تصوير الكالسيوم أحادي الخلية لدراسة تنشيط قنوات أيونات الكالسيوم

Pengtao Xu; MengYuan Guo; Wanping Lu; Yan Jiang; Lei Wang; Yunqian Li; Tao Lu; Xiaoling Liu

doi:10.3791/67412

مقالة منهجية

تصوير الكالسيوم أحادي الخلية لدراسة تنشيط قنوات أيونات الكالسيوم

DOI:

10.3791/67412

⸱

ديسمبر 13, 2024

Pengtao Xu^*¹ , MengYuan Guo^*¹ , Wanping Lu^*¹ , Yan Jiang² , Lei Wang¹ , Yunqian Li¹ , Tao Lu¹ , Xiaoling Liu¹

¹School of Life Science, Beijing University of Chinese Medicine, ²School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua University

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه المقالة طريقة للمراقبة الكمية في الوقت الفعلي لتركيزات أيون الكالسيوم (Ca²⁺) في الخلايا باستخدام تصوير Ca²⁺ أحادي الخلية باستخدام صبغة Fura-2 / AM. تتيح هذه التقنية تحميل الصبغة بكفاءة والحساب الدقيق لمستويات Ca²⁺ من خلال نسب شدة التألق ، مما يجعلها نهجا بسيطا وسريعا لتطبيقات البحث.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تصوير الخلية المفردة Ca²⁺ ضروريا لدراسة قنوات Ca²⁺ التي يتم تنشيطها بواسطة محفزات مختلفة مثل درجة الحرارة والجهد والمركب الأصلي والمواد الكيميائية وما إلى ذلك. يعتمد بشكل أساسي على تقنية التصوير المجهري ومؤشر Ca² + ذي الصلة Fura-2 / AM (AM هو اختصار ل Acetoxymethyl ester). داخل الخلايا ، يتم تحلل Fura-2 / AM بواسطة الإستراز إلى Fura-2 ، والذي يمكن أن يرتبط بشكل عكسي بالسيتوبلازمي الحر Ca²⁺. يتحول الحد الأقصى للطول الموجي للإثارة من 380 نانومتر إلى 340 نانومتر (عند التشبع ب Ca²⁺) عند الربط. ترتبط شدة التألق المنبعثة كميا بتركيز Ca²⁺ المرتبط. من خلال قياس نسبة 340/380 ، يمكن تحديد تركيز Ca²⁺ في السيتوبلازم ، مما يلغي الأخطاء الناتجة عن الاختلافات في كفاءة تحميل مسبار الفلورسنت بين العينات المختلفة. تسمح هذه التقنية بالمراقبة في الوقت الفعلي والكمي والمتزامن لتغيرات Ca²⁺ في خلايا متعددة. يتم تخزين النتائج في ". XLSX" للتحليل اللاحق ، وهو سريع ويولد منحنيات تغيير بديهية ، مما يحسن بشكل كبير من كفاءة الكشف. من وجهات نظر تجريبية مختلفة ، تسرد هذه المقالة استخدام هذه التقنية للكشف عن إشارات Ca²⁺ في الخلايا ذات البروتينات القناة الداخلية أو المعبر عنها بشكل مفرط. في غضون ذلك ، تم أيضا عرض طرق مختلفة لتنشيط الخلايا ومقارنتها. الهدف هو تزويد القراء بفهم أوضح لاستخدام وتطبيقات التصوير أحادي الخلية Ca²⁺ .

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يلعب Ca²⁺ دورا مهما في نقل الإشارات الخلوية ، حيث ينظم الوظائف الخلوية المختلفة مثل تقلص العضلات¹ ، والتوصيل العصبي² ، والإفراز³ ، والتعبير الجيني⁴ ، وبالتالي التأثير على العمليات الفسيولوجية المتعددة. يمكن أن تؤدي تركيزات Ca²⁺ غير الطبيعية إلى أمراض مثل عدم انتظام ضربات^{القلب 5} واضطرابات التخثر⁶ والاختلالات الهرمونية⁷. لذلك ، فإن دراسة آليات تغيرات تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا لها أهمية قصوى.

تشارك القنوات الأيونية المختلفة في تنظيم تركيز Ca²⁺ في الخلايا ، بما في ذلك قنوات الكالسيوم المنشط بإطلاق الكالسيوم (CRAC) الانتقائية عالية الكالسيوم^{2 +} ⁸ والقنوات الكاتيونية غير الانتقائية من عائلة TRP⁹. يمكن تنشيط هذه القنوات الأيونية عن طريق المحفزات مثل درجة الحرارة¹⁰ والمركبات والمكونات النشطة الموجودة في الطب الصيني التقليدي¹¹ ، مما يلعب دورا مهما في العديد من العمليات الفسيولوجية المتعلقة ب Ca²⁺.

تعد المراقبة الفعالة لتغيرات تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا أمرا ضروريا لدراسة القنوات الأيونية المرتبطة ب Ca²⁺ ، لا سيما في مجال الطب الصيني التقليدي ، حيث يلعب تنظيم إشارات الكالسيوم دورا مركزيا في العديد من الأساليب العلاجية. حاليا ، يمكن تصنيف الطرق الأساسية لقياس Ca²⁺ داخل الخلايا إلى نوعين: القياسات الكهربائية والبصرية. يستخدم نهج القياس الكهربائي تقنية مشبك التصحيح لتقييم التغيرات في إمكانات غشاء الخلية بسبب تدفق Ca²⁺ ¹².

في القياس البصري ، ترتبط مجسات الفلورسنت على وجه التحديد ب^{Ca 2+} ، مما يسمح للباحثين بتتبع التغيرات في شدة التألق الخلوي. تشمل الطرق البصرية الشائعة التقنيات القائمة على البروتين الفلوري والصبغة الفلورية. في الطرق القائمة على البروتين الفلوري ، يمكن للباحثين الإفراط في التعبير عن البروتينات الفلورية الحساسة ل Ca^{2 +} مثل Cameleon¹³ و GCaMP¹⁴ في الخلايا ومراقبة تغيرات إشارة التألق باستخدام المجهر الفلوري أو قياس التدفق الخلوي لمراقبة التحولات في تركيزات Ca^{2 +} السيتوبلازمية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن للباحثين الإفراط في التعبير عن هذه البروتينات في الفئران واستخدام الفحص المجهري الفلوري ثنائي الفوتون للمراقبة في الوقت الفعلي في الجسم الحي أو على مستوى الأنسجة لتركيزات Ca²⁺ داخل الخلايا ، مما يوفر دقة عالية واختراق الأنسجة العميقة¹⁰.

بالنسبة للطرق القائمة على صبغة الفلورسنت ، تشمل مجسات Ca²⁺ شائعة الاستخدام Fluo-3 / AM و Fluo-4 / AM و Fura-2 / AM¹⁰. يحتضن الباحثون الخلايا في محلول يحتوي على مجسات الفلورسنت هذه ، والتي تعبر غشاء الخلية ويتم شقها بواسطة استيرازات داخل الخلايا لتشكيل مركبات نشطة (على سبيل المثال ، Fluo-3 و Fluo-4 و Fura-2) التي تبقى داخل الخلية. تظهر هذه المجسات الحد الأدنى من التألق في شكلها الحر ولكنها تنبعث منها مضان قوي عند ربطها ب Ca²⁺ داخل الخلايا ، مما يشير إلى التغيرات في تركيزات Ca²⁺ السيتوبلازمية. بالمقارنة مع البروتينات والأصباغ الفلورية الأخرى ، عادة ما يكون Fura-2 متحمسا عند أطوال موجية 340 نانومتر و 380 نانومتر. عندما يرتبط ب Ca²⁺ الحر داخل الخلايا ، يخضع Fura-2 لتحول امتصاص ، مما يحرك ذروة الطول الموجي للإثارة من 380 نانومتر إلى 340 نانومتر ، بينما تظل ذروة الانبعاث بالقرب من 510 نانومتر دون تغيير. هناك علاقة كمية بين شدة التألق وتركيز Ca²⁺ المرتبط ، مما يسمح بحساب تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا عن طريق قياس نسبة شدة التألق عند هذين الطولين الموجيين للإثارة. تقلل قياسات النسبة من آثار التبييض الضوئي ، وتسرب مسبار الفلورسنت ، والتحميل غير المتكافئ ، والاختلافات في سمك الخلية ، مما يؤدي إلى نتائج أكثر موثوقية وقابلية للتكرار (الشكل 1).

تستخدم أنظمة التصوير أحادية الخلية Ca²⁺ بشكل أساسي تقنيات الفحص المجهري ومؤشر Ca² + Fura-2 / AM للكشف عن تركيزات Ca²⁺ داخل الخلايا. تشتمل هذه الأنظمة على مجهر مضان ، ومصدر ضوء تصوير Ca²⁺ ، وبرنامج تصوير مضان ، مما يتيح المراقبة الكمية في الوقت الفعلي لتغيرات Ca²⁺ في السيتوبلازم لخلايا متعددة في وقت واحد (ما يصل إلى 50 خلية لكل مجال رؤية). يتم حفظ النتائج بتنسيق ".xlsx" لتحليلها لاحقا. يوفر النظام سرعة تحليل سريعة (حوالي دقيقة واحدة لتحليل مجموعة من الخلايا داخل مجال رؤية واحد) ويولد منحنيات تغيير بديهية ، مما يعزز بشكل كبير من كفاءة الكشف. يعد التصوير أحادي الخلية Ca^{2 +} نهجا تقنيا أساسيا لدراسة القنوات المتعلقة ب Ca^{2 +} وله قيمة كبيرة في البحوث الطبية الحيوية المتعلقة بالقناة الأيونية. من المتوقع أن يؤدي تطبيقه في تقنية تصوير الكالسيوم أحادي الخلية إلى تعزيز البحث بشكل كبير حول الآليات الكامنة وراء الطب الصيني التقليدي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على الطرق التجريبية واتبعتها إرشادات IACUC لجامعة تسينغهوا وجامعة بكين للطب الصيني. يقدم هذا البروتوكول طرق تصوير Ca²⁺ أحادية الخلية لأنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية الأولية المعزولة من جلد العديد من الفئران حديثي الولادة (في غضون ثلاثة أيام من الولادة ، مع رفقاء القمامة العشوائية حسب الجنس ، الفئران C57BL / 6). تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. تحضير الخلية

ملاحظه: الخلايا الأولية ، أو خطوط الخلايا ذات الجينات المستهدفة الداخلية ، أو تلك التي تم نقلها ببلازميدات مفرطة التعبير عنها كلها مناسبة لتصوير Ca²⁺ أحادي الخلية. تم الحصول على البلازميدات المستخدمة في هذه الدراسة من مختبر البروفيسور شياو بايلونغ في جامعة تسينغهوا. تم إنشاء هذه البلازميدات من خلال دمج تسلسلات من بروتين الفلورسنت GFP مع STIM1 البشري ، وبروتين الفلورسنت DsRed مع Orai1 البشري ، وبروتين الفلورسنت mRuby مع الأرانب TRPV1 ، بالإضافة إلى البروتين الفلوري الأحمر mCherry في ناقلات البلازميد العاثية¹⁰.

قم بإعداد شرائح زجاجية معقمة بقطر 8 مم في صفيحة 24 بئرا. أضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت بولي دي ليسين (PDL) (50 ميكروغرام / مل في DPBS) إلى كل بئر.
احتضن الشرائح عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة للسماح بالطلاء ، ثم تخلص من محلول الطلاء باستخدام ماصة.
اغسل الشرائح مرة واحدة باستخدام DPBS واتركها جانبا لاستخدامها لاحقا.
زراعة الخلايا الأولية وخطوط الخلايا بشكل منفصل وفقا لطرق زراعتها المحددة¹⁰.
خلايا البذور على صفيحة 24 بئرا محضرة بكثافة حوالي 1.5 × 10⁵ خلايا لكل بئر. استخدم الخلايا لتصوير Ca²⁺ بمجرد التصاق بغطاء الغطاء.
بالنسبة للخلايا التي تفرط في التعبير عن البلازميدات ، قم بنقل¹⁰^،¹⁵ البلازميد المستهدف (1 ميكروغرام / بئر) باستخدام كاشف التعداء Lipofectamine 2000 (أو Lipofectamine 3000) بنسبة 1: 1 ، واحتضانه في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة تقريبا.
ملاحظه: قد يكون وقت الحضانة أطول ضروريا للبروتينات المعبر عنها الأكبر.

2. إعداد حل عمل Fura-2 / AM

أضف 50 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) إلى أنبوب يحتوي على 50 ميكروغرام من مسحوق Fura-2 / AM واخلطه جيدا لتحضير محلول مخزون 1 ميكروغرام / ميكرولتر من Fura-2 / AM.
امزج محلول مخزون Fura-2 / AM و Pluronic F-127 في مخزن هانك الذي يحتوي على 1.3 ملي مولار من الكالسيوم²⁺.
ملاحظه: التركيز النهائي ل Fura-2 / AM و Pluronic F-127 في محلول العمل هو 2.5 ميكروغرام / مل. يتم تحضير المخزن المؤقت ل Hank عن طريق إضافة 10 ملي مولار HEPES إلى 1x مخزن مؤقت HBSS.
استخدم رقائق الألومنيوم لحماية حل العمل Fura-2 / AM من الضوء.

3. المعالجة المسبقة للخلية لتصوير Ca²⁺ أحادي الخلية

انقل الشرائح الزجاجية مع الخلايا إلى صفيحة جديدة مكونة من 24 بئرا تحتوي على عازلة هانك للغسيل.
تخلص من المخزن المؤقت باستخدام ماصة وأضف 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعمل Fura-2 / AM إلى كل بئر.
احتضن في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 30 دقيقة للسماح بتحميل المسبار.
قم بإزالة المخزن المؤقت للعمل Fura-2 / AM واغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام مخزن هانك للتخلص من Fura-2 / AM الزائد. الخلايا جاهزة الآن للاستخدام.

4. بدء تشغيل نظام التصوير Ca²⁺

ملاحظة: في هذه الدراسة ، يتم استخدام المجهر الفلوري لتصوير Ca²⁺ .

ابدأ المكونات التالية بالتسلسل: ضوء DG4 (مصباح الزينون) ، والكاميرا ، ومصدر الضوء الأبيض ، ووحدة التحكم في مرحلة المجهر ، والمجهر ، والكمبيوتر ، وبرنامج التصوير الفلوري.
ملاحظه: في حالة اكتشاف تنشيط القنوات الأيونية حسب درجة الحرارة ، قم أيضا بتشغيل المكونات التالية: نظام التروية ، ونظام التدفئة ، وجهاز التحكم في درجة الحرارة ، وجهاز تسخين / تبريد دوران السائل.

5. إجراء الاستجابة الخلوية Ca²⁺

افتح برنامج التصوير الفلوري (انظر جدول المواد).
1. اختر البروتوكول، ثم حدد ملف، متبوعا ببروتوكول التحميل. حدد البروتوكول وانقر فوق موافق.
2. قم بتكوين التجربة (في قائمة القائمة).
3. حدد تجربة جديدة.
قم بتركيب غرفة التروية على المجهر.
ملاحظه: قم دائما بخفض الهدف بالكامل عند تركيب الغرف أو إزالتها باستخدام مقبض التركيز الخشن لمنع تلف الهدف.
قم بإزالة شرائح الخلية المعالجة Fura-2 / AM وضعها في الغرفة التي تحتوي على مخزن هانك.
ابدأ نظام التروية.
حدد هدف DIC 20x واضبط التركيز البؤري تحت الضوء الأبيض.
انقر فوق Cfg Exp على شريط المهام.
1. حدد الفلور المطلوب للتصوير.
2. تحديد تردد الاستحواذ وإعدادات العرض على الشاشة (اكتساب: تحقق من 340 ، 380 ، GFP ؛ الفاصل الزمني للاكتساب: 1 ثانية ؛ الفاصل الزمني للحفظ: 1 ثانية).
ركز
1. في لوحة تحكم التجربة ، انقر فوق الزر تركيز .
2. اضبط وقت الاستحواذ (عادة 100 مللي ثانية) واربحه حسب الحاجة ، ثم "وفر لهذه الموجة".
  ملاحظه: بالنسبة للأشعة فوق البنفسجية ، استخدم الكسب بدلا من وقت التعرض.
3. اختر الطول الموجي المطلوب للتركيز (على سبيل المثال ، 380) وانقر فوق بدء التركيز.
4. قم بتبديل العرض من المناظير إلى الكمبيوتر.
5. تأكد من ظهور لون أخضر باهت من خلال المنظار.
6. ركز على الخلايا ، باستخدام التركيز التقريبي أولا لإغلاق الهدف ، ثم التركيز الدقيق.
  ملاحظه: سوف يصدر المجهر صوتا إذا اقترب كثيرا من المسرح. إذا حدث هذا ، فقم بخفض الهدف ، وأعد تنظيم اللوحة على المسرح ، وركز مرة أخرى. قلل الوقت المستغرق في التركيز لتقليل تلف الخلايا الناجم عن الليزر.
7. تحقق من شدة تألق الخلايا أثناء عملية التركيز.
8. اضبط شدة التألق للخلايا عن طريق تعديل وقت التعرض والكسب.
  ملاحظه: يجب أن يكون وقت التعرض والكسب ل 340 و 380 متسقين.
9. بمجرد تحقيق التركيز الجيد ، اضغط على الزر الموجود على المجهر لتبديل العرض إلى الكمبيوتر.
10. أعد التركيز حسب الحاجة للحصول على الصورة الأكثر وضوحا على الكمبيوتر ، ثم انقر فوق إيقاف التركيز.
إجراء بديل للعثور على الخلايا الإيجابية ل GFP
1. استخدم الإجراء 340/380 أولا لتحقيق تركيز جيد على الخلايا.
2. حدد FITC ثم انقر فوق بدء التركيز.
3. استخدم وحدة التحكم في المرحلة للعثور على الخلايا موجبة GFP.
4. قم بتبديل العرض إلى الكمبيوتر ثم انقر فوق إيقاف التركيز.
اختيار المنطقة
1. انقر فوق الزر "المنطقة " في شريط القائمة.
2. حدد نوع الإضاءة المفضل (340/380/FITC/TRITC). يتم اختيار مرشحات FITC و TRITC ل GFP و mCherry / DsRed / mRuby ، على التوالي ، للخلايا التي تفرط في التعبير عن البلازميدات المستهدفة. وإلا، فحدد Fura-2.
  ملاحظه: تجنب اختيار الخلايا التي تكون في حالة سيئة أو ميتة ، مثل تلك التي من الواضح أنها مستديرة أو ذات بروتينات الفلورسنت المعرضة بشكل مفرط.
3. انقر فوق الحصول على الصور ، ثم موافق.
4. ستظهر نافذة جديدة. حدد الخلايا بالنقر فوق الأداة البيضاوية ثم النقر فوق الخلية.
5. حدد الخلايا المرغوبة تحت التألق الذي يحمله البروتين المستهدف (FITC أو TRITC). حدد خلايا التحكم التي لا تعبر عن البروتين المستهدف في حالة 380 نانومتر.
6. التراجع عن منطقة عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على الدائرة ثم تحديد حذف المنطقة.
7. حدد عينة خلفية كمنطقة أخيرة وسجل رقم المعرف الخاص بها.
8. انقر فوق حفظ ثم تم.
طرح الخلفية
1. انقر فوق زر القائمة المراجع.
2. حدد رقم منطقة الخلفية.
  ملاحظه: إذا كانت الخلفية هي آخر منطقة تم تحديدها ، فسيؤدي إدخال رقم مرتفع جدا إلى التبديل تلقائيا إلى آخر منطقة تم اختيارها.
3. حدد المربع طرح المراجع ثم انقر فوق موافق.
بيانات السجل
1. انقر فوق الزر Log Data في لوحة تحكم التجربة.
  ملاحظه: يتم حفظ الصور فقط إذا كانت هناك رغبة في إعادة تشغيل التجربة لاحقا. عادة ، يكفي مجرد تحديد مربع البيانات.
2. تأكد من ظهور مطالبة تطلب نوع ملف البيانات المفضل ؛ تحديد. يوصى بتنسيق XLSX .
3. سيتم فتح ورقة عمل من النوع ".xlsx". سيؤدي تصغير ورقة العمل إلى منعها من شغل مساحة الشاشة.
الحصول على البيانات
1. في قسم الفاصل الزمني في لوحة التحكم، اضبط الفاصل الزمني للحصول على البيانات إلى 1 ثانية.
  ملاحظه: يمكن تعديل هذا وفقا للاحتياجات الفعلية.
2. انقر فوق Zero Clock and Acquire في لوحة تحكم التجربة لبدء التجربة. ستكون خطوط الأساس مرئية على رسم بياني يشير إلى كل منطقة من مناطق الخلية المحددة.
3. إجراء سلسلة من العلاجات على الخلايا وفقا للمتطلبات التجريبية.
4. لمراقبة استجابة درجة حرارة الخلايا ، قم بتسخين المخزن المؤقت في نظام التروية إلى درجة حرارة مناسبة باستخدام جهاز التحكم في درجة الحرارة.
5. لمراقبة آثار الأدوية على الخلايا ، قم ببث أو إضافة مخزن مؤقت يحتوي على دواء يدويا وتسجيل تغيرات الخلايا.
6. بعد اكتمال الحصول على البيانات ، انقر فوق إيقاف مؤقت.
  ملاحظه: يمكن إيقاف الحصول على البيانات مؤقتا، ويمكن إعادة ضبط الساعة في أي وقت أثناء التجربة.
7. حفظ البيانات وتحليلها.
انقر فوق ملف وإغلاق التجربة لإنهاء التجربة ، وحدد لا في مربع الحوار لحفظ البروتوكول.
افتح تجربة جديدة بالنقر فوق جديد في القائمة ، وكرر العملية.
إيقاف التشغيل
1. أغلق البرنامج وانقل البيانات من الكمبيوتر.
2. عكس إجراء بدء التشغيل.
3. سجل الساعات في ورقة التسجيل ونظف أي فوضى.
تحليل البيانات
1. قم بتمثيل تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا بنسبة Fura-2 340/380 أو قم بالتحويل إلى تركيز Ca²⁺ المقابل.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كشف استجابة درجة الحرارة
الخلايا الكيراتينية الأولية
تم عزل الخلايا الكيراتينية الأولية من الفئران حديثي الولادة وأعدت وفقا للبروتوكولات المعمول^{بها 10}. تم زرع هذه الخلايا في 24 بئرا تحتوي على شرائح زجاجية. بعد تحميل مسبار Fura-2 ، تم ضبط التركيز تحت المجهر بطول موجي يبلغ 380 نانومتر لتحقيق تصور واضح لتشكل الخلية ، كما هو موضح في الشكل 2 أ. إذا لم يتم تحميل المسبار بنجاح أثناء العملية ، فلن تكون الخلايا مرئية. تم استبدال المخزن المؤقت خارج الخلية في الغرفة باستمرار من خلال نظام التروية ، مما يضمن الظروف المثلى للخلايا. تم توصيل نظام التحكم في درجة الحرارة بنظام التروية ، مما يتيح اكتشاف الاستجابات الحرارية الخلوية عن طريق التحكم في تغيرات درجات الحرارة في المخزن المؤقت خارج الخلية. تضمنت هذه العملية تسخين المخزن المؤقت خارج الخلية تدريجيا ثم تبريده تدريجيا.

تم استخدام نظام التصوير أحادي الخلية Ca²⁺ لمراقبة التغيرات في تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا في ظل ظروف تجريبية مختلفة. كما هو موضح في الشكل 2 ب ، أظهرت الخلايا الكيراتينية استجابة حرارية مميزة عند تعرضها للتسخين ، بالإضافة إلى استجابة ملحوظة أثناء مرحلة التبريد. والجدير بالذكر أن استجابة درجة الحرارة هذه اختفت عندما تم حذف جين STIM1 ، المسؤول بشكل أساسي عن هذه الاستجابة ، (الشكل 2 ج) ¹⁰. يسمح التصوير أحادي الخلية Ca² + بمراقبة التغيرات في الوقت الفعلي في تركيز Ca²⁺ داخل الخلايا استجابة لمحفزات خارجية مختلفة ، مما يتيح تحليلا مفصلا للسلوك الخلوي والإشارات.

HEK293T الخلايا تفرط في التعبير عن البلازميدات المستهدفة
تم زرع HEK293T الخلايا في صفيحة مكونة من 24 بئرا تحتوي على شرائح زجاجية وفقا للطريقة التجريبية. ثم تم الإفراط في التعبير عن الخلايا باستخدام STIM1 / Orai1 ، وتم الكشف عن استجابتها الحرارية بوساطة باستخدام نفس الطريقة الموضحة أعلاه للخلايا الأولية. في حالة الإفراط في التعبير عن البلازميد المستهدف ، تم تأكيد التعداء الناجح عن طريق اختيار الخلايا التي تعبر عن البلازميد المقابل ، كما يتضح من بروتينات الفلورسنت الحمراء أو الخضراء التي يحملها البلازميد تحت الأطوال الموجية TRITC أو FITC. في هذه التجربة ، تم استخدام بلازميدات STIM1-GFP / Orai1-DsRed ، مع اكتشاف GFP تحت FITC ، مما ينبعث منه مضان أخضر ، واكتشاف DsRed تحت TRITC ، مما ينبعث منه مضان أحمر. تم استخدام الخلايا التي تفرط في التعبير عن mCherry الفارغ (TRITC) كعناصر تحكم سلبية. كما هو موضح في الشكل 3 أ ، أشارت الخلايا الفلورية التي لوحظت بموجب FITC إلى التعبير الناجح عن STIM1 ، مما يتيح اختيار وتسجيل استجابتها الحرارية أثناء عمليات التسخين والتبريد. كانت الخلايا التي لم يتم نقلها بمثابة عنصر تحكم سلبي. يوضح الشكل 3 ب أن STIM1 / Orai1 أظهر استجابة حرارية كبيرة أثناء عملية التبريد ، على النقيض من التحكم السلبي الموضح في الشكل 3C.

الكشف عن الاستجابة للأدوية
يمكن أيضا استخدام تقنية التصوير أحادية الخلية Ca²⁺ للكشف عن استجابات الخلايا للمركبات. تحضير الخلية للكشف عن الاستجابة الحرارية هو نفسه كما هو موضح أعلاه. يكمن الاختلاف بين الاستجابة الدوائية والاستجابة الحرارية في حقيقة أن الاستجابة الحرارية تتطلب عادة تنشيط الخلايا عن طريق تغيير درجة حرارة المخزن المؤقت خارج الخلية من خلال نظام التروية ، بينما يمكن إعطاء المركبات إما من خلال التروية أو عن طريق إضافتها مباشرة باستخدام ماصة. يمكن أن تحافظ الإضافة المباشرة باستخدام الماصة بشكل فعال على كمية المركب المستخدم ؛ ومع ذلك ، قد لا يكون المنحنى الناتج دائما جذابا بصريا مثل ذلك الذي تم الحصول عليه من خلال التروية.

بأخذ الشكل 4 كمثال ، يوضح الشكل 4 أ استجابة دخول الكالسيوم (SOCE) التي يتم تشغيلها في المتجر ل STIM1 / Orai1 ، حيث يتم تغيير تركيز Ca²⁺ خارج الخلية ومحتوى حمض السيكلوبيازونيك (CPA) بالتتابع من خلال نظام التروية للحث على SOCE. في الشكل 4 ب ، تتم إضافة الكابسيسين الناهض TRPV1 مباشرة باستخدام ماصة للخلايا التي تفرط في التعبير عن بلازميد TRPV1. يمكن أن ينشط الكابسيسين TRPV1 ويحث تدفق Ca²⁺ خارج الخلية.

figure-results-1

الشكل 1: رسم تخطيطي ل Fura-2 AM. Fura-2 هو مسبار مضان Ca²⁺ شائع الاستخدام في بيولوجيا الخلية يرتبط بشكل انتقائي ب Ca²⁺ بنسبة 1: 1 ويصدر مضانة. نظرا لطبيعته القطبية للغاية كمركب حمضي ، لا يمكن ل Fura-2 دخول الخلايا. لتعزيز نفاذية الخلية ، يتم ترافقه مع أسيتوكسي ميثيل (AM) على مجموعته السلبية لتشكيل Fura-2 / AM. يزيد هذا التعديل من قابلية ذوبان الإستر ويزيل الشحنة السالبة. داخل الخلايا ، يتم تحلل Fura-2 / AM بواسطة الإستراز إلى Fura-2 ، والذي يمكن أن يرتبط بشكل عكسي بالسيتوبلازمي الحر Ca²⁺. عند الربط ، ينتقل الحد الأقصى للطول الموجي للإثارة من 380 نانومتر إلى 340 نانومتر (عند التشبع ب Ca²⁺). ترتبط شدة التألق المنبعثة كميا بتركيز Ca²⁺ المرتبط. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: الكشف عن استجابة درجة الحرارة للخلايا الكيراتينية الأولية. (أ) تلطيخ Fura-2 للخلايا الكيراتينية من الفئران حديثي الولادة ، لوحظ تحت عدسة موضوعية 20x. (ب ، ج) استجابة درجة حرارة الخلايا الكيراتينية WT (B) والخلايا الكيراتينية بالضربة القاضية STIM1 (C) باستخدام نظام تصوير Ca²⁺ أحادي الخلية. التكبير: 20x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-3
الشكل 3: الكشف عن استجابة درجة الحرارة ل STIM1-GFP / Orai1-Dsred المعبر عنه بشكل مفرط في خلايا HEK293T. (أ) شكل تمثيلي يوضح الخلايا الموجبة التي تعبر عن STIM1-GFP بموجب FITC. (ب ، ج) استجابة درجة حرارة الخلايا HEK293T التي تعبر عن البلازميد المعني الذي تم اكتشافه بواسطة نظام تصوير Ca²⁺ أحادي الخلية. التكبير: 20x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-4
الشكل 4: الكشف عن الاستجابة للأدوية باستخدام تصوير Ca²⁺ أحادي الخلية. (أ) استجابة SOCE للخلايا HEK293T التي تفرط في التعبير عن STIM1 / Orai1. يتم تغيير المخزن المؤقت خارج الخلية من Ca²⁺ - المحتوي على Ca^{2+ إلى Ca 2+} - خال باستخدام نظام التروية. في حالة عدم وجود Ca²⁺ ، تتم إضافة CPA لاستنفاد Ca²⁺ من الشبكة الإندوبلازمية. ثم يتم استبدال المخزن المؤقت خارج الخلية بمخزن مؤقت يحتوي على Ca²⁺ للحث على تدفق Ca²⁺ خارج الخلية ، مما يمثل دخول Ca²⁺ الذي يتم تشغيله في المتجر. يتم استخدام تصوير Ca² + أحادي الخلية لتسجيل التغيرات في تركيز Ca²⁺ العصاري الخلوي الناجم عن هذه العمليات. (ب) HEK293T الخلايا التي تفرط في التعبير عن TRPV1-mRuby ، حيث mRuby هو بروتين فلوري يستخدم للتحقق من حالة تعداء بروتين TRPV1. يضاف الكابسيسين باستخدام ماصة بينما يتم تسجيل تدفق Ca²⁺ عن طريق تصوير Ca²⁺ أحادي الخلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد تطبيق أنظمة التصوير أحادية الخلية Ca²⁺ واسع النطاق ، مما يتيح دراسة إشارات Ca²⁺ في أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك الخلايا الكيراتينية ، والخلايا الجذعية¹⁶ ، وخلايا الكبد ، وخلايا القلب¹⁷ ، والخلايا^{البودوية 18} ، والخلايا المناعية ، وخطوط الخلايا التي تفرط في التعبير عن البروتينات المستهدفة¹⁰^،¹⁹. تقيس هذه التقنية التغيرات والقيم المطلقة لتركيزات Ca²⁺ الخلوية وتلعب دورا مهما في التحقيق في القنوات الأيونية المرتبطة ب Ca^{2 +} ، مما يجعلها واحدة من الأدوات الأساسية في مختبرات أبحاث القنوات الأيونية.

مع تقدم البحث ، اكتسبت أهمية القنوات الأيونية المتعلقة بإشارات Ca²⁺ اعترافا متزايدا بين باحثي الطب الصيني التقليدي. إنهم يهدفون إلى فك تشفير القضايا الأساسية للطب الصيني التقليدي من خلال عدسة القنوات الأيونية. على سبيل المثال ، تعلم الخصائص الساخنة والباردة للطب الصيني مبدأ "معالجة الحرارة بالبرد ومعالجة البرد بالحرارة". ترتبط العديد من القنوات الأيونية الحساسة لدرجة الحرارة التي تتوسط إشارات Ca²⁺ ارتباطا وثيقا بهذا المبدأ. علاوة على ذلك ، تمارس العديد من الأدوية الصينية تأثيرات علاجية من خلال الإجراءات المضادة للالتهابات ، حيث تلعب القنوات الأيونية المتعددة المتعلقة ب Ca^{2 +} أدوارا مهمة في تنظيم الالتهاب²⁰.

من الضروري دراسة تأثيرات المكونات المهمة في الطب الصيني التقليدي على خصائص القناة الأيونية للكشف عن الخصائص الدوائية لهذه الأدوية على المستوى الجزيئي. حاليا ، يركز الباحثون في الطب الصيني التقليدي بشكل أساسي على اكتشاف التعبير عن القنوات الأيونية ذات الصلة. ومع ذلك ، لا تزال هناك مراقبة محدودة نسبيا في الوقت الفعلي فيما يتعلق بتأثيرات الطب الصيني التقليدي على القنوات الأيونية المرتبطة ب Ca²⁺ ، ولا تزال العديد من الآليات الأساسية غير واضحة.

تم تخصