مقالة منهجية

توصيف أطياف الامتصاص البيولوجي التي تمتد عبر المرئي للأشعة تحت الحمراء قصيرة الموجة

DOI:

10.3791/67403

⸱

يناير 10, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Washington University in St. Louis, 2Department of Radiology, Washington University in St. Louis, 3Department of Dermatology, Washington University in St. Louis, 4Department of Obstetrics & Gynecology, Washington University in St. Louis

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع العينات البيولوجية بخصائص بصرية مميزة في الأشعة تحت الحمراء قصيرة الموجة (SWIR) مقارنة بنطاقات الطول الموجي المرئية (VIS) والأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR). ومع ذلك ، فإن تسجيل أطياف امتصاص SWIR النقية يمثل تحديا ونادرا ما يتم إجراؤه للجزيئات البيولوجية. تقدم هذه المقالة طريقة لتوصيف أطياف امتصاص VIS-SWIR للامتصاصات البيولوجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للمراقبة الفسيولوجية غير الغازية القائمة على الضوء ، يمكن تحديد الأطوال الموجية المثلى لمكونات الأنسجة الفردية باستخدام التحليل الطيفي للامتصاص. ومع ذلك ، نظرا لعدم وجود حساسية للأجهزة ذات الأطوال الموجية الأطول ، فقد تم تطبيق التحليل الطيفي للامتصاص عادة على الأطوال الموجية في النطاق المرئي (VIS) والأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR) من 400 إلى 1,000 نانومتر. مكنت التطورات في الأجهزة في نطاق الأشعة تحت الحمراء قصيرة الموجة (SWIR) الباحثين من استكشاف الأطوال الموجية في نطاق ~ 1,000 نانومتر إلى 3,000 نانومتر حيث تقع قمم الامتصاص المميزة للدهون والبروتين والماء. يصعب تصور هذه الجزيئات في VIS-NIR ويمكن أن توفر مصادر خالية من الملصقات للتباين البيولوجي. علاوة على ذلك ، لوحظ انخفاض امتصاص SWIR للميلانين ، وهو الصبغة الأساسية المسؤولة عن تصبغ الجلد. تم العثور على الأجهزة البصرية في الجسم الحي مثل مقاييس التأكسج النبضي القياسية سريريا لتقليل الدقة لدى الأشخاص ذوي البشرة الداكنة ، ربما بسبب امتصاص الميلانين الأقوى في نطاق VIS. وبالتالي ، يمكن تقليل الخطأ المرتبط بتصبغ الجلد باستخدام الأجهزة التي تعمل في SWIR. يتم تسهيل تصميم الأداة البصرية من خلال فهم خصائص امتصاص مكونات الأنسجة الأساسية من VIS إلى نطاق SWIR. توضح هذه المقالة البروتوكولات والأجهزة للحصول على أطياف امتصاص VIS-SWIR لامتصاص الأنسجة الشائعة: الهيموجلوبين المؤكسج ، والهيموجلوبين غير المؤكسج ، والميلانين ، والماء ، والدهون.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تمييز معظم الماصات البيولوجية بصريا في النطاقات الطيفية المرئية (VIS ، ~ 400-700 نانومتر) والأشعة تحت الحمراء القريبة (NIR ، ~ 700-1,000 نانومتر) ولكن ليس الأشعة تحت الحمراء قصيرة الموجة (SWIR ، ~ 1,000-3,000 نانومتر) 1،2،3،4 (الشكل 1). هذا على الرغم من أن SWIR يوفر اختراقا أعمق للضوء بسبب انخفاض تشتت الأنسجة وانخفاض امتصاص الميلانين بالإضافة إلى تباين بيولوجي إضافي خال من الملصقات للماء والدهون والبروتين1،5،6. أدى الافتقار إلى أطياف الامتصاص التي تمتد عبر VIS-SWIR إلى خلق فجوة في المعرفة تمنع تطوير الأجهزة البصرية الطبية الحيوية التي تستفيد من مزايا SWIR هذه. في حين تم تقديم العديد من المحاولات لتوصيف الأطياف في الماضي ، فإن أطياف امتصاص VIS-SWIR عالية الجودة للمكونات النقية بدون قطع أثرية مذيبة كبيرة تفتقرإلى 1،7،8. على سبيل المثال ، تم تمييز المواد القابلة للذوبان في الماء مثل الهيموجلوبين في SWIR باستخدام الماء كمذيب وطرح امتصاص الماء النقي من الأطياف الناتجة9. ومع ذلك ، فإن دقة هذا النهج غير واضحة لأن الماء هو الماص المهيمن في هذه المنطقة.

يتمتع العمل في SWIR بميزة إضافية تتمثل في تقليل أو ربما إزالة التحيز الناجم عن امتصاص الميلانين القوي في VIS عند استخدام التشخيص البصري في الجسم الحي . وجدت العديد من الدراسات أن مقاييس التأكسج النبضي تبالغ في تقدير الأكسجين لدى المرضى السود ، وعلى هذا النحو ، فمن المرجح أن يكون لدى المرضى السود مستويات أكسجين منخفضة بشكل خطير لم تكتشفها مقاييس التأكسج النبضي10. أدى تحيز تصبغ الجلد هذا إلى تأخر وعدم كفاية العلاج الطبي للعديد من مرضى نقص الأكسجة السوداء11،12 ودفع إلى دعوة للعمل في مجتمعات البصريات والهندسة لتحسين دقة الأجهزة البصرية لجميع ألوانالبشرة 13. يعد الانتقال من الأطوال الموجية VIS عالية الامتصاص للميلانين إلى NIR و SWIR أحد الابتكارات التقنية المثيرة التي يمكن أن تقلل من التفاوتات العرقية في تقنيات البصريات الطبية الحيوية ذات الأهمية الحاسمة

يعد تسجيل أطياف امتصاص الحقيقة الأرضية للجزيئات الحيوية أمرا ضروريا لفهم الخصائص البصرية لعينات الأنسجة المستخدمة في مجموعة متنوعة من التطبيقات الهندسية والطبيةالحيوية 14. يقيس التحليل الطيفي للامتصاص امتصاص الضوء الخاص بالجزيء كدالة للطول الموجي. تتمثل الطريقة القياسية الذهبية للحصول على قياسات الامتصاص في المحلول في توجيه الضوء الموازي أحادي اللون من خلال عينة مذابة وتسجيل الضوء المرسل باستخدام كاشف يوضع على الجانب الآخر من العينة من مصدر الضوء. ثم يتم تحديد الامتصاص (A) للعينة بواسطة Eq. (1).

أ = سجل10 (I0 / I) (1)

حيث Io هي شدة الضوء الساقط على العينة ، و I هي شدة الضوء المنقول عبر العينة التي تصطدم بالكاشف. يتم الحصول على Io عن طريق قياس مرجع ، والذي عادة ما يكون مذيب المذاب محل الاهتمام ، باستخدام نفس إعدادات الاستحواذ مثل I. يوفر التحليل الطيفي للامتصاص خصائص امتصاص كمية ويحكمه قانون بير لامبرت (المعادلة 2) ، والذي لا ينطبق على العينات التي تحتوي على تشتت بصري. تنص هذه المعادلة على أن الامتصاص البصري يتم تحديده بواسطة معامل الامتصاص المولي للعينة (ε ، الوحدات L ·mol−1 سم −1) عند الطول الموجي λ مضروبا في تركيزها المولي (C ، وحدات mol∙L-1) وطول المسار (L ، وحدات cm) ، والتي تعرف على أنها المسافة المقطوعة عبر العينة15:

أ (λ) = ε (λ) * L * C (2)

الأهم من ذلك ، أن معامل الامتصاص المولي فريد من نوعه لكل ممتص بيولوجي ويشير إلى مدى قوة امتصاص العينة للضوء عند طول موجيمعين 16.

عند أخذ قياسات التحليل الطيفي للامتصاص الممتدة من VIS إلى SWIR ، يلزم إجراء تعديلات على الأجهزة وإعداد العينة والمعالجة اللاحقة الطيفية بما يتجاوز أطياف VIS-NIR القياسية:

الاجهزه
تستخدم قياسات VIS-NIR عادة كاشف السيليكون أو أنابيب المضاعف الضوئي (PMT) مع الكاثودات الضوئية الحساسة لفوتونات الأشعة فوق البنفسجية ، بينما يتطلب امتصاص SWIR كاشفا ضوئيا حساسا لفوتونات SWIR ، مثل كاشف زرنيخيد الغاليوم الإنديوم (InGaAs)17. تتطلب أنظمة VIS و NIR و SWIR أيضا عناصر تشتت خاصة بالطول الموجي ، مثل حواجز شبكية بصرية ، لتشتت الضوء في هذه النطاقات البصرية. بالإضافة إلى ذلك ، يتطلب امتصاص SWIR كوفيت زجاجي أو كوارتز ، والذي يتمتع بنقل أعلى من الكوفيت البلاستيكي في SWIR ، مما يجعله أكثر ملاءمة لأطياف VIS-SWIR. وينبغي اختيار مصدر أو مصادر ضوئية ذات انبعاث واسع وموحد نسبيا يغطي VIS-SWIR، مثل مصباح التنغستن والهالوجين (المستخدم في هذا البروتوكول). يمكن أن يساعد ضبط قوة الضوء الساقط أو وقت التعرض أو المدة التي يتعرض فيها الكاشف الضوئي للضوء في تحسين قياسات الامتصاص.

تحضير العينة
سيؤدي تركيز العينة أو طول مسار الكوفيت إلى تغيير مقدار الامتصاص الذي يحدث خطيا كما هو موضح أعلاه في المعادلة (2) ، وبالتالي ، يمكن تغيير أي منهما لتحقيق نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية (SNR ، محسوبة هنا على أنها نسبة سعة الذروة مقسومة على الانحراف المعياري لمنطقة غير متجهة من الطيف ، عادة SNR > 30 تعتبر قياسات عالية الجودة) في أقسام مختلفة من الطيف ذات الارتفاع أو الانخفاض نسبيا الامتصاص. لتحسين قياسات SWIR في محلول مائي ، يمكن استخدام أكسيد الديوتيريوم (D2O) ، الذي يشار إليه أيضا باسم الماء الثقيل أو الماء المنزوع ، بدلا من الماء (H2O) ، لأنه يحتوي على قمم امتصاص أقل بكثير في SWIR1. هذا يسمح بتوصيف المذاب دون تدخل امتصاص الماء السائد في SWIR.

المعالجة اللاحقة الطيفية
المعالجة اللاحقة مطلوبة لأن أطياف VIS-SWIR تتطلب كاشفين ، أحدهما للأشعة تحت الحمراء المرئية (عادة ما يكون السيليكون أو الأشعة فوق البنفسجية حساسة للأشعة فوق البنفسجية) والآخر ل SWIR (عادة InGaAs) ، ويجب خياطة الأطياف معا لتحقيق طيف VIS-SWIR كامل. عندما تمتد الأطياف إلى VIS-SWIR ، يمكن أن يختلف الامتصاص بشكل كبير اعتمادا على منطقة الطول الموجي ، وقد تحتاج العينة إلى التخفيف أو تقليل طول المسار في بعض المناطق لمنع التشبع. يجب تحجيم الأطياف خطيا لحساب التغيرات في تركيز العينة أو طول المسار ثم تجميعها معا لإنشاء طيف واحد يتضمن منطقتين للطول الموجي.

ستوضح البروتوكولات التالية بالتفصيل التحضير والقياس الطيفي من VIS إلى SWIR لخمسة أمثلة على الامتصاص البيولوجي: الماء (يتكون من ~ 60٪ من وزن الجسم) ، الميلانين (الممتص الأساسي لتصبغ الجلد) ، زيت الذرة (يستخدم كنظير للدهون البشرية لأنه يحتوي على تباين منخفض بين الدفعات ، التركيب الكيميائي القريب من الدهون البشرية والحيوانية ، والحد الأدنى من التشتت) ، والهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج (الماصات الأولية في الدم).

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تحضير العينات

  1. تحضير عينة الماء
    1. لتحضير العينة ، املأ وعاءا نظيفا بالماء فائق النقاء وقم بتصفيته باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. تأكد من توجيه إخراج المحقنة إلى زجاج نظيف أو كوفيت كوارتز لأخذ قياسات التحليل الطيفي للامتصاص للعينة.
    2. لتحضير المرجع ، املأ وعاءا نظيفا بالماء المنزوع وقم بتصفيته باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. تأكد من توجيه إخراج المحقنة إلى زجاج نظيف متطابق أو كوفيت كوارتز مثل عينة كوفيت لتكون بمثابة مرجع.
      ملاحظة: ستقلل خطوة الترشيح من التشتت البصري من العينة عن طريق تصفية الجسيمات الصغيرة في الماء ، والتي لها مساهمات قوية في المنطقة المرئية.
  2. تحضير عينة الميلانين
    1. قم بإعداد محلول 1.7 مجم / مل من الميلانين عن طريق إضافة مسحوق الميلانين إلى أنبوب طرد مركزي مملوء ب 3.5 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). للبدء ، يجب أن تبدأ القياسات من الأطوال الموجية ذات الامتصاص المتوقع الأدنى ، حيث يلزم أعلى تركيز للميلانين. ابدأ قياسات الميلانين بحوالي 1.7 مجم / مل ل SWIR وتخفيفه باستخدام DMSO لاحقا إلى تخفيف 10x (حوالي 0.17 مجم / مل) لمناطق VIS / NIR.
    2. قم بتوصيل الأنبوب لمدة 10 دقائق للتأكد من ذوبان مسحوق الميلانين في DMSO ونقل المحلول إلى زجاج نظيف أو كوفيت كوارتز لقياسات التحليل الطيفي.
    3. ابق ضمن نطاق الامتصاص الخطي لمقياس الطيف وتأكد من قياسات SNR عالية عن طريق تغيير التركيز و / أو طول المسار (على سبيل المثال ، عن طريق التبديل من طول مسار قصير (1 أو 2 مم) إلى كوفيت بطول مسار 10 مم). امتصاص الميلانين له نطاق واسع يمتد من VIS إلى SWIR. بالنسبة ل VIS ، استخدم أقل تركيز و / أو كوفيت طول المسار من الميلانين نظرا لمعامل الانقراض المولي المرتفع ؛ بالنسبة ل SWIR ، استخدم أعلى تركيز من الميلانين و / أو كوفيت طول المسار للحصول على قياس طيفي نظيف نوعيا.
  3. تحضير عينة زيت الذرة
    1. أضف زيت الذرة إلى كوب نظيف أو كوفيت كوارتز لقياسات التحليل الطيفي.
    2. استخدم الهواء الطلق كمرجع. لن يتم استخدام أي كوفيت أو محلول كمرجع.
  4. تحضير عينة الهيموجلوبين المؤكسج بدم الإنسان الكامل الهبارين
    ملاحظة: تم شراء دم بشري كامل بالهيبارين وتم جمعه في مراكز التجميع المرخصة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية والموجودة في الولايات المتحدة.
    1. لعزل الهيموجلوبين من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) وإزالة أكبر قدر ممكن من الماء من الدم ، قم أولا بإدخال 1,800 ميكرولتر من الدم البشري الكامل الهبارين إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وأجهزة الطرد المركزي عند 9.6 × جم لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يوصى باستخدام ما يقرب من 4-6 أنابيب طرد مركزي دقيقة
    2. بعد الطرد المركزي ، قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي الدقيق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها (ستكون حوالي 850 ميكرولتر) من عينة الدم بالطرد المركزي دون إزعاج الحبيبات (الشكل 2). يتكون المادة الطافية من السائل (البلازما والصفائح الدموية بشكل أساسي) فوق حبيبات خلايا الدم الحمراء. ابحث عن حبيبات خلايا الدم الحمراء في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
    3. أعد تكوين كل حبيبات بنفس حجم الماء المنزوع مثل حجم المادة الطافية التي تم التخلص منها. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 9.6 × جم لمدة 10 دقائق.
    4. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي ، ثم تخلص من المادة الطافية دون إزعاج الحبيبات.
    5. أعد تكوين الحبيبات بنفس حجم الماء المنزوع مثل حجم المادة الطافية التي تم التخلص منها. أعد جهاز الطرد المركزي عند 9.6 × جم لمدة 10 دقائق.
    6. قم بإزالة الأنابيب من جهاز الطرد المركزي ، ثم قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة وتخلص منها.
    7. تحلل خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء): أعد تكوين كريات كرات الدم الحمراء بحجم كبير (4.5 مل) من الماء المنزوع ، مما يؤدي إلى انفجار منخفض التوتر. إذا كانت الحبيبات ملتصقة بالأنبوب ، اشطفها ببعض 4.5 مل من الماء المنظوف لفكها.
      ملاحظة: سيزداد حجم المادة الطافية بعد كل خطوة من خطوات الطرد المركزي. يمكن أن يتراوح هذا الحجم من المادة الطافية من 800 ميكرولتر إلى 1,600 ميكرولتر. يمكن أن يتغير حجم الماء المنزوع للتحلل اعتمادا على تركيز العينة المطلوب ولكن يجب أن يكون مرتفعا بما يكفي لإحداث انفجار منخفض التوتر.
    8. قم بإزالة محلول الدم المحلل من الأنبوب بإبرة وحقنة ؛ بعد ذلك ، قم بإزالة إبرة المحقنة ذات الطرف الحاد بعناية وتخلص منها في حاوية الأدوات الحادة Biohazard. قم بتوصيل المحقنة بفلتر حقنة 0.22 ميكرومتر وادفع محتويات المحقنة عبر الفلتر إلى كوفيت بطول مسار 10 مم أو 3.5 مل أو زجاج أو كوارتز.
      ملاحظة: ستقلل خطوة الترشيح من التشتت البصري من العينة عن طريق تصفية العضيات الخلوية والأغشية في المحلول. إذا كانت العينة عالية التركيز وأصبح من الصعب دفع مرشح المحقنة ، فاستخدم مرشحات حقنة متعددة.
    9. قم بتأمين الكوفيت بسدادة محكمة الغلق فوق الكوفيت لمنع بخار الماء من الهواء الذي يلوث العينة. قم بضبط الجزء الخارجي من السدادة لمنع التلوث وضمان إحكام إحكام الغلق.
      ملاحظة: بالنسبة للقياسات من 600 نانومتر إلى 1,600 نانومتر, ما يقرب من 1,200-1,600 ميكرولتر من الحبيبات المذابة في 4.5 مل من الماء المنزوع ستعطي قياسات نظيفة نوعيا.
      ملاحظة: بالنسبة للمناطق الطيفية ذات الامتصاص المتوقع العالي (400 نانومتر إلى 600 نانومتر) ، ستحتاج العينات إلى التخفيف باستخدام الماء المنزوع للحصول على قيم امتصاص غير مشبعة والتأكد من أن قيم الامتصاص ضمن النطاق الخطي للكاشف. بالإضافة إلى ذلك ، يجب وضع العينات والمرجع في كوفيت قصير بطول مسار (1 أو 2 مم). بالنسبة للأطياف الموضحة هنا ، تم تخفيف العينات 10x ل 400-500 نانومتر و 5x ل 500-600 نانومتر وتم قياسها في كوفيت بطول مسار 2 مم.
      سيسمح طول المسار الأقصر (1 أو 2 مم) بامتصاص أقل للضوء في الأطوال الموجية عالية الامتصاص ، مما يساعد على ضمان انتقال بعض الفوتونات إلى الكاشف والبقاء ضمن نطاق الكشف الخطي.
    10. احصل على كوفيت نظيف بنفس طول المسار والحجم مثل عينة كوفيت تحتوي على محلول الدم المصفى واملأها بالماء المنزوع للقياسات الأساسية والمرجعية. في حالة تغيير أطوال مسارات الكوفيت لنطاقات طيفية مختلفة ، قم بتسجيل طيف مرجعي جديد لكل طول مسار كوفيت.
  5. تحضير عينة من الهيموجلوبين غير المؤكسج بدم بشري كامل
    1. اتبع الخطوات 1.4.1-1.4.8.
    2. يضاف ثنائي ثيونيت الصوديوم إلى محلول الدم في الكوفيت ويحرك برفق. قم بتأمين الكوفيت بسدادة محكمة الغلق فوق الكوفيت لمنع بخار الماء من الهواء الذي يلوث العينة. قم بضبط الجزء الخارجي من السدادة لمنع التلوث وضمان إحكام إحكام الغلق. قم بإمالة الكوفيت بعناية من جانب إلى آخر للتأكد من ذوبان ثنائي ثيونيت الصوديوم في المحلول. سيتغير محلول الدم من اللون الأحمر إلى اللون الأرجواني والأحمر الداكن.
      ملاحظة: لإزالة الأكسجين من الهيموجلوبين بالكامل ، تبلغ كتلة ثنائي ثيونيت الصوديوم المطلوبة حوالي 0.007 جم لكل مل من محلول الدم. وفقا ل Briley-Sӕbø و Bjørnerud ، هناك حاجة إلى ما لا يقل عن 2.5 مجم من ثنائي تيونيت الصوديوم / غرام من الدم لإزالة الأكسجين الكاملمن الدم الكامل 18. ومع ذلك ، وجد أن هذا التركيز غير كاف في الدراسات هنا. تم العثور على تركيز يبلغ حوالي 3.4 مجم / غرام من الدم الكامل لإزالة الأكسجين تماما من محلول الدم دون إدخال التشتت البصري. بالنسبة للقياسات من 400 إلى 600 نانومتر ، يجب تخفيف محلول الدم بالماء المنزوع. احسب كتلة ثنائي ثيونيت الصوديوم المطلوبة بناء على حجم محلول bood المستخدم وليس الحجم بعد التخفيف. بالنسبة للقياسات من 600 نانومتر إلى 1,600 نانومتر ، فإن ما يقرب من 1,200-1,600 ميكرولتر من الحبيبات المذابة في 4.5 مل من الماء المنزوع ستعطي قياسات SNR عالية.
      ستسمح الكوفيت ذات طول المسار الأقصر (1 أو 2 مم) بامتصاص أقل للضوء في الأطوال الموجية عالية الامتصاص ، مما يساعد على ضمان انتقال بعض الفوتونات إلى الكاشف والبقاء ضمن نطاق الكشف الخطي.
    3. املأ كوفيت آخر بطول مسار مطابق مثل الكوفيت بمحلول الدم المصفى بالماء المنزوع للقياسات الأساسية والمرجعية. في حالة تغيير أطوال مسارات الكوفيت لنطاقات طيفية مختلفة ، قم بتسجيل طيف مرجعي جديد لكل طول مسار كوفيت.

2. الحصول على قياسات امتصاص عالية الجودة

  1. قم بإعداد العينات والمراجع كما هو موضح في القسم 1 وضعها في كوفيت زجاجي أو كوارتز لقياسات VIS NIR-SWIR. قم بتشغيل مصباح مقياس الطيف وأجهزة الكشف واسمح للنظام بالتسخين لمدة 5-20 دقيقة على الأقل ، اعتمادا على نظام مقياس الطيف ومصدر الضوء.
    ملاحظة: توفر خمس دقائق تبريدا كافيا للكاشف وثبات خرج المصباح للأطياف التي تم جمعها هنا ، ولكن يجب وصف ذلك لكل نظام قبل التقاط قياسات الامتصاص.
    احتفظ بالعينة والمرجع في متناول يدك خلال فترة التجميع هذه. تأكد من أن أغطية الكوفيت آمنة. حافظ على مساحة القياس مظلمة قدر الإمكان لمنع تشويه قياسات الامتصاص بواسطة الضوء المحيط.
  2. كرر الخطوات التالية لمناطق مختلفة من الطيف بسبب التباين الكبير في الامتصاص عبر VIS-SWIR.
    1. إذا كنت تستخدم تكوين شعاع مزدوج (كاشفان منفصلان للعينة والرجوع إليها) ، فتأكد من أن النظام أساسي. احصل على خط الأساس عن طريق وضع عينات مرجعية متطابقة تحتوي على المذيب أمام كل كاشف وجمع قياس الامتصاص باستخدام معلمات الاستحواذ الدقيقة لاستخدامها في جمع طيف امتصاص العينة. في حين أن أجهزة الكشف يجب أن تظهر نظريا امتصاصا صفريا ، إلا أنها عادة ما تكون غير مثالية. اطرح طيف الامتصاص الناتج من جميع أطياف امتصاص العينة التي يتم الحصول عليها باستخدام نفس الإعدادات.
      ملاحظة: يجب تكرار خط الأساس في أي وقت يتم فيه تغيير إعدادات الاقتناء لجمع البيانات.
    2. ضع العينة في مقياس الطيف واختر الكاشف ذي الصلة بالمنطقة المراد قياسها (VIS-NIR = السيليكون أو UV-VIS PMT ، SWIR = InGaAs) واعرض الامتصاص في الوضع المباشر ، حيث يتم تحديث القياس باستمرار عند ضبط معلمات القياس.
    3. بدءا من معلمات مقياس الطيف الافتراضية ، اضبط طاقة الضوء الساقط ووقت التعرض حتى يتم الحصول على طيف امتصاص نظيف نوعيا دون تشبع.
      1. إذا لم ينتج عن ضبط المعلمات أطياف نظيفة نوعيا، فقم بتعديل المعلمات مثل قوة الضوء الساقط ووقت التعرض وطول المسار وتركيز العينة. أولا ، حاول ضبط الطاقة ووقت التعرض. إذا لم ينتج عن ضبط هذه المعلمات طيف SNR عال ، فقم بتغيير تركيز العينة أو طول مسار العينة والمرجع.
        ملاحظة: كانت المعلمات الافتراضية المستخدمة في جمع الأطياف الموضحة هنا هي القدرة الضوئية الساقطة البالغة 15 نانو واط عند 400 نانومتر و20 نيو واط عند 1,000 نانومتر ، ووقت التعرض 30 مللي ثانية ، وطول مسار الكوفيت 10 مم ، والتركيزات المحددة للعينة: 100٪ ماء ، ميلانين 1.7 مجم / مل ، زيت ذرة 100٪ ، هيموجلوبين مؤكسج (15.9 جم / ديسيلتر) ، والهيموجلوبين غير المؤكسج (15.9 جم / ديسيلتر).
      2. لزيادة SNR، قم بزيادة عدد قراءات البيانات في المتوسط لكل نقطة بيانات. كلما زاد متوسط عدد قراءات البيانات، زاد الوقت لكل قياس.
      3. لزيادة الدقة الطيفية ، قم بتقليل حجم الخطوة (نانومتر) للقياس وصولا إلى حد دقة مقياس الطيف. سيؤدي ذلك إلى زيادة الوقت لكل قياس. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتقليل عرض النطاق الترددي لطاقة الضوء الساقط إلى 1/10من العرض الكامل لأضيق قمة عند نصف الحدالأقصى 19.
      4. بمجرد تحسين إعدادات القياس للعينة ، قم بتوثيق الإعدادات لكل طيف تم الحصول عليه.
      5. للحصول على الطيف، استخدم الإعدادات المحسنة لقياس المرجع فقط. بعد ذلك ، استبدل الكوفيت المرجعي بعينة الكوفيت وقم بإجراء قياس آخر. تأكد من حفظ كل من القياسات المرجعية والعينة بشكل منفصل.
        ملاحظة: من الضروري ألا يكون القياس المرجعي مشبعا. إذا حدث ذلك ، قلل من طاقة الضوء الساقط و / أو وقت التعرض حتى لا يكون هناك تشبع. الحفاظ على جميع معلمات النظام متشابهة بين القياسات المرجعية والعينة ؛ إذا احتاج أحدهما إلى التغيير ، فسيحتاج الآخر أيضا إلى تكراره لمطابقته.
      6. لكل مجموعة مقترنة من القياسات المرجعية والعينة ، احسب الامتصاص A (المعادلة 1) عن طريق التعامل مع القياس المرجعي على أنه Io وقياس العينة على أنه I.
      7. لتجميع المناطق المختلفة التي تتطلب اختلافات في تركيز العينة أو طول المسار معا ، قم بتطبيق عامل ضرب على إحدى المناطق الطيفية. على سبيل المثال ، بالنسبة للمنطقة الأولى التي تحتوي على 1/10 من التركيز وطول المسار المتطابق كمنطقة ثانية ، اضرب المنطقة الطيفية الأولى في 10 لقياس المنطقتين معا بشكل مناسب.
        ملاحظة: يجب أن يكون عامل الضرب هو الفرق في التركيز و / أو طول المسار بين المناطق.
      8. بمجرد تصحيح الأطياف بحثا عن الاختلافات في طول المسار أو التركيز ، اختر طولا موجيا متداخلا في المنطقتين الطيفيتين لخياطة المنطقتين معا.
      9. اقتطاع الأطياف لتنتهي عند الطول الموجي المتداخل. اختر طيفا واحدا لتضمين قيمته الطيفية الانتقالية. تسلسل الأطياف المقطوعة لإنشاء طيف واحد ناتج لنطاق طول موجي أوسع.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البيانات متاحة عبر مستودع مواد البحث الرقمي WUSTL (DRMR) doi: https://doi.org/10.7936/6RXS-108249

التوصيف الطيفي للمياه
الماء ، أحد أكثر الامتصاصات البيولوجية شيوعا ، له قمم مميزة وعالية الامتصاص في NIR و SWIR. هذه القمم المميزة قوية جدا لدرجة أنه عند قياس امتصاص الماء ، يجب تخفيفه بالماء المنزوع لمنع التشبع. يظهر الفرق في الامتصاص بين الماء والماء المنزوع في الشكل 3 ، مما يسلط الضوء على أكثر من زيادة كبيرة في امتصاص الماء على الماء المنزوع. كما أن الامتصاص القوي للماء في SWIR يجعل من الصعب الحصول على أطياف امتصاص الماصات البيولوجية الأخرى التي تحتوي على الماء في العينة أو التي تستخدم الماء كمذيب ومرجع. كحل لهذه المشكلة ، يمكن استخدام المياه المنزوعة بدلا من الماء. يعمل الماء المنزوع بطريقة مشابهة للماء بينما يكون ممتصا للمياه الأضعف بكثير ، مما يجعله بديلا مثاليا للماء في قياسات التحليل الطيفي SWIR.

لقياس طيف امتصاص الماء ، تم استخدام الماء كعينة والماء المنزوع كمرجع. لمنع التشبع في SWIR ، تم تخفيف العينة بالماء المنزوع في منطقة SWIR. يظهر طيف امتصاص الماء الناتج امتصاصا منخفضا في VIS ، والذي يزداد عند الأطوال الموجية الأطول. يمكن رؤية قمم الامتصاص المميزة عند حوالي 750 نانومتر و 970 نانومتر و 1,200 نانومتر و 1,450 نانومتر (الشكل 4). يحتوي طيف الماء الناتج على SNR يبلغ 3536.6 وتم مقارنته بطيف امتصاص الماء20 في Hale and Querry ، مما يظهر منحنى امتصاص مماثل من ~ 500 نانومتر إلى 1,600 نانومتر. ومع ذلك ، من 400 إلى 500 نانومتر ، تختلف منحنيات الامتصاص ، حيث يظهر Hale و Querry قيمة امتصاص أعلى عند الأطوال الموجية المنخفضة. قد يكون هذا الاختلاف بسبب الجسيمات الصغيرة المتبقية في الماء والتي سيكون لها تشتت أعلى بأطوال موجية أقصر مقارنة بالأطوال الموجيةالأطول 3 وقد تبطل افتراضات عدم التشتت في قياسات الامتصاص القائمة على قانون بير لامبرت.

التوصيف الطيفي للميلانين
تم تمييز الميلانين ، الممتص البصري الأساسي للبشرة ، بشكل طيفي باستخدام مسحوق الميلانين كعينة و DMSO كمذيب ومرجع. يحتوي الطيف الناتج على SNR 172 ومقارن ببيانات eumelanin من Sarna et al.21،22 و Crippa et al.23 (الشكل 5). الميلانين هو الصبغة الأساسية المسؤولة عن لون الجلد ، وبالتالي يوفر البيانات الأكثر دقة حول كيفية تأثير الميلانين على الأجهزة البصرية. يظهر الطيف الذي تم جمعه باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ارتباطا عاليا بقيم الأدبيات هذه.

التوصيف الطيفي لزيت الذرة
للتحقيق في طيف امتصاص الدهون ، تم اختيار زيت الذرة بسبب الحد الأدنى من تشتت البشرة البصرية عند مقارنته بالدهون الأخرى وتشابهه المعروف في التركيب الكيميائي للدهونالحيوانية 1. لأخذ طيف امتصاص زيت الذرة ، تم استخدام زيت الذرة كعينة مع الهواء كمرجع. كما هو موضح في الشكل 6 ، يحتوي طيف زيت الذرة على قمم مميزة عند حوالي 930 نانومتر و 1,210 نانومتر و 1,410 نانومتر. يحتوي طيف زيت الذرة الناتج على SNR يبلغ 10363.1 وتم تراكبه مع طيف زيت الذرة1 الخاص ب Cao et al. ، مما يدل على ارتباط قوي.

التوصيف الطيفي للهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج
في حين أن توصيف امتصاص الهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج هو أحد أهم المآثر في البصريات الطبية الحيوية ، إلا أن أطياف امتصاصها التي تمتد عبر VIS إلى SWIR لا تزال غير مفهومة جيدا. أحد أكثر الجوانب تحديا لتحديد طيف امتصاص الهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج في SWIR هو إزالة الماء في الدم ، مما يطغى على امتصاص الهيموجلوبين الصغير نسبيا. لفك تشابك امتصاص الهيموجلوبين والماء ، تم عزل الهيموجلوبين أولا من الدم البشري الكامل باستخدام الطرد المركزي وإزالة المادة الطافية واستبدالها بالماء المنزوع. تم استخدام الماء المنزوع أيضا كمرجع ومذيب أعيد تكوين الهيموجلوبين فيه لإحداث انفجار منخفض التوتر. كما هو موضح في الشكل 3 ، فإن الماء المنزوع يحتوي على امتصاص بصري أقل بكثير من الماء ، مما يجعله مذيبا مثاليا ومرجعا لقياسات امتصاص SWIR. يمتد طيف الهيموجلوبين المؤكسج الناتج من VIS إلى SWIR مع SNR 23118.7 ويطابق بشكل وثيق طيف الهيموجلوبين المؤكسج المنشور من Prahl4  (الشكل 7). في VIS ، يظهر طيف الهيموجلوبين المؤكسج امتصاصا عاليا مع قمم امتصاص مميزة عند حوالي 415 نانومتر وذروة مزدوجة من حوالي 540 إلى 575 نانومتر. في NIR ، يظهر طيف الهيموجلوبين المؤكسج ذروة مميزة تمتد على نطاق أوسع من الأطوال الموجية ، حوالي 800 نانومتر إلى 1,100 نانومتر. في SWIR ، يكون امتصاص الهيموجلوبين منخفضا. ومع ذلك ، من حوالي 1,400 نانومتر إلى 1,600 نانومتر ، يظهر طيف الهيموجلوبين امتصاصا أعلى مع القمم ، ويرجع ذلك على الأرجح إلى الماء الموجود في الهيموجلوبين الذي لم يكن من الممكن إزالته بالكامل أثناء عملية الطرد المركزي.

بالنسبة للهيموجلوبين غير المؤكسج ، تمت إضافة ثنائي ثيونيت الصوديوم إلى محلول الهيموجلوبين لإدخال تفكك ثنائي الأكسجين من الهيموجلوبين المؤكسج وتحويل العينة إلى هيموجلوبين غير مؤكسج. يحتوي الطيف الناتج على SNR 9813.9 وتم مقارنته مع طيف الهيموجلوبين غير المؤكسج لبرال ويظهر ارتباطا قويا جدا بين 400 نانومتر و 1,000 نانومتر4  (الشكل 8). يظهر طيف الهيموجلوبين غير المؤكسج الناتج قمم امتصاص مميزة عند حوالي 430 نانومتر و 560 نانومتر و 760 نانومتر. بعد ذلك ، ينخفض امتصاص الهيموجلوبين غير المؤكسج ولكنه يحتوي على قمم امتصاص أصغر حوالي 1,200 نانومتر ومن 1,400 نانومتر إلى 1,600 نانومتر. من المحتمل أن يكون الامتصاص بين 1,400 و 1,600 نانومتر بسبب الماء الذي لم تتم إزالته بالكامل من عينة الهيموجلوبين أثناء عملية الطرد المركزي.

مقارنة بين الامتصاصات البيولوجية من VIS-SWIR
تظهر أطياف VIS-SWIR الكاملة من جميع الماصات البيولوجية المميزة في هذا البروتوكول في الشكل 9 ، والتي تم قياسها بناء على تركيزها البيولوجي في الأنسجة2 ، والتي تسلط الضوء على الاختلافات الطيفية المميزة بين الماصات البيولوجية. على سبيل المثال ، يتمتع الميلانين والهيموجلوبين المؤكسج والهيموجلوبين غير المؤكسج بامتصاص قوي ومميز في VIS يتناقص بشكل عام مع الطول الموجي ، بينما يظهر الماء والدهون قمم مميزة في NIR و SWIR. في الأنسجة البيولوجية ، يوفر الجمع بين الانخفاض في الميلانين والهيموجلوبين وكذلك الانخفاض في التشتت البصري زيادة في عمق الاختراق البصري في NIR و SWIR. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح امتصاص الميلانين المنخفض ل NIR و SWIR التحقيق البصري للهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج والدهون والماء مع الحد الأدنى من التأثيرات بسبب تصبغ الجلد.

أطياف امتصاص الكروموفورات البيولوجية ، رسم بياني يقارن الميلانين ، HbO2 ، Hb ، الدهون ، الماء.
الشكل 1: أطياف منشورة سابقا من الماصات البيولوجية الشائعة عبر الأشعة فوق البنفسجية إلى SWIR. تم رسم أطياف الهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج باستخدام بيانات من Prahl4. تم رسم طيف الميلانين باستخدام بيانات من Sarna21 و Crippa23. تم رسم طيف الدهون باستخدام بيانات من فان فين24. تم رسم طيف المياه باستخدام بيانات من Hale و Querry20. الاختصار: SWIR = الأشعة تحت الحمراء قصيرة الموجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

عينة دم معملية في قارورة حمراء ، تحليل كيميائي حيوي ، إعداد تجربة البحث الطبي.
الشكل 2: صورة لحبيبات الخلايا الطافية وخلايا الدم الحمراء من الدم الكامل بالطرد المركزي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

أطياف امتصاص الماء في المقياس اللوغاريتمي مقابل الخطي ؛ رسم بياني يوضح أوبراين المياه المنزوعة.
الشكل 3: مقارنة طيف الامتصاص للماء والمياه المنزعة التي تم جمعها بإعدادات اكتساب متطابقة في مقياس الامتصاص اللوغاريتمي (يسار) والخطي (الأيمن). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرسم البياني لطيف امتصاص الماء Milli-Q ؛ مقارنة الطول الموجي مقابل الامتصاص ، التحليل الضوئي.
الشكل 4: مقارنة طيف امتصاص الماء المكتسب باستخدام الطرق الموضحة هنا مقابل Hale and Querry20. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

رسم بياني لطيف امتصاص الميلانين يقارن OBrien الميلانين بسارنا وكريبا eumelanin.
الشكل 5: مقارنة طيف امتصاص الميلانين المكتسب باستخدام الطرق الموضحة هنا مقابل Sarna et al.21،22 و Crippa et al.23. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

طيف امتصاص زيت الذرة مقابل بيريزين ، التحليل الطيفي ، الرسم البياني ، القياس البصري.
الشكل 6: مقارنة طيف امتصاص زيت الذرة المكتسب باستخدام الطرق الموضحة هنا مقابل Cao et al.1. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط طيف امتصاص الهيموجلوبين المؤكسج ؛ التحليل الطيفي؛ الطول الموجي مقابل الامتصاص.
الشكل 7: مقارنة طيف امتصاص الهيموجلوبين المؤكسج المكتسب باستخدام الطرق الموضحة هنا مقابل Prahl4. من المحتمل أن تعزى السمات الطيفية من 1,400 إلى 1,600 نانومتر إلى المياه المتبقية في العينة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

طيف امتصاص الهيموجلوبين غير المؤكسج; رسم بياني يقارن بيانات OBrien و Prahl (الطول الموجي مقابل الامتصاص).
الشكل 8: مقارنة طيف امتصاص الهيموجلوبين غير المؤكسج المكتسب باستخدام الطرق الموضحة هنا مقابل Prahl4. من المحتمل أن تعزى السمات الطيفية من 1,400 إلى 1,600 نانومتر إلى المياه المتبقية في العينة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرسم البياني لأطياف الامتصاص. الامتصاص البيولوجي Hb ، HbO₂ ، الميلانين. الطول الموجي مقابل الامتصاص.
الشكل 9: أطياف VIS-SWIR لامتصاصات بيولوجية شائعة. الاختصار: VIS-SWIR = الأشعة تحت الحمراء المرئية قصيرة الموجة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن استخدام البروتوكول (البروتوكولات) الموضحة في هذه المقالة للحصول على أطياف امتصاص VIS-SWIR للامتصاصات البيولوجية وعوامل التباين. هنا ، نعرض خطوات محددة للحصول على أطياف الماء والميلانين وزيت الذرة والهيموجلوبين المؤكسج والهيموجلوبين غير المؤكسج الذي يمتد من 400 نانومتر إلى 1,600 نانومتر. تغطي المناقشة التالية الخطوات الحاسمة ، ونصائح لتحسين القياس ، وقيود الطريقة ، وتطبيقات هذا البروتوكول في الطب الحيوي.

في حين أن جميع خطوات البروتوكول مهمة ، يجب اتباع بعض الخطوات الحاسمة للحصول على أطياف دقيقة مع هذا البروتوكول. أولا ، يجب أن تكون العينة غير مبعثرة. على سبيل المثال ، عند الحصول على الهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج من الدم ، يجب تصفية المشتتات الموجودة في العينة (هنا ، تم استخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر). عند تحضير الهيموجلوبين غير المؤكسج ، يجب ألا تتجاوز كمية ثنائي ثيونيت الصوديوم المضافة الوزن المقدم ، لأنها ستحول العينة إلى عكر بنسب وزن أعلى وتبطل متطلبات قانون Beer-Lambert.

ثانيا ، يجب استخدام الماء المنزوع كمذيب للعينة ومرجع للمواد المذابة القابلة للذوبان في الماء مثل الهيموجلوبين. في SWIR ، يكون امتصاص الماء قويا ويمكن أن يخفي الماصات الأخرى. ثالثا ، يجب الحصول على القياسات ضمن النطاق الخطي للكاشف ، والذي يعرف بأنه المنطقة التي يؤدي فيها التغيير في الفوتونات التي تصل إلى الكاشف إلى تغيير خطي في إشارة الكاشف. في حالة حدوث الحد الأدنى من الامتصاص ، قد يسجل الكاشف امتصاصا صفرا ، حتى لو كان هناك امتصاص. يحدث هذا عندما تكون العينة مخففة جدا ، ويكون وقت التعرض منخفضا جدا ، و / أو طول مسار الكوفيت قصيرا جدا ، ولكن يمكن علاجه عن طريق زيادة تركيز العينة ، وطول مسار الكوفيت ، و / أو وقت التعرض. وبالمثل ، في حالة حدوث امتصاص عال ، قد لا يسجل الكاشف أي فوتونات وينتج خطا مسطحا يسمى "التشبع" غير حساس للتغيرات في الامتصاص. يحدث هذا عندما تكون العينة مركزة للغاية ، ويكون وقت التعرض منخفضا جدا ، و / أو يكون طول المسار طويلا جدا ، ولكن يمكن إصلاحه عن طريق زيادة تركيز العينة ، وزيادة وقت التعرض ، و / أو تقليل طول مسار الكوفيت.

رابعا ، يجب أن تكون أجهزة الكشف المستخدمة خطية. إذا لم يكن من المؤكد ما إذا كان الكاشف يظهر استجابة خطية لعدد الفوتونات التي تصل إلى الكاشف ، فيمكن قياس التخفيفات المختلفة للعينة بنفس إعدادات الاستحواذ للتحقق مما إذا كانت قيم الامتصاص تظهر الاتجاه الخطي المتوقع بين الامتصاص والتركيز. بدلا من ذلك ، يمكن قياس عينة واحدة وزيادة وقت التعرض لاختبار ما إذا كانت هناك زيادة خطية في شدة الكاشف. يجب أن ينتج عن كلا الاختبارين علاقة خطية إذا كان المستخدم يعمل ضمن حدوده الخطية (انظر النقطة الحرجة الثالثة أعلاه).

خامسا ، للبقاء ضمن النطاق الخطي للكاشف للنطاق الطيفي VIS-SWIR بأكمله ، يجب تغيير تركيز العينة ، ووقت التعرض للكاشف ، و / أو طول مسار الكوفيت للمناطق الطيفية المختلفة ذات الامتصاص الأعلى أو الأقل بكثير من المنطقة الطيفية البدءية.

سادسا ، يجب خياطة الأطياف المكتسبة باستخدام تركيزات عينات مختلفة أو أطوال مسارات لمناطق طيفية مختلفة معا عن طريق القياس الخطي لمنطقة واحدة بناء على التغيرات المعروفة في التركيز أو طول المسار. بعد التحجيم ، يجب خياطة الأطياف معا بطول موجي متداخل بين المنطقتين. إذا كان القياس سيمتد إلى قياسات من كاشفات مختلفة ، فيجب أن تكون هناك أطياف امتصاص متداخلة تحتوي على الطول الموجي الانتقالي المطلوب للكاشف (يستخدم 800 نانومتر بشكل شائع عند خياطة مناطق UV-VIS و SWIR). يتم اقتطاع كل طيف عند الطول الموجي الانتقالي للكاشف ، ويتم اختيار طيف واحد ليشمل قيمة امتصاص انتقال الكاشف الأصلية. بعد ذلك ، يتم ربط الأطياف المقطوعة لإنشاء طيف ممدود واحد.

تتضمن النصائح الإضافية للحصول على أطياف امتصاص عالية الجودة استخدام طيف منشور سابقا للعينة محل الاهتمام ، حتى لو كان لا يغطي النطاق الطيفي الكامل المراد قياسه ، لتوجيه القياسات. بمعرفة نطاق الطول الموجي بأقل امتصاص مسبقا ، يمكن بدء القياسات في هذه المنطقة ذات أعلى عينة تركيز ثم تعديلها وتخفيفها من هناك. يمكن أن يساعد في تحديد عدد المناطق المنفصلة التي يجب قياسها بناء على حجم تغيرات الامتصاص المتوقعة. ويمكن أن يوفر أيضا الثقة في أن الطيف المتوقع قد تم الحصول عليه إذا كان يتطابق مع الأطياف المنشورة، أو إذا لم يتطابق مع الأطياف المنشورة، فيمكن إعادة فحص طريقة إعداد العينة جنبا إلى جنب مع المشكلات التي يمكن أن تشوه الطيف.

قد تتطلب أطياف الامتصاص معالجة لاحقة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام مرشح المتوسط المتحرك الرقمي لتسهيل قياسات الامتصاص ويمكن إزالة نقاط الخطأ المعروفة من خلال إصلاح مجموعة البيانات التي يتم فيها حذف النقاط الخاطئة ، ويتم إجراء الاستيفاء بين النقاط غير الخاطئة.

تشمل قيود هذه الطريقة عدم دقة العينات ذات التشتت البصري مثل الدم الكامل. لقياس الهيموجلوبين بدقة ، يتم تحلل عينة الدم ثم ترشيحها بالحقنة لإزالة معظم المكونات الخلوية المتبقية الأخرى التي تسبب التشتت البصري. وبالمثل ، لا يتم استخدام هذه الطريقة في الجسم الحي بسبب تشتت الأنسجة. في حين أن قياسات الامتصاص المستندة إلى قانون Beer-Lambert قد تكون مملة ويصعب إجراؤها في بعض الأحيان ، إلا أنها الطريقة القياسية الذهبية لقياسات الامتصاص البصري النقي. بالإضافة إلى ذلك ، تجعل بعض المذيبات من الصعب بشكل خاص الحصول على طيف امتصاص نقي لبعض المواد المذابة. على سبيل المثال ، المذيب الأصلي للهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج هو الماء ، لكن امتصاص الماء قوي في SWIR ، مما يهيمن على امتصاص الهيموجلوبين المؤكسج. لذلك ، نحاول إزالة الماء من الدم عن طريق الطرد المركزي المتكرر ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة التكوين بالماء المنزوع الذي يحتوي على امتصاص SWIR أضعف. يشتبه في أن أطياف الهيموجلوبين المؤكسجة وغير المؤكسجة الناتجة من دم الإنسان الكامل بالهيبارين تحتوي على امتصاص صغير متبقي بسبب امتصاص الماء من حوالي 1,300 نانومتر إلى 1,600 نانومتر كما هو موضح في الشكل 3. على الرغم من أنه من المحتمل ألا يكون فصلا مثاليا للماء عن الهيموجلوبين المؤكسج وغير المؤكسج ، إلا أننا نلاحظ محاذاة وثيقة مع أطياف الهيموجلوبين المؤكسجة وغير المؤكسجة المنشورة من 400 نانومتر إلى 1,000 نانومتر ونوسع الطيف بعدة مئات من النانومتر2،3.

ستساعد البروتوكولات الموضحة هنا الباحثين على توسيع مكتبات أطياف الامتصاص لتشمل أطياف VIS-SWIR لمجموعة من المكونات البيولوجية وعوامل التباين. يمكن استخدام هذه المعرفة لتحسين فهم علم الأحياء الأساسي وعلم وظائف الأعضاء من خلال التصوير الطبي الحيوي غير الجراحي والاستشعار بأطوال موجية أعمق مما تعمل عليه معظم الأنظمة حاليا. تعمل إضافة الأطوال الموجية SWIR على توسيع نوع مكونات الأنسجة التي يمكن مراقبتها بشكل غير جراحي ويمكن أن تفيد بتطوير المراقبة والتشخيص الجديدة. علاوة على ذلك ، يجب أن تساعد الأجهزة العاملة في NIR و SWIR في تقليل تحيز تصبغ الجلد الذي تم الإبلاغ عنه للأجهزة البصرية التي تعمل في نطاقات VIS و NIR وهي استراتيجية واعدة لإنشاء أجهزة طبية عادلة.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتمتع كريستين أوبراين وليونيد شمويلوفيتش بحصة ملكية مالية في شركة Armor Medical Inc. وقد تستفيد ماليا إذا نجحت الشركة في تسويق منتجاتها المتعلقة بهذا البحث.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم دعم هذا العمل من خلال منح من المعاهد الوطنية للصحة (NIH) R00HD103954 و R21EB035823. تم دعم البحث الوارد في هذا المنشور من قبل UL1TR002345 منحة معهد جامعة واشنطن للعلوم السريرية والانتقالية من المركز الوطني للعلوم الانتقالية (NCATS) التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH). المحتوى هو مسؤولية المؤلفين وحدهم ولا يمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة. يود المؤلفون أن يشعروا بالمساعدة المقدمة من أعضاء مختبر أوبراين ، ومايكل فاهي وأعضاء مختبره ، وهوانزهو جيانغ.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.22 وميكرو ؛ مرشحات حقنة قطرها MSigma-AldrichSLGPM33RS
1000 & L ماصةMillipore SigmaEP3124000121
200 & micro; L ماصةMillipore SigmaEP3124000083
أنابيب مخروطيةAvantor VWR21008-089
زيت الذرةHappy Bellyn / A48 أونصة سائلة
من أكسيد الديوتيريوممختبرات كامبريدج للنظائرDLM-4-100
أكسيد الديوتيريومسيجما ألدريتش7789-20-0
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجما ألدريتشD5879-1L
يمكن التخلص منها 1 مل حقنةBH مستلزماتBH1LL
إبرة يمكن التخلصمنها Atshuhut / Amazon66941
Freezer (-80 & deg; ج)فيشر ScientificIUE386FARK
أكواب زجاجيةMillipore SigmaCLS1000PACK
زجاج أو كوارتزسيجما ألدريتشZ802875-1EA700 & micro ؛ L حجم
الزجاج أو الكوارتز CuvettesThorlabsCV10Q35EPحجم 3500 مل
Heparinized HumanLampire7203710
أنابيب الطرد المركزيالدقيقة Costar3213
Micro Centrifuge - accuSpin Micro 17Fisher Scientific13-100-675
MilliQ WaterMillipore SigmaZMQSP0D01
OSRAM FCS 64640 150 واط 24 فولت HLX لمبة هالوجينأمازونB0001221DG
بارافيلمميليبور سيجماHS234526B
أطراف الماصةإيبندورف22492055
مسحوق الميلانين الاصطناعيسيجما ألدريتش8049-97-6
مقياسسارتوريوسUX-11976-09
ثيونيتالصوديومسيجما ألدريتش1065070500
Sonicatorفيشر CPX1800
Spatula Aozita000 00 0 0 1 2 3
UV / VIS / SWIR مقياس الطيف الضوئيعلى الإنترنت أنظمة الصكOlis Cary 14
WeighBoats Amazon  ؛ B07M5RMNPF
كوفيت ثنائي Scientific

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cao, Q., Zhegalova, N. G., Wang, S. T., Akers, W. J., Berezin, M. Y. Multispectral imaging in the extended near-infrared window based on endogenous chromophores. J Biomed Opt. 18 (10), 101318(2013).
  2. Yao, J., Wang, L. V. Sensitivity of photoacoustic microscopy. Photoacoustics. 2 (2), 87-101 (2014).
  3. Jacques, S. L. Optical properties of biological tissues: a review. Phys Med Biol. 58 (11), R37(2013).
  4. Prahl, S. A. Optical absorption of hemoglobin. , https://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
  5. Zhang, H., et al. Penetration depth of photons in biological tissues from hyperspectral imaging in shortwave infrared in transmission and reflection geometries. J Biomed Opt. 21 (12), 126006(2016).
  6. Du, T., et al. Hyperspectral imaging and characterization of allergic contact dermatitis in the short-wave infrared. J Biophotonics. 13 (9), e202000040(2020).
  7. Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Mueller, G. J. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J Biomed Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
  8. Kuenstner, J. T., Norris, K. H. Spectrophotometry of human hemoglobin in the near infrared region from 1000 to 2500 nm. J Near Infrared Spectrosc. 2 (2), 59-65 (1994).
  9. Smith, B. C. Spectral subtraction. , https://www.spectroscopyonline.com/view/spectral-subtraction (2021).
  10. Sjoding, M. W., Dickson, R. P., Iwashyna, T. J., Gay, S. E., Valley, T. S. Racial bias in pulse oximetry measurement. N Engl J Med. 383 (25), 2477-2478 (2020).
  11. Fawzy, A., et al. Racial and ethnic discrepancy in pulse oximetry and delayed identification of treatment eligibility among patients with COVID-19. JAMA Intern Med. 182 (7), 730-738 (2022).
  12. Sudat, S. E. K., et al. Racial disparities in pulse oximeter device inaccuracy and estimated clinical impact on COVID-19 treatment course. Am J Epidemiol. 192 (5), 703-713 (2023).
  13. Keller, M. D., Harrison-Smith, B., Patil, C., Arefin, M. S. Skin colour affects the accuracy of medical oxygen sensors. Nature. 610 (7932), 449-451 (2022).
  14. Butler, W. L. Absorption spectroscopy of biological materials. Methods Enzymol. 24, 3-25 (1972).
  15. Tang, J., et al. Calculation extinction cross sections and molar attenuation coefficient of small gold nanoparticles and experimental observation of their UV-vis spectral properties. Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 191, 513-520 (2018).
  16. Rossman, G. R. Optical spectroscopy. Rev Mineral Geochem. 78 (1), 371-398 (2014).
  17. Thimsen, E., Sadtler, B., Berezin, M. Y. Shortwave-infrared (SWIR) emitters for biological imaging: a review of challenges and opportunities. Nanophotonics. 6 (5), 1043-1054 (2017).
  18. Briely-Sabo, K., Bjornerud, A. Accurate de-oxygenation of ex-vivo whole blood using sodium dithionite. Proc Intl Sot Mag Reson Med. 8, 2025(2020).
  19. Skoog, D. A., Holler, F. J., Crouch, S. R. Principles of instrumental analysis. Cengage Leaning. , (2019).
  20. Hale, G. M., Querry, M. R. Optical constants of water in the 200-nm to 200-microm wavelength region. Appl Opt. 12 (3), 555-563 (1973).
  21. Sarna, T., Sealy, R. Photoinduced oxygen consumption in melanin systems. Action spectra and quantum yields for eumelanin and synthetic melanin. Photochem Photobiol. 39 (1), 69-74 (1984).
  22. Nordlund, J. J., et al. The physical properties of melanins. The pigmentary system: Physiology and pathophysiology. , Blackwell Publishing Ltd. 311-341 (2006).
  23. Crippa, P., Cristofoletti, V., Romeo, N. A band model for melanin deduced from optical absorption and photoconductivity experiments. Biochim Biophys Acta. 538 (1), 164-170 (1978).
  24. van Veen, R., et al. Determination of visible near-IR absorption coefficients of mammalian fat using time- and spatially resolved diffuse reflectance and transmission spectroscopy. J Biomed Opt. 10 (5), 054004(2005).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة