدماغ بالخروج من العمود.
    ملاحظة: يتم تلخيص جزء البروتوكول المفصل أعلاه في الشكل 1.

4. تأكيد علامات الحويصلة الصغيرة خارج الخلية عن طريق النشاف الغربي

  1. لتحليل sEVs قبل تحليل اللطخة الغربية (لضمان تحليل جميع شحنات الأغشية والعصارة الخلوية) ، قم بتخفيف عينة sEV المعزولة 1: 1 في المخزن المؤقت للتحلل والاستخراج (1x مثبط البروتياز و 1x مثبط الفوسفاتيز).
  2. حرك العينة على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  3. عينة أجهزة الطرد المركزي عند 14 000 × جم لمدة 15 دقيقة.
  4. اجمع المادة الطافية للبروتين وقم بقياس تركيزات البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين.
  5. امزج العينات مع 4x Laemmli Buffer وقم بتحميل 20 ميكروغرام من البروتين في كل بئر مقابل سلم بروتين ملطخ مسبقا.
  6. بمجرد حلها ، انقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز 0.45 ميكرومتر. بعد النقل ، قم بسد الغشاء لمدة 2 ساعة في 5٪ BSA.
  7. احتضان الأغشية بالأجسام المضادة الأولية (الجدول 1) بين عشية وضحاها.
  8. اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام محلول غسيل (1٪ Tween20 في PBS) وصمة عار باستخدام جسم مضاد ثانوي مضاد للفأر. بعد ذلك ، اغسل ثلاث مرات باستخدام مخزن غسيل (1٪ Tween20 في PBS).
  9. اتبع الخطوات المذكورة أعلاه في المخطوطة قبل تصوير البقع.
  10. الصورة باستخدام ركيزة بيروكسيداز الفجل (HRP).

5. تأكيد الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية (NTA)

  1. قم بإجراء NTA لتحليل تركيز وحجم جميع الجسيمات في العينة. قم بذلك عن طريق تخفيف كل عينة في PBS بعامل تخفيف قدره 1: 1000.
  2. حقن العينة في أداة NTA وقراءة العينة بطول موجي 550 نانومتر. في هذه المرحلة ، استخدم كمية الجسيمات لقياس كمية البروتين لكل جسيم (يتم التعبير عنها عادة في مخطط الفيمتوغرام) على النحو الموصى به في إرشادات MISEV.
  3. بعد ذلك ، بالنسبة ل NTA الفلورية ، قناع الخلية المخفف البرتقالي (CMO) (يلطخ جميع الجسيمات البيولوجية داخل العينة) في PBS بعامل تخفيف قدره 1: 1000. من هذا ، قم بتخفيف صبغة CMO باستخدام عينة sEV بعامل تخفيف 1:10 - احتضان خطوة التخفيف هذه في الظلام لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
  4. تمييع التخفيف الثاني من CMO باستخدام PBS بمعامل تخفيف قدره 1: 1000.
    ملاحظة: يجب أن يكون التخفيف النهائي لصبغة CMO 1: 10 000 000.
  5. اقرأ CMO لكل عينة sEV بطول موجي 550 نانومتر باستخدام أداة NTA.
  6. بالنسبة للأجسام المضادة الفلورية رباعي السبانين (انظر جدول المواد) ، أولا ، قم بتخفيف كل جسم مضاد في PBS بعامل تخفيف 1:10. من هذا ، قم بتخفيف كل صبغة باستخدام عينة sEV بعامل تخفيف 1:10 - احتضان خطوة التخفيف في الظلام لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
  7. قم بتخفيف الأجسام المضادة الثانية باستخدام PBS بعامل تخفيف 1: 1000.
    ملاحظة: يجب أن يكون التخفيف النهائي لكل جسم مضاد رباعي السبانين 1: 100 000.
  8. اقرأ قراءات الأجسام المضادة الفلورية لعينة sEV بطول موجي 550 نانومتر باستخدام أداة NTA.

6. تأكيد الحويصلات الصغيرة خارج الخلية عن طريق المجهر الإلكتروني للإرسال (TEM)

ملاحظة: تم تنفيذ هذا البروتوكول من قبل مرفق الفحص المجهري الطبي الحيوي في جامعة ليفربول.

  1. أولا ، قم بإصلاح عينات sEV باستخدام الجلوتارالديهايد والبقع باستخدام أسيتات اليورانيل.
  2. من خلال سلسلة متدرجة من الكحوليات ، قم بتجفيف العينة الجاهزة ل TEM.
  3. عينات الصور باستخدام مجهر إلكتروني ناقل الإرسال المناسب.

7. علاج البروتيناز K و RNase A

  1. إلى 50 ميكرولتر من الدماغ المعزول مشتق EVs ، أضف 1 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / ميكرولتر بروتيناز K واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. أوقف كل تفاعل عن طريق إضافة كوكتيل مثبط البروتيناز 1x واحتضانه على الثلج لمدة 10 دقائق.
  3. بعد الحضانة ، أضف 1 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / ميكرولتر RNase A إلى كل عينة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: انتقل على الفور إلى القسم 8.

8. عزل الحمض النووي الريبي الكلي عن الحويصلات الصغيرة خارج الخلية

  1. لعزل الحمض النووي الريبي الكلي ، أضف 700 ميكرولتر من كاشف تحلل استعادة الحمض النووي الريبي عالي الجودة إلى 50 ميكرولتر من عينة EV المشتقة من الدماغ (BDsEV). حرك كل عينة لمدة 1 ساعة.
  2. أضف 140 ميكرولتر من الكلوروفورم ، ورج كل عينة بقوة لمدة 20 ثانية ، واتركها لتحتضن في RT لمدة 3 دقائق.
  3. قم بالطرد المركزي للعينة عند 12 000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية وجمع الطور البيني من العينة. أضف حجم 1.5x من الإيثانول بنسبة 100٪.
  4. أضف 700 ميكرولتر من أعمدة عزل الحمض النووي الريبي لخليط الطور البيني / الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة 15 ثانية عند RT.
    ملاحظة: كرر هذه الخطوة باستخدام جميع عينات الطور البيني / الإيثانول.
  5. أضف إلى العمود 700 ميكرولتر من محلول الغسيل وجهاز الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق.
  6. أضف 500 ميكرولتر من RPE العازلة ومرة أخرى جهاز الطرد المركزي عند ≥8000 × غرام لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق.
  7. أضف 500 ميكرولتر من 80٪ من الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة دقيقتين. تجاهل التدفق.
  8. في هذه المرحلة ، جفف غشاء العمود عن طريق الطرد المركزي للأعمدة بأقصى سرعة (>8000 × جم) لمدة 5 دقائق مع فتح الغطاء.
  9. انقل العمود إلى أنبوب تجميع جديد ، وأضف 14 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة إلى غشاء العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند ≥8000 × جم لمدة 1 دقيقة لتصفية إجمالي الحمض النووي الريبي من BDsEVs.
  10. حدد إجمالي الحمض النووي الريبي الميكرو باستخدام العينات باستخدام مجموعة مقايسة القياس الكمي miRNA ، حيث تم قياس العينات على مقياس فلوري للقياس الكمي ، واختيار نوع مقايسة miRNA.

