على الرغم من الجهود الكبيرة لعلاج الجروح المزمنة ، إلا أن النجاح كان محدودا. العمليات الخلوية والجزيئية التي تعطل الشفاء الطبيعي وتساهم في بدء الجروح المزمنة وتطورها ليست مفهومة جيدا. نتيجة لذلك ، ثبت أن تطوير علاجات فعالة لهذه الجروح يمثل تحديا. ويرجع ذلك في المقام الأول إلى عدم وجود نماذج حيوانية تحاكي الجروح المزمنة لدى البشر ولأن التجارب على البشر الذين يعانون من الجروح المزمنة محدودة. في السابق ، نشرنا نموذجا للفأر لدراسة الجروح المزمنة التي تشترك في العديد من الخصائص مع الجروح المزمنة السكرية لدى البشر. يتضمن هذا النموذج وجود أغشية حيوية تتكون بشكل طبيعي من البكتيريا الموجودة في الجراثيم الجلدية والبيئة دون الحاجة إلى إدخال بكتيريا خارجية في الجروح. لذلك ، يمكن لهذا النموذج أن يعزز الفهم الأساسي لكيفية تحول الجروح إلى مزمنة. هنا ، نقدم تحديثا للبروتوكول الأصلي لتطوير نموذج الماوس هذا. لقد ركزنا على تقليل معدل وفيات الفئران من ~ 30٪ إلى ~ 5٪. نصف أيضا كيف تم استخدام هذا النموذج لفهم بدء وتطور مزمنة الجرح باستخدام مناهج النسخ من الجيل التالي ، وتوضيح ديناميكيات السكان البكتيرية أثناء العدوى وتطور الأغشية الحيوية ، وإظهار قيمة اختبار فعالية العلاجات ، بما في ذلك الجزيئات الصغيرة. حتى الآن ، هذا هو نموذج الجرح المزمن الوحيد الذي لا يلتئم دون تدخل.
مقالة منهجية
بروتوكول إحداث جروح مزمنة في الفئران السكرية - تحديث للبروتوكول المنشور
في هذه المقالة
الملخص
المقدمة
هذا تحديث لمقالة موجودة. الرجاء النقر هنا لرؤية النسخة الأصلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
مستجدات:
هذا تحديث للبروتوكول المقدم سابقا1
تم الانتهاء من جميع التجارب وفقا والامتثال للوائح الفيدرالية وتمت الموافقة على سياسة وإجراءات جامعة كاليفورنيا من قبل جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد IACUC.
1.
تضاف الملاحظة التالية إلى الخطوة 1.1:
ملاحظة: إذا تم شراء الفئران المصابة بالسكري متماثلة اللواقح مباشرة من الموردين ، فقم بإيواء الفئران في فيفاريوم تقليدي للسماح باستعمار الجلد بفلورا الجلد الطبيعية. يمكن استخدام كل من الذكور والإناث.
أضف القسم التالي بعد الخطوة 1.3:
1.4. إجراء التنميط الجيني
ملاحظة: قم بإجراء التنميط الجيني بعد تربية كما هو موضح سابقا حتى الخطوة 1.31. تم تعديل البروتوكول التالي من إجراء منشورسابقا 2. يمكن تنميط كل من الفئران من الذكور والإناث في وقت مبكر من 14 إلى 21 يوما عند الفطام.
1.4.1. استخراج الحمض النووي الخام
1.4.1.1. اجمع خزعة لكمة الأذن من الفأر وضع عينة الأنسجة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
1.4.1.2. أضف 180 ميكرولتر من 50 ملي مولار هيدروكسيد الصوديوم ، مما يضمن غمر العينة.
1.4.1.3. احتضان العينة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، مع إزالة الضغط وتدوير الأنبوب كل 5 دقائق.
1.4.1.4. قم بتبريد العينة على الجليد لمدة دقيقة واحدة على الأقل.
1.4.1.5. أضف 20 ميكرولتر من 1 M Tris HCl عند درجة الحموضة 8.0 والدوامة.
1.4.1.6. قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
1.4.2. تفاعل البوليميراز المتسلسل
1.4.2.1 قم بتجميع المزيج التمهيدي التالي في أنبوب طرد مركزي دقيق (جدول الاشعال).
ملاحظة: تعمل البادئات على تضخيم المنطقة المحيطة بطفرة نقطة LepR.
1.4.2.2. قم بإعداد 20 ميكرولتر من تفاعلات البوليميراز المتسلسلة في أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل . أضف 10 ميكرولتر من 2x Taq polymerase Master Mix (الذي يحتوي على Taq DNA Polymerase و dNTPs و MgCl2 و KCI) ، و 1 ميكرولتر من مزيج التمهيدي (انظر جدول الاشعال) ، و 4 ميكرولتر من مستخلص الحمض النووي الخام ، و 5 ميكرولتر من H2O.
1.4.2.3. قم بإعداد معلمات التدوير الحراري على النحو التالي: 94 درجة مئوية لمدة دقيقتين ؛ 40 دورة من 97 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، و 52 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ، و 72 درجة مئوية لمدة 45 ثانية ؛ تليها 72 درجة مئوية لمدة دقيقتين و 10 درجات مئوية للاحتفاظ اللانهائي.
1.4.2.4. بعد اكتمال تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أضف 4 ميكرولتر من صبغة تحميل الحمض النووي 6x إلى منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل وافصلها على هلام الاغاروز بنسبة 2٪ (الشكل 1).
ملاحظة: يولد كل تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل 3 منتجات PCR: منتج مشترك 610 نقطة أساس ، ومنتج أليل T متحور 406 نقطة أساس ، وأليل G من النوع البري 264 نقطة أساس. يتكون النمط الجيني من النوع البري من منتجات 610 نقطة أساس و 264 نقطة أساس ، ويتكون النمط الجيني المتغاير الزيجوت من جميع المنتجات الثلاثة ، ويتكون النمط الجيني ديسيبل / ديسيبل من منتجات 610 نقطة أساس و 406 نقطة أساس.
2. Vivarium والتربية
يستعاض عن الخطوة 1.2 بالخطوة التالية والملاحظة:
2.1 إيواء الفئران ديسيبل / ديسيبل في حيم تقليدي (ليس منشأة خالية من الحاجز / مسببات الأمراض) بحيث يمكن للبكتيريا أن تثبت نفسها على جلد الفئران dB / db . لنمذجة البشر الذين يعانون من الجروح المزمنة على وجه التحديد ، لا تتخذ احتياطات خاصة لمنع التعرض لمسببات الأمراض الطبيعية الموجودة في بيئة الفئران ، حيث قد تفقد مسببات الأمراض الأساسية للدراسة مع ظروف نظيفة أكثر صرامة.
ملاحظة: نظرا لأن هذه الفئران كبيرة جدا ومصابة بالسكري ، فمن الأفضل إيواء ما يصل إلى 3 ديسيبل / ديسيبل من الفئران لكل قفص قبل استخدامها في تجارب الجروح المزمنة.
3. متطلبات تطوير الجروح المزمنة
أضف الخطوة التالية بعد الخطوة 3.2
3.3 حافظ على الجرح مغطى بضمادة غشاء شفافة في جميع الأوقات لتجنب جفاف أنسجة الجرح.
5. إعداد الكاشف
تضاف الملاحظة التالية بعد الفقرة 5.2
ملاحظة: استخدم ATZ فقط من الشركة المدرجة في جدول المواد. ATZ من الشركات الأخرى غير متوافق مع هذا النموذج وسيزيد من معدل الوفيات.
6. الجراحة
6.1. العلاج والتخدير
ملاحظة: يتم وصف نظام التخدير المحدث أدناه.
6.1.5. في نظام مفتوح ، قم بإعطاء 5٪ من الأيزوفلوران الذي يتم توصيله مع O2 إلى الفأر بمعدل تدفق (2-3.5 لتر / دقيقة) للحث على التخدير. راقب باستمرار حالة الماوس.
ملاحظة: بمجرد أن يفقد الفأر الوعي أو لا يتحرك ، ضعه على وسادة جراحية بيضاء وقم بتركيب الرأس بمخروط أنف مثبت في المرذاذ للسماح بالإدارة المستمرة للأيزوفلوران أثناء الجراحة.
6.1.6. في نظام مفتوح ، قم بإعطاء 1٪ من الأيزوفلوران بنفس معدل التدفق أثناء الجراحة واضبط تدفق الأيزوفلوران للحفاظ على عمق التخدير.
6.3. الجرح
6.3.5. إيقاف إعطاء 1٪ من الأيزوفلوران للفأر في نهاية الإجراء.
7. علاج ما بعد الجراحة والتعافي
يستعاض عن الخطوة 7.1 في البروتوكول الأصلي بالخطوة التالية ولاحظ:
7.1. بعد وضع ضمادة الفيلم الشفافة بعد الجراحة مباشرة ، باستخدام حقنة الأنسولين ، قم بإيداع MSA موضعيا في الجزء العلوي من الجرح الذي تم إنشاؤه على ظهر الفأر عن طريق اختراق ضمادة الفيلم الشفافة بالإبرة. استخدم 150 مجم / كجم من MSA في محلول PBS المعقم في غضون 10 دقائق بعد الجراحة. تم تحديد هذا التركيز بعد بحث مكثف في الأدبيات ، كما هو موضح سابقا3،4.
ملاحظة: يميل MSA إلى التعجيل إن لم يكن مضطربا باستمرار. تأكد من إذابة MSA تماما في المحلول قبل وضعه على الجرح لتوصيل الجرعة المحسوبة إلى الماوس.
يستعاض عن الخطوة 4.7 في البروتوكول الأصلي بالخطوة التالية:
7.4. إعطاء الجرعة الثانية من Buprenex بعد 6 ساعات من الجراحة. بعد ذلك ، قم بجرعة الفئران بشكل دوري وفقا لقواعد IACUC المحلية لأول 48 ساعة.
ملاحظة: لا ينصح باستخدام تركيبات ممتدة المفعول من المسكنات المطلوب إعطاؤها تحت الجلد في نموذج الفأر هذا. قد يتم تعليق البوبرينورفين المرتبط بالدهون في زيت الدهون الثلاثية للأحماض الدهنية متوسطة السلسلة (MCT). بينما تم اختبار تأثير زيت MCT في الفئران الصغيرة جدا ديسيبل / ديسيبل ، لم يتم اختبار تأثيرات MCT على الفئران الأكبر سنا أو المصابة بالسمنة المفرطة بنسبة ديسيبل / ديسيبل 5،6. بالنظر إلى وزن الفئران ، فإن كميات كبيرة من المسكنات التي يتم حقنها تحت الجلد بالقرب من الجرح قد تؤثر بشكل كبير على العمليات الخلوية والجزيئية لالتئام الجروح وبدء الجروح المزمنة وتطورها. أيضا ، سوف يذوب مسكن الألم هذا في المستويات العالية من الدهون في هذه الفئران ، وبالتالي قد لا يكون فعالا في قتل الألم ويمكن أن يصبح ساما.
8. جمع البيانات والتعامل مع الفئران بعد الجرح واستراتيجيات البقاء على قيد الحياة ونصائح إضافية
8.1 جمع البيانات
أضف الخطوات التالية بعد الخطوة 8.1.3.
8.1.4. تأكد من أن الأنسجة التي تم جمعها للتحليل يجب أن تشمل فقط الأنسجة التي تبعد 2 مم عن هامش الجرح في كل من الجروح الضابطة والمزمنة. يمكن جمع الجروح عن طريق الاستئصال في وقت مبكر من 1-2 ساعة بعد تطبيق MSA.
