مقالة منهجية

تلطيخ حي / ميت لقياس الخلايا القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة في البكتيريا المسببة للجروح المعالجة بعسل مانوكا

DOI:

10.3791/67398

⸱

أبريل 25, 2025

 ,  , 
1Department of Biology, Eastern Washington University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف البروتوكول المقدم إجراء لتحديد الخلايا القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة (VBNC) في المزارع البكتيرية المعالجة بعسل مانوكا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تشكل مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية وتحملها تهديدا كبيرا للصحة العالمية. تشمل الآليات التي تساهم في مقاومة المضادات الحيوية وتحملها الطفرات الجينية واكتساب جينات المقاومة والانتقال إلى حالات السكون القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة (VBNC) وحالات السكون الأخرى ، على التوالي. على الرغم من تطابقها وراثيا مع نظيراتها غير المتحملة للمضادات الحيوية ، إلا أن خلايا VBNC تتهرب من تأثيرات المضادات الحيوية من خلال البقاء غير نشطة من الناحية الأيضية. تكون المضادات الحيوية فعالة فقط عندما تكون عملياتها المستهدفة ، مثل تكرار الحمض النووي أو نسخه ، نشطة. نظرا لأن الضغوطات البيئية ، وخاصة المضادات الحيوية ، يمكن أن تدفع البكتيريا إلى السكون ، فإن مضادات الميكروبات البديلة ضرورية لتقليل هذه الاستجابة أو منعها. عسل مانوكا المضاد للميكروبات (MH) فعال ضد العديد من البكتيريا ، مع تطور نادر للمقاومة. إن آلياته المضادة للميكروبات متعددة الأوجه تجعله عاملا قيما لعلاج الالتهابات البكتيرية. بحث هذا البحث في تمرد MH لتطوير مقاومة المضادات الحيوية من خلال اختبار الفرضية القائلة بأن MH يحفز خلايا VBNC أقل من المضادات الحيوية التقليدية. للتحقيق في هذا الأمر ، تم تطوير بروتوكول لعلاج البكتيريا المسببة للجروح المكورات العنقودية الذهبية والزائفة الزنجارية مع الحد الأدنى من التركيزات المثبطة ل MH أو المضادات الحيوية التقليدية توبرامايسين أو ميروبينيم ، والتي استخدمت بعد ذلك عدد الألواح القابلة للحياة لتحديد الخلايا القابلة للزراعة النشطة الأيضية والتلوين الحي / الميت لتحديد جميع الخلايا القابلة للحياة. عدد خلايا VBNC يساوي عدد الخلية القابلة للحياة مطروحا منه عدد الخلية القابلة للزراعة. في بعض التجارب ، كان عدد الخلايا القابلة للزراعة أعلى من عدد الخلية القابلة للحياة ، مما يعطي عددا سالبا من خلايا VBNC. وبالتالي ، لم تتم مقارنة أرقام خلايا VBNC بشكل مباشر. بدلا من ذلك ، تمت مقارنة أعداد الخلايا القابلة للزراعة والقابلة للحياة لكل علاج. فقط P. aeruginosa المعالجة ب tobramycin كان لديها خلايا قابلة للزراعة أقل بكثير من الخلايا القابلة للحياة ، مما يشير إلى عدد أكبر من خلايا VBNC. هذا البروتوكول سريع وسهل ويمكن استخدامه لتقييم تحريض MH لخلايا VBNC في البكتيريا المسببة للأمراض الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنجو البكتيريا في حالة السكون القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة (VBNC) من العلاج بالمضادات الحيوية وتسبب أمراضا معدية متكررة ومميتةفي بعض الأحيان 1،2،3. الأكثر شيوعا بالنسبة لنا هي مقاومة المضادات الحيوية ، والتي تحدث عن طريق التغيير الجيني الوراثي4. يوفر التغيير الجيني مقاومة لمضاد حيوي معين من خلال عدة آليات ، بما في ذلك الحد من امتصاص المضاد الحيوي ، أو زيادة تدفق المضاد الحيوي ، أو تعديل هدف المضاد الحيوي ، أو تعطيل المضادالحيوي 4. على النقيض من ذلك ، تظهر البكتيريا في حالات السكون تحملا أكثر اتساعا للمضادات الحيوية وغير وراثية عن طريق تقليل عملية التمثيل الغذائي2،3. تستهدف المضادات الحيوية عمليات التمثيل الغذائي المحددة ، بما في ذلك تكرار الحمض النووي وتخليق جدار الخلية ، وهي غير فعالة ضد خلايا VBNC غير النشطةالأيضية 4. توجد خلايا VBNC بشكل عشوائي بأعداد منخفضة جنبا إلى جنب مع أشقائها المتطابقين وراثيا المعرضين للمضادات الحيوية في معظم مجموعات البكتيريا5. ومع ذلك ، فإن الضغوطات البيئية ، بما في ذلك التعرض للمضادات الحيوية ، تحفز الخلايا البكتيرية الحساسة على دخول حالة VBNC التي تتحمل المضادات الحيوية3،6. سيقتل العلاج بالمضادات الحيوية الخلايا الحساسة للمضادات الحيوية داخل السكان ، بينما تبقى خلايا VBNC الخاملة. كما يوحي اسمها ، فإن خلايا VBNC غير قابلة للزراعة على وسائط مناسبة لنمو أشقائها النشطين في التمثيل الغذائي. ومع ذلك ، فإن أغشيتها ومادتها الوراثية غير تالفة ، ويمكنها التكاثر 7,8. عند إزالة المضادات الحيوية ، يلزم وجود محفزات محددة مثل العناصر الغذائية أو درجة الحرارة أو عوامل المضيف لإيقاظ خلايا VBNC من حالة السكون واستعادة النمو3،9. تم توثيق خلايا VBNC في العديد من الأنواع البكتيرية المسببة للأمراض ، بما في ذلك المتصورة الزنجارية و S. aureus ، وهي عوامل مسببة رئيسية لالتهابات الجروح10،11.

يستخدم العسل منذ فترة طويلة في التطبيقات الطبية ، بما في ذلك علاج الجروح ، بسبب خصائصه المضادةللبكتيريا 12. لوحظ عسل مانوكا (MH) ، المشتق من أزهار شجيرة مانوكا (Leptospermum scoparium) ، لنشاطه القاتل للجراثيم واسع الطيف (تمت مراجعته في13،14،15). يقتل بنجاح غالبية البكتيريا المسببة للعدوى البشرية التي تم اختبارها ، بما في ذلك السلالات البكتيرية مثل المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين والمكورات المعوية المقاومة للفانكومايسين التي تظهر مقاومة وراثية للمضادات الحيوية التقليدية16،17. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المقاومة البكتيرية المستحثة ل MH نادرة ، حيث يتم اكتشافها فقط في الأغشية الحيوية المتصورة الزنجارية المعرضة للعسل والإشريكية القولونية المزروعة بتركيزات متزايدة من مجموعة فرعية من العسل التي تماختبارها 18،19،20،21. يشير هذا إلى أن الآليات المضادة للميكروبات في MH تختلف عن المضادات الحيوية التقليدية وقد تحفز عددا أقل من خلايا VBNC أو لا تؤدي إلى أي منها. تم اختبار هذه الفرضية من خلال تحديد كيفية تأثير MH على مجموعات VBNC مقارنة بالمضادات الحيوية التقليدية.

يجب تمييز خلايا VBNC عن أشقائها النشطين في التمثيل الغذائي والخلايا الميتة. يتم حساب الخلايا القابلة للزراعة باستخدام تقنية عد الألواح القابلة للحياة ، حيث يتم نقل الخلايا إلى وسائط الثقافة الروتينية وتحضينها لفترة كافية لتقسيم الخلايا الكافية لإنتاج مستعمرات يمكن ملاحظتها. تم تطوير عدة طرق للتمييز بين خلايا VBNC والخلايا الميتة بناء على أغشيتها السليمة والنسخ منخفض المستوى. يسمح امتصاص الركيزة والصبغة الفلورية ، جنبا إلى جنب مع الفحص المجهري أو قياس التدفق الخلوي ، بالعد المباشر للخلايا عن طريق الفحص المجهري أو قياس التدفق الخلوي بلون يشير إلى الأغشية السليمة22،23. كما تم استخدام فحوصات التنفس التي تتطلب وجود سلسلة نقل الإلكترون في غشاء خلوي سليم للتمييز بين الخلايا القابلة للحياة والخلاياالميتة 24. كما تم تطوير طرق PCR الكمية (qPCR) جنبا إلى جنب مع الأصباغ المعدلة للحمض النووي التي تمنع التضخيم. سيتم تضخيم الحمض النووي فقط من الخلايا القابلة للحياة حيث تستبعد الأغشية السليمة الصبغة25. على الرغم من أن خلايا VBNC نائمة ، إلا أنها لا تزال تنسخ الجينات على مستوى منخفض ، ويمكن استخدام هذا أيضا لتمييزها عن الخلايا الميتة باستخدام النسخ العكسي PCR26.

في هذا العمل ، تم تطوير اختبار لتحديد خلايا VBNC في اثنين من البكتيريا المسببة للأمراض المسببة للجروح ، المكورات العنقودية الذهبية و P. aeruginosa ، المعالجة ب MH. يصف علاج البكتيريا بالمضادات الحيوية والمضادات الحيوية التقليدية واستخدام عدد الألواح القابلة للحياة والتلوين الحي / الميت للكشف عن الخلايا القابلة للزراعة والقابلة للحياة. سيسمح هذا البروتوكول السهل وغير المكلف بتحليل قدرة MH على تحفيز خلايا VBNC المقاومة للمضادات الحيوية في العديد من مسببات الأمراض البكتيرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وبما أن المتصورة الزنجارية (ATCC9721) والمكورات العنقودية الذهبية (ATCC29213) مصنفتان على أنهما عاملان من المستوى 2 للسلامة البيولوجية، يجب أن يكون الوصول إلى الغرف التي يجري العمل فيها محدودا وأن تكون مجهزة بخزانة للسلامة البيولوجية من أجل التلاعب الذي يمكن أن يتسبب في تناثر البقع أو الهباء الجوي، مثل المزارع المحفزة والطرد المركزي. في جميع خطوات هذا البروتوكول ، ارتد معدات الحماية الشخصية (PPE) ، بما في ذلك معطف المختبر والنظارات الواقية والقفازات. يتم سرد جميع الكواشف والمعدات المستخدمة في التجارب في جدول المواد.

1. تحضير مرق معقم ووسائط ثقافة أجار

  1. تحضير لوريا بيرتاني ومولر هينتون ، كلوريد الصوديوم (0.85٪) ، والمضادات الحيوية ، والأواني الزجاجية.
    1. قم بإعداد وسائط المرق وفقا لتعليمات الشركة المصنعة ، مع إضافة مسحوق أجار إلى 1.5٪ لوسائط الأجار. أضف 0.85 جم من كلوريد الصوديوم إلى 100 مل من الكثافةالكريهية 20 لتحضير 0.85٪ كلوريد الصوديوم. ضع شريط الأوتوكلاف على الأوعية ، وضعها في حاوية آمنة للأوتوكلاف ، وقم بالتعقيم عليها في دورة سائلة مناسبة للأحجام المستخدمة.
    2. عند اكتمال دورة الأوتوكلاف ، قم بتبريد الأجار إلى حوالي 60 درجة مئوية قبل سكبه في أطباق بتري المعقمة.
  2. تحضير 100 ميكروغرام / مل من محاليل مخزون المضادات الحيوية توبرامايسين والميروبينيم في dH2O لتخفيف وعلاج البكتيريا. عقيم مخزون المضادات الحيوية باستخدام حقنة معقمة سعة 5 مل متصلة بفلتر معقم 0.2 ميكرومتر.
    1. قم بتخزين مخزون المضادات الحيوية المعقمة عند -20 درجة مئوية في حصص صغيرة متعددة لمنع فقدان النشاط بسبب دورات التجميد والذوبان المتعددة.

2. استرجاع سلالات المكورات العنقودية الذهبية والسلالات الزائفة الزنجارية المؤرشفة من -80 درجة مئوية (اليوم 1)

  1. اجمع المواد اللازمة لوضع مجموعة صغيرة من السلالات البكتيرية المجمدة من قوارير الفريزر التي تبلغ درجة حرارتها 80 درجة مئوية إلى أجار لوريا بيرتاني (LB). يتضمن ذلك العديد من العصي الخشبية المعقمة ولوحة أجار LB المكتوبة على الكائن الحي والتاريخ.
  2. افتح الفريزر -80 درجة مئوية ، وقم بإزالة القوارير محل الاهتمام بسرعة ، وأغلق باب الفريزر. افتح كل قارورة بالتتابع واستخدم عصا معقمة لكشط كمية صغيرة من البكتيريا المجمدة على لوحة أجار LB المسمى بشكل مناسب. استبدل غطاء القارورة وأعده بسرعة إلى الفريزر -80 درجة مئوية.
  3. احتضان ألواح أجار LB الملقحة ، جانب أجار لأعلى ، عند 37 درجة مئوية في ظل الظروف الهوائية (الجوية) لمدة 18-24 ساعة. بعد فترة الحضانة ، قم بإغلاق ألواح أجار LB الملقحة بشريط تطعيم وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن أسبوع واحد. تلقيح المزارع البكتيرية الطازجة من المخزون المجمد -80 درجة مئوية أسبوعيا حسب الحاجة.

3. تحضير المكورات العنقودية الذهبية و المتصورة الزنجارية للعلاج بعسل مانوكا (MH) والمضاد الحيوي (اليوم 2)

  1. اجمع المواد المطلوبة لبدء ثقافة مرق LB لكل سلالة ، بما في ذلك أنابيب الاختبار الصغيرة المعقمة ، والماصات المصلية سعة 5 مل ، ومرق LB المعقم ، وحلقة التلقيح. أيضا ، اجمع ماصة يدوية أو كهربائية لاستخدامها مع الماصات المصلية ، وموقد بنسن ، وحاضنة الاهتزاز.
  2. من خلال العمل بجوار لهب موقد بنسن، استخدم ماصة مصلية لنقل 2 مل من مرق LB إلى أنبوبي اختبار معقمين. قم بتعقيم حلقة التلقيح في لهب موقد بنسن ثم انقل ربع حلقة مليئة بالبكتيريا من ألواح أجار LB إلى أنبوب الاختبار المسمى بشكل مناسب مع مرق LB.
    1. احتضان أنبوب الاختبار في ظل الظروف الهوائية في حاضنة اهتزاز (~ 250 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 18-24 ساعة.

4. تحضير MH وإعداد MH وعلاجات المضادات الحيوية للمكورات العنقودية الذهبية و P. aeruginosa (T = 0) (اليوم 3)

  1. اجمع المواد اللازمة للتجربة ، بما في ذلك مرق مولر هينتون وألواح أجار ، والمزارع البكتيرية LB broth من اليوم 2 ، وأنابيب الاختبار المعقمة ، ومخزونات المضادات الحيوية على الجليد ، والماصات (P20 ، P200 ، و P1000) والنصائح ، وأنابيب 15 مل ، والماصات المصلية والماصات ، وأنابيب الطرد الدقيق.
    1. قم بإعداد حلول مخزون 25٪ و 50٪ MH طازجة في يوم إعداد التجربة. بناء على كثافة MH (1.47 جم / مل) ، قم بوزن الكمية المناسبة من MH في أنبوب معقم سعة 15 مل وأضف الكمية المناسبة من مرق Mueller Hinton المعقم. أعد تعليق MH عن طريق وضع الأنابيب في ماء دافئ وعكسها حسب الحاجة.
  2. قم بإعداد تخفيف 1: 1000 (حوالي 106 CFU / mL) من المزارع البكتيرية الليلية في أنابيب معقمة سعة 15 مل عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من الثقافة البكتيرية إلى 10 مل من مرق مولر هينتون.
    1. استخدم المزارع المخففة لإعداد ثلاث عينات لكل نوع من أنواع البكتيريا: عنصر تحكم غير معالج ، عينة معالجة ب MH (عند الحد الأدنى من التركيز المثبط ، MIC) ، وعينة معالجة بالمضادات الحيوية (توبرامايسين للمكورات العنقودية الذهبية أو ميروبينيم ل P. aeruginosa ، في MIC).
    2. أضف المزرعة البكتيرية المخففة ، MH ، والمضاد الحيوي المناسب إلى العينات في المجلدات الموضحة في الجدول 1 والجدول 2.
  3. نقل 0.1 مل و 0.5 مل من العينة غير المعالجة إلى أنابيب أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المعقمة لعدد الألواح القابلة للحياة (الخطوة 5) والتلوين الحي / الميت (الخطوة 6) ، على التوالي ، للعينات T = 0.
    1. احتضان عينات المراقبة غير المعالجة ، المعالجة بالMH ، والمعالجة بالمضادات الحيوية (توبرامايسين أو ميروبينيم) في ظروف هوائية عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز (250 دورة في الدقيقة) لمدة 24 ساعة. قم بإجراء عدد الألواح القابلة للتطبيق (الخطوة 5) والتلوين الحي / الميت (الخطوة 6) على عينات T = 0 غير المعالجة.

5. تحديد الخلايا القابلة للزراعة في العينات باستخدام طريقة عد الألواح القابلة للتطبيق (اليوم 3 - 5)

  1. في اليوم 4 ، بعد حضانة العينة لمدة 24 ساعة ، اجمع 0.1 مل و 0.5 مل من كل عينة في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة لعدد الألواح القابلة للحياة والتلوين الحي / الميت (الخطوة 6) ، على التوالي. ستكون هذه هي عينات T = 24 ساعة.
  2. قم بإجراء عد الألواح القابلة للحياة على عينات T = 0 و T = 24 ساعة في يوم جمعها عن طريق تحضير تخفيفات بمقدار 10 أضعاف لعينات عدد الألواح القابلة للحياة في مرق LB للحصول على عدد قابل للعد من الخلايا (~ 25-150).
    1. انشر 50 ميكرولتر من كل عينة مخففة على 1/2 من لوح أجار LB. احتضان ألواح أجار LB في ظل الظروف الهوائية عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. في اليوم التالي ، قم بإزالة ألواح أجار LB من الحاضنة وحدد لوحة التخفيف التي تحتوي على ~ 25-150 مستعمرة. احسب العدد الدقيق للمستعمرات على اللوحة واستخدم صيغة وحدات تشكيل المستعمرة (CFU) (CFU / mL = # المستعمرات التي تم حسابها / (مطلي بالحجم ، مل) (التخفيف المستخدم)) لتحديد عدد الخلايا القابلة للزراعة لكل مل.
    ملاحظة: سيتم طلاء عينة T = 0 في اليوم 3 وتحليلها في اليوم 4 ؛ سيتم طلاء عينات T = 24 ساعة في اليوم 4 وتحليلها في اليوم 5.

6. تحديد الخلايا القابلة للحياة في العينات باستخدام التلطيخ الحي / الميت والفحص المجهري الفلوري (اليوم 3 أو 4)

  1. اجمع المواد المطلوبة للتلطيخ الحي / الميت ، بما في ذلك كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.85٪ للحفاظ على بيئة تناضحية مواتية للخلايا والماصات (P20 و P200 و P1000) ، وأطراف الماصة المعقمة ، ومجموعة تلطيخ حية / ميتة للبكتيريا ، ومقياس كثافة الدم القابل للتصرف احصل على إمكانية الوصول إلى مجهر الفلورسنت باستخدام مرشح إيزوثيوسيانات الفلورسينات (FITC) للكشف عن صبغة SYTO 9 ، التي تلطخ الخلايا الحية.
  2. أضف 0.5 مل من 0.85٪ كلوريد الصوديوم إلى 0.5 مل من كل من العينات الحية / الميتة التالية: جميع عينات T = 0 غير المخففة ، T غير المخفف = 24 ساعة MH ، والعينات المعالجة بالمضادات الحيوية ، وتخفيف 1: 1000 من عينة التحكم T = 24 ساعة غير المعالجة.
    1. تأكد من مضاعفة عدد الخلايا الحية النهائية لجميع العينات في اثنين وضرب T المخفف = 24 ساعة من التحكم غير المعالج في 1000. امزج 1.5 ميكرولتر من SYTO 9 و 1.5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم لكل عينة ، ثم أضف 3 ميكرولتر من الخليط إلى كل عينة. احتضان العينات عند 21 درجة مئوية في الظلام لمدة 15 دقيقة.
  3. انقل 6 ميكرولتر من كل عينة ملطخة ومختلطة بلطف إلى مقياس كثافة الدم القابل للتصرف وعرضها باستخدام مجهر فلوري مع مرشح FITC وعدسة موضوعية 40x. التقط صورة توضح كلا من خطوط شبكة مقياس كثافة الدم والخلايا الخضراء الحية.
    1. احسب الخلايا الخضراء في ستة حقول لكل عينة، مع ملاحظة أبعاد الشبكة بحيث يمكن حساب عدد الخلايا الخضراء لكل حجم.
      ملاحظة: أبعاد المجال في التجارب الحالية هي 1.05 مم × 0.6 مم × 0.1 مم ، وهو ما يعادل 0.063 مم3 أو 6.3 × 10-5 مل. للحصول على عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مل ، قسم عدد الخلايا الحية المحسوبة على 6.3 × 10-5 مل ، ثم اضربها في اثنين (أو 2000 إذا كان T = 24 ساعة تحكم غير معالج).

7. تحديد عدد الخلايا القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة (VBNCs)

ملاحظة: استخدم أرقام الخلايا القابلة للزراعة التي تم الحصول عليها من عدد الألواح القابلة للحياة ورقم الخلية القابلة للحياة الذي تم الحصول عليه من التلوين الحي / الميت لتحديد عدد VBNCs.

  1. احسب VBNCs / مل عن طريق طرح عدد الخلايا القابلة للزراعة / مل من عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مل.
  2. استخدم اختبار أزواج Wilcoxon المتطابقة لمقارنة VBNCs / مل أو الخلايا القابلة للزراعة / مل بالخلايا القابلة للحياة / مل لكل علاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تحدث أشكال الحياة البكتيرية القابلة للحياة ولكن غير القابلة للزراعة (VBNC) بسبب الضغوطات ، بما في ذلك العلاج بالمضادات الحيوية ، وتسبب التهابات متكررة بسبب تحملها للمضادات الحيوية. نظرا لأن MH هو مضاد للميكروبات واسع الطيف نادرا ما تم اكتشاف مقاومة له ، فقد تم الافتراض بأن MH تسبب في عدد أقل من VBNCs من المضادات الحيوية التقليدية. تم استخدام الطريقة الموضحة هنا لتحديد VBNCs التي تشكلت من بكتيريا مسببة للجروح ، S. aureus و P. aeruginosa. عدد VBNCs يساوي عدد الخلايا القابلة للحياة التي يحددها التلوين الحي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يسمح البروتوكول الموصوف هنا بالكشف عن مجموعات خلايا VBNC في البكتيريا المسببة للجروح المعالجة بأقل تركيزات مثبطة (MICs) من MH والمضادات الحيوية التقليدية. تضمنت الخطوات الحاسمة في البروتوكول إعداد تخفيفات MH في يوم التجربة ، ومنع فقدان العينة أثناء التلوين الحي / الميت ، وحساب الحجم الذي تم تحليله بشكل صحيح. بالنسبة لهذه الدراسة وغيرها من الدراسات ، تم تحديد MH MICs ل S. aureus و P. aeruginosa تجريبيا27. استعدادا لاختبار النسب المئوية للميراث الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإفصاح عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمويل هذا العمل من خلال منحتين من جامعة شرق واشنطن ، ومنحة أبحاث أعضاء هيئة التدريس والأعمال الإبداعية إلى A.R.C ومنحة البحث الجامعي والأنشطة الإبداعية ل L.T.B. تبرع بيل وكوني كروس بأموال ل EWU لشراء مجهر الفلورسنت المقلوب Leica DMIL بكاميرا رقمية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرق مولر هينتونفيشر الكواشف الحيويةB12322
مرق لوريا بيرتاني (LB)  فيشر الكواشف الحيويةBP142602
BD Difco AgarFisher ScientificDF0812-07-1
كلوريد الصوديومSigma   ؛S3014-500g
meropenemTargetMolT0224
tobramycinSelleck ChemicalsS2514
المكورات العنقودية الذهبية   ؛ATCCATCC29213
  Pseudomonas aeruginosaATCCATCC9721
حاضنة اهتزازEppendorfM13520000
حاضنةالمعيار ScientificH2200-H 
مانوكاجارد مانوكا عسلأمازونNA
DMIL مجهر الفلورسنت المقلوب  Leica Microsystems11521265
الكاميرا الرقميةLeica Microsystems12730522
15 مل أنابيب الصقرGenesee Scientific28-103
الماصات المصليةتشخيصDP-LB0100005 ، DP-LB010010
Pipet Aid PipettorDrummond Scientific Company4-000-101
Bunsen burnerFisher ScientificS48108
ماصات RaininPipette.comL-20 ، L-200 ، L-1000
التوازنMettler ToledoXS603S
96-well لوحةFalcon351172
حلقة التلقيحفيشر Scientific13-104-5
الأيزوبروبانولفيشر ScientificBP2618-1
الزجاج موزعمحلي الصنعNA
طقم تلطيخ ميت للبكتيرياInvitrogenL7012
أنابيب الطرد الدقيقBiologix Research CompanySKU 80-1500 / P80-1500
رقائق القصديرCostcoNA
تمGraphPadNAGraphPad Prism لعمل الأشكال وإجراء التحليلات الإحصائية.
استخدام برنامج صنع الشكل

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Spoering, A., Lewis, K. Biofilms and planktonic cells of Pseudomonas aeruginosa have similar resistance to killing by antimicrobials. J Bacteriol. 183 (23), 6746-6751 (2001).
  2. Mulcahy, L. R., Burns, J. L., Lory, S., Lewis, K. Emergence of Pseudomonas aeruginosa strains producing high levels of persister cells in patients with cystic fibrosis. J Bacteriol. 192 (23), 6191-6199 (2010).
  3. Li, L., Mendis, N., Trigui, H., Oliver, J. D., Faucher, S. P. The importance of the viable but non-culturable state in human bacterial pathogens. F Microbiol. 5, 00258(2014).
  4. Reygaert, W. C. An overview of the antimicrobial resistance mechanisms of bacteria. AIMS Microbiol. 4 (3), 482-450 (2018).
  5. Ayrapetyan, M., Williams, T. C., Baxter, R., Oliver, J. D. Viable but nonculturable and persister cells coexist stochastically and are induced by human serum. Infect Immun. 83 (11), 4194-4203 (2015).
  6. Cabral, D. J., Wurster, J. I., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. PHARH2. 11 (1), 11010014(2018).
  7. Heidelberg, J. F., et al. Effect of aerosolization on culturability and viability of gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3585-3588 (1997).
  8. Cook, K. L., Bolster, C. H. Survival of Campylobacter jejuni and Escherichia coli in groundwater during prolonged starvation at low temperatures. J Appl Microbiol. 103 (3), 573-583 (2007).
  9. Xu, H. S., et al. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in the estuarine and marine environment. Microbl Ecol. 8 (4), 313-323 (1982).
  10. Qi, Z., Huang, Z., Liu, C. Metabolism differences of biofilm and planktonic Pseudomonas aeruginosa in viable but nonculturable state induced by chlorine stress. Sci Total Environ. 821, 153374(2022).
  11. Li, Y., et al. Study on the Viable but Non-culturable (VBNC) state formation of staphylococcus aureus and its control in food system. F Microbiol. 11, 599739(2020).
  12. Oryan, A., Alemzadeh, E., Moshiri, A. Biological properties and therapeutic activities of honey in wound healing: A narrative review and meta-analysis. J Tissue Viability. 25 (2), 98-118 (2016).
  13. Lusby, P. E., Coombes, A. L., Wilkinson, J. M. Bactericidal Activity of different honeys against pathogenic bacteria. Arch Med Res. 36 (5), 464-467 (2005).
  14. Mandal, M. D., Mandal, S. Honey: Its medicinal property and antibacterial activity. Asian Pac J Trop. Biomed. 1 (2), 154-160 (2011).
  15. Carter, D. A., et al. Therapeutic Manuka Honey: No longer so alternative. F Microbiol. 7, 00569(2016).
  16. Cooper, R. A., Molan, P. C., Harding, K. G. The sensitivity to honey of Gram-positive cocci of clinical significance isolated from wounds. J Appl Microbiol. 93 (5), 857-863 (2002).
  17. George Narelle May, C., Keith, F. Antibacterial Honey: In-vitro activity against clinical isolates of MRSA, VRE, and other multiresistant Gram-negative organisms. HMP Global Learning Network. , https://www.hmpgloballearningnetwork.com/site/wounds/article/7751 (2007).
  18. Blair, S. E., Cokcetin, N. N., Harry, E. J., Carter, D. A. The unusual antibacterial activity of medical-grade Leptospermum honey: Antibacterial spectrum, resistance and transcriptome analysis. Eur Soc Clin Microbiol. 28 (10), 1199-1208 (2009).
  19. Cooper, R. A., Jenkins, L., Henriques, A. F. M., Duggan, R. S., Burton, N. F. Absence of bacterial resistance to medical-grade manuka honey. Eur Soc Clin Microbiol. 29 (10), 1237-1241 (2010).
  20. Lu, J., et al. Honey can inhibit and eliminate biofilms produced by Pseudomonas aeruginosa. Sci Rep. 9 (1), 18160(2019).
  21. Bischofberger, A. M., Pfrunder Cardozo, K. R., Baumgartner, M., Hall, A. R. Evolution of honey resistance in experimental populations of bacteria depends on the type of honey and has no major side effects for antibiotic susceptibility. Evol Appl. 14 (5), 1314-1327 (2021).
  22. Cunningham, E., O'Byrne, C., Oliver, J. D. Effect of weak acids on Listeria monocytogenes survival: Evidence for a viable but nonculturable state in response to low pH. Food Control. 20 (12), 1141-1144 (2009).
  23. Kogure, K., Simidu, U., Taga, N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria. Can J Microbiol. 25 (3), 415-420 (1979).
  24. Albertini, M. C., et al. Use of multiparameter analysis for Vibrio alginolyticus viable but nonculturable state determination. Cytom J Int Soc Anal Cytol. 69 (4), 260-265 (2006).
  25. Nocker, A., Camper, A. K. Novel approaches toward preferential detection of viable cells using nucleic acid amplification techniques. FEMS Microbiol Lett. 291 (2), 137-142 (2009).
  26. Trevors, J. T. Viable but non-culturable (VBNC) bacteria: Gene expression in planktonic and biofilm cells. J Microbiol Methods. 86 (2), 266-273 (2011).
  27. Ankley, L. M., Monteiro, M. P., Camp, K. M., O'Quinn, R., Castillo, A. R. Manuka honey chelates iron and impacts iron regulation in key bacterial pathogens. J App Microbiol. 128 (4), 1015-1024 (2020).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

plates

مقالات ذات صلة