9. تسلسل الحمض النووي الريبي الصغير

  1. بعد القياس الكمي ل miRNA داخل العينة ، قم بتجميع مكتبة (كدنا) باستخدام مجموعة إعداد مكتبة الحمض النووي الريبي الصغير.
    ملاحظة: باستخدام هذا البروتوكول ، تضمن إنشاء المكتبة أربع خطوات: ربط محول 3 بوصات ، وتنقية ، وربط محول 5 بوصات ، والنسخ العكسي - حيث يتم في النهاية تشكيل مكتبة RNA / cDNA. بعد إنشاء المكتبة ، يحدث تضخيم PCR لنقطة النهاية مع إضافة بادئات الفهرس (المستخدمة لأغراض تعدد الإرسال) ، وبعد ذلك يتم تنقية العينات.
  2. لاختبار جودة الحمض النووي الريبي ، استخدم مقايسة تطبيق مراقبة الجودة التي توضح بالتفصيل حجم كل مستحضر وكثافة الذروة.
  3. لاختبار تركيز الحمض النووي ، قم بقياس كمية الحمض النووي على مقياس فلوري للقياس الكمي ، واختيار نوع مقايسة dsDNA.
  4. قم بإعداد العينات ل Small RNA Seq باستخدام مجموعة الكاشف ، وبعد ذلك يتم تحميل العينات في خلية التدفق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتأكيد وجود BDsEVs ، تم استخدام ثلاث تقنيات: النشاف الغربي ، و NTA ، و TEM (الشكل 3). تظهر نتائج اللطخة الغربية (الشكل 3 أ والملف التكميلي 1) وجود جميع العلامات الإيجابية الخمس (CD9 و CD63 و CD81 و Flot-1 و TSG101) وغياب Calnexin في sEVs (المستخدمة كعنصر تحكم سلبي) ، مما يؤكد عدم وجود تلوث بالمحتويات الخلوية. كما هو متوقع ، تظهر متجانسات الدماغ (BH) بروتينا أكثر مما لوحظ في sevs للعلامات التي تم اختبارها. أكدت صور TEM مورفولوجيا BDsEVs وحجمها ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوضح هذا البروتوكول المعدل والمحسن لعزل الحويصلات الصغيرة خارج الخلية المشتقة من الدماغ وحمولتها من الحمض النووي الريبي الصغير جدوى استخدام الحد الأدنى من الأنسجة دون المساس بجودة وكمية المنتجات في اتجاه مجرى النهر. في مجال اكتشاف المؤشرات الحيوية ، يمكن أن يؤدي تحديد المعرفات الجزيئية الخاصة بأنواع الخلايا والأنسجة إلى وسائل أكثر سهولة للاختبارات التشخيصية غير الغازية باستخدام سوائل الجسم. علاوة على ذلك ، يوفر النهج الموصوف هنا إطارا لتحديد مجموعات سكانية فرعية محددة من sEV داخل أنواع م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

لا يوجد تضارب في المصالح لأي من المؤلفين.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من خلال منحة الدكتوراه لجوزيف مورغان من جمعية الزهايمر في المملكة المتحدة (المنحة رقم 549 / SERA-52) ومن قبل صناديق استراتيجية الابتكار بجامعة سالفورد (منحة SEFA-39). تم الحصول على أنسجة المخ من بنك الدماغ في مانشستر (مرجع REC 09 / H0906/52) لشبكة أدمغة الخرف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مصل الأبقار الألبومينميركA9418-100G
قناع الخلية صبغة غشاء البلازما البرتقاليThermoFisher ScientificC10045
Collagenase Type-IIIStemCell Technologies07422
أعمدة ExoSpin وأنظمة توجيه الخلايا العازلةالمحدودة.EX01-50تحتوي هذه المجموعة على أعمدة SEC المستخدمة في هذه التجربة ، والمخزن المؤقت لهطول الأمطار و EV PBS الخالي من المركبات الكهربائية.
كوكتيل مثبط البروتياز (100x)ThermoFisher Scientific78429
Hibernate-EMedium ThermoFisherScientific A1247601
Laemmli Sample Buffer (4x)BioRad1610747
Lexogen Small RNA-Seq Library Prep KitLexogen052.24تحتوي هذه المجموعة على صندوق كاشف صغير لتحضير الحمض النووي الريبي مع لوحة أولية i7 Index.
miRNeasy Micro Kit (50)Qiagen217084تحتوي هذه المجموعة على كاشف تحلل استعادة الحمض النووي الريبي عالي الجودة (Qiazol) ، وأعمدة عزل الحمض النووي الريبي ، ومخازن العزل (RWT ، RPE) ومياه خالية من RNase.
طقم كاشف MiSeq v3IlluminaMS-102-3001هذا هو غشاء النيتروسليلوز لمجموعة تحضير
Illumina ، 0.45 & mu ؛ mThermoFisher Scientific88018
PE / Dazzle 594 CD63 الأجسام المضادة BioLegend المضادة للإنسان143914تستخدم لتحليل fNTA
PE / Dazzle 594 CD81 الأجسام المضادة للإنسانBioLegend349520تستخدم لتحليل fNTA
PE / Dazzle 594 الأجسام المضادة CD9للإنسانBioLegend312118 المستخدمة لتحليل fNTA
PhosSTOPMerck4906845001
فحص البروتين BCAبيرس ThermoFisher Scientific23225
Proteinase KThermoFisher Scientific25530049
كيوبيت ميكرو رينا كيت الفحصThermoFisher ScientificQ32880
كيوبيت 1X dsDNA HS مجموعة الفحصThermoFisher ScientificQ33230
كيوبيت 3.0 مقياس الفلورThermoFisher ScientificQ33216
RIPA تحلل واستخراج عازلةThermoFisher Scientific89901
RNase AThermoFisher ScientificEN0531
SuperSignal West Femto أقصى حساسية الركيزةThermoFisher Scientific34094
المضادة مجموعة

المراجع

  1. Jia, Y., et al. Small extracellular vesicles isolation and separation: Current techniques, pending questions and clinical applications. Theranostics. 12 (15), 6548-6575 (2022).
  2. Fornari, S., Schäfer, A., Jucker, M., Goriely, A., Kuhl, E. Prion-like spreading of Alzheimer's disease within the brain's connectome. J R Soc Interface. 16 (159), 20190356(2019).
  3. Zhang, P., et al. Tumor-derived small extracellular vesicles in cancer invasion and metastasis: molecular mechanisms, and clinical significance. Mol Cancer. 23 (1), 18(2024).
  4. Constantinides, V., et al. CSF Aβ42 and Aβ42/ Aβ40 ratio in Alzheimer's disease and frontotemporal dementia. Diagnostics. 13 (4), 783(2023).
  5. Cheng, L., et al. Prognostic serum miRNA biomarkers associated with Alzheimer's disease shows concordance with neuropsychological and neuroimaging assessment. Mol Psychiatry. 20 (10), 1188-1196 (2015).
  6. Roser, A. E., Caldi Gomes, L., Schünemann, J., Maass, F., Lingor, P. Circulating miRNAs as diagnostic biomarkers for Parkinson's disease. Front Neurosci. 12, 625(2018).
  7. Jackson, N., Guerrero-Muñoz, M. J., Castillo-Carranza, D. L. The prion-like transmission of tau oligomers via exosomes. Front Aging Neurosci. 14, 974414(2022).
  8. Vella, L., et al. A rigorous method to enrich for exosomes from brain tissue. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1348885(2017).
  9. Yousif, G., Qadri, S., Parray, A., Akhthar, N., Shuaib, A., Haik, Y. Exosomes derived neuronal markers: Immunoaffinity isolation and characterization. Neuromolecular Med. 24 (3), 339-351 (2022).
  10. Kumar, K., et al. Recent advances in microfluidic approaches for the isolation and detection of exosomes. TRAC-Trend Anal Chem. 159, 116912(2023).
  11. Ransom, L., et al. Human brain small extracellular vesicles contain selectively packaged, full-length mRNA. Cell Rep. 43 (4), 114061(2024).
  12. Gomes, P., et al. A novel isolation method for spontaneously released extracellular vesicles from brain tissue and its implication for stress-driven brain pathology. Cell Commun Signal. 21 (1), 35(2023).
  13. Welsh, J., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV 2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2023).
  14. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  15. Pirisinu, M. The long journey of extracellular vesicles towards global scientific acclamation. Adv Pharm Bull. 13 (3), 489-501 (2023).
  16. Bender, A., Sullivan, B. P., Lillis, L., Posner, J. D. Enzymatic and chemical-based methods to inactivate endogenous blood ribonucleases for nucleic acid diagnostics. J Mol Diagn. 22 (8), 1030-1040 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المؤشرات الحيوية للحمض النووي الريبي الميكرويالحويصلات خارج الخلوية الصغيرة في أنسجة الدماغكروماطوغرافيا استبعاد الحجمتحليل تتبع الجسيمات النانويةلطخة ويسترنتتبع الأجسام المضادة الفلوريةCD9 CD63 CD81تسلسل الحمض النووي الريبياكتشاف المؤشرات الحيوية للأمراض
تسخير قوة شحنات الحمض النووي الريبي الصغير في حويصلات صغيرة خارج الخلية يتم إطلاقها من أقسام الدماغ البشري المجمدة حديثا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.