مقالة منهجية

التحقيق في تمايز الخلايا التائية CD4 الفئران باستخدام الاستئصال الجيني بوساطة البروتين النووي الريبي المركب CRISPR-Cas9

1.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67380

⸱

يونيو 20, 2025

 ,  , 
1Laboratory of Immune System Biology, NIAID, NIH

في هذه المقالة

ملخص

نحدد نهجا قابلا للتكيف بدرجة كبيرة لاستخدام الاستئصال الجيني بوساطة البروتين النووي الريبي المركب CRISPR-Cas9 في خلايا CD4 T الساذجة في الفئران للتحقيق في وظيفة الجينات في تمايز الخلايا التائية CD4.

الملخص

جعلت إمكانية الوصول الواسع النطاق لتقنية التكرار القصير المتجانس العنقودية (CRISPR) -Cas9 استهداف الجينات في الخلايا الأولية طريقة روتينية لتقييم وظيفة الجينات في الخلايا التائية. نظرا للتكلفة والتوافر المحدود لسلالات الفأر بالضربة القاضية (KO) ، فإن اختبار الفرضيات الأولية التي تنطوي على وظيفة الجينات في الخلايا التائية يمكن أن يكون باهظا باستخدام النماذج الحيوانية المستهدفة بالجينات. ومع ذلك ، باستخدام الموارد المتاحة تجاريا ، بما في ذلك دليل الحمض النووي الريبي المصمم مسبقا (gRNAs) ، يمكن للباحثين إنشاء خلايا تائية ساذجة مستهدفة للجينات يمكن استخدامها لتنشيط الخلايا التائية ودراسات التمايز.

نحدد هنا بروتوكولا لاستخدام مجمعات البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 (RNPs) التي يتم تسليمها بواسطة النواة لتوليد خلايا CD4 T الساذجة للجين KO الفئران بكفاءة والتي يمكن استخدامها لتقييم وظيفة الجينات في تمايز الخلايا التائية CD4 ، في المختبر. يضمن عزل خلايا CD4 T الساذجة عن الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفأر ، متبوعا بالنواة بمجمعات Cas9-gRNA بدء تشغيل الجين KO قبل تنشيط الخلايا التائية النهائية ، مما يوفر ميزة استراتيجية على توصيل الحمض النووي الريبي بوساطة الفيروسات القهقرية ، والذي يتطلب عادة التنشيط المسبق للخلايا التائية ، مما يمنع تقييم التأثيرات في الخلايا التائية الساذجة. علاوة على ذلك ، تتجاوز هذه الطريقة القائمة على النواة المشكلات التنموية المحتملة المرتبطة بحيوانات KO الجينية.

بعد تسليم Cas9-gRNA ، نصف بروتوكولات دراسة تمايز الخلايا التائية CD4 إلى سلالات Th1 و Th2 و Th17 و Treg باستخدام الاستقطاب في المختبر . بالإضافة إلى ذلك ، فإن هذا البروتوكول قابل للتكيف مع استخدام خلايا CD4 أو CD8 T المستهدفة جينات للعديد من التطبيقات النهائية ، بما في ذلك دراسات تنشيط الخلايا التائية الأخرى في المختبر ودراسات النقل بالتبني في الجسم الحي. أدى استخدام طرق CRISPR-Cas9 إلى تبسيط قدرتنا على تقييم وظيفة الجينات في الخلايا التائية ويسمح ب KO الروتيني للعديد من الجينات ذات الأهمية ، مما يحرر الباحثين من القيود المرتبطة بدراسة KO الجينية.

المقدمة

أدى استخدام التقنيات القائمة على التكرار القصير المتجانس (CRISPR) العنقودية المتباعدة بانتظام إلى تحويل قدرتنا على التلاعب بتسلسلات الحمض النووي الجينومي ، مما عزز بشكل كبير قدرتنا على دراسة وظيفة الجينات في عدد لا يحصى من الأنظمة البيولوجية. فيما يتعلق بالخلايا التائية CD4 ، ظهرت طرق تستخدم مجمعات البروتين النووي الريبي CRISPR-Cas9 (RNP) ، مما يسهل خروج الضربة القاضية الجيني الفعال (KO) في الخلايا التائية الأولية الساذجة التي يمكن استخدامها في الدراسات في المختبر وفي الجسم الحي 1،2،3،4. غالبا ما يكون تحديد الجينات المفترضة الجديدة التي تنظم تمايز الخلايا التائية CD4 مدفوعا بالتحليلات النسخية والجينية ، مما يولد أهدافا جديدة يمكن أن يكون هناك القليل من الموارد أو التي يصعب الحصول عليها للتحقيق فيها ، خاصة إذا كان الجين يؤثر على أنسجة متعددة وقد يتطلب تقييما باستخدام الفئران المشروطة التي تستهدف الجينات. تم استخدام استهداف الجينات عن طريق نقل الفيروسات القهقرية ل gRNAs5،6 لتقييم وظيفة الجينات في الخلايا التائية ، ومع ذلك يتطلب تنشيط الخلايا التائية للعدوى الفيروسية القهقرية ، ولا يمكن استخدامه لاستهداف الجينات في الخلايا التائية الساذجة. يوفر CRISPR-Cas9 الذي يتم تسليمه بواسطة Nucleofection في الخلايا التائية الساذجة أداة بديلة غير مكلفة وسريعة نسبيا للتحقق من صحة الجينات الجديدة ذات الأهمية واستجوابها قبل الاستثمار في نماذج الفئران التي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة.

في بروتوكولنا الموضح هنا ، يتم إجراء تحرير الجينات بوساطة CRISPR-Cas9 باستخدام بروتين Cas9 المؤتلف المركب بجزيئات دليل الحمض النووي الريبي (gRNA) التي يتم تسليمها إلى خلايا CD4 T الساذجة عن طريق النواة. يتكون gRNA من مكونين متميزين ، CRISPR RNA المنشط عبر التنشيط (tracrRNA) و CRISPR RNA (crRNA). من الناحية الوظيفية ، تسهل التسلسلات المشتقة من tracrRNA ارتباط gRNA ب Cas9 ، بينما تحتوي تسلسلات crRNA على خصوصية لمناطق الحمض النووي المستهدفة ذات الأهمية. تتوسط مجمعات Cas9-gRNA فواصل الحمض النووي المستهدف مزدوج الشريطة (dsDNA) ، حيث تتوسط gRNAs خصوصية تسلسل نشاط نوكلياز Cas97،8. يؤدي انقسام dsDNA بوساطة Cas9 إلى تعطيل الجينات ، من خلال توليد طفرات indel بعد انضمام نهاية غير متماثلة في الخلايا المستهدفة9. في هذا البروتوكول ، نوصي باستخدام العديد من gRNAs التي تستهدف الجينات ذات الأهمية لضمان KO قوي في خلايا CD4 T الساذجة.

تعد الخلايا التائية المساعدة CD4 لاعبا رئيسيا في الجهاز المناعي ، حيث توجه الاستجابات المناعية من خلال إنتاج مجموعة متنوعة من السيتوكينات التي تعدل وظيفة العديد من أنواع الخلايا المناعية. عند التحفيز من خلال مستقبلات الخلايا التائية (TCR) في وجود سيتوكينات معينة ، يمكن لخلايا CD4 T الساذجة أن تتمايز إلى سلالات مميزة من خلايا CD4 التائية المساعدة التائية (Th) ، بما في ذلك Th1 و Th2 و Th17 والخلايا التائية التنظيمية (Treg) 10،11،12. إن تحديد سلالات الخلايا التائية CD4 المميزة هذه هو التعبير عن عوامل نسخ محددة تحدد النسب (TFs) والسيتوكينات (الشكل 1). يمكن نمذجة تمايز الخلايا التائية CD4 باستخدام الاستقطاب في المختبر 13،14،15 ، باستخدام خلايا CD4 T الساذجة التي يتم تنشيطها من خلال TCR في وجود السيتوكينات المعززة للنسب وتمنع الأجسام المضادة التي تمنع التبني غير المناسب.

يوفر الجمع بين استهداف جين CRISPR-Cas9 في خلايا CD4 T الساذجة مع استقطاب الخلايا التائية CD4 في المختبر نظاما قويا لتقييم وظيفة الجينات في هذه الخلايا (الشكل 2). نظرا للتوافر الواسع النطاق للكواشف لتقييم تمايز CD4 عن طريق قياس التدفق الخلوي ، يمكن بسهولة استجواب الجوانب الرئيسية لتمايز الخلايا التائية CD4 ، بما في ذلك تعبير TF وإنتاج السيتوكين ، باستخدام البروتوكولات الموضحة هنا. يعزز تحديد الجينات الجديدة التي تنظم وظيفة الخلايا التائية CD4 فهمنا لهذه الخلايا ، وتوفر طرق CRISPR-Cas9 المقترنة بالاستقطاب في المختبر طريقة قوية لتقييم وظيفة الجينات قبل الالتزام بنماذج الفئران الجينية KO.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

بالنسبة لجميع الإجراءات الموضحة هنا ، استخدمنا الفئران C57 / BL6J من النوع البري (WT). تم الحفاظ على الفئران ومعالجتها في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض (SPF) وفقا لإرشادات NIAID (بروتوكول LISB-22E) ولجان رعاية واستخدامه في المعاهد الوطنية للصحة (ضمان رعاية #A-4149-01).

1. اعتبارات قبل البدء

  1. اختيار كواشف الحمض النووي الريبي
    ملاحظة: راجع جدول المواد للحصول على كواشف gRNA المصممة مسبقا التي تستهدف جينوم الفأر المستخدم في هذا البروتوكول.
    1. ابحث عن الجين محل الاهتمام (جدول المواد ، crRNAs المطلوبة) وحدد أفضل ثلاثة crRNAs مصممة مسبقا (تنسيق 2 نانومول). بالإضافة إلى ذلك ، احصل على التحكم السلبي crRNA لاستخدامه بالتوازي (جدول المواد).
      ملاحظة: يتطلب تكوين gRNAs الوظيفية ازدواج crRNA مع tracrRNA. احصل على كاشف tracrRNA واتبع الخطوات الواردة في القسم 3.
    2. تصميم تسلسلات gRNA المستهدفة المخصصة.
      ملاحظة: يعد تصميم تسلسلات gRNA المستهدفة المخصصة خارج نطاق هذا البروتوكول ولكن يمكن إجراؤه باستخدام الأدوات المتاحة للجمهور مثل CRISPick (جدول المواد).
  2. المخازن المؤقتة والوسائط والمعدات
    ملاحظة: ما لم يذكر خلاف ذلك ، استخدم المخازن المؤقتة والكواشف الباردة (4 درجات مئوية).
    1. قم بإعداد المخزن المؤقت MACS ، والمخزن المؤقت FACS ، والمخزن المؤقت Triton X-100 بنسبة 0.5٪ ، والمخزن المؤقت للنفاذية 1x ، ووسائط RPMI كاملة ، ووسائط IMDM كاملة (جدول المواد) قبل بدء الإجراء وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
    2. احصل على عزل الخلايا التائية CD4 الساذجة ومجموعات الميكروبيدات المضادة ل FITC (جدول المواد) قبل البدء في هذا الإجراء.
    3. قبل بدء النوة (القسم 4) ، قم بتسخين (37 درجة مئوية) 5 مل من وسائط IMDM الكاملة وقم بإعداد ما لا يقل عن 10 مل من IMDM الكامل المكمل ب IL-7 عند 5 نانوغرام / ميكرولتر دافئ إلى 37 درجة مئوية (جدول المواد). اضبط حجم الوسائط الدافئة مسبقا حسب الحاجة لمراعاة إضافة 125 ميكرولتر لكل عينة بعد النواة. اضبط حجم IMDM الكامل المحتوي على IL-7 حسب الحاجة ، بناء على عدد الخلايا التي تم نوويكتها (القسم 4).
    4. قبل البدء في عزل الخلية العارضة للمستضد (APC) ، قم بإعداد كاشف الميتومايسين C عن طريق إضافة 4 مل من H2O المعقم إلى قارورة 2 مجم من ميتومايسين C (تركيز مخزون 0.5 مجم / مل).
      ملاحظة: قم بتنفيذ جميع الخطوات في غطاء مزرعة الأنسجة واستخدم تقنيات معقمة معقمة.

2. عزل الخلايا التائية CD4 الساذجة

ملاحظة: يمكن عزل خلايا CD4 التائية الساذجة باستخدام العزل المغناطيسي أو من خلال فرز الخلايا. عادة ما يكون النقاء الذي يتم الحصول عليه من العزل المغناطيسي 97٪ ، وتكون صلاحية الخلية عالية جدا ، في حين أن الفرز الإلكتروني يمكن أن يحسن نقاء الخلية على حساب بقاء الخلية. سيستخدم البروتوكول الموصوف هنا العزل المغناطيسي ولكن يمكن تكييفه مع أي من السيناريوهين. تأكد من إعداد أعمدة LS بشكل مناسب (جدول المواد).

  1. اعزل الطحال والغدد الليمفاوية (الأربية والعضدية والمحورية وعنق الرحم) من الفئران (الفئران WT C57BL / 6J المستخدمة هنا).
  2. ضع شاشة 70 ميكرومتر في طبق 60 مم مع 5 مل من RPMI الكامل (جدول المواد) لكل أنسجة تتم معالجتها. قم بمعالجة الغدد الليمفاوية والطحال في أطباق مختلفة لزيادة المحصول. قم بطحن المناديل برفق من خلال الفلتر باستخدام مكبس من حقنة سعة 3 مل. اشطف الفلتر ب 1-3 مل من الوسائط وانقل المعلقات أحادية الخلية إلى أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
  3. كرر الخطوة 2.2 للعقد الليمفاوية الإضافية وأنسجة الطحال، حسب الحاجة.
  4. جهاز الطرد المركزي المعلقات أحادية الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. استعد لعد الخلايا على النحو التالي.
    1. بالنسبة لعينات الطحال, شفط الطاف, إعادة تعليق حبيبات الخلية برفق في 1 مل من المخزن المؤقت تحلل ACK, احتضان لمدة 2-5 دقائق في RT, ثم إضافة 2 مل من RPMI كامل, تدوير لأسفل, إعادة تعليق في 5 مل من RPMI كامل, عد الخلايا.
    2. بالنسبة لخلايا العقدة الليمفاوية ، قم بشفط المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من RPMI الكامل الطازج ، واحسب الخلايا.
  6. للإدخال في مجموعة عزل CD4 الساذجة ، امزج خلايا الطحال مع خلايا العقدة الليمفاوية للوصول إلى رقم الخلية المطلوب للعزل.
    ملاحظة: عادة ما ينتج عن 1 × 10 8 خلاياالعقدة الليمفاوية والطحال من الفئران WT-B6 2-8 × 106 خلايا CD4 T ساذجة.
  7. الطرد المركزي لخلايا الطحال والعقدة الليمفاوية المجمعة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في الحجم المناسب من المخزن المؤقت MACS (جدول المواد) كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة (مجموعة عزل الخلايا التائية CD4 الساذجة).
  8. اتبع بدقة بروتوكول الشركة المصنعة لعزل خلايا CD4 T الساذجة عن طريق الاختيار السلبي (جدول المواد) باستخدام كوكتيل الأجسام المضادة للخلايا التائية CD4 + الساذجة ، وميكروبيدات مضادة للبيوتين و CD44 ميكروبيدات ؛ استخدم أعمدة LS لهذا العزل واجمع الخلايا في أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
  9. بعد العزل ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 2 مل من وسائط RPMI الكاملة ، وعد الخلايا.
  10. قم بتخزين الخلايا عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة للبدء بالنواة.

3. تشكيل مركب Cas9-gRNA

ملاحظة: قم بإعداد التحكم السلبي ومخزون crRNA الخاص بالجينات. نحن نحدد استخدام crRNA فريد واحد لظروف التحكم السلبية وثلاثة crRNAs فريدة لظروف استهداف الجينات. يضمن استخدام ثلاثة crRNAs متميزة في وقت واحد KO للجينات ذات الأهمية.

  1. أعد تعليق crRNAs و tracrRNA إلى تركيزات مخزون 100 ميكرومتر باستخدام المخزن المؤقت المزدوج (جدول المواد). هذا يصل إلى 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل 1 نانومول من الحمض النووي الريبي.
  2. اجمع بين crRNAs الفردية مع tracrRNA بنسبة 1: 1 في أنابيب PCR المعقمة واخلطها عن طريق سحب العينات. يسخن إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في جهاز التدوير الحراري. بعد ذلك ، اترك المجمعات تبرد حتى توضع على سطح الطاولة لمدة 10 دقائق على الأقل.
    ملاحظة: يشار إلى الازدواج crRNA / tracrRNA باسم gRNAs من هذه النقطة فصاعدا. تكون المجمعات مستقرة لمدة 6 أشهر على الأقل إذا تم تخزينها عند -20 درجة مئوية. عادة ما نصنع 6 ميكرولتر من gRNA (3 ميكرولتر من crRNA + 3 ميكرولتر من tracrRNA) لكل تشغيل ، مما يوفر مادة كافية لخمس عينات تقريبا (1 ميكرولتر / عينة).
  3. بالنسبة ل gRNAs التي تستهدف الجينات: في أنابيب PCR المعقمة ، أضف 3 ميكرولتر من gRNAs (1 ميكرولتر لكل من ثلاثة gRNAs فريدة لكل هدف) ، و 1 ميكرولتر من بروتين Cas9 ، و 1 ميكرولتر من المخزن المؤقت المزدوج (إجمالي 5 ميكرولتر لكل عينة). ماصة بلطف لخلط والتأكد من وجود جميع المواد في قاع الأنبوب. احتضن في RT لمدة 10 دقائق. مزامنة توقيت هذه الخطوة مع nucleofection (الخطوات 4.1-4.2).
  4. للتحكم السلبي gRNA: في أنابيب PCR المعقمة ، أضف 1 ميكرولتر من gRNA ، و 1 ميكرولتر من بروتين Cas9 ، و 3 ميكرولتر من المخزن المؤقت المزدوج (إجمالي 5 ميكرولتر لكل عينة). ماصة بلطف لخلط والتأكد من وجود جميع المواد في قاع الأنبوب. احتضن في RT لمدة 10 دقائق. مرة أخرى ، قم بمزامنة توقيت هذه الخطوة مع nucleofection (الخطوات 4.1-4.2).
    ملاحظة: يعد استخدام 50 مللي مول من الحمض النووي الريبي المرسال للتحكم السلبي (مقابل 3 × 50 ملي مول للاختبار) أكثر فعالية من حيث التكلفة وليس له أي تأثير على النتائج.

4. Nucleofection - استئصال الجينات بوساطة Cas9-gRNA

  1. أجهزة الطرد المركزي 1-8 × 106 خلايا تائية منقاة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية لكل عينة نووية. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية بعناية.
  2. إعادة تعليق الخلايا في 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت P3 (16.4 ميكرولتر من P3 + 3.6 ميكرولتر من المكملات لكل عينة ؛ مجموعة Nucleofector ، جدول المواد) ونقل المعلق إلى أنابيب PCR التي تحتوي على مجمعات Cas9-gRNA. امزج وانقل إلى آبار مستقلة من 16 بئرا من nucleocuvette (مجموعة Nucleofector ، جدول المواد). تأكد من عدم تكوين الفقاعات عند نقل الخلايا إلى الكوفيت ، حيث يمكن أن يؤثر ذلك سلبا على كفاءة النواة. اضغط على الكوفيت على سطح العمل للتأكد من أن جميع المواد في قاع كل بئر وخالية من الفقاعات.
  3. قم بإجراء النواة باستخدام برنامج DN100 للنواة المشار إليها (جدول المواد). أضف على الفور 125 ميكرولتر من وسائط IMDM الكاملة الدافئة مسبقا إلى آبار النواة ونقل الخلايا إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل. اشطف كل بئر مرة إضافية ب 125 ميكرولتر من الوسائط الدافئة مسبقا لضمان جمع جميع الخلايا.
  4. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة جميع الوسائط ، وإعادة تعليقها في 200 ميكرولتر من وسائط IMDM الكاملة الدافئة + 5 نانوغرام / مل IL-7 (جدول المواد).
  5. انقل 200 ميكرولتر من الخلايا إلى لوحة الاستزراع وأضف وسائط IMDM كاملة دافئة + 5 نانوغرام / مل IL-7 لعمل الحجم النهائي المطلوب وفقا لحجم اللوحة على النحو التالي: 1-2 × 106 خلايا لكل بئر على صفيحة 48 بئرا (1 مل من الوسائط لكل بئر) ، 2-4 × 106 خلايا لكل بئر على صفيحة 24 بئرا (1.5 مل من الوسائط لكل بئر) الحجم ، 4-6 × 106 خلايا لكل بئر على صفيحة من 12 بئرا (2 مل من الوسائط لكل بئر) ، و 6-10 × 106 خلايا لكل بئر على صفيحة من 6 آبار (4 مل من الوسائط لكل بئر). زراعة الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 3 أيام.
    ملاحظة: اعتمادا على معدل دوران البروتين ومقايسة المصب ، قم بتحسين فترة الثقافة هذه. لقد وجدنا فترة راحة مثالية مدتها 3 أيام ، ولكن يمكن تعديلها بناء على الجين المستهدف إلى ما بين 1 و 7 أيام باستخدام هذه الشروط.
  6. بعد الزراعة في وسائط IMDM كاملة + 5 نانوغرام / مل IL-7 ، أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات وحصادها في أنابيب مخروطية سعة 15 مل. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من وسائط RPMI الكاملة.
  7. عد الخلايا لتحديد عدد خلايا CD4 T الساذجة الحية المقابلة للخلايا ذات الأهمية ذات النواة gRNA.
    ملاحظة: في عملية النواة ، توقع أن تفقد ~ 50٪ من خلايا الإدخال على مدار هذا البروتوكول وضبط عدد خلايا CD4 T الساذجة المستخدمة وفقا لذلك. أيضا ، في هذه المرحلة ، يمكنك اختبار كفاءة استهداف الجينات في خلايا CD4 T الساذجة باستخدام مجموعة متنوعة من التقنيات (قياس التدفق الخلوي ، أو اللطخة الغربية ، أو qPCR ، أو فحص T7EI).

5. عزل الخلية العارضة للمستضد (APC)

ملاحظة: تأكد من تحضير كاشف الميتومايسين ، والذي سيتم استخدامه لمعالجة ناقلات الجنود المدرعة بعد العزل (جدول المواد). اقرأ بروتوكول microbead المضاد ل FITC الخاص بالشركة المصنعة قبل البدء وتأكد من إعداد أعمدة LS بشكل مناسب (جدول المواد).

  1. عزل الطحال من الفئران WT المخصصة لعزل APC.
  2. قم بعمل معلقات أحادية الخلية كما هو موضح أعلاه (2.2 ، 2.5.1) - ليز كريات الدم الحمراء مع محلول تحلل ACK ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من RPMI الكامل (4 °C) ، وعد الخلايا.
    ملاحظة: بعد عزل APC ، توقع الحصول على ما يقرب من نصف عدد خلايا الإدخال ، على سبيل المثال ، 1 × 108 خلايا طحال مدخلة ستنتج ~ 40-50 × 106 APCs. تحضير العدد المطلوب من خلايا الطحال للعزل.
  3. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS (جدول المواد).
  4. أضف 4 ميكرولتر لكل من الأجسام المضادة المضادة ل CD4 ومضادة ل CD8 المترافقة ب FITC (جدول المواد) إلى خلايا الطحال. تخلط جيدا وتحتضن على حرارة 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
  5. خلايا الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، قم بإعادة تعليق الخلايا في الحجم الموصى به من المخزن المؤقت MACS وأضف الكمية المناسبة من الميكروبيدات المضادة ل FITC (جدول المواد).
  6. احتضان الخلايا عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. الطرد المركزي للخلايا عند 500 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت MACS وقم بتمرير الخلايا عبر عمود LS المحضر كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة ، وجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
  7. الطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق و 4 درجات مئوية ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الخلايا في 2.7 مل من المعقم 1x PBS.
    ملاحظة: قد تنتشر ناقلات الجنود المدرعة بشكل سيئ. استخدم سرعة متزايدة للطرد المركزي.
  8. أضف 300 ميكرولتر من محلول الميتومايسين C إلى الخلايا لتكوين تركيز نهائي يبلغ 50 ميكروغرام / مل. تخلط جيدا وتحتضن عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 30 دقيقة أو لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 في حاضنة.
  9. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية ، واغسلها ب 10 مل من 1x PBS المعقم. استخدم المكنسة الكهربائية لإزالة أكبر قدر ممكن من المواد الطافية. كرر الغسيل 2x.
  10. قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 5 مل من وسائط RPMI الكاملة (4 درجات مئوية). عد الخلايا. قم بتخزين APCs عند 4 درجات مئوية حتى تصبح جاهزة لإجراء تمايز الخلايا التائية CD4.

6. تمايز الخلايا التائية CD4

ملاحظة: تم تعيين هذا البروتوكول على زراعة الخلايا بتنسيق لوحة 48 بئرا -2 × 105 CD4 الساذج + 1 × 106 APC لكل بئر - نسبة 1: 5. يتم زراعة الخلايا في وسائط IMDM كاملة. هنا ، سنوفر شروطا لتمايز خلايا Th1 و Th2 و Th17 و Treg CD4 T ؛ ومع ذلك ، يمكن اختيار شروط النسب الفردية اعتمادا على تركيز المستخدم.

  1. حدد عدد الخلايا في لوحة 48 بئرا لاستخدامها واحسب عدد الخلايا اللازمة لكل نوع من أنواع الخلايا.
    ملاحظة: على سبيل المثال ، تتطلب 10 آبار 2 × 106 CD4 ساذجة و 10 ×10 6 ناقلات الجنود المدرعة للحفاظ على نسبة 1: 5. إذا سمحت أرقام الخلايا ، فاحسب خلايا كافية لبئر إضافي واحد لحساب أي خطأ في سحب العينات عند الطلاء.
  2. امزج العدد المطلوب من CD4 و APCs الساذجة معا عند 1: 5 ، وقم بالطرد المركزي للخلايا عند 600 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية ، وقم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من وسائط IMDM الكاملة لكل بئر (على سبيل المثال ، الخلايا المقابلة ل 10 آبار في 5 مل من الوسائط).
  3. لوحة 500 ميكرولتر زيادات الخلايا في آبار من صفيحة 48 بئرا ، مما يضمن أن كل بئر يحتوي على 2 × 105 CD4 ساذج + 1 × 106 APCs.
  4. للحصول على ظروف تمايز الخلايا التائية CD4 المطلوبة ، قم بإعداد 2x سيتوكين + مزيج من الأجسام المضادة في IMDM كامل كما هو موضح في الجدول 1. أضف 500 ميكرولتر من مزيج 2x إلى زيادات الخلايا المطلية مسبقا بمقدار 500 ميكرولتر لجعل التركيزات النهائية للكواشف 1x.
    ملاحظة: تستند هذه الأمثلة إلى صنع 2.5 مل من مستحضرات 2x ، وهو ما يكفي لخمسة آبار لكل حالة. مرة أخرى، إذا سمحت كميات الكاشف بذلك، فقم بإجراء زيادة إضافية واحدة قدرها 2x مزيج لحساب خطأ سحب العينات.
  5. أضف 500 ميكرولتر من 2x cytokinine + وسائط الأجسام المضادة إلى 500 ميكرولتر من الآبار المحتوية على خلايا CD4 / APC لعمل تركيز نهائي من الكواشف عند 1x.
  6. ضع اللوحة المكونة من 48 بئرا في حاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. استزراع الخلايا لمدة 72 ساعة للسماح بإكمال استقطاب CD4.
    ملاحظة: افحص اللوحة بعد فترة الاستزراع لضمان نمو قوي. يجب أن تكون الوسائط برتقالية اللون بعد الحضانة ، مع وجود وسائط صفراء تشير إلى فرط نمو الخلايا المحتمل.

7. تقييم تأثير الاستئصال الجيني في تمايز الخلايا التائية CD4

ملاحظة: لجميع خطوات التلوين ، قم بإعداد مزيج رئيسي من الأجسام المضادة المضافة عند التخفيف المناسب إلى مخزن التلوين المطلوب. يتم استخدام حجم 50 ميكرولتر من كوكتيل الجسم المضاد / العازلة لكل عينة. اضبط الأجسام المضادة المحددة المستخدمة بناء على التجربة. يجب على المستخدمين اختيار لوحات الأجسام المضادة ذات الصلة بتجاربهم المحددة. نقدم هنا نموذجا يمكن من خلاله التعامل مع هذا في سياق الجينات المستهدفة هنا.

  1. بعد تمايز CD4 ، قم بإزالة 600 ميكرولتر من المادة الطافية بعناية ، ثم أعد تعليق الخلايا في كل بئر عن طريق سحب العينات.
  2. قم بإزالة 200 ميكرولتر من الخلايا من كل بئر وأضفها إلى صفيحة 96 بئرا تحمل علامة لتلطيخ عامل النسخ. قم بتكسير العينات عن طريق الدوران عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم قم بنفض الغبار عن المادة الطافية ، وانتقل إلى تلطيخ السطح (الخطوة 7.5).
  3. لتحليل السيتوكين ، أعد تحفيز 200 ميكرولتر المتبقية من الخلايا مع PMA (50 نانوغرام / مل) ، الأيونوميسين (500 نانوغرام / مل) ، و Golgi Stop (1 / 2,000 التخفيف) في IMDM الكامل. أضف 200 ميكرولتر من مزيج إعادة التحفيز 2x إلى كل بئر واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 4 ساعات.
    ملاحظة: يجب أن يكون هناك 200 ميكرولتر متبقية في اللوحة المكونة من 48 بئرا ؛ ومن ثم ، فإن إضافة 200 ميكرولتر من مزيج 2x من PMA (2x ، 100 نانوغرام / مل) ، Ionomycin (2x ، 1 ميكروغرام / مل) ، و Golgi Stop (2x ، 1 / 1,000) سيخلق تركيزا نهائيا قدره 1x (جدول المواد).
  4. في غضون ذلك ، ابدأ تلطيخ عامل النسخ. قم بإجراء تلطيخ المستضد السطحي عن طريق تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS الذي يحتوي على الأجسام المضادة المترافقة بالفلوروكروم المرغوبة لكل عينة (الجدول 2). احتضن في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر لغسل المخزن المؤقت للتلطيخ. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نفض الغبار عن المادة الطافية. كرر لمدة غسلتين إجمالا.
  6. قم بإصلاح الخلايا ب 100 ميكرولتر من محلول تثبيت Foxp3 (جدول المواد) في الظلام عند RT لمدة 25 دقيقة.
  7. بعد 25 دقيقة ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر لغسل المثبت. قم بالطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ونفض الغبار عن المادة الطافية. كرر لمدة غسلتين إجمالا.
  8. قم بإجراء تلطيخ داخل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من 1x Foxp3 المخزن المؤقت للنفاذية الذي يحتوي على أجسام مضادة خاصة بعامل النسخ المترافق مباشرة لكل عينة (الجدول 2) لمدة لا تقل عن ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  9. بعد اكتمال التلوين داخل الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول FACS إلى كل بئر. قم بالطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ونفض الغبار عن المادة الطافية. كرر لمدة غسلتين إجمالا. أعد تعليق الخلايا في الحجم النهائي 200 مل لقياس التدفق الخلوي.
  10. بعد إعادة تحفيز PMA / الأيونوميسين / جولجي ، أعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينة ونقل 400 ميكرولتر من كل عينة من السيتوكين إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مل. حبيبات العينات على حرارة 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وإزالة المادة الطافية. أعد تعليق عينات الخلية في 100 ميكرولتر من عازلة FACS وانقلها إلى صفيحة 96 بئرا لتلوين السطح. قم بتكسير العينات مرة أخرى عن طريق الدوران عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ونفض الغبار عن المادة الطافية.
  11. قم بإعداد كوكتيل تلطيخ السطح باستخدام عازلة FACS تحتوي على أجسام مضادة فلورية موجهة ضد المستضدات السطحية (الجدول 2). أعد تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من محلول التلوين لكل عينة واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  12. أضف 150 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر لغسل المخزن المؤقت للتلطيخ. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نفض الغبار عن المادة الطافية. كرر لمدة غسلتين إجمالا.
  13. قم بإصلاح الخلايا في 100 ميكرولتر من 4٪ PFA (جدول المواد) في الظلام عند RT لمدة 25 دقيقة.
  14. أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS إلى كل بئر لغسل المثبت. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نفض الغبار عن المادة الطافية. كرر لمدة غسلتين إجمالا.
  15. قم بإجراء تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا عن طريق إعادة تعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من الجسم المضاد للسيتوكين الذي يحتوي على 0.5٪ من محلول تلطيخ Triton X-100 لكل عينة (الجدول 2) لمدة لا تقل عن ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
  16. بعد اكتمال التلوين داخل الخلايا ، أضف 100 ميكرولتر من محلول FACS إلى كل بئر. قم بالطرد المركزي للوحة عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ونفض الغبار عن المادة الطافية. كرر لمدة غسلتين إجمالا. أعد تعليق الخلايا في الحجم النهائي 200 مل لقياس التدفق الخلوي.
  17. تحليل عامل النسخ والعينات الملطخة بالسيتوكين عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    ملاحظة: سيتم عرض ملفات قياس التدفق الخلوي المتوقعة من لوحات التلوين الموضحة في قسم النتائج التمثيلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

للتحقق من أنه تم الحصول على مجموعة نقية من خلايا CD4 T الساذجة باستخدام بروتوكولنا (القسم 2) ، استخدمنا قياس التدفق الخلوي لتحديد هذه الخلايا قبل وبعد العزل المغناطيسي. باستخدام نهجنا ، حصلنا على مجموعة نقية للغاية من خلايا CD4 + TCRb + CD25-CD44-CD62L + خلايا CD4 T الساذجة بعد العزل (الشكل 3 أ). علاوة على ذلك ، للتأكد من أن مجمعات Cas9-gRNA قد تم تحويلها بنجاح إلى خلايا CD4 T الساذجة (القسم 4) ، أجرينا ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر دمج بروتوكولات توصيل مجمعات CRISPR-Cas9 في خلايا CD4 T الساذجة مع طرق لدراسة تمايز الخلايا التائية CD4 أداة قوية لاستكشاف الجينات الجديدة التي تنظم بيولوجيا الخلايا التائية CD4. هنا ، نقدم دليلا شاملا لاستخدام كواشف Cas9 و gRNA المتوفرة تجاريا والتي يسهل التعامل معها. يوفر التوصيل بوساطة Nucleofection لمجمعات Cas9-gRNA إلى خلايا CD4 T الساذجة تحريرا جينيا عالي الكفاءة ، مما يسهل الضربة القاضية شبه الكاملة للجينات ذات الأهمية. بالإضافة إلى ذلك ، يسمح تحليل قياس التدفق الخلوي لخلايا C...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.

شكر وتقدير

تم دعم هذا البحث من قبل برنامج البحوث الداخلية التابع ل NIAID ، المعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.5 م EDTA ، الرقم الهيدروجيني = 8.0IPM Scientific11005-016
16٪ بارافورمالدهيد ، PFAElectron Microscopy Sciences15710تمييع مع PBS لصنع محلول مثبت PFA بنسبة 4
1x eBioscience Buffer (1x buffer permeabilization)Thermo Fisher Scientific00-5523-00استخدم مخزن النفاذية من المجموعة لعمل محلول 1x
1x PBS ، درجة الحموضة = 7.4الجودة البيولوجي114-058-101
2-mercaptoethanol (1000x)Gibco21985-023
4D Nucleofector Core UnitLonzaAAF-1003B
4D Nucleofector X UnitLonzaAAF-1003X
60 مم طبقفالكون353002
70 & micro ؛ مصفاة شبكية من النايلونم فيشربراند22363548
ACK Lysing BufferGibcoA10492-01
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X KitLonzaV4XP-3032تتضمن هذه المجموعة: محلول الخلية الأولية P3 ، الملحق 1 ، وشرائط النولوكوفيت المكونة من 16 بئرا
مضادة للميكروبيدات FITCMiltenyi Biotec130-048-701اتبع بروتوكول Miltenyi Anti-FITC Microbeads
مضاد للفأر CD28 (37.51)bioXcellBE0015-1انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
المضاد للفأر CD3e (145-2C11)bioXcellBE0001-1انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
المضاد للفأر IFN & gamma ؛ (XMG1.2)bioXcellBE0055انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
المضاد للفأر IL-12p40 (C17.8)bioXcellBE0051انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
المضاد للفأر IL-4 (11B11)bioXcellBE0045انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
BioLite 48-well MultilidishThermo Fisher Scientific130187
زلالات مصل الأبقار ، BSASigma Life ScienceA3059
Cas9 إنزيمIDT1081059Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 (10 مجم / مل) - يحتوي على تسلسل التوطين النووي
IMDM + IL-7 MediaComplete IMDM مع 5 نانوغرام / مل IL-7
IMDM MediaIMDM + GlutMAX ، 10٪ FBS ، 1٪ L-Glutamine ، 1٪ قلم / بكتيريا ، 0.1٪ BME
كامل RPM MediaRPMI-1640 ، 10٪ FBS ، 1٪ L-Glutamine ، 1٪ قلم / بكتيريا ، 0.1٪ BME
CRISPickhttps://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public
crRNAs المطلوبة   ؛IDTمستعملة مصممة مسبقا من موقع IDT: https://www.idtdna.com/site/order/designtool/index/CRISPR_PREDESIGN  
eBioscience FOXP3 / مجموعة عازلة تلطيخ عامل النسخThermo Fisher Scientific00-5523-00تحتوي المجموعة على ثلاثة كواشف: تركيز التثبيت / النفاذية (4x) ، مخفف التثبيت / النفاذية ، ومخزن النفاذية (10x)
FACS Buffer1x PBS ، 1٪ FBS ، 1 ملي مولار EDTA
مصل الأبقار الجنينية (FBS)VWR Seradigm علوم الحياة97068-085قم بتعطيل الحرارة قبل الاستخدام (دافئ إلى 56 درجة ؛ C لمدة 45 دقيقة) FITC
مضاد للفأر CD4 (RM4-5)Biolegend1005101/200 تخفيف (تركيز مخزون 0.5 مجم / مل)
FITC مضاد للفأر CD8 & alpha ؛ (53-6.7)Biolegend1007061/200 (تركيز مخزون 0.5 مجم / مل)
جولجي ستوبBD Biosciences51-2092KZ1/2000 تخفيف
IMDM (1x) + GlutMAX-1 MediaGibco31980-030
ملح الكالسيوم Ionomycin من Streptomyces conglobatus (1 مجم / مل)Sigma Aldrich10634التركيز النهائي الموصى به 500 نانوغرام / مل
L-Glutamine 200 ملي مولار (100x)أعمدة Gibco25030-081
LSMiltenyi Biotec130-042-401
MACS Buffer1x PBS ، 0.5٪ BSA ، 1 ملي مولار EDTA ، مرشح معقم
Mitomycin C (0.5 مجم / مل)Millipore SigmaM4287-2MG & nbsp ؛
فأر Naï طقم عزل الخلايا التائية ل ve CD4Miltenyi Biotec130-104-453اتبع Miltenyi Naï ve بروتوكول عزل الخلايا التائية CD4. تتضمن هذه المجموعة Na ï. ve CD4 + T Cell Biotin كوكتيل الأجسام المضادة ، الميكروبيدات المضادة للبيوتين و CD44 Microbeads
التحكم السلبي crRNAIDT1072544بديل لتصميم التحكم السلبي
Nuclease Free Duplex BufferIDT1072570
PCR شرائط أنبوب الولاياتالمتحدة الأمريكية العلمية1402-2700
البنسلين ستربتومايسينجيبكو15140-023
فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات ، PMA (100 & micro; جم / مل)Sigma AldrichP8139التركيز النهائي الموصى به ل 50 نانوغرام / مل
ProSeries عالية الأداء 15 مل أنابيب الطرد المركزيالقلوية العلميةPS560015 مل أنابيب مخروطية
مؤتلفة بشرية (ح) IL-2Peprotech200-02انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
البشري المؤتلف TGF-b1 (مشتق من HEK293)Peprotech100-21انظر الجدول 1 للمخزون تركيز
الفأر المؤتلف IL-12p70Peprotech210-12انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
الفئران المؤتلف IL-4Peprotech214-14انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
الفئران المؤتلف IL-6Peprotech216-16انظر الجدول 1 لتركيز المخزون
الفئران المؤتلف IL-7Peprotech217-17تحضير عند 100 نانوغرام / مل
RPMI 1640 MediaGibco21870-076
Thermal CyclerApplied Biosystems4375786نحن نستخدم هذا النموذج من الدراجة الحرارية ، ولكن أي معدات مماثلة ستعمل بشكل جيد في هذا البروتوكول
tracrRNA Atto550 المسمى  IDT1075928يسمح بالكشف عن مجمعات Cas9-gRNA بعد nuceloefection باستخدام فلور Atto550 كقراءة. نوصي بهذا الكاشف إذا كان ذلك ممكنا.
Triton-X Buffer1x PBS ، 0.5٪ TritonX-100 ، 0.1٪ BSA
TritonX-100BioRad161-0407
tracrRNA غير المسمى   ؛IDT1072534خيار tracrRNA أكثر فعالية من حيث التكلفة ، ولكنه لا يسمح بتقييم كفاءة التركيب لمجمعات Cas9-gRNA
Veriti Thermal Cycler ، 96 بئر FastThermo Fisher Scientific4375305نحن نستخدم هذا النموذج من التدوير الحراري ، ولكن أي معدات مماثلة ستعمل بشكل جيد في هذا البروتوكول
٪ تخفيف الخاص ب

المراجع

  1. Seki, A., Rutz, S. Optimized RNP transfection for highly efficient CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. J Exp Med. 215 (3), 985-997 (2018).
  2. Nussing, S., et al. Efficient CRISPR/Cas9 gene editing in uncultured naive mouse T cells for in vivo studies. J Immunol. 204 (8), 2308-2315 (2020).
  3. Albanese, M., et al. efficient and activation-neutral gene editing of polyclonal primary human resting CD4+ T cells allows complex functional analyses. Nat Methods. 19 (1), 81-89 (2022).
  4. Oh, S. A., Seki, A., Rutz, S. Ribonucleoprotein transfection for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in primary T cells. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e69(2019).
  5. Huang, B., Johansen, K. H., Schwartzberg, P. L. Efficient CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis in primary murine T lymphocytes. Curr Protoc Immunol. 124 (1), e62(2019).
  6. Huang, B., et al. In vivo CRISPR screens reveal a HIF-1α-mTOR network regulates T follicular helper versus Th1 cells. Nat Commun. 13 (1), 805(2022).
  7. Asmamaw, M., Zawdie, B. Mechanism and applications of CRISPR/Cas-9-mediated genome editing. Biologics. 15, 353-361 (2021).
  8. Li, T., et al. CRISPR/Cas9 therapeutics: progress and prospects. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 36(2023).
  9. Yang, H., et al. Methods favoring homology-directed repair choice in response to CRISPR/Cas9-induced double-strand breaks. Int J Mol Sci. 21 (18), (2020).
  10. Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of effector CD4 T cell populations. Annu Rev Immunol. 28, 445-489 (2010).
  11. Luckheeram, R. V., Zhou, R., Verma, A. D., Xia, B. CD4+ T cells: differentiation and functions. Clin Dev Immunol. 2012, 925135(2012).
  12. Sun, L., Su, Y., Jiao, A., Wang, X., Zhang, B. T cells in health and disease. Signal Transduct Target Ther. 8 (1), 235(2023).
  13. Rumble, J., Segal, B. M. In vitro polarization of T-helper cells. Methods Mol Biol. 1193, 105-113 (2014).
  14. Yang, W., Chen, X., Hu, H. CD4(+) T-cell differentiation in vitro. Methods Mol Biol. 2111, 91-99 (2020).
  15. Wang, W., Ai, X. Primary culture of immature, naive mouse CD4+ T cells. STAR Protoc. 2 (3), 100756(2021).
  16. Hsieh, C. S., et al. Development of TH1 CD4+ T cells through IL-12 produced by Listeria-induced macrophages. Science. 260 (5107), 547-549 (1993).
  17. Szabo, S. J., et al. A novel transcription factor, T-bet, directs Th1 lineage commitment. Cell. 100 (6), 655-669 (2000).
  18. Zhang, D. H., Cohn, L., Ray, P., Bottomly, K., Ray, A. Transcription factor GATA-3 is differentially expressed in murine Th1 and Th2 cells and controls Th2-specific expression of the interleukin-5 gene. J Biol Chem. 272 (34), 21597-21603 (1997).
  19. Zheng, W., Flavell, R. A. The transcription factor GATA-3 is necessary and sufficient for Th2 cytokine gene expression in CD4 T cells. Cell. 89 (4), 587-596 (1997).
  20. Ivanov, I. I., et al. The orphan nuclear receptor RORγt directs the differentiation program of proinflammatory IL-17+ T helper cells. Cell. 126 (6), 1121-1133 (2006).
  21. Wan, Y. Y., Flavell, R. A. Regulatory T-cell functions are subverted and converted owing to attenuated Foxp3 expression. Nature. 445 (7129), 766-770 (2007).
  22. Williams, L. M., Rudensky, A. Y. Maintenance of the Foxp3-dependent developmental program in mature regulatory T cells requires continued expression of Foxp3. Nat Immunol. 8 (3), 277-284 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CRISPR Cas9 Th1 Th2 Th17 Treg
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة