مقالة منهجية

التحصين النشط لتحفيز الوهن العضلي الوبيل للعضلات المناعية الذاتية (MuSK) في الفئران

DOI:

10.3791/67408

⸱

يوليو 3, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Aziz Sancar Institute of Experimental Medicine, Istanbul University, 2Department of Immunology, Hellenic Pasteur Institute

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة بروتوكولا شاملا لنموذج فأر تجريبي للوهن العضلي الوبيل من كيناز العضلات المناعية الذاتية (MuSK) ، والذي يهدف إلى التحقيق في الفيزيولوجيا المرضية والاستراتيجيات العلاجية المحتملة للمرض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الوهن العضلي الوبيل (MG) هو اضطراب مناعي ذاتي يؤثر على الوصلة العصبية العضلية. في حين أن معظم مرضى MG ينتجون أجساما مضادة ذاتية ضد مستقبلات الأسيتيل كولين (AChR) ، فإن مجموعة فرعية من المرضى تظهر أجساما مضادة ذاتية تستهدف كيناز العضلات (MuSK). يتميز MuSK MG بضعف شديد في العضلات ، ومظاهر سريرية مقاومة للعلاج ، وأزمات الوهن العضلي ، وغالبا ما تتطلب التهوية الميكانيكية. وبالتالي ، يحتاج المرضى في كثير من الأحيان إلى استخدام مثبطات المناعة لفترات طويلة ، والتي ترتبط بآثار ضارة طويلة الأجل. نظرا لشدة وندرة MuSK-MG ، فإن تطوير نموذج حيواني تجريبي أمر بالغ الأهمية لتطوير طرق علاج جديدة وفهم أعمق لآليات الفيزيولوجيا المرضية الأساسية. يعمل الوهن العضلي الوبيل المناعي الذاتي التجريبي (EAMG) كنموذج حيواني ل MuSK-MG ، حيث يحاكي بشكل فعال ولكن جزئيا السمات السريرية والمناعية ل MG البشري. يمكن تحقيق تحريض النماذج الحيوانية المناعية الذاتية من خلال التحصين النشط أو السلبي. في البروتوكول التجريبي المقدم هنا ، تم استخدام التحصين النشط عن طريق إدارة المجال خارج الخلية المنقى تحت الجلد ل MuSK البشري المستحلب في مساعد فرويند الكامل مع المتفطرة السلية المقتولة بالحرارة. تم إجراء التحصين في أربعة مواقع ، تلاه حقنة معززة من MuSK في اليوم الثامن والعشرين. يتيح هذا العامل المساعد مع M. tuberculosis تنشيط الجهاز المناعي من خلال TLR4 وتعزيز البلعمة للمستضد المعطا. توضح هذه المقالة بالتفصيل بشكل شامل تطوير وتوصيف MuSK-EAMG من البداية إلى النهاية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الوهن العضلي الوبيل (MG) هو مرض مناعي ذاتي يتطور من خلال آليات تعتمد على الخلايا التائية بوساطة الأجسام المضادة. وهو ناتج بشكل أساسي عن الأجسام المضادة ضد مستقبلات أستيل كولين النيكوتين (AChR) على الغشاء ما بعد المشبكي للوصلة العصبية العضلية (NMJ) في 80٪ -85٪ من المرضى ، والأجسام المضادة ضد كيناز العضلات (MuSK) في حوالي 5٪ من المرضى بالإضافة إلى بروتينات NMJ الأخرى. أصبح MG نموذجا أوليا لاضطرابات المناعة الذاتية ونموذجا لفهم وظيفة ما بعد المشبكي1. يمكن تقسيم النماذج الحيوانية لاضطرابات المناعة الذاتية إلى فئتين رئيسيتين: (1) النماذج العفوية ، التي تصاب فيها بشكل طبيعي بمرض المناعة الذاتية ، و (2) النماذج المستحثة ، حيث يتم محاكاة مرض المناعة الذاتية وتكراره بشكل مصطنع. أظهرت الدراسات التي أجريت على الوهن العضلي الوبيل (MG) أن كلا من التحصين النشط والسلبي يمكن أن يحفز المرض ، مما يساهم بشكل كبير في فهم الحالات بوساطة الأجسامالمضادة 2.

النقل السلبي هو طريقة فعالة للغاية لتقييم الآثار الحادة للأمراض بوساطة الأجسام المضادة الذاتية وقد تم استخدامه على نطاق واسع لدراسة الأجسام المضادة المشتقة من المريض في MG. كان هذا النهج مفيدا في توسيع فهم العوامل المناعية الكامنة وراء المرض. على سبيل المثال ، أظهرت دراسات النقل السلبي التأثير الممرض ل IgG4 المضاد ل MuSK على تقليل مجموعات AChR3. ومع ذلك ، هناك بعض القيود على نموذج النقل السلبي ، مثل الاختلافات الوظيفية بين الإنسان والقوارض IgG والجهاز المناعي وعدم كفاية نموذج النقل السلبي لتقليد آليات التنشيط الأولية للمناعة الذاتية المضادة ل MuSK التي تحدث في الأنسجة اللمفاوية.

من ناحية أخرى ، فإن التقييد المحتمل لدراسات التحصين هو التباين المناعي بين سلالات الفئرانالمختلفة 4. على سبيل المثال ، في حين أن الفئران C57BL / 6 (B6) عرضة للتحصين النشط باستخدام AChR ، فإن الفئران AKR / J مقاومة. لذلك ، عند إنشاء نموذج حيواني EAMG ، من الضروري تحديد الأنواع الحيوانية بشكل صحيح وطريقة التحصين ومحتوى البروتوكول ليعكس المرضبدقة 5.

بالإضافة إلى ذلك ، غالبا ما يؤدي استخدام المستضد المستهدف كبروتين كامل إلى ارتفاع عيارات الأجسام المضادة. ومع ذلك ، قد لا تتفاعل جميع الأجسام المضادة مع مستضد الفأر أو تنتج حواتم مسببة للأمراض. لذلك ، لا تعكس نماذج التحصين النشطة دائما بدقة علم الأمراض البشري. ومع ذلك ، عندما تنجح هذه النماذج في إنشاء نمط ظاهري سريري وفسيولوجي مناسب ، توفر منصة طويلة الأجل لاختبار العلاجات التجريبية.

تشير الدراسات السريرية إلى آليات المرض المتباينة والمتطلبات العلاجية ل MuSK-MG ، مما يسلط الضوء على الحاجة إلى مزيد من التحديد للسمات المسببة للأمراض المحددة لهذا النوع الفرعي MG4،5،6. أظهرت دراسات MuSK EAMG النشطة السابقة القائمة على التحصين مشاركة سائدة لمناعة نوع Th2 ومضاد للفأر IgG1 في المناعة الذاتية MuSK وحددت عددا من طرق العلاج المحتملة (على سبيل المثال ، تيريفلونوميد ، الخلايا الجذعية الوسيطة ، FCRLB shRNA) ل MuSK MGالبشري 7،8،9. أظهر هذا أهمية نموذج MuSK EAMG في اختبار أهداف علاجية جديدة والتحقيق في الفيزيولوجيا المرضية MuSK MG.

في هذه المقالة ، تم تفصيل إجراءات تحفيز النموذج الحيواني ، ومراقبة تطور المرض ، والتحقق من صحة تحريض EAMG. تضمن التقييم السريري مراقبة الوزن والموقف وقوة القبضة والنتائج السريرية من قبل مراقب. تم القتل الرحيم للفئران بعد 28 يوما من التحصين الثاني ، وتم جمع أنسجة مختلفة ، بما في ذلك الدم وعضلات الأطراف الخلفية والطحال والغدد الليمفاوية الإبطية والإربية ، لتأكيد إنشاء المرض. تم قياس الأجسام المضادة ل MuSK في الأمصال باستخدام طريقة ELISA. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء تلطيخ الفلورسنت المناعي على أنسجة العضلات لتصور الرواسب عند التقاطع العصبي العضلي. لإثبات ومقارنة الاستجابات السريرية والمناعية في مجموعات الفئران ذات القابلية المختلفة للإصابة ب MuSK EAMG ، أظهرت الفئران التي عولجت ب KCNS3 shRNA تأثيرا مسبكا للالتهابات (غير منشور) ، وأظهر FCRLB shRNA تأثيرا مضاداللالتهابات 9 ، كما هو محدد في الدراسات السابقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على البروتوكول من قبل لجنة الأخلاقيات المحلية للتجارب على بجامعة اسطنبول (HADYEK) بالقرار رقم 2020/29. في دراساتنا السابقة7،8،9 ، تم تحفيز نموذج EAMG في فئران BALB / c أو B6 البالغة من العمر 8-10 أسابيع عن طريق التحصين النشط ببروتين MuSK. تقدم هذه المقالة بيانات نموذجية تم الحصول عليها من تجارب مختلفة باستخدام فئران BALB / C المحصنة ب MuSK (4-8 فئران لكل مجموعة). الكواشف والمعدات المستخدمة مدرجة في جدول المواد.

1. إنتاج وإعداد MuSK البشري للتحصين

  1. استنساخ الأحماض الأمينية خارج الخلية في مجال MuSK البشري 24-495 (التسلسل المرجعي NCBI: NP_005583.1) في ناقل pPIC9.
  2. يفرز التعبير في الخميرة Pichia pastoris (سلالة GS115) النظام.
  3. تحفيز التعبير عن طريق إضافة الميثانول (2.5٪ حجم / حجم) في وسط النمو.
  4. أضف علامة C-terminal 6xHIS لأغراض التنقية.
  5. عبر عن البروتين كبروتين جليكوزيل مفرز وتنقيته في ظل الظروف المحلية. غسيل الكلى وسط المزرعة مقابل 50 ملي مولار من الفوسفات المخزن الهيدروجيني 8.0 ، 300 ملي كلوريد الصوديوم.
  6. استمر في كروماتوغرافيا تقارب أيون النيكل باستخدام Ni2 + / nitrilotriaceetate agarose (Ni-NTA). قم بتخزين البروتين المنقى بعد إضافة 10٪ جلسرين عند -80 درجة مئوية ، حيث يكون مستقرا لمدة عامين على الأقل10.
    ملاحظة: مستويات التعبير ، المقدرة بعد تنقية Ni-NTA ، هي حوالي 0.4 مجم / لتر ثقافة. لم يتم الكشف عن أي شوائب بروتينية أخرى في العينات التي تم تحليلها بواسطة SDS-PAGE.
  7. قبل التحصين ، تحقق من نقاء المجال خارج الخلية المعزول لبروتين MuSK عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام (الشكل التكميلي 1).
  8. قم بإعداد MuSK لكل فأرة بتركيز 45 ميكروغرام/100 ميكرولتر PBS.
  9. تجانس (استحلاب) MuSK بنسبة 1: 1 مع PBS (100 ميكرولتر) ومساعد فرويند الكامل (CFA-100 ميكرولتر) الذي يحتوي على المتفطرة السلية H37Ra (10 مجم / 10 مل) (الحجم الإجمالي للمستحلب 200 ميكرولتر لكل فأر).

2. إجراء التخدير والتحصين

  1. قبل التحصين ، قم بتخفيف البروبوفول في PBS (نسبة 1: 5).
  2. يتم تطبيق داخل الصفاق بمعدل 50 ملغم/كغ لكل فأر.
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام الأيزوفلوران للتخدير عن طريق الاستنشاق (باتباع البروتوكولات المعتمدة من المؤسسة). عادة ما يتم ضبط التركيز الأولي على 3٪ -5٪ بمعدل تدفق أكسجين يبلغ 1-2 لتر / دقيقة ، بينما يكون تركيز الصيانة عادة 1٪ -3٪ مع معدل تدفق أكسجين يبلغ 0.5-1 لتر / دقيقة.
  3. التحصين الأول: حقن ما مجموعه 45 ميكروغرام / 200 ميكرولتر من MuSK المحضر في CFA تحت الجلد في الكتفين والكفوف الخلفية الداخلية (حوالي 11.25 ميكروغرام / 50 ميكرولتر لكل جزء).
  4. التحصين الثاني: حقن ما مجموعه 45 ميكروغرام / 200 ميكرولتر من MuSK المحضر في CFA تحت الجلد في الكتفين والوركين (حوالي 11.25 ميكروغرام / 50 ميكرولتر لكل جزء).
    ملاحظة: قم بإعطاء الحقن مرتين بفاصل 28 يوما لإنشاء النموذج. يرتبط الإعطاء العضلي بألم العضلات ، مما قد يتداخل مع تقييم الضعف السريري. نظرا لأن EAMG هو مرض عضلي ، فإن استخدام الحقن العضلي قد يؤدي إلى ضعف غير وهن عضلي مرتبط بالألم وبالتالي يكون بمثابة مربك. يوصى بمجموعة ضابطة محصنة ب CFA فقط (بدون MuSK).

3. التسجيل السريري

  1. قم بتمرين الفئران عن طريق سحبها برفق 40 مرة عبر الشبكة العلوية للقفص أثناء محاولتها الإمساك بالشبكة للحث على التعب ، حيث تصبح أعراض الوهن العضلي الوبيل في الفئران أكثر وضوحا بعد التمرين والتعب.
  2. بعد التمرين ، راقب الفئران بعناية بحثا عن التغيرات في النشاط والوزن وقوة العضلات. قم بتعيين الدرجات المناسبة بناء على هذه الملاحظات لتوجيه معايير التقييم.
    ملاحظة: النتيجة 0: تظل الفئران نشطة وتستمر في استكشاف بيئتها. النتيجة 1: لوحظت وضعية منحنية بعد التمرين ، لكن الفئران تعود إلى النشاط الطبيعي والتواصل الاجتماعي. يتم الحفاظ على الاستمالة الفراء بشكل عام. النتيجة 2: تكون الوضعية المنحنية مرئية حتى قبل التمرين وتصبح أكثر وضوحا بعد التمرين. لوحظ انخفاض في الاستمالة الذاتية والنشاط. النتيجة 3: لوحظ وضعية منحنية دراماتيكية قبل التمرين وبعده. هناك انخفاض كبير في الحركة والتواصل الاجتماعي وقوة العضلات ، مصحوبا بفقدان الوزن بمقدار 1-2 جرام كل 2-3 أيام. يحدث الجفاف ، مما يجعل من الصعب على الفئران الوصول إلى الماء والطعام. يتم التعرف على الجفاف من خلال عدم عودة الجلد بسرعة بعد الضغط والتغيرات في البراز. تتميز الفئران التي تعاني من الألم بالتحديق والوضعية المنحنية. يتم التضحية بالفئران التي تظهر عليها علامات الألم الشديد وفقدان الوزن الذي يزيد عن 20٪. النتيجة 4: تم العثور على الفأر ميتا في القفص. يجب إزالة الفأر المتوفى على الفور ، ويجب تغيير القفص5.
  3. افحص الفئران يوميا حيث تطورت الأعراض بسرعة بعد حوالي 10 أيام من التطعيم الثاني. قم بإجراء التسجيلات والقياسات السريرية أسبوعيا لأول 28 يوما ثم مرتين في الأسبوع.
  4. إجراء قياس الوزن.
    ملاحظة: يوفر قياس الوزن معلمة حاسمة لتتبع تطور المرض. نظرا لارتفاع معدلات الأيض للفئران ، يمكن أن يختلف وزن الجسم بشكل كبير. من المهم استخدام نفس المقياس لجميع القياسات وإجراء هذه القياسات في نفس الوقت من اليوم من أجل الاتساق.
  5. إجراء قياس قوة العضلات. استخدم مقياس ديناميكي أفقي بسلك شبكي لقياس قوة العضلات.
    1. قم بتمرين الفئران للتسجيل السريري عن طريق سحبها برفق فوق القفص 40 مرة للحث على التعب.
    2. ضع كل فأر على الفور على شبكة مقياس الدينامومتر واسحبه برفق من الذيل ، مع التأكد من أن جميع الكفوف تمسك بالشبكة بإحكام. ضع في اعتبارك فقط القياسات التي تمسك فيها الفئران بالشبكة بالكفوف الأربعة.
      ملاحظة: حاول تطبيق قدر متساو من القوة أثناء كل قياس ، ويوصى بأن يقوم نفس الباحث بإجراء جميع القياسات للحفاظ على الموثوقية وتقليل التباين. نظرا لأن الإرهاق هو السمة المميزة لضعف MG ، يجب إجراء سلسلة من اختبارات قوة القبضة دون قياس قوة القبضة. بعد ذلك ، تم إجراء سبعة قياسات لكل فأر ، وتم تجاهل القيم القصوى والدنيا يتم حساب متوسط القياسات الخمسة المتبقية لضمان نتائج موثوقة.

4. تحضير عينة الأنسجة

ملاحظة: التضحية بالفئران بعد 28 يوما من التحصين الثاني باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا. سيكون جمع الدم والعضلات والطحال والغدد الليمفاوية من الفئران المضحية مفيدا لمزيد من التحقيقات.

  1. جمع الدم القلبي
    ملاحظة: لجمع دم القلب ، قم بتخدير الفئران باستخدام مخدر مناسب (على سبيل المثال ، بروبوفول) معتمد من قبل اللجنة الأخلاقية. يتطلب ثقب القلب تخديرا وهو إجراء نهائي ، مما يعني أنه يجب القتل الرحيم للحيوانات بعد ذلك مباشرة.
    1. بعد تخدير الجرذ بعمق ، ضعه على ظهره ، وافتح البطن ، وحدد موقع القلب ، على بعد حوالي 1 سم فوق الضلع السفلي وقليلا إلى اليمين.
    2. باستخدام إبرة 25-35 جم ، اسحب الدم بعناية من البطين الأيسر بزاوية 45 درجة دون تحريك المحقنة لتجنب المضاعفات11.
    3. نقل عينات الدم إلى أنابيب جافة لفصل المصل و / أو إلى أنابيب EDTA لعزل الحمض النووي الريبي - إذا كان مخططا.
    4. افصل المصل عن طريق الطرد المركزي واحتفظ بعينات المصل عند -20 درجة مئوية حتى يتم استخدامه.
  2. الحفاظ على عينة العضلات وتحضيرها
    1. جمع عضلة الظنبوب الأمامية11،12،13. اشطفها باستخدام PBS المثلج.
    2. ضع العينات في أنابيب التبريد ، واغمسها على الفور في الأيزوبنتان السائل المبرد بالنيتروجين عند -20 درجة مئوية ، واحفظها في فريزر -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: يجب تجميد العينات للحصول على نتائج أكثر دقة في التجارب.
    3. ضع الأنسجة عموديا على حامل التقسيم ؛ يمكن استخدام الفلين. قم بتضمين العينات لتلوين التألق المناعي في OCT (مركب درجة حرارة القطع الأمثل).
    4. اسمح للأنسجة بالطفو على الأيزوبنتان المبرد بالنيتروجين السائل. يحفظ في فريزر -80 درجة مئوية حتى يتم تقسيمه باستخدام بريدوستات.

5. تقييم الوصلات العصبية العضلية عن طريق وضع العلامات على التألق المناعي

  1. تقسيم وتثبيت Cryostat
    1. قم بتقسيم الأنسجة المجمدة المضمنة في OCT عند -24 درجة مئوية إلى سمك 7 ميكرومتر باستخدام ناظم البرد.
    2. إصلاح الأقسام في الأسيتون المبردة إلى -20 درجة مئوية. يغسل مع PBS لمدة 5 دقائق.
    3. اغسل مرة أخرى PBS الذي يحتوي على 0.4٪ Triton X (PBS-T) لمدة 10 دقائق.
      ملاحظة: يمكن تنفيذ خطوة النفاذية لتصحيح تشكل الجزيئات المتأثرة بالتثبيت ، مما يضمن ارتباطا أكثر دقة. تضمنت النفاذية العلاج باستخدام PBS الذي يحتوي على 1٪ FBS لمدة 10 دقائق و PBS-T لمدة 10 دقائق أخرى.
    4. قم بحظر الأقسام التي تحتوي على PBS-T التي تحتوي على 10٪ FBS لمدة 30 دقيقة لمنع الارتباط غير المحدد.
  2. تلطيخ التألق المناعي
    ملاحظة: بالنسبة للتلطيخ ، يمكن استخدام الأجسام المضادة التالية: C3 ، IgG ، علامة مستقبلات الأسيتيل كولين α-bungarotoxin.
    1. تمييع الأجسام المضادة المختارة في PBS-T التي تحتوي على 1٪ FBS.
    2. احتضن في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2.5 ساعة.
    3. اغسل الأقسام باستخدام PBS-T التي تحتوي على 1٪ FBS.
    4. Counterstain مع DAPI.
    5. قم بتخزين الأقسام حتى الفحص تحت المجهر الفلوري في بيئة مظلمة ورطبة عند 4 درجات مئوية.
    6. إجراء التصوير والتحليل.
      ملاحظة: يجب حساب الوصلات العصبية العضلية الإيجابية ل Bungarotoxin (BTX) في كل قسم باستخدام المجهر الفلوري. التقط الصور بتكبير 20 ضعفا. للتحليل ، تم حساب التقاطعات العصبية العضلية الإيجابية ل BTX و C3 أو IgG يدويا تحت المجهر. يجب استخدام النسبة المئوية للوصلات الموجبة المزدوجة بالنسبة إلى إجمالي التقاطعات المسماة ب BTX في المقاطع التسلسلية للتحليل.

6. اللطخة الغربية

  1. عزل البروتين وقياسه الكمي
    1. استخدم عينات العضلات المجمدة بشكل مفاجئ.
    2. تحضير عازلة التحلل بمثبطات البروتياز والفوسفاتيز.
    3. أضف حبات أكسيد الزركونيوم 0.5 مم تساوي وزن العينة و 2 ضعف حجم المخزن المؤقت للتحلل.
    4. تجانس العينات باستخدام الخالط.
    5. تعمل أجهزة الطرد المركزي على محلول 12,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    6. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على محللات البروتين.
    7. استخدم مجموعة مقايسة BCA أو كاشف برادفورد لتحديد تركيز البروتين.
    8. تحضير عينات البروتين إلى التركيز المطلوب باستخدام عازلة التحلل. 25 ميكروغرام من البروتين لكل بئر فعال لإظهار AChR.
  2. الرحلان الكهربائي للهلام SDS-PAGE
    1. امزج عينات البروتين مع 4x Laemmli buffer.
    2. سخني العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتمسخ الطبيعة.
    3. قم بتحميل كميات متساوية من البروتين وسلم البروتين في آبار جل SDS-PAGE.
    4. قم بتشغيل الجل عند 200 فولت لمدة 30 دقيقة (قد يختلف الوقت بين مصادر الطاقة المختلفة).
  3. نقل البروتين
    1. للنقل شبه الجاف باستخدام غشاء النيتروسليلوز ، بلل كل مكون بمخزن مؤقت للنقل البارد.
    2. قم بإعداد شطيرة النقل: الإسفنج ، ورق الترشيح ، الجل ، الغشاء ، ورق الترشيح ، الإسفنج.
      ملاحظة: تأكد من عدم وجود فقاعات بين الطبقات. يجب اختيار برنامج النقل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
  4. حجب وحضانة الأجسام المضادة
    1. قم بسد الغشاء في 5٪ حليب جاف خالي الدسم أو BSA في TBST لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف.
    2. احتضان الغشاء بالجسم المضاد الأولي (المضاد ل AChR) المخفف في 2.5٪ مانع مانع طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع هزاز لطيف.
    3. اغسل الغشاء 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما في TBST.
    4. احتضان الغشاء بجسم مضاد ثانوي مترافق ب HRP (IgG HRP) مخفف في مخزن مؤقت مانع بنسبة 2.5٪ لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
    5. اغسل الغشاء 3 مرات لمدة 10 دقائق لكل منهما في TBST.
  5. الكشف والتصوير
    1. ضع ركيزة ECL على الغشاء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
    2. التقط إشارة الإضاءةالكيميائي باستخدام نظام التصوير.
    3. تحليل العصابات باستخدام برامج التصوير.
      ملاحظة: احتفظ دائما بالبروتينات والكواشف على الجليد لمنع التدهور. تأكد من التحميل المتساوي عن طريق تشغيل بروتين التدبير المنزلي (على سبيل المثال ، بيتا أكتين أو ألفا توبولين أو GAPDH) كعنصر تحكم. تحسين تركيزات الأجسام المضادة وأوقات الحضانة للحصول على أفضل النتائج. يعد إظهار أن بروتين AChR أقل تعبيرا في الفئران المحصنة ب MuSK أمرا بالغ الأهمية.

7. محلية الصنع المضادة ل MuSK IgG ELISA

  1. تحضير مستضد MuSK بتركيز 0.5 ميكروغرام لكل بئر في 100 ميكرولتر من عازلة بيكربونات الكربونات (طلاء اللوحة).
  2. قم بتوزيع 100 ميكرولتر من محلول المستضد في كل بئر من لوحة المقايسة المناعية.
  3. احتضان الطبق طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  4. اغسل الطبق باستخدام PBS الذي يحتوي على 0.5٪ Tween 20 (محلول الغسيل).
  5. احتضان اللوحة باستخدام PBS الذي يحتوي على 5٪ FBS (محلول حظر) لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية لمنع مواقع الربط غير المحددة (الحظر).
  6. نظرا لأن دراسات التحسين أظهرت مستويات عالية من MuSK-IgG ، قم بتخفيف عينات المصل 1 / 50،000 في محلول الحظر.
  7. بدون غسل بعد الانسداد ، أضف عينات المصل المخففة إلى الآبار.
  8. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  9. اغسل الطبق ثلاث مرات بمحلول الغسيل.
  10. تمييع الجسم المضاد الثانوي IgG المترافق HRP (ab97023) 1/5000 في محلول الحظر.
  11. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المخفف إلى كل بئر.
  12. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  13. اغسل الطبق ثلاث مرات بمحلول الغسيل.
  14. أضف 100 ميكرولتر من ركيزة TMB إلى كل بئر ولاحظ تغير اللون.
  15. أوقف التفاعل في الوقت المناسب باستخدام 2 M H2SO4.
  16. قم بقياس الكثافة البصرية عند 450 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
  17. قم بإجراء جميع العينات في نسخ مكررة وعلى نفس اللوحة من أجل الاتساق.
    ملاحظة: ينبغي استخدام قيم الكثافة البصرية للتحليل حيث لم تكن هناك تخفيفات عينة قياسية. يجب ألا يكون هناك تغيير في اللون في آبار التحكم السلبية (فارغة). من المتوقع حدوث تغيير سريع في اللون ، لذلك يجب الاحتفاظ بمحلول التوقف في مكان قريب لإيقاف التفاعل في الآبار على الفور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عند تقييم والتحقق من صحة نموذج الوهن العضلي الوبيل المناعي الذاتي التجريبي (EAMG) من MuSK ، تعد العديد من المعلمات الرئيسية والنتائج التجريبية حاسمة لإثبات التحريض الناجح وتوصيف نموذج المرض. فيما يلي النتائج التمثيلية التي تؤكد إنشاء نموذج MuSK EAMG.

التهديف السريري
تتم مراقبة الفئران وتسجيلها بحثا عن الأعراض السريرية للوهن العضلي الوبيل باستخدام نظام تسجيل سريري موحد. يتضمن هذا التسجيل تقييم قوة العضلات والموقف والحالة البدنية العامة. تؤكد الزيادة في الدرجات السريرية بمرور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحاكي Murine MuSK-EAMG MuSK-MG البشري في كل من جوانبه السريرية والممرضة للمناعة من حيث ضعف العضلات ، وفقدان الوزن بسبب ضعف العضلات البصلية ، والأجسام المضادة المضادة ل MuSK المنتشرة ، وانخفاض AChR في العضلات. بالنسبة للمعالم والجدول الزمني المتوقع لنموذج MuSK-EAMG هذا ، يجب أن تظهر العلامات السريرية لضعف العضلات خلال الأسبوع الأول بعد التحصين الثاني. قد تظهر على ما يقرب من 5٪ من الفئران علامات المرض بعد التحصين الأول. ومن المتوقع أن يكون معدل انتشار EAMG بنسبة >70٪ (على الأقل من الدرجة 1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لا توجد إفصاحات للإعلان.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نعرب عن تقديرنا لدعم ومساهمات معهد العلوم الصحية بجامعة اسطنبول ومعهد عزيز سانجار للطب التجريبي في إكمال هذا البحث.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
125I-α-bungarotoxinInvitrogenBTX T1175
2-MethylbutaneSigma-AldrichM32631
40 & mu; م مصفاة الخليةNEST258369
96 بئر Maxisorp لوحةSigma-AldrichM9410
مساعد غير مكتملBecton Dickinson & Co. & nbsp ؛263910
مكافحة AChR alfa1 AlomoneANC-001
المضادة للفأر IgG HRPAbcamab97023
Bullet Blender StormNext AdvanceTissue homogenizer
C3NovusNB200-540G
Carbonate-Bicarbonate BufferMerckC3041
CryostatLeicaCM1860   ؛
مقياس الدينامومتر Imada DST-50NMuromachiMK380Si
مجهر مضانLeicaDM4M
حقنة زجاجية مع قفل لورISOLAB094.92.005
IgGAbcamab96871
مقياس ضوئي دقيق ، طقم جراحي للفأر Multiskan FCThermo Scientific51119000
كينت الكوربوريشن العلميINSMOUSEKIT
المتفطرة السلية H37RaBecton Dickinson & Co. 231141
علمية من مركب OCT
، 1 ملBecton Dickinson & Co.   ؛309625
المحاقن ، 2 ملB. Braun7389
Universal Animal RetrainerMerckZ756911-1EA
WesternBright Sirius-Western طقم الكشف عن النشافAdvanstaK-12043-D10ECL
محاقن AGR1180

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Keesey, J. A. A history of treatments for myasthenia gravis. Semin Neurol. 24, 5-16 (2004).
  2. Giannoccaro, M. P., Wright, S. K., Vincent, A. In vivo mechanisms of antibody-mediated neurological disorders: Animal models and potential implications. Front Neurol. 10, 1394(2020).
  3. Verschuuren, J. J. G. M., Plomp, J. J. Passive transfer models of myasthenia gravis with muscle-specific kinase antibodies. Ann N Y Acad Sci. 1413 (1), 111-118 (2018).
  4. Berman, P. W., Patrick, J. Linkage between the frequency of muscular weakness and loci that regulate immune responsiveness in murine experimental myasthenia gravis. J Exp Med. 152 (3), 507-520 (1980).
  5. Kusner, L. L., et al. Guidelines for pre-clinical assessment of the acetylcholine receptor-specific passive transfer myasthenia gravis model-recommendations for methods and experimental designs. Exp Neurol. 270, 3-10 (2015).
  6. Koneczny, I., et al. IgG4 autoantibodies in organ-specific autoimmunopathies: Reviewing class switching, antibody-producing cells, and specific immunotherapies. Front Immunol. 13, 834342(2022).
  7. Ulusoy, C., et al. Dental follicle mesenchymal stem cell administration ameliorates muscle weakness in MuSK-immunized mice. J Neuroinflammation. 12, 231(2015).
  8. Yilmaz, V., et al. Effects of teriflunomide on B cell subsets in MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis and multiple sclerosis. Immunol Invest. 50 (6), 671-684 (2021).
  9. Koral, G., et al. Silencing of Fcrlb by shRNA ameliorates MuSK-induced EAMG in mice. J Neuroimmunol. 383, 578195(2023).
  10. Trakas, N., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. J. Development of a highly sensitive diagnostic assay for muscle-specific tyrosine kinase (MuSK) autoantibodies in myasthenia gravis. J Neuroimmunol. 240-241, 79-86 (2011).
  11. JoVE, Science Education Database. Blood withdrawal I. JoVE Sci Educ. , (2023).
  12. Peretti, A. L., et al. Action of vanillin (Vanilla planifolia) on the morphology of tibialis anterior and soleus muscles after nerve injury. Einstein (Sao Paulo). 15 (2), 186-191 (2017).
  13. Van Der Meulen, J. H., Kuipers, H., Stassen, F. R., Keizer, H. A., Van Der Vusse, G. J. High energy phosphates and related compounds, glycogen levels and histology in the rat tibialis anterior muscle after forced lengthening and isometric exercise. Pflugers Arch. 420 (3-4), 354-358 (1992).
  14. Kucukerden, M., et al. MuSK-induced experimental autoimmune myasthenia gravis does not require IgG1 antibody to MuSK. J Neuroimmunol. 295-296, 84-92 (2016).
  15. Ulusoy, C., et al. Preferential production of IgG1, IL-4 and IL-10 in MuSK-immunized mice. Clin Immunol. 151 (2), 155-163 (2014).
  16. Mori, S., et al. Antibodies against muscle-specific kinase impair both presynaptic and postsynaptic functions in a murine model of myasthenia gravis. Am J Pathol. 180 (2), 798-810 (2012).
  17. Wu, B., Goluszko, E., Huda, R., Tuzun, E., Christadoss, P. Experimental autoimmune myasthenia gravis in the mouse. Curr Protoc Immunol. Chapter 15, Unit 15.23. , (2011).
  18. Klooster, R., et al. Muscle-specific kinase myasthenia gravis IgG4 autoantibodies cause severe neuromuscular junction dysfunction in mice. Brain. 135 (Pt 4), 1081-1101 (2012).
  19. Vergoossen, D. L. E., et al. Functional monovalency amplifies the pathogenicity of anti-MuSK IgG4 in myasthenia gravis. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (13), e2020635118(2021).
  20. Oh, S., et al. Precision targeting of autoantigen-specific B cells in muscle-specific tyrosine kinase myasthenia gravis with chimeric autoantibody receptor T cells. Nat Biotechnol. 41 (9), 1229-1238 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

MuSK
الفيديو قريباً

مقالات ذات صلة