مقالة منهجية

التصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الأبهرية في تصلب الشرايين

1.7K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67400

⸱

أكتوبر 25, 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 2Institute for Cardiovascular Prevention (IPEK), Ludwig-Maximilians-University, 3Institute of Precision Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich Heart Alliance

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولات محسنة لإزالة الأنسجة لتصوير الشريان الأورطي الفأري في ثلاثة أبعاد (3D). نحدد أحدث الإجراءات للتلوين المناعي والتطهير البصري والتصوير بقصد تحديد القرب التشريحي للجهاز العصبي المحيطي مع لويحات تصلب الشرايين والعرض التراكمي في تصلب الشرايين.

الملخص

عززت الأبحاث الحديثة فهم تصلب الشرايين باعتباره مرضا التهابيا مزمنا ينطوي على جميع الطبقات الثلاث لجدار الشرايين ، بما في ذلك لوحة البطانة ، والوسائط ، والهجوم ، الذي يشكل طبقة النسيج الضام الخارجي للشرايين. اقترحت دراساتنا الحديثة أن الجهاز العصبي المحيطي يستخدم adventitia كقناة للوصول إلى جميع خلايا الأنسجة. وجدنا أيضا أن الجهاز العصبي المحيطي ، أي الجهاز العصبي الحسي والودي ، يخضع لعمليات إعادة تشكيل رئيسية تنطوي على تكوين جديد للشبكات المحورية المجاورة لويحات تصلب الشرايين. في هذا السياق ، فإن فهم بنية الشبكة العصبية وتفاعلاتها مع مكونات الأوعية الدموية للشرايين المريضة يحمل وعودا كبيرة لفهم أفضل للتسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. لتحقيق هذه الأهداف ، هناك حاجة إلى طرق لتصور البنية الخلوية تحت الخلوية للشرايين السليمة والمريضة جنبا إلى جنب مع المقصورات المحيطة بالأوعية الدموية. يسمح تطهير الأنسجة بتصوير الأنسجة العميقة السليمة لأجزاء الأنسجة الكبيرة التي يتعذر الوصول إليها. يسمح بالتصوير الحجمي للشرايين السليمة من خلال دمج أدوات وضع العلامات والمسح والتصوير المجهري المتقدم ومعالجة الصور. هنا ، نصف طريقتين متميزتين ولكنهما تكميلين لإزالة الأنسجة السلبية ، وهما تطهير 2 ، 2-ثيوديثانول (TDE) القائم على الماء والتصوير ثلاثي الأبعاد القائم على الملصقات المناعية القائمة على المذيبات لإزالة الأعضاء المطهرة بالمذيبات (iDISCO) لتصوير أجزاء الأبهر المعزولة أو الشريان الأورطي الكامل في الموقع في الفأر بأكمله.

المقدمة

توفر التقنيات النسيجية فهما أساسيا للعينات البيولوجية من خلال تقسيم الأنسجة / الأعضاء. ومع ذلك ، فإن تحديد تفاعلات الخلايا / الخلية التشريحية المعقدة والأنسجة / الأنسجة في ثلاثة أبعاد (3D) كان - حتى وقت قريب - من الصعب تحقيقه. كانت هذه الحاجة غير الملباة واضحة بشكل خاص في سياق نظام القلب والأوعية الدموية في الظروف الصحية والمريضة. كان تصوير الأنسجة السليمة أمرا صعبا في الماضي بسبب امتصاص الضوء وتشتت الضوء ، مما يجعلها معتمة في جوهرها. يجعل إزالة الأنسجة العينة البيولوجية السليمة شفافة عن طريق تقليل هذه القيود. تتيح التطورات الحديثة في تقنيات تطهير الأنسجة التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للأنسجة الشفافة غير المقسمة لتوفير نظرة ثاقبة كبيرة على البنية الدقيقة الخلوية والهيكلية للأعضاء بأكملها بدقة ميكرومتر ، وبالتالي تمكين تعريف شبكات الاتصال التشريحية.

يتضمن تصلب الشرايين ثلاث طبقات من جدار الشرايين ، بما في ذلك طبقة البطى الداخلية ، وطبقة الوسائط الوسطى ، وطبقة النسيج الضام الخارجية ، والتي تسمى Adventitia. كانت لويحات تصلب الشرايين في الطبقة الداخلية للشرايين هدفا تقليديا للبحث لعقود1،2. ومع ذلك ، تحتوي طبقة adventitia على أوعية دموية وأوعية ليمفاوية وألياف عصبية للجهاز العصبي المحيطي. علاوة على ذلك ، ترتبط الأدفنتيتشيا بالأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية ومكونات الأنسجة العصبية ، بما في ذلك الأعصاب الطرفية والعقد المحيطة بالأوعيةالدموية 3،4. من المعروف أن الأعصاب الطرفية تستخدم adventitia كقنوات للوصول إلى الأنسجة المستهدفة البعيدة ، وفي الواقع ، الخلايا5. عززت دراساتنا الحديثة التقدم في فهم التفاعلات متعددة الطبقات للأنظمة البيولوجية الرئيسية ، والتي تشمل الجهاز المناعي والجهاز العصبي والجهاز القلبي الوعائي. لقد أطلقنا على هذه التفاعلات الواجهات العصبية المناعية والقلب والأوعية الدموية6،7. أثناء تصلب الشرايين ، تخضع مكونات جدار الشرايين لإعادة هيكلة وإعادة تشكيل قوية. على سبيل المثال ، بجوار تطور لويحات تصلب الشرايين في البطانة ، تتشكل مجاميع الخلايا المناعية ، ويحدث تكوين المحور العصبي العصبي في المجيء الأبهريالفأري 6،8،9. مع تقدم تصلب الشرايين ، تتطور مجاميع الخلايا المناعية إلى أعضاء ليمفاوية شريانية ثلاثية جيدة التنظيم (ATLOs) مع خلايا تائية مميزة وخلايا بائية وخلايا بلازما10. ومع ذلك ، لتحديد هذه التغييرات في 3D ، كان التصوير عالي الدقة للأنسجة السليمة يمثل تحديا بسبب عدم كفاية نفاذية الغشاء وتشتت الضوء المتأصل11. تغلبت مناهج تطهير الأنسجة على القيود الرئيسية لنهج الأنسجةالتقليدية 11،12،13،14،15 مع تغلغل معزز للأجسام المضادة للوصول إلى عمق الأنسجة أو الأعضاء السليمة عن طريق ضبط معامل الانكسار (RI) بشكل موحد ، مما يؤدي إلى صور بدقة مقياس ميكرومتر مع عمق تصوير أعلى في فوكسل. يمكن مطابقة RIs للعينات إما مع الجلسرين (RI 1.46) أو زيت الغمر (RI 1.52) ، مما يقلل بشكل كبير من تشتت الضوء والانحرافات الكروية ، مما يتيح دقة عالية. سمحت التطورات الحديثة في تقنيات تطهير أنسجة الجسم بالكامل أو العضو بأكمله ، مثل 2،2-ثيوديثانول (TDE) المائي والتصوير ثلاثي الأبعاد للأعضاء المنظوفة بالمذيبات (iDISCO) ، على التوالي ، جنبا إلى جنب مع تقنيات التصوير الحجمي (بما في ذلك التصوير المجهري الكونفوكي والمتعدد الفوتون والصفائح الضوئية) بإعادة بناء التشريح المجهري لبنية الأوعية الدموية من خلال بناء أطلس الاتصال11،16. يمكن أن يوفر تصور هذه الروابط الخلوية والهيكلية في 3D رؤى جديدة للإجابة على الأسئلة البيولوجية التي لم تتم الإجابة عليها حتى الآن.

البروتوكول

أجريت هذه الدراسة وفقا لإرشادات اللجنة المحلية والوطنية لاستخدام ورعايتها. تم استخدام الفئران الذكور فرط الشحوم على خلفية C57BL / 6J التي تم الحفاظ عليها على نظام غذائي قياسي للقوارض تتطور تلقائيا إلى تصلب الشرايين أثناء الشيخوخة في هذه الدراسة.

1. التصوير الكامل للشريان الأورطي المعزول وإزالة TDE

  1. تحضير الأنسجة
    1. تحضير المخدر بجرعة 150 ملغم/كغ من الكيتامين و30 ملغم/كغ من الزيلازين (انظر جدول المواد) لكل فأر. تخدير الفئران بعمق عن طريق الحقن داخل الصفاق وتأكيد ذلك من خلال عدم وجود رد فعل على اختبار الألم العميق.
      ملاحظة: تركيز وحجم الحقن على النحو التالي: الكيتامين 100 مجم / مل. زيلازين 20 مجم / مل ؛ حجم الحقن 50:50 خليط من الكيتامين والزيلازين بمعدل 3 ميكرولتر / جم.
    2. ضع الماوس على صفيحة رغوية مغطاة بمناشف ورقية جراحية ، وقم بتثبيت الذراعين والساقين في وضع ضعيف باستخدام الأشرطة. تطهير الصدر بالإيثانول بنسبة 75٪ (انظر جدول المواد) وأخذ الدم عبر البطين الأيسر باستخدام حقنة 1 مل يمكن التخلص منها لإزالة الدم لتحسين التروية.
      ملاحظة: يمكن أيضا استخدام جمع الدم القلبي عن طريق بضع الصدر.
    3. قم بعمل شق خط الوسط على الصدر لكشف القلب وشق صغير في الأذين الأيمن للسماح بالتروية عبر القلب. قم بنشر الفأر عبر البطين الأيسر ب 10 مل من 5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA ؛ انظر جدول المواد) في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) لمدة 5 دقائق ، متبوعا ب 20 مل من PBS لمدة 5-10 دقائق حتى يتم طرد الدم. أخيرا ، قم بتناول 10 مل من 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ جميع الإجراءات باستخدام مضخة التروية التمعجية بضغط 100-125 مم زئبق في درجة حرارة الغرفة (RT). يتم إدخال إبرة التروية في قلب الفأر من خلال نفس الثقب مثل استخراج الدم.
    4. إزالة الأعضاء الداخلية ، بما في ذلك الطحال والكبد والرئة والجهاز الهضمي والتناسلي باستخدام الأدوات الجراحية. حافظ على القلب والشريان الأورطي والكلى سليمة في الموقع.
      ملاحظة: الأدوات الجراحية المستخدمة في تشريح الأعضاء وإزالتها هي مقص التشريح ، ومقص القزحية الناعم ، والمقص الزنبركي ، والملقط الحاد ، والملقط المنحني ، والملقط الدقيق المنحني.
    5. كشف الشريان الأورطي بالكامل من الشريان الأورطي الصاعد إلى التشعب الحرقفي تحت المجهر المجهري التشريح (تكبير 30-40x). قم بإزالة الغدة الصعترية والأنسجة الدهنية بعناية دون إصابة الشريان الأورطي.
      ملاحظة: احرص على عدم قطع الشريان الأورطي. بالنسبة للفئران Apoe-/- ، احتفظ بالحد الأدنى من الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية الدموية في الشريان الأورطي للهيكل المتصل.
    6. احصد الشريان الأورطي بأكمله في طبق بتري مليء ب PBS. افصل الشريان الأورطي إلى أجزاء مختلفة وقسم الشريان الأورطي بالكامل طوليا باستخدام قزحية أو مقص زنبركي لفضح السطح الحميمي باتباع التسلسل والاتجاه الموضح في الشكل 1 أ لإزالة TDE.
    7. قم بتثبيت الشريان الأورطي على صفيحة الشمع الأسود المسطحة على شكل حرف Y ، كما هو موضح في الشكل 1 أ. قم بتثبيته في 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قم بتثبيت الشريان الأورطي على لوح الشمع قبل التثبيت لتجنب الطي والتجعيد في الخطوات التالية.
    8. قم بفك تثبيت الشريان الأورطي ونقله إلى PBS. اغسل الشريان الأورطي جيدا لمدة 5 دقائق لمدة 5 مرات.
      ملاحظة: انقل الشريان الأورطي إلى أنابيب مختلفة مملوءة ب PBS في كل مرة للغسيل.
  2. تلطيخ الأجسام المضادة للشريان الأورطي في الوجه
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الحضانة في أنابيب قفل آمن سعة 2 مل مع دوران أو اهتزاز لطيف عند RT.
    1. انقل الشريان الأورطي الثابت إلى محلول مانع لمدة 2 ساعة للحجب والنفاذية.
      ملاحظة: يختلف محلول الحجب بناء على الأجسام المضادة الأولية والثانوية. على سبيل المثال ، محلول الحبس: 0.5 مجم / مل CD16 / 32 (1: 100) ، مصل حمار عادي 10٪ ، 2٪ Triton X-100 في PBS (انظر جدول المواد)
    2. احتضان الشريان الأورطي بالأجسام المضادة الأولية في محلول الحجب أعلاه (الخطوة 1.2.1) ، على سبيل المثال ، CD3e (تخفيف 1: 100) ، NF200 (تخفيف 1: 200) ، و B220 (تخفيف 1: 200) لمدة 24 ساعة (انظر جدول المواد). اغسل الشريان الأورطي في PBS لمدة 5 دقائق لمدة 5 مرات.
    3. احتضان الشريان الأورطي بالأجسام المضادة الثانوية في مصل الحمار العادي بنسبة 10٪ (تخفيف 1: 300) و 4'،6-diamidino-2-phenylindole (DAPI ؛ 1 مجم / مل) للتلوين النووي بين عشية وضحاها (انظر جدول المواد). اغسل الشريان الأورطي في PBS لمدة 5 دقائق 5 مرات وقم بتخزين الشريان الأورطي في PBS عند 4 درجات مئوية حتى إجراء إزالة الأنسجة.
      ملاحظة: انقل الشريان الأورطي إلى أنابيب مختلفة مملوءة ب PBS في كل مرة للغسيل. قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لإبقائها في الظلام للخطوة 1.2.3.
  3. إزالة أنسجة TDE
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الحضانة في أنابيب قفل آمن سعة 2 مل ، تدور برفق عند RT ، ومغطاة بورق الألمنيوم في الظلام. حلول العمل TDE (انظر جدول المواد) شديدة الاختراق ويجب التعامل معها بعناية في غطاء الدخان. جمع النفايات والتخلص منها وفقا للوائح المحلية.
    1. انقل الشريان الأورطي الملون إلى محاليل عمل TDE بنسبة 20٪ واحتضانه لمدة 1 ساعة.
    2. انقل الشريان الأورطي إلى حلول عمل TDE بنسبة 47٪ واحتضانها لمدة 12 ساعة. انقل الشريان الأورطي إلى 60٪ من حلول عمل TDE واحتضانها لمدة 24-36 ساعة حتى تصبح العينات شفافة في الضوء المرئي لتتناسب مع RI.
    3. قم بتخزين الشريان الأورطي في 60٪ TDE في RT في الظلام حتى التصوير.
      ملاحظة: قم بتحديث حلول العمل كل 30 دقيقة على المدى القصير من الحضانة (على سبيل المثال ، الخطوة 1.3.1) وكل 4 ساعات للحضانة على المدى الطويل (على سبيل المثال ، الخطوة 1.3.2). يمكن تعديل وقت الحضانة لكل خطوة اعتمادا على حجم الأنسجة للحصول على اختراق أفضل للأجسام المضادة أو شفافية الشفافية. بالنسبة للشريان الأورطي الفأر المحاط بأنسجة دهنية ، يجب تمديد وقت الحضانة بشكل مناسب.
  4. تصوير الشريان الأورطي المزهر TDE باستخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر (CLSM)
    1. استخدم آبار فاصل التصوير المستطيلة اللاصقة على الوجهين المتوفرة تجاريا بسمك 0.2 مم (انظر جدول المواد). ألصق البئر بشريحة زجاجية نظيفة وانقل الشريان الأورطي الذي تم تطهيره. تأكد من أن adventitia الأبهري في الوجه يواجه الغطاء.
      ملاحظة: اضغط برفق على الشريان الأورطي المقطع مع الجانب العظمي من الشريان الأورطي في الأعلى باستخدام ملقط بزاوية. قم بتكديس آبار فاصل التصوير المتعددة لتتناسب مع حجم الأنسجة إذا لزم الأمر.
    2. قم بتركيب الشريان الأورطي بقطرات من محلول TDE بنسبة 60٪. قم بتوصيل غطاء بعناية بالبئر ، وتجنب فقاعات الهواء بين العينة والغطاء.
      ملاحظة: قم بإزالة الفقاعات بعناية بإبرة قبل الغطاء. لا تستخدم كمية زائدة من محلول التركيب ، حيث قد تطفو العينة.
    3. استخدم أداة CLSM مقلوبة (انظر جدول المواد) مزودة بأهداف غمر 20x (متعددة) (NA: 0.75).
      ملاحظة: يسمح CLSM بالتصوير الحجمي حتى عمق 70 ميكرومتر بدقة أعلى ، وهو أمر ضروري لتحليل قطر العصب وتفاعل الخلايا العصبية المناعية في الهجوم الأبهري.
    4. حدد هدف الغمر 20x/0.75 (الزيت). قم بضبط أجهزة الكشف عن الصمام الثنائي الهجين بناء على الأصباغ الملطخة. اضبط إعدادات العرض وحدد تنسيق XY 1024 × 1024 بكسل للتصوير.
      ملاحظة: تلتقط العدسة الموضوعية الغاطسة بالزيت إشارات أفضل من الماء.
    5. قم بإسقاط زيت الغمر (مع الجلسرين) بالتساوي على طول الشريان الأورطي على الغطاء. حرك الهدف 63x بشكل خشن نحو العينة حتى تلامس زيت الغمر / الغطاء.
    6. حرك هدف 63x بدقة تحت المجهر لتحديد منطقة الاهتمام. احصل على Z-stack من الجانب العرضي من الشريان الأورطي en الوجه عند حجم خطوة 2-4 ميكرومتر حتى عمق 60 ميكرومتر للتصوير ثلاثي الأبعاد.
    7. قم بتسمية الملف بتفاصيل العينة ومسح التفاصيل ضوئيا وحفظ البيانات.
  5. تصوير الشريان الأورطي المزيل TDE باستخدام مجهر متعدد الفوتون
    1. اتبع الخطوات 1.4.1-1.4.2 لتركيب الشريان الأورطي على الشريحة.
    2. استخدم مجهرا متعدد الفوتون عموديا (انظر جدول المواد) مزودا بهدف 20x (الغمر في الماء ، NA: 1.00 ، مسافة العمل = 2 مم) ، مما يسمح بالتصوير الحجمي بعمق يصل إلى 1.5 مم.
    3. احصل على مداخن Z من الجانب العظمي بحجم خطوة 10-15 ميكرومتر حتى عمق 700 ميكرومتر. قم بتسمية الملف وحفظ البيانات كما في الخطوة 1.4.7.

2. تلطيخ مناعي لكامل الجسم وإزالة أنسجة iDISCO

  1. تحضير الأنسجة
    1. اتبع الخطوات 1.1.1-1.1.3 أعلاه للتخدير وتثبيت الفأر والتروية.
    2. إزالة الجلد والأعضاء الداخلية ، بما في ذلك الطحال والكبد والرئة والجهاز الهضمي والتناسلي باستخدام الأدوات الجراحية. حافظ على القلب والشريان الأورطي والكلى سليمة في الموقع.
    3. قم بتشريح جزء الجسم فوق مستوى الحجاب الحاجز وقم بإصلاح الجزء السفلي من الجسم بنسبة 4٪ PFA لمدة 1-2 أيام (أيام) عند 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: قم بإجراء التثبيت والغسيل والحضانات في أنابيب سعة 50 مل على شاكر دوار برفق. قم بتحديث المحلول في أنابيب جديدة لمدة 2-3 مرات.
    4. اغسل العينة جيدا لمدة 10 دقائق 3 مرات في RT.
      ملاحظة: انقل الشريان الأورطي إلى أنابيب مختلفة مملوءة ب PBS في كل مرة.
    5. احتضان العينة في 20٪ من كوكتيلات تصوير الدماغ / الجسم الشفافة ودون عائق ومحلول التحليل الحسابي (CUBIC) لمدة 48 ساعة لإزالة اللون.
      ملاحظة: للحصول على محلول مكعب بنسبة 20٪ ، قم بإذابة 25 جم من اليوريا في 15 مل من Triton X-100 و 28 مل من Quadrol ، وأضف PBS إلى الحجم النهائي البالغ 100 مل. قم بإعداده في الغطاء لأن المكونات محفزة (انظر جدول المواد).
    6. اغسل العينة جيدا لمدة 1 ساعة خمس مرات في PBS في RT.
  2. تلطيخ الأجسام المضادة
    ملاحظة: يتم تنفيذ جميع خطوات الحضانة في أنابيب قفل آمن سعة 50 مل مع دوران أو اهتزاز لطيف عند 4 درجات مئوية.
    1. احتضان العينة في محلول مصل PBS-gellatin-Triton X-100-serum (PGST) طوال الليل من أجل النفاذية والانسداد.
      ملاحظة: يختلف محلول الحجب بناء على الأجسام المضادة. على سبيل المثال ، محلول الحظر: PBS-gelatin-Triton X-100-serum (PGST ، انظر جدول المواد) محلول: 0.2٪ جيلاتين جلد الخنازير ، 0.5٪ تريتون X-100 ، و 5٪ مصل الماعز في PBS.
    2. احتضان العينة بالأجسام المضادة الأولية في محلول PGST ، على سبيل المثال ، NF200 (تخفيف 1: 200 ، انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية ، ورجها برفق لمدة 10-12 يوما. ثم اغسل العينة جيدا في PGST لمدة 1 ساعة 5 مرات في RT.
    3. احتضان العينة بمحلول الأجسام المضادة الثانوية (1: 300 مخفف) و DAPI (1 مجم / مل) في PGST عند 4 درجات مئوية لمدة 7 أيام.
    4. اغسل العينة جيدا في PGST لمدة 1 ساعة 5 مرات في RT. انقل العينة إلى PBS وقم بتخزين الشريان الأورطي في PBS عند 4 درجات مئوية لمزيد من الخطوات.
      ملاحظة: قم بتغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لإبقائها مظلمة للخطوات 2.2.3-2.2.4.
  3. مقاصة أنسجة iDISCO المعدلة
    ملاحظة: أثناء المقاصة ، يجب تغطية الأنابيب بورق الألمنيوم لتجنب تبييض / تبريد الإشارة بسبب التعرض المباشر للضوء الطبيعي / الاصطناعي. جميع الكواشف العضوية المستخدمة في إزالة الديسكو ضارة ، ويجب أن تتم جميع خطوات التنظيف في غطاء الدخان. ارتد معطف مختبر وقفازات وقناع عند التعامل مع الكواشف لتجنب الاستنشاق والتلامس مع الجلد والعينين. اجمع نفايات الإزالة وتفريغها في حاويات النفايات المناسبة في غطاء المحرك.
    1. نقل العينات الملطخة من الخطوة 2.2.4 إلى سلسلة من التركيزات المتزايدة من محاليل عمل رباعي هيدروفوران (THF ، انظر جدول المواد) للجفاف ، أي 50٪ و 70٪ و 90٪ و 100٪ (مرتين في 100٪). احتضان لمدة 12 ساعة لكل تركيز.
      ملاحظة: قم بتخفيف كاشف THF (99٪ -100٪) في الماء المقطر لمحاليل العمل بتركيزات مختلفة في الغطاء. تحديث حلول العمل كل 6 ساعات.
    2. انقل العينة إلى محلول ثنائي كلورو ميثان المطلق (DCM ، انظر جدول المواد) لمدة 3 ساعات لإزالة الدهون.
    3. انقل العينة إلى محلول عمل مطابق ل RI البنزيل والكحول والبنزيل والبنزوات (BABB) (انظر جدول المواد). احتضن لمدة 3-6 ساعات حتى يصبح النسيج شفافا وشفافا في الغالب في الضوء المرئي.
      ملاحظة: لتحضير محلول عمل BABB ، اخلطي جزءا واحدا من كحول البنزيل وجزأين من بنزوات البنزيل (1: 2) في زجاجة زجاجية. رجها برفق لمدة 5 دقائق في الغطاء.
  4. تصوير أنسجة تنظيف iDISCO باستخدام مجهر ضوئي
    ملاحظة: قم بتصوير العينة التي تم مسحها بمجرد تحقيق الشفافية المثلى. يستخدم مجهر الألواح الضوئية ، مثل المجهر الفائق الثاني (انظر جدول المواد) ، للتصوير. املأ خزان التصوير بمحلول المقاصة النهائي ، محلول BABB. احرص على عدم انسكاب BABB على الأداة لتجنب تلف الأداة.
    1. استخدم هدف هواء 1x للصور ذات التكبير المنخفض التي تغطي عرض العينة بأكملها بالكامل. انقل العينة برفق من محلول المقاصة على قطعة قماش ورقية وجففها قريبا.
      ملاحظة: استخدم ملقطا غير حاد لتجنب الضغط على العينة.
    2. حدد حامل عينة بالحجم المناسب بناء على حجم العينة/المنديل وقم بتوصيل الجانب الخلفي من العينة بحامل العينة باستخدام الغراء الفائق.
      ملاحظة: انتظر لمدة 1-2 دقيقة حتى يتم توصيل العينة بإحكام بحامل العينة.
    3. املأ خزان التصوير لمجهر الألواح الضوئية بمحلول BABB وضع العينة فيه برفق. اضبط حامل العينة للتأكد من أن العينة عمودية على ورقة الضوء ومضاءة بشكل صحيح.
    4. قم بخفض الهدف لتركيز العينة وضبط إعدادات العرض أثناء التركيز البؤري لعرض العينة بشكل صحيح. حدد ورقة (صفائح) الضوء المناسبة في برنامج المجهر واضبط عرضها لإضاءة مجال العرض بالكامل بالتساوي.
      ملاحظة: في نظام المجهر الفائق مع إضاءة الليزر على كلا الجانبين ، ابدأ بمحاذاة الليزر وتركيزه على جانب واحد. بمجرد ضبط كلا الجانبين ، قم بتنشيط كلا الليزرات الجانبيين لمراقبة صورة مسح ضوئي مدمجة من كلا الإضاءة.
    5. حدد قناة حمراء بعيدة (680 نانومتر) لتصوير الهياكل العصبية الملطخة ب NF200 وقناة مضان ذاتي (488 نانومتر) لتصوير الشريان الأورطي والأنسجة الضامة غير الملوثة. اضبط طاقة الليزر اعتمادا على شدة إشارة الفلورسنت للحصول على نسبة إشارة إلى ضوضاء مثالية ووقت التعرض وعرض لوح (صفائح) الضوء.
    6. حدد وضع المسح الضوئي xyz. اضبط مسح z-stack بخطوة z من 2-8 ميكرومتر وحدد تداخل 25٪ -60٪ على طول المحور الطولي لمسح البلاط (16 بت) يغطي الأسطح البطنية والظهرية للعينات لتصوير حجم العينة بالكامل (حتى 6-8 مم في العمق).
    7. قم بتسمية الفحص بمعلومات مفصلة ، بما في ذلك تاريخ الفحص واسم العينة والجسم المضاد المستخدم والهدف وعامل التكبير والخطوات z والليزر المستخدم. احفظ البيانات.
    8. قم بالتغيير إلى تكبير أعلى (2x أو 4x) عبر وظيفة التكبير لتصوير مناطق معينة من الجسم ذات الاهتمام.
    9. اتبع الخطوات 2.4.4-2.4.7 أعلاه للتصوير وحفظ البيانات.

3. معالجة الصور وتحليلها

ملاحظة: هناك حاجة إلى محطة عمل معالجة عالية الطاقة للمعالجة. تأكد من النسخ الاحتياطي للبيانات مباشرة بعد المعالجة بسبب الحجم الكبير للتصوير (5-100 جيجابايت لكل صورة).

  1. معالجة الصور ل CLSM والصور متعددة الفوتون
    1. قم بتحميل الصور المبلطة Z-stack من CLSM والمجاهر متعددة الفوتون إلى محطة عمل معالجة الصور المجهزة ب Las X أو Imaris (برنامج تحليل الصور) أو برنامج فيجي للتصور ثلاثي الأبعاد وثنائي الأبعاد (2D) والتجزئة والقياس الكمي.
    2. لترميز عمق حجم الخلية أو البنية ، استخدم برنامج استعادة الصور (انظر جدول المواد) لفك التطور للصورة الأولية وإنشاء إسقاط أقصى كثافة للبيانات غير المعقدة باستخدام الترميز اللوني الزمني في Las X أو Fiji.
  2. معالجة الصور للصور الورقية الخفيفة
    1. قم بتحميل سلسلة صور TIFF المبلطة Z-stack إلى برنامج فيجي. قم بدمج الصور باستخدام المكون الإضافي لخياطة فيجي واحفظ الصور المخيطة بتنسيق TIFF.
      ملاحظة: إذا لزم الأمر، قم بضغط الصور المخيطة بتنسيق LZW للسماح بالمعالجة السريعة باستخدام برامج مختلفة.
    2. قم بتحميل الصور المخيطة في برنامج التصور ثلاثي الأبعاد (انظر جدول المواد) لتجزئة الصور. تتبع الهياكل العصبية والأوعية الدموية يدويا في المحور xyz. للتتبع اليدوي للألياف العصبية الصغيرة ، حدد إشارات NF200 + يدويا بكسل تلو الآخر في كل مستوى z على طول مسار الألياف العصبية بالكامل بين الشريان الأورطي والعقد.
    3. قم بتحميل الصور المعالجة مسبقا في برنامج تحليل الصور (انظر جدول المواد) لإنشاء الفيديو والتصور ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد للصور.
    4. استخدم التألق الذاتي لتقسيم الشريان الأورطي والأنسجة الضامة ، بما في ذلك الغدد الليمفاوية والعضلات ، في برنامج تحليل الصور. قم بتطبيق ألوان زائفة منفصلة في برنامج تحليل الصور لتصور الأجزاء الأبهرية المميزة مثل جدار الأبهر واللويحات.
    5. استخدم وظيفة معادلة الرسم البياني التكيفي (CLAHE) محدودة التباين في برنامج فيجي لتحسين التباين المحلي على خلفية الصور المعالجة.

النتائج

لإثبات التشريح المجهري للشريان الأورطي السليم والمريض والكشف عن الروابط الجسدية بين الجهاز المناعي والجهاز العصبي والجهاز القلبي الوعائي في نماذج الفئران لتصلب الشرايين ، استخدمنا طريقتين تكميليتين لإزالة الأنسجة: تطهير TDE للشريان الأورطي المعزول ، وإزالة iDISCO للفأر بأكمله (الشكل 1). بعد التلوين المناعي بالكامل ، تم مسح الشريان الأورطي السطحي بسلسلة من حلول عمل TDE. تتم مطابقة RI عند 1.4-1.5 ، اعتمادا على تركيز TDE للخطوة النهائية ، لتحقيق الشفافية المثلى للأنسجة الأبهرية دون تغيير حجمها (الشكل 1 أ). على عكس مقاصة TDE ، يتضمن بروتوكول المقاصة iDISCO خطوات إزالة اللون والنفاذية قبل التلوين المناعي بالكامل ، متبوعا بإزالة الدهون والجفاف باستخدام مذيبات كيميائية مختلفة ، ومطابقة RI عند 1.56 (الشكل 1 ب). يسمح مقاصة iDISCO بتصور الأنسجة كبيرة الحجم وحتى جسم الفأر بالكامل بسبب انكماش الأنسجة.

يسمح التصوير ثلاثي الأبعاد متحد البؤر والمتعدد الفوتون للجبل الوجهي بالكامل الذي تم تطهيره بتقنية TDE بتصور الهياكل ، بما في ذلك اللويحات الحميمة ، والخلوية الهجومية ، والإسقاطات العصبية الهجومية من بين الهياكل الأخرى ، في حين أن التصوير بورقة ضوئية للفأر الذي تم تطهيره iDISCO يسمح بتصور وإعادة بناء شجرة الشرايين جنبا إلى جنب مع الأنسجة الدهنية حول الأوعية الدموية والغدد الليمفاوية الكلوية والمكونات العصبية المرتبطة بها بما في ذلك الأعصاب والعقد (الشكل 1 ج). على سبيل المثال ، اكتشف التصوير متحد البؤر لشريان الشرايين التصلب الشرايين المنقوصة ب TDE العديد من الخلايا التائية الملطخة ب CD3e في البلاك وتكوين جديد واسع النطاق للألياف العصبية الملطخة ب NF200 بأقطار مختلفة في ATLOs ، في حين أن التصوير متعدد الفوتون ل TDE أزال الشريان الأورطي البطني المصاب بالجبل الكامل من الفئران المسنة Apoe - / - أظهر إقليمية لمحور عصبي يعبر عن NF200 ينبت في مناطق الخلايا التائية السالبة B220 داخل ATLOs (الشكل 2 أ). على العكس من ذلك ، فإن التصوير بورقة ضوئية ل iDISCO مسح بطن الفأر بالكامل تصور العلاقة المكانية بين الشريان الأورطي والعقد الودي المجاورة. كشف تجزئة الصور ثلاثية الأبعاد وتتبع المحاور الفردية من العقد إلى سطح الأبهر عن إعادة هيكلة عصبية قوية ، بما في ذلك المحاور الملونة NF200 المشكلة حديثا في الشريان الأورطي المجاور للويحة تصلب الشرايين (الشكل 2 ب).

figure-results-1
الشكل 1: سير عمل الدراسة. (أ) إزالة TDE المائي للشريان الأورطي الموجه . (ب) إزالة iDISCO القائمة على المذيبات للماوس بأكمله. (ج). 3D التصوير الحجمي ومعالجة الصور للشريان الأورطي المعزول أو عينات الفأر الكاملة التي تم تطهيرها بصريا. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Sun et al.17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: مثال على صور ثلاثية الأبعاد للأنسجة التي تم تطهيرها من TDE و iDISCO. (أ) تصوير ثلاثي الأبعاد ل TDE تم تطهيره في الشريان الأورطي في الوجه . اللوحة العلوية: أظهرت الصور متحدة البؤر خلايا CD3e + T (حمراء ، سهم) في البلاك الحميمة و NF200 + المحاور العصبية (الأخضر) في الشريان الأورطي التصلب الشرايين (ATLO) ؛ اللوحة السفلية: أظهرت الصور متعددة الفوتونات محاور عصبية NF200 + (خضراء ، رؤوس سهام) ، خلايا B220 + B (حمراء ، مثلث مفتوح) ، الجيل التوافقي الثاني المشتق من الكولاجين (SHG ، أبيض) في ATLOs لذكور Apoe - / - البالغ من العمر 78 أسبوعا. أظهر Sytox (الأزرق) و DAPI (الأزرق) النوى. (ب) صور ثلاثية الأبعاد المعاد بناؤها والمجزأة ل iDISCO تم تطهير بطن الفأر بالكامل. إعادة بناء وتجزئة وتتبع الأعصاب والمحاور NF200 + (الأسهم والأخضر) وعلاقتها المكانية مع العقد المتعاطفة (رؤوس الأسهم) في الشريان الأورطي البطني السليم. أشار المثلث المفتوح إلى محور عصبي تم تشكيله حديثا بجوار لويحات تصلب الشرايين. تم استخدام التألق الذاتي (تلقائي) لتصوير الشريان الأورطي والنسيج الضام ، بما في ذلك اللويحة (السماوية) والعقدة الليمفاوية الكلوية (RLN ، الأزرق). CG ، العقد البطنية ، SycG ، العقد المتعاطفة مع السلسلة. تم تعديل هذا الرقم بإذن من Mohanta et al.6 و Sun et al.17. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يمكن اعتبار تصلب الشرايين مرضا التهابيا عابريا يصيب الشرايين التي تشمل جميع الطبقات الثلاث لجدار الشرايين. علاوة على ذلك ، فإن الشرايين محاطة بالأنسجة الدهنية والعصبية حول الأوعية الدموية. أثناء تطور تصلب الشرايين ، يخضع كل من هذه الأنسجة لتغييرات خلوية وهيكلية كبيرة ، الأمر الذي يتطلب طرقا للحصول على وصول بصري تحت الخلوي إلى الأنسجة السليمة المحيطة بالشرايين السليمة والمريضة. يتم توفير هذه الطرق هنا لفهم تفاعلات الخلايا والخلايا والأنسجة بشكل أفضل وتعزيز فهم التسبب في أمراض القلب والأوعية الدموية. يسمح تطهير الأنسجة والتصوير المجهري ثلاثي الأبعاد اللاحق بتصوير مقصورات الأنسجة السليمة على نطاق واسع والتي يتعذر الوصول إليها حتى الآن ، مما يكشف عن عمليات إعادة بناء مفصلة للشرايين. هنا ، نقدم بروتوكولات لتقنيات تنظيف الأنسجة TDE و iDISCO ، مع تسليط الضوء على فعاليتها وبساطتها في تحقيق شفافية شبه كاملة للأنسجة ، والتصوير الفعال باستخدام الفحص المجهري الكونفوكالي / متعدد الفوتون أو الألواح الضوئية ، وفي نفس الوقت ، الحفاظ على السلامة الهيكلية.

يستخدم تطهير TDE كاشفا قابلا للذوبان في الماء لتحقيق شفافية الأنسجة عن طريق ضبط RI ، وبالتالي الحفاظ بشكل فعال على إشارات التألق في الأنسجة. إنه يمثل طريقة فعالة لإزالة الأنسجة للأوعية الدموية الأصغر حجما ، أي حجم الأنسجة بحجم ميكرومتر إلى مليمتر دون انكماش الأنسجة. ومع ذلك ، فإنه يتطلب وقتا أطول للمعالجة للأنسجة الكبيرة ، أي أحجام الأنسجة بحجم المليمتر إلى السنتيمتر. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف الإجراء مع حاجة المستخدم عن طريق ضبط تركيز الكواشف ووقت الحضانة. من ناحية أخرى ، يستخدم iDISCO سلسلة من المذيبات العضوية لإزالة الدهون والماء ، مما يؤدي إلى تحسين شفافية الأنسجة للأنسجة الكبيرة أو الأعضاء الكاملة أو الفأر بأكمله أو الأنسجة البشرية الأكبر. إنه يوفر المزايا الفريدة لأوقات المعالجة القصيرة والملاءمة لأحجام الأنسجة الكبيرة. ومع ذلك ، فإنه يؤدي إلى انكماش العينات التي تم تطهيرها ، وإخماد إشارات التألق ، وإزالة الدهون ، وهو قيد رئيسي لأنسجة تصلب الشرايين الغنية بالدهون. بالإضافة إلى ذلك ، لا يمكن للفحص المجهري للصفائح الضوئية ، على عكس الفحص المجهري متحد البؤر أو متعدد الفوتون ، تصور التفاصيل تحت الخلوية على مستوى الميكرومتر وتصور الإسقاطات العصبية ذات القطر الصغير ، مثل المحاور المفردة واتصالاتها بخلايا الأوعية الدموية الأخرى.

يلعب تعصيب الأوعية الدموية دورا مهما في تطور تصلب الشرايين6،7،18. سيساعد التحقيق في توزيع الأعصاب الطرفية على طول شجرة الشرايين وتغييراتها على فهم تطور المرض. نظرا لقدرته على المعالجة الفعالة ، يستخدم iDISCO بشكل شائع لتصوير شبكة الأوعية الدموية بالكامل في نماذج تصلب الشرايين في الفئران والفئران12،19،20،21 ، مما يوفر صورا ثلاثية الأبعاد عالية الدقة. من ناحية أخرى ، فإن TDE مناسب للدراسات التي تتطلب الحفاظ على ملصقات الفلورسنت ، مثل مراقبة علامات عصبية محددة ، وبالتالي الكشف بدقة عن البنية الدقيقة والتغيرات في تعصيب الأوعيةالدموية 6. كلا بروتوكولي تطهير الأنسجة مطلوبان لأن تطهير TDE لا ينطوي على تقلص ويمكنه تصوير الدهون ، بينما يؤدي iDISCO إلى تقلص الأنسجة بسبب الجفاف وإزالة الشحوم. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام بروتوكول iDISCO المعدل لتطهير أنسجة أنسجة القلب والأوعية الدموية البشرية22،23. تقدم كلتا تقنيتي المقاصة مزايا تكميلية لدراسة إعادة تشكيل الشرايين في تصلب الشرايين. من خلال الجمع بين نقاط القوة في كلتا الطريقتين ، يمكن تحقيق فهم أكثر شمولا وعمقا للآليات المرضية لتصلب الشرايين.

الإفصاحات

SKM و CJY و AJRH هم مؤسسون مشاركون لشركة Easemedcontrol R & D GmbH وشركة KG.

شكر وتقدير

تم تمويل هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية (DFG) SFB1123 / Z1 ، والمركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية (DZHK) DZHK 81X2600282 ، ومنحة مؤسسة كورونا (S199 / 10087 / 2022) إلى SKM ؛ و ERA-CVD (PLAQUEFIGHT) 01KL1808 ومنحة حكومية لشركة AJRH في Easemedcontrol R & D GmbH and Co. KG.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
2،2'-ثيوديثانول (TDE)سيجما   ؛166782كاشف المقاصة
أميرةثيرمو فيشر برنامجثلاثي الأبعاد ؛ برامج معالجة الصور المستخدمة للتجزئة اليدوية والتتبع في الصور ثلاثية الأبعاد
كحول البنزيلسيجما & nbsp ؛W213713كاشف المقاصة
بنزوات البنزيلسيجماB6630كاشف المقاصة
CD16 / 32eBioscience14-0161-82محلول حجب
مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر   ؛تصوير Leica MicrosystemsTCS- SP8 3Xللتصوير متعدد الأبعاد عالي الدقة للأنسجة أو الأقسام البيولوجية السليمة ذات الخصوصية العالية بدقة تحت الخلوية.
DAPIInvitrogenD3571علامة النوى
ثنائي كلورو الميثان (DCM)Sigma 270997كاشف المقاصة
تشريح الشمع الأسود   ؛ثرمو علمية S17432تشريح الشريان الأورطي وتثبيته 
تشريح المجهرالمجسم Leica Microsystems Stemi 2000تشريح جهاز الفأر
الإيثانول  انشقاق SigmaE7023 
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) روث& nbsp ؛8040.1النزعة المؤقتة 
فيجي (ImageJ ، NIH)برنامج معالجة الصور مفتوح المصدر للصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد
للماعز المضاد للهامستر IgG ، Cy3Dianova   ؛127-165-099الجسم المضاد الثانوي
للماعز المضاد للأرانب IgG ، Alexa Fluor 680Thermo Fisher Scientific / InvitrogenA-21109الجسم المضاد الثانوي   ؛
الماعز المضادة للجرذ IgG ، Cy5Dianova712-175-150الجسم المضاد الثانوي
الهامستر المضاد ل CD3e   ؛BD Bioscience145-2C11 علامة خلية Pan-T
Huygens ProfessionalScientific Volume Imaging ، برنامجالهولندي الإصدار 19.10؛ برنامج معالجة الصور يستخدم بشكل أساسي لفك الالتفاف للصور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد
محطة عمل معالجة الصورMIFCOM & nbsp ؛MIFCOM X5مجهزة بجميع برامج معالجة الصور بما في ذلك مجموعة تطبيقات Leica X و Fiji و Imaris للمعالجة اللاحقة للصور التي تم الحصول عليها بواسطة مجاهر كونفوكالية ومتعددة الفوتون والصفائح الضوئية
ImarisBitplaneالإصدار 8.4برنامج تحليل الصور ؛ برنامج معالجة الصور المستخدم للتجزئة الآلية للصور ثلاثية الأبعاد
حاضنة ودوار  مارشال العلمي Innova 4230جهاز الحضانة والدوران أثناء إزالة الأنسجة
 
iSpacerSunjin LabIS4020مستطيل أيضا حامل العينة
KetamineLivistoAnesthetic
Leica تطبيق Suite X (LAS-X)  لايكا مايكروسيستمزالإصدار 3.5برنامج معالجة الصور للصور التي تم الحصول عليها باستخدام مجهر لايكا
مجهر ضوئيلايكا مايكروسيستمزDM LBجهاز تصوير للتصوير اللامع
ضوء ورقة  مجهرLaVision BioTechUltramicroscope IIتقنية تصوير للتصوير السريع وعالي الدقة للعينات البيولوجية الكبيرة أو الفأر الكامل مع التعرض للضوء المنخفض من خلال الحصول بسرعة على صور للمقاطع البصرية الرقيقة.
الفحص المجهري متعدد الفوتونLeica MicrosystemsTCS-SP5II MP طريقة التصوير للتصوير متعدد الأبعاد وعالي الدقة للأنسجة البيولوجية السليمة والقابلة للحياة على المستوى الخلوي والجزيئي على مدى فترات طويلة من الزمن ، في عمق العينة وبأقل قدر من الغزو.
مصل الماعز العادي SigmaG9023حجب الحل
بارافورمالدهيد (PFA) سيجما P-6148 التثبيت 
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)Sigma P4417-100TAB عازلة الغسيل
جيلاتين جلد الخنازيرSigma G1890حضانة عازلة
كوادرولسيجما122262كاشف مقاصة
مكعب أرنب مضاد NF200سيجماN4142عموم علامة الخلايا العصبية
الجرذ المضاد ل B220   ؛BD BioscienceRA3-6B2Pan-B خلية السمك
السكروزسيجما  90M003524V الجفاف 
SytoxThermo Fisher ScientificS11380علامة النوى
TetrahydrofuranSigma   ؛401757كاشف المقاصة 
Triton X-100Roth 3051.1اختراق
اليورياسيجما U5128كاشف المقاصة المكعب
Xylene فيشر للكيماويات x/0250/17 مخدر 
التصور العلمي جهاز استعادة الصور محطة عمل معالجة الصور ورقة

المراجع

  1. Libby, P. The changing landscape of atherosclerosis. Nature. 592 (7855), 524-533 (2021).
  2. Mohanta, S., Yin, C., Weber, C., Hu, D., Habenicht, A. J. Aorta atherosclerosis lesion analysis in hyperlipidemic mice. Bio Protoc. 6 (11), e1833(2016).
  3. Yin, C., Mohanta, S. K., Srikakulapu, P., Weber, C., Habenicht, A. J. Artery tertiary lymphoid organs: Powerhouses of atherosclerosis immunity. Front Immunol. 7, 387(2016).
  4. Mohanta, S. K., et al. Artery tertiary lymphoid organs contribute to innate and adaptive immune responses in advanced mouse atherosclerosis. Circ Res. 114 (11), 1772-1787 (2014).
  5. Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436 (7048), 193-200 (2005).
  6. Mohanta, S. K., et al. Neuroimmune cardiovascular interfaces control atherosclerosis. Nature. 605 (7908), 152-159 (2022).
  7. Mohanta, S. K., et al. Cardiovascular brain circuits. Circ Res. 132 (11), 1546-1565 (2023).
  8. Hu, D., Yin, C., Luo, S., Habenicht, A. J. R., Mohanta, S. K. Vascular smooth muscle cells contribute to atherosclerosis immunity. Front Immunol. 10, 1101(2019).
  9. Newland, S. A., et al. Type-2 innate lymphoid cells control the development of atherosclerosis in mice. Nat Commun. 8, 15781(2017).
  10. Grabner, R., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling promotes tertiary lymphoid organogenesis in the aorta adventitia of aged Apoe-/- mice. J Exp Med. 206 (1), 233-248 (2009).
  11. Mai, H., et al. Whole-body cellular mapping in mouse using standard igg antibodies. Nat Biotechnol. 42 (4), 617-627 (2024).
  12. Molbay, M., Kolabas, Z. I., Todorov, M. I., Ohn, T. L., Erturk, A. A guidebook for disco tissue clearing. Mol Syst Biol. 17 (3), e9807(2021).
  13. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  14. Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. J Anat. 238 (2), 489-507 (2021).
  15. Adolfs, Y., Raj, D. D. A., Brignani, S., Pasterkamp, R. J. Protocol for tissue clearing and 3d analysis of dopamine neurons in the developing mouse midbrain. STAR Protoc. 2 (3), 100669(2021).
  16. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  17. Sun, T., et al. Tissue clearing approaches in atherosclerosis. Methods Mol Biol. 2419, 747-763 (2022).
  18. Chistiakov, D. A., Ashwell, K. W., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Innervation of the arterial wall and its modification in atherosclerosis. Auton Neurosci. 193, 7-11 (2015).
  19. Cao, Y., Wang, H., Wang, Q., Han, X., Zeng, W. Three-dimensional volume fluorescence-imaging of vascular plasticity in adipose tissues. Mol Metab. 14, 71-81 (2018).
  20. Kirst, C., et al. Mapping the fine-scale organization and plasticity of the brain vasculature. Cell. 180 (4), 780-795.e25 (2020).
  21. Todorov, M. I., et al. Machine learning analysis of whole mouse brain vasculature. Nat Methods. 17 (4), 442-449 (2020).
  22. Bhatia, H. S., et al. Spatial proteomics in three-dimensional intact specimens. Cell. 185 (26), 5040-5058.e19 (2022).
  23. Mai, H., et al. Scalable tissue labeling and clearing of intact human organs. Nat Protoc. 17 (10), 2188-2215 (2022).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

التصوير ثلاثي الأبعاد للأنسجة الأبهرية في تصلب الشرايين
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.