8.1.5. اجمع السوائل الزائدة المتراكمة من الجرح ، أو إفرازات الجرح ، باستخدام حقنة معقمة عن طريق ثقب ضمادة الفيلم الشفافة. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية للدراسات البكتيرية أو -80 درجة مئوية للدراسات الكيميائية والجزيئية.
8.1.6 لجمع أنسجة الجرح الكاملة ، بما في ذلك الأغشية الحيوية ، بعد 10 أيام ، ضع 4٪ PFA في PBS على الجرح ، موضعيا لمدة 10 دقائق قبل الاستئصال بالملقط والمقص. عند إزالة الأنسجة ، أضف هامشا إضافيا للجرح من 5 إلى 10 مم حتى يتم دعم أنسجة الجرح بأنسجة طبيعية إضافية. استمر في التثبيت في 4٪ PFA في PBS والغسلات اللاحقة والتحضير للتضمين.
ملاحظة: قد تصبح الجروح المزمنة بعد 10 أيام من الجراحة هشة للغاية بحيث لا يمكن جمعها من أجل الأنسجة.
8.5. استراتيجيات البقاء على قيد الحياة
8.5.1. توفير دعم إضافي للترطيب: تحقق مما إذا كانت الفئران تصبح خاملة ولا تأكل أو تشرب بنشاط لأن الجراحة وتوليد المزمنة مرهقة. يتم تطبيق محلول ملحي دافئ (35-38 درجة مئوية) تحت الجلد أو داخل الصفاق بحجم 0.25 مل لكل 10 جم من وزن الجسم خلال أول 48-72 ساعة بعد الجراحة. قد تكون هناك حاجة إلى دعم الترطيب حتى 2-3 مرات في اليوم ، اعتمادا على مدى خمول الفئران. أيضا ، يمكن وضع كريات الطعام والمواد الهلامية المائية في الفراش لسهولة الوصول إليها ، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى تغييرات أكثر تكرارا في القفص.
8.5.2. توفير دعم إضافي للدفء: يزداد البقاء على قيد الحياة بعد الجراحة بشكل كبير إذا تم وضع الفئران في أقفاص على وسادة يتم تسخينها عن طريق تدوير الماء (93 درجةمئوية) مباشرة بعد الجراحة وعندما تكون في الحيمة. ضع القفص 1/2 على وسادة 1/2 للسماح للحيوان بالابتعاد عن الحرارة إذا ارتفعت درجة حرارته وتحرك أعلى الوسادة إذا كان باردا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
الشكل 1: التنميط الجيني لتحديد الزيجوت المتغايرة لإنشاء مربين. يوضح مثال على الجل نتائج 8 عينات فأر غير معروفة. العينة 2 و 5 متغايرة الزيجوت لأنها تحتوي على 3 نطاقات (610 نقطة أساس ، 406 نقطة أساس ، و 264 نقطة أساس). العينات 1 و 3 و 4 و 6 و 7 و 8 هي أنواع برية لأنها تحتوي فقط على نطاقين (610 نقطة أساس و 264 نقطة أساس).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
النتائج باستخدام هذا النموذج للجروح المزمنة:
تم استخدام هذا النموذج لإجراء العديد من الدراسات في محاولة لفهم الآليات الخلوية والجزيئية لبدء الجرح المزمن وتطوره. لقد ثبت أنه عن طريق تثبيط الإنزيمات المضادة للأكسدة ، يمكن إنشاء جروح مزمنة في الفئران ديسيبل / ديسيبل. احتوت الجروح في البداية على مجتمع متعدد الميكروبات تم اختياره بمرور الوقت لبكتيريا معينة مكونة للأغشية الحيوية. تم عكس المزمنة من خلال علاج الفئران باثنين من مضادات الأكسدة...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| لكمة الأذن 1 مم | فيشربراند | 13812201 | قطر ثقب 2 |
| مم 3-أمينو-1،2،4-تريازول (ATZ) TCI | A0432 | ||
| 70٪ إيثانول | |||
| أكو لكمة 7 مم خزعة الجلد | لكمات Acuderm Inc. | P750 | |
| agarose | |||
| ب 6. BKS(D)-Leprdb/J | مختبر جاكسون | 00697 | متماثل الزيجوت ومتغاير الزيجوت المتاحة |
| بوبرينيكس (بوبرينورفين هيدروكلورايد) | هنري شتاين لصحة | 059122 | 0.3 مجم / مل ، صبغة تحميل جل من الفئة 3 |
| ، أرجواني (6X) | قفازات | ||
| غسول مزيل الشعر مع الصبار المهدئ واللانولين | ناير | لإزالة الشعر | |
| وسادة التدفئة | Conair | Moist Dry Heating | |
| Pad Hose Adapters | الأنسولين Adroit MedicalSystems | ||
| BD | 329461 | 0.35 مم (28 جم) × 12.7 مم (1/2 بوصة) | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| مبخر الأيزوفلوران | JA Baulch & شركاه | ||
| Kimwipes | |||
| Maxi-Therm Hyper-Hypothermia | سينسيناتي Sub-Zero | Cat رقم 247 | 22 بوصة × 30 بوصة قابل لإعادة الاستخدام Heavy Duty |
| حمض Mercaptosuccinic (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| الأكسجين | |||
| متوافقا مع نظام التبخير | |||
| هيدروكسيد الصوديوم | |||
| Taq 2X ماستر ميكس | نيو إنجلاند بيولابس | M0270L | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624 واط | ضمادة فيلم شفافة (6 سم × 7 سم) |
| معدنية رفيعة | |||
| ثلاثي حمض الهيدروكلوريك | |||
| أنابيب | |||
| ملاقط | |||
| Wahl ماكينة قص الشعر | Wahl | Lithium Ion Pro |
المراجع
- Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. J Vis Exp. (151), e57656(2019).
- He, J. -F., Tan, T., Zhu, H. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacol Sin. 39 (1), 117-123 (2018).
- Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. J Diabetes Res. 2014 (562625), (2014).
- Kim, J., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nat Protoc Exch. , (2016).
- Martínez-Carrillo, B. E., et al. Changes in metabolic regulation and the microbiota composition after supplementation with different fatty acids in db/db mice. Int J Food Sci. , (2022).
- Zhang, Y., et al. Medium-chain triglyceride activated brown adipose tissue and induced reduction of fat mass in C57BL/6J mice fed high-fat diet. Biomed Environ Sci. 28 (2), 97-104 (2015).
- Basu, P., Kim, J. H., Saeed, S., Martins-Green, M. Using systems biology approaches to identify signalling pathways activated during chronic wound initiation. Wound Repair Regen. 29 (6), 881-898 (2021).
- Basu, P., Martins-Green, M. Signaling pathways associated with chronic wound progression: a systems biology approach. Antioxidants. 11 (8), 1506(2022).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS and skin microbiome are critical for initiation and development of chronic wounds in diabetic mice. Sci Rep. 9 (1), 19318(2019).
- Kim, J. H., et al. High levels of OS create a microenvironment that significantly decreases the diversity of the microbiota in diabetic chronic wounds and promotes biofilm formation. Front Cell Infect Microbiol. 10 (259), (2020).
- Kim, J. H., et al. Pseudomonas aeruginosa activates quorum sensing, antioxidant enzymes and type VI secretion in response to OS to initiate biofilm formation and wound chronicity. Antioxidants. 13 (6), 655(2024).
- Kim, J. H., et al. Skin microbiota and its role in health and disease with an emphasis on wound healing and chronic wound development. , Elsevier eBooks. 297-311 (2022).
- Kim, J. H., et al. Targeting anaerobic respiration in Pseudomonas aeruginosa with chlorate improves healing of chronic wounds. Adv Wound Care. 13 (2), 53-69 (2024).
- Jabbari, P., et al. Chronic wound initiation: single-cell RNAseq of cutaneous wound tissue during initiation of chronic wound development. Antioxidants. 14 (2), 214(2025).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذنالوسوم
