يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الفحص الكمي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل لقياس إشارات القنفذ الصوتي في النموذج الخلوي لتكوين التدباب

1.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67407

⸱

يناير 31, 2025

 , 
1CellBio Lab, Institute of Health Sciences, Presidency University

في هذه المقالة

ملخص

توضح الدراسة فحصا كميا قائما على تفاعل البوليميراز المتسلسل لتنشيط مسار إشارات القنفذ الصوتي (SHH) بوساطة الأهداب الأولية باستخدام ناهض SHH في نموذج خلوي لتكوين الأهداب.

الملخص

يشير الاعتلال الهدبي إلى مجموعة من الأمراض والاضطرابات البشرية متعددة الأجهزة ومتعددة الجينات التي تنشأ بسبب انحراف في بنية أو وظيفة الأهداب المتحركة أو غير المتحركة (الأولية) التي هي نتوءات خلوية قائمة على الأنابيب الدقيقة. توجد الأهداب الأولية (PC) في معظم الأنسجة الظهارية والبطانية البشرية وتعمل كمحور لنقل الإشارات الفسيولوجية ، بما في ذلك إشارات Sonic Hedgehog (SHH). تتطلب المواقف المختلفة فحص وظيفة الكمبيوتر الشخصي ، والتي يمكن تحقيقها عن طريق قياس مسار إشارات SHH المتعارف عليه بشكل حصري تقريبا بواسطة الكمبيوتر الشخصي. هنا ، تم تطوير تقنية تعتمد على PCR الكمي (qPCR) لقياس مستوى النسخ لجينات مسار SHH في خلايا hTERT-RPE1 الهادئة (أو RPE1) التي تحتوي في الغالب على PC. يتم تحقيق الهدوء في خلايا RPE1 عن طريق تجويع المصل لمدة 48 ساعة ، بينما يتم تعزيز تنشيط مسار SHH بواسطة ناهض معين. هذا الاختبار القائم على زراعة الخلايا سهل المتابعة وحساس. يشير العرض الناجح لهذا الاختبار في خلايا RPE1 المهدبة إلى إمكاناته الهائلة كمقايسة في المختبر لفحص الوظيفة المناسبة للكمبيوتر الشخصي عند التغيير الجيني أو اللاجيني لجين واحد أو عدة جينات ، والتي قد تكون مرتبطة باعتلالات هدبية مختلفة.

المقدمة

الأهداب عبارة عن نتوء قائم على الأنابيب الدقيقة ومغلف بالغشاء من سطح الخلية ، والذي يتم تجميعه على جسم قاعدي1. في الفقاريات ، لوحظ نوعان من الأهداب ، وهما الحركة وغير المتحركة. توجد الأهداب المتحركة في الأنسجة المتخصصة وتمنح الحركة. توجد الأهداب الأولية غير المتحركة (PC) في معظم الخلايا الفقارية ، وتؤدي وظائف حسية وتنقل الإشارات الحرجة من البيئة خارج الخلية إلى داخل الخلايا2. بمجرد تجميعها ، يتم مساعدة الاستطالة الهدبية من خلال آلات النقل داخل السوط (IFT) ، وهي عبارة عن نظام نقل ثنائي الاتجاه يحمل البضائع مدفوعة بالحركيات (الحركة الأمامية) والبروتينات الحركية dynein-II (الحركة الرجعية) 3،4. قد تؤدي العيوب الهيكلية أو الوظيفية في الأهداب المتحركة أو الأولية إلى عدد كبير من الأمراض البشرية متعددة الأجهزة التي تعرف مجتمعة باسم الاعتلال الهدبي5،6.

يعمل الكمبيوتر الشخصي كمحور لعمليات الإشارات التنموية المختلفة ، مثل Wingless (Wnt) ، والمستقبلات المقترنة بالبروتين G (GPCR) ، ومستقبلات التيروزين كينازات (RTKs) ، وتحويل عامل النمو β (TGFβ) ، وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) الذي يشيرإلى 7،8. في الثدييات ، تعد إشارات Sonic Hedgehog (SHH) إشارة حرجة ، والتي يتم نقلها بشكل حصري تقريبا بواسطة الكمبيوتر الشخصي في الخلايا التي تحتوي على PC9،10،11. يؤدي الهيكل أو الوظيفة الشاذة للكمبيوتر الشخصي إلى تضعيف مسارات الإشارات المرتبطة بأمراض مثل عيوب القلب الخلقية ، وأمراض الكلى المتعددة الكيسات ، والتشوهات القحفية الوجهية ، وضمور الشبكية ، وبعض الأمراض النادرة مثل متلازمة بارديت بيدل (BBS) ، ومتلازمة جوبيرت (JBTS) ، ومتلازمة ألستروم ، وخلل التنسج الصدري الخانق (JATD) 12،13،14،15. معظم هذه الأمراض متعددة الجينات في الأنسجة الظهارية أو البطانية ، مما يجعل التحديات في التشخيص المبكر والعلاج لهذه الأمراض. إن تحديد كيفية مساهمة هذه الطفرات في الإشارات المخففة بوساطة الكمبيوتر في نموذج زراعة الخلية قد لا يوفر نظرة ثاقبة للتعقيد الجزيئي لمسار الإشارات هذا فحسب ، بل يسهل أيضا تشخيص الاعتلال الهدبي المختلفة وقد يقترح تدخلات علاجية. مع هذه الفكرة ، تم تطوير مقايسة كمية تستند إلى PCR (qPCR) لتحديد التغيير في مسار إشارات SHH بوساطة الكمبيوتر الشخصي في الخلايا الظهارية الصبغية الصبغية للشبكية الخليدة من التيلوميراز البشري (hTERT-RPE1 ، المشار إليها هنا باسم RPE1). خلايا RPE1 هي خلايا بشرية شبه ثنائية الصبغيات وغير محولة تستخدم على نطاق واسع كنموذج خلوي لتكوين الأهداب حيث أن ما يقرب من 75٪ -80٪ من هذه الخلايا تجمع PC عند تجويع المصل (احتضان الخلايا في وسط خال من المصل) لمدة 24-48 ساعة ، مقارنة ب 15٪ -18٪ فقط من الهدبة في ثقافة متنامية بشكل غير متزامن لخلايا RPE116.

يتم حفظ إشارات القنفذ (HH) بين الفقاريات من أجل التطور الجنيني17. في الثدييات ، شوهدت ثلاثة أنواع مختلفة من إشارات القنفذ: سونيك (SHH) ، هندي (IHH) ، وصحراء (DHH) ، والتي تظهر SHH و IHH وظائف متداخلة على مستوى الأنسجة11. تلعب إشارات SHH أدوارا رئيسية أثناء التطور الجنيني من خلال تنظيم زخرفة الأطراف ومواصفات نوع الخلية في الجهاز العصبي والحفاظ على توازن الأنسجة البالغة10،11،18. على الرغم من أن إشارات SHH معقدة ، إلا أن هناك أدلة متزايدة تشير إلى أن إشارات SHH الكنسية تعتمد على PC7،11،19 ، والتي تتوسط فيها الوظائف الجماعية لعوامل نسخ Gli (Gli1 و Gli2 و Gli3). لقد تم اقتراح أن إشارات HH والكمبيوتر الشخصي قد تطورا معا ، مع تركيز مكونات الإشارات الحرجة في الحجم المضغوط عند طرف الأهداب لتمكين الاستجابات الفعالة لنسب الترابط المنخفضة11.

في حالة عدم وجود روابط SHH ، فإن Patched1 (Ptch1) ، المترجمة على غشاء الكمبيوتر الشخصي ، يمنع نشاط Smoothened (Smo) من خلال آلية غير مفهومة جيدا والتي من المحتمل أن تنطوي على نقل الدهون ، وبالتالي الحفاظ على المسار مكبوت7،20. يضمن GPR161 الهدبي النشط بشكل أساسي ، وهو مستقبل بروتين مقترن ب G ومنظم سلبي للنظام ، الحفاظ على القمع من خلال الحفاظ على مستويات عالية من AMP الدوري الهدبي (cAMP) الذي يزيد من نشاط بروتين كيناز A (PKA) 21 ، ومن خلال الحفاظ على التوطين الهدبي ل PKA7. نشاط PKA ، جنبا إلى جنب مع الكازين كيناز 1 (CK1) وسينسيز الجليكوجين سينسيز كيناز 3 β (GSK3β) ، يفسفري بقايا متعددة من بروتينات Gli ، Gli2 و Gli3 ، داخل الكمبيوتر. يمكن أن يعمل Gli2 و Gli3 كمنشطين ومثبطين لنسخ الجينات المستهدفة. تتسبب الفسفرة بوساطة PKA في تثبيط وظيفة المنشط ل Gli2 ، بينما يتم شق Gli3 الفسفوري بواسطة البروتياز لإنتاج شكل مثبط Gli3R22. بشكل عام ، يتم قمع التعبير عن الجينات المستهدفة SHH في مثل هذه الظروف.

عندما يكون ترابط SHH موجودا ، يرتبط به Ptch1 ، ويترك GPR161 PC ، و SMO ، الذي يتم فسفرته بواسطة مستقبلات G المقترنة بالبروتين (GPCR) كيناز 2 (GPRK2) و CK1 ، يتم تهريبه إلى الكمبيوتر الشخصي ، جنبا إلى جنب مع β-arrestin ومحرك الأنابيب الدقيقة KIF3A23. في الحفلة الموسيقية ، يتم تعزيز توطين Gli2 / 3 ، وقامع الصهر (SUFU) ، و Kif7 عند الطرف الهدبي ويرتبط بانخفاض انقسام Gli2 / 3 ، وبالتالي زيادة وظيفة المنشط ل Gli2 / 324،25. بمجرد تنشيطه ، يحفز Gli2 / 3 التعبير عن Gli1 ، والذي يمكن أن يعمل فقط كمنشط ، وبالتالي يضخم استجابة مسار SHH22. يتم تسهيل ارتباط SHH ب Ptch1 من خلال الجينات المسرطنة (CDO) المرتبطة ب CAM / التقليل من التنظيم بواسطة الجينات المسرطنة (CDO) ، شقيق CDO (BOC) ، وتوقف النمو المحدد 1 (GAS1) ، والبروتين 2 المرتبط بمستقبلات البروتين الدهني منخفض الكثافة (LRP2). على العكس من ذلك ، يمكن للبروتين المتفاعل مع القنفذ (HHIP) عزل SHH من خلال التفاعل المباشر معه ويتنافس أيضا مع Ptch1 من التفاعل مع SHH26. الأهم من ذلك ، يتم نسخ GLI1 و HHIP و PTCH1 عند تنشيط مسار SHH ، بينما يشارك الأخيران في التنظيم السلبي لمسار SHH.

أظهرت الدراسات السابقة أنه يمكن قياس مستويات النسخ لجينات SHH المستهدفة لتقييم مسار SHH ، على الرغم من أنه قد يختلف اختلافا كبيرا في أنواع الخلايا المختلفة27،28. يمكن أن يعزى هذا الاختلاف في استجابة مسار SHH إلى مجموعات مختلفة من إشارات SHH بوساطة الكمبيوتر وإشارات SHH التي يتم بوساطة غشاء الخلية ، على الأرجح في حالة عدم وجود PC. SAG هو ناهض Smo يستخدم في هذه الطريقة لتقليد تنشيط إشارات SHH في خلايا RPE1 المتعطشة للمصل والتي تكون مهدبة بشكل كبير. تم قياس مستويات النسخ للجينات المستهدفة SHH مثل HHIP و GLI1 و PTCH1 والجين غير المستهدف SMO باستخدام qPCR في الخلايا الضابطة والمعالجة ب SAG ومقارنتها لتحديد تنشيط مسار SHH. يشير العرض الناجح لهذا الاختبار الحساس القائم على زراعة الخلايا لقياس إشارات SHH بوساطة الكمبيوتر إلى تطبيقه الواعد في البحوث الطبية الحيوية المرتبطة بوظيفة الأهداب الأولية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا

  1. قم بتمرير قارورة ثقافة خلايا T-25 شبه ملتقية من خلايا RPE1 عند تخفيف 1: 5 من المزرعة الأصلية إلى قارورة ثقافة خلية T-25 جديدة تحتوي على 5 مل من وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) مكمل بمصل الأبقار الجنيني 10٪ (FBS) ، مزيج البنسلين والستربتومايسين 1٪ (التركيز النهائي - 100 وحدة / مل بنسلين G و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين). يشار إلى هذه الوسيلة باسم الوسيط الكامل. تنمو الخلايا عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
    ملاحظة: خلايا RPE1 هي خلايا غير محولة تستخدم بشكل شائع لدراسة التنظيم الجزيئي لتجميع الكمبيوتر الشخصي وتفكيكه في زراعة الخلايا. يقوم ما يقرب من 80٪ من خلايا RPE1 بتجميع الكمبيوتر الشخصي عند تجويع المصل ، والذي يتم تفكيكه مرة أخرى عند إعادة إضافة المصل16.
  2. قم بإعداد الغطاء الزجاجي المستدير مقاس 12 مم عن طريق احتضانه في 50 مل من 1 نيوتن حمض الهيدروكلوريك في دورق زجاجي مغطى طوال الليل دون اهتزاز عند 60 درجة مئوية في حمام مائي أو حاضنة.
  3. في اليوم التالي، باستخدام ماصة سعة 25 مل، أخرج الماصة المحلول الحمضي وتخلص منه بشكل صحيح في حاوية خطر كيميائية. بعد ذلك ، اغسل الغطاء 3 مرات في 100 مل من الماء المقطر عن طريق الحضانة لمدة 15 دقيقة مع الرج العرضي ، متبوعا بسحب العينات.
  4. كرر خطوات الغسيل بنسبة 70٪ إيثانول و 95٪ إيثانول. جفف أغطية الغطاء عن طريق وضعها بشكل فردي على ورق نشاف مختبر في خزانة السلامة الحيوية. بمجرد التجفيف ، قم بتعقيمه بالأشعة فوق البنفسجية لمدة 60 دقيقة.

2. نمو الخلايا ، تجويع المصل ، وعلاج SAG

  1. أعد تعليق الخلايا في قارورة T-25 في وسط كامل تم تسخينه مسبقا بعد إزاحة الخلايا عن طريق النشاط الأنزيمي لمحلول Trypsin-EDTA الدافئ مسبقا. حدد كثافة خلية المعلق عن طريق عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم.
  2. قم بإعداد طبقين لزراعة الخلايا مقاس 35 مم وضع غطاءين معقمين مقاس 12 مم في كل منهما. مرور 2 × 105 خلايا RPE1 تنمو بشكل غير متزامن في كل طبق 35 مم يحتوي على أغطية وتنمو الخلايا في 2 مل من الوسط الكامل لمدة 24 ساعة.
  3. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة وسط خلايا RPE1 النامية واغسل الخلايا 1x باستخدام 1 مل من المخزن المؤقت DPBS المسخن مسبقا. أضف 2 مل من وسائط DMEM الدافئة مسبقا التي تحتوي على 1٪ بنسلين - ستربتومايسين ولكنها خالية من FBS (وسط خال من المصل) إلى كل طبق واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في وجود 5٪ CO2.
  4. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسط بالوسط الخالي من المصل الذي يحتوي إما على SAG بتركيز نهائي يبلغ 250 نانومتر أو DMSO كمذيب تحكم واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. يظهر مخطط كرتوني لبروتوكول زراعة الخلايا في الشكل 1 أ.

3. جمع الخلايا

  1. انقل الغطاء إلى صفيحة 24 بئرا مع غطاء واحد في كل بئر. أضف 0.5 مل من الميثانول المبرد إلى كل بئر واحتضن اللوحة عند -20 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتثبيت الخلايا على الغطاء. بعد ذلك مباشرة ، اغسل أغطية 3x مع 0.5 مل من مخزن الغسيل المؤقت (1x PBS يحتوي على 0.5 ملي مولار MgCl2 و 0.05٪ Triton-X 100).
  2. تخلص من الوسائط وأضف 0.5 مل من كاشف التریزول مباشرة إلى كل طبق. اتركه يوزع بالتساوي ويحتفظ به لمدة 5 دقائق. ماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات لعمل خليط متجانس وتجميعه في أنابيب طرد مركزي دقيقة خالية من النوكلياز سعة 1.5 مل.

4. تحضير الحمض النووي الريبي الكلي والحمض النووي (كدنا)

  1. أضف 0.1 مل من الكلوروفورم إلى كل أنبوب يحتوي على خلايا محللة واحتضنه لمدة 2-3 دقائق. جهاز طرد مركزي لكل عينة لمدة 15 دقيقة عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية. نقل المرحلة المائية التي تحتوي على الحمض النووي الريبي إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة.
  2. أضف 0.25 مل من الأيزوبروبانول إلى المرحلة المائية واحتضنه لمدة 10 دقائق. جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 12,000 × جم عند 4 درجات مئوية. يشكل راسب الحمض النووي الريبي حبيبات بيضاء تشبه الهلام. باستخدام ماصة دقيقة، تخلص من المادة الطافية.
  3. أعد تعليق حبيبات الحمض النووي الريبي في 0.5 مل من الإيثانول المخفف حديثا بنسبة 75٪. قم بتدوير العينات لفترة وجيزة ، ثم جهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 7500 × جم عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة.
  4. جفف حبيبات الحمض النووي الريبي في الهواء لمدة 10 دقائق وأعد تعليقها في 25 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز. حدد تركيز الحمض النووي الريبي الكلي عن طريق قياس الامتصاص عند 260 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي الصغير.
  5. استخدم 1-3 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي من كلتا العينتين لتحضير الحمض النووي (cDNA) باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة توليف (كدنا). قم بتخزين cDNA عند -20 درجة مئوية.

5. تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي

  1. اضبط تفاعلات qPCR (في ثلاث نسخ ، الجدول 1) باستخدام 1: 5 cDNA المخفف من كل عينة مع مجموعات أولية من GLI1 و PTCH1 و HHIP و SMO و β-ACTIN (كجين التدبير المنزلي ؛ الجدول 2) الجينات التي تحتوي على مزيج رئيسي qPCR يحتوي على بوليميراز الحمض النووي المناسب ، و dNTPs ، والمخزن المؤقت ، في لوحة PCR مناسبة متعددة الآبار وحساسة للتألق.
  2. قم بتغطية اللوحة بمادة مانعة للتسرب مناسبة ، وضعها في أداة qPCR مناسبة ، وقم بتشغيل برنامج qPCR موحد مع 40 دورة تضخيم وخطوة تحليل منحنى الانصهار في نهاية البرنامج. يظهر برنامج qPCR القياسي المكون من 40 دورة ، بما في ذلك تحليل منحنى الانصهار ، بشكل تخطيطي في الشكل 1 ب.
  3. عند اكتمال برنامج qPCR ، تحقق من منحنى الذوبان لكل أمبليكون للحصول على ذروة واحدة عند درجة الحرارة المطلوبة.
    ملاحظة: في نهاية دورات التضخيم ، يقيس تحليل منحنى الذوبان المرتبط درجة حرارة انصهار الأمبليكون عن طريق زيادة درجة حرارة كل بئر من 65 درجة مئوية إلى 95 درجة مئوية ، مع زيادة قدرها 0.5 درجة مئوية لكل خطوة مدتها 5 ثوان.
  4. قم بتصدير بيانات التضخيم إلى جدول بيانات واحسب التعبير النسبي (طريقة 2−ΔΔCT) لكل نسخة عن طريق التطبيع مقابل جين β-ACTIN لكل عينة. ارسم الرسم البياني واحسب الدلالة الإحصائية للتغيرات في التعبير النسبي لكل نسخة باستخدام اختبار T غير متزاوج.

6. التلوين المناعي واكتساب الصور باستخدام الفحص المجهري الفلوري

  1. احتضان الخلايا الثابتة على الغطاء في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (2٪ BSA و 0.1٪ TritonX-100 في 1x PBS) لمدة 30 دقيقة.
  2. احتضان الخلايا بمزيج من الأجسام المضادة الأولية (عادة ما تكون مضادة للفأر ضد α توبولين الأسيتيل من أكسونيم PC والأجسام المضادة للأرانب ضد الغشاء الهدبي والمركزي ، على التوالي) المخففة في المخزن المؤقت المانع (انظر جدول المواد للتخفيف النهائي) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية في غرفة رطبة.
    1. اصنع غرفة مرطبة عن طريق وضع منشفة ورقية مبللة في النصف السفلي من صندوق طرف ماصة فارغ سعة 1 مل. ضع شريطا من الفيلم الشفاف على سطح الرف وحدد قطرة (20-25 ميكرولتر) من محلول الجسم المضاد على الفيلم ، واحدة لكل غطاء ليتم احتضانه. ضع غطاء على القطرات بحيث يتم غمر الخلايا ، وأغلق غطاء صندوق الطرف.
  3. في اليوم التالي ، اقلب الغطاء مرة أخرى وأعده إلى الطبق المكون من 24 بئرا. اغسل الأغطية بمخزن الغسيل المؤقت ثم احتضنها في 150 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الثانوية مع تخفيف موحد مسبقا للأجسام المضادة (هنا ، مضاد للفأر المترافق بالصبغة الفلورية الخضراء ومضاد للأرانب المترافق بالصبغة الحمراء الفلورية المخفف في المخزن المؤقت للحجب ) وكواشف تلطيخ الحمض النووي النووي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأغطية 3x.
  4. اكتشف قطرة (حوالي 3-5 ميكرولتر) من محلول التركيب الذي يحتوي على كاشف مضاد للبهتان على شريحة مجهر زجاجي. ضع غطاء ، بحيث يكون جانب الخلية متجها لأسفل ، على محلول التثبيت. امسح السائل الزائد بالضغط برفق على منديل نظيف. ضعي طلاء الأظافر الشفاف على طول حافة الغطاء لإغلاقه على الشريحة.
  5. ضع شريحة على المجهر (انظر جدول المواد) مرفقة بمرحلة آلية وكاميرا قادرة على التصوير الرقمي. استخدم هدف غمر زيت Plan Apo 60x (بفتحة عددية 1.4) للحصول على صور خلايا RPE1 المتعطشة للمصل في درجة الحرارة المحيطة ، لتصور الكمبيوتر الشخصي في الخلايا ، كما هو موضح بالأجسام المضادة المذكورة.
  6. احصل على صور للعينات المختلفة على أغطية منفصلة باستخدام وقت التعرض المتطابق للفلوروفورات المختلفة على طول المحور Z باستخدام حزمة برامج التصوير المجهري الرقمي. احسب عدد الخلايا المحتوية على الكمبيوتر الشخصي من 500 خلية على الأقل لتحديد النسبة المئوية للهدب في حالة 48 ساعة من الجوع للمصل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يعد تنشيط مسار نقل إشارة SHH بوساطة الكمبيوتر طريقة لفهم الوظيفة المناسبة للكمبيوترالشخصي 7. هنا ، يتم قياس التعبير النسبي للجينات المستهدفة لمسار SHH باستخدام اختبار RT-qPCR عند التنشيط بوساطة SAG لمسار SHH في خلايا RPE1 التي تكون في الغالب مهدبة. كثيرا ما يتم استخدام مخرجات النسخ المباشرة لمسار SHH GLI1 و PTCH1 لقياس نشاط هذا المسار11. يتضمن هذا البروتوكول أيضا نسخة HHIP ، والتي ينظمها مسار SHH. نظرا لأن SMO ليس هدفا مباشرا لمسار SHH ، فلا ينبغي أن يتغير مستوى نسخ SMO مع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعد فحص وظائف الكمبيوتر خطوة حاسمة نحو فهم ديناميكيات الهدبة والأمراض أو الاضطرابات المرتبطة بالخلل الوظيفي في الكمبيوتر. بصرف النظر عن فحص الهدبة عن طريق التلوين المناعي للعلامات الهدبية أو المكونات الهيكلية الهدبية الموسومة بالفلوروفور ، يتم تحديد وظيفة الكمبيوتر بشكل شائع عن طريق فحص تنشيط مسار SHH المتعارف عليه عن طريق قياس الإزاحة الهدبية ل Smo في الأنسجة والخلايا باستخدام الفحص المجهري الفلوري27،31. يكتشف الاختبار المستند إ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يتم دعم هذا العمل من خلال زمالة Ramalingaswami إلى SM من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية (DBT) ، حكومة الهند ، ومنحة بحثية من مجلس أبحاث العلوم والهندسة (SERB) ، حكومة الهند إلى SM (CRG / 2020 / 004042). ترعى زمالة PH من قبل لجنة المنح الجامعية (UGC) ، حكومة الهند. يتقدم المؤلفون بخالص الشكر للدكتور تشاندراما موخيرجي والسيد أفيك موخيرجي من مختبر RNABio التابع لمعهد العلوم الصحية بجامعة الرئاسة للوصول إلى أداة qPCR والتدريب على الأداة على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMSO ،معقم مصفى SigmaD2650
، مضاد للفأر IgG (H + L) Alexa Fluor 488ThermoFisher ScientificA21202
Donkey ، مضاد للأرانب IgG (H + L) Alexa Fluor 568ThermoFisher ScientificA10042
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco ، ThermoFisher Scientific41965039
Dulbecco's محلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS)Gibco ، ThermoFisher Scientific14190144
مصل الأبقار الجنينية (FBS)HimediaRM1112
مجهر فلوري مزود بهدف 60XCarl Zeiss & nbsp ؛Axio مراقب colibri 5
خلايا hTERT-RPE1ATCCCRL-4000
iScript cDNA Synthesis KitBio-Rad Laboratories1708891
Mouse ، أحادي النسيلة المضاد للتوبولين المضاد للأسيتيلMilipore Sigma-AldrichT7451التخفيف النهائي 1: 1000
البنسلين الستربتومايسين ، 100XGibco ، ThermoFisher Scientific15140122
آلة PCR Quantitaive ، CFX 96Bio-Rad Laboratories
Rabbit ، الأجسام المضادة Arl13B متعددة النسيلةProteinTech17711-1-APالتخفيف النهائي 1:250
أرنب ، الجسم المضاد متعدد النسيلة Cep135ProteinTech24428-1-APالتخفيف النهائي 1:500
SlowFade الذهب المضاد للتلاشيThermoFisher ScientificS36940
Smoothened ناهض (SAG) AbmoleM4865محلول المخزون: في DMSO ، 5 ملي
مولار SsoAdvanced Universal SYBR Green SupermixBio-Rad Laboratories1725271
TRIzol ReagentInvitrogen15596026
TrypLEGibco و ThermoFisher Scientific12605028
حمار

المراجع

  1. Nigg, E. A., Raff, J. W. Centrioles, centrosomes, and cilia in health and disease. Cell. 139 (4), 663-678 (2009).
  2. Halder, P., Khatun, S., Majumder, S. Freeing the brake: Proliferation needs primary cilium to disassemble. J Biosci. 45, 117(2020).
  3. Eguether, T., Cordelieres, F. P., Pazour, G. J. Intraflagellar transport is deeply integrated in hedgehog signaling. Mol Biol Cell. 29 (10), 1178-1189 (2018).
  4. Ishikawa, H., Marshall, W. F. Intraflagellar transport and ciliary dynamics. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (3), a021998(2017).
  5. Hildebrandt, F., Benzing, T., Katsanis, N. Ciliopathies. N Engl J Med. 364 (16), 1533-1543 (2011).
  6. Reiter, J. F., Leroux, M. R. Genes and molecular pathways underpinning ciliopathies. Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 533-547 (2017).
  7. Hilgendorf, K. I., Myers, B. R., Reiter, J. F. Emerging mechanistic understanding of cilia function in cellular signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (7), 555-573 (2024).
  8. Bansal, R., et al. Hedgehog pathway activation alters ciliary signaling in primary hypothalamic cultures. Front Cell Neurosci. 13, 266(2019).
  9. Gigante, E. D., Caspary, T. Signaling in the primary cilium through the lens of the hedgehog pathway. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 9 (6), e377(2020).
  10. Anvarian, Z., Mykytyn, K., Mukhopadhyay, S., Pedersen, L. B., Christensen, S. T. Cellular signalling by primary cilia in development, organ function and disease. Nat Rev Nephrol. 15 (4), 199-219 (2019).
  11. Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian hedgehog signaling. Cold Spring Harb Perspect Biol. 9 (5), a028175(2017).
  12. Brown, J. M., Witman, G. B. Cilia and diseases. Bioscience. 64 (12), 1126-1137 (2014).
  13. Hanaki, K., et al. Alstrom syndrome: A review focusing on its diverse clinical manifestations and their etiology as a ciliopathy. Yonago Acta Med. 67 (2), 93-99 (2024).
  14. Merrill, A. E., et al. Ciliary abnormalities due to defects in the retrograde transport protein dync2h1 in short-rib polydactyly syndrome. Am J Hum Genet. 84 (4), 542-549 (2009).
  15. Dagoneau, N., et al. Dync2h1 mutations cause asphyxiating thoracic dystrophy and short rib-polydactyly syndrome, type iii. Am J Hum Genet. 84 (5), 706-711 (2009).
  16. Majumder, S., Fisk, H. A. Vdac3 and mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12 (5), 849-858 (2013).
  17. Briscoe, J., Therond, P. P. The mechanisms of hedgehog signalling and its roles in development and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (7), 416-429 (2013).
  18. Placzek, M., Briscoe, J. Sonic hedgehog in vertebrate neural tube development. Int J Dev Biol. 62 (1-2-3), 225-234 (2018).
  19. Wong, S. Y., et al. Primary cilia can both mediate and suppress hedgehog pathway-dependent tumorigenesis. Nat Med. 15 (9), 1055-1061 (2009).
  20. Deshpande, I., et al. Smoothened stimulation by membrane sterols drives hedgehog pathway activity. Nature. 571 (7764), 284-288 (2019).
  21. Mukhopadhyay, S., et al. The ciliary g-protein-coupled receptor gpr161 negatively regulates the sonic hedgehog pathway via camp signaling. Cell. 152 (1-2), 210-223 (2013).
  22. Niewiadomski, P., et al. Gli protein activity is controlled by multisite phosphorylation in vertebrate hedgehog signaling. Cell Rep. 6 (1), 168-181 (2014).
  23. Kovacs, J. J., et al. Beta-arrestin-mediated localization of smoothened to the primary cilium. Science. 320 (5884), 1777-1781 (2008).
  24. He, M., et al. The kinesin-4 protein kif7 regulates mammalian hedgehog signalling by organizing the cilium tip compartment. Nat Cell Biol. 16 (7), 663-672 (2014).
  25. Wen, X., et al. Kinetics of hedgehog-dependent full-length gli3 accumulation in primary cilia and subsequent degradation. Mol Cell Biol. 30 (8), 1910-1922 (2010).
  26. Griffiths, S. C., et al. Hedgehog-interacting protein is a multimodal antagonist of hedgehog signalling. Nat Commun. 12 (1), 7171(2021).
  27. Gomez, A. E., Christman, A. K., Van De Weghe, J. C., Finn, M., Doherty, D. Systematic analysis of cilia characteristics and hedgehog signaling in five immortal cell lines. PLoS One. 17 (12), e0266433(2022).
  28. Schmidt, S., et al. Primary cilia and shh signaling impairments in human and mouse models of parkinson's disease. Nat Commun. 13 (1), 4819(2022).
  29. Dutta, A., et al. Increase in primary cilia number and length upon vdac1 depletion contributes to attenuated proliferation of cancer cells. Exp Cell Res. 429 (2), 113671(2023).
  30. De, K., et al. Hyperphosphorylation of cdh1 in glioblastoma cancer stem cells attenuates apc/c(cdh1) activity and pharmacologic inhibition of apc/c(cdh1/cdc20) compromises viability. Mol Cancer Res. 17 (7), 1519-1530 (2019).
  31. Yang, S., Zheng, X. The immunofluorescence-based detection of hedgehog pathway components in primary cilia of cultured cells. Methods Mol Biol. 2374, 89-94 (2022).
  32. Wang, W., et al. The mir-669a-5p/g3bp/hdac6/akap12 axis regulates primary cilia length. Adv Sci (Weinh). 11 (6), e2305068(2024).
  33. Alanazi, A., et al. Identifying the roles of mir-17 in ciliogenesis and cell cycle. Front Cell Dev Biol. 12, 1397931(2024).
  34. Bustin, S. A., et al. The miqe guidelines: Minimum information for publication of quantitative real-time pcr experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

RPE1 Smoothened RNA
الفحص الكمي القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل لقياس إشارات القنفذ الصوتي في النموذج الخلوي لتكوين التدباب
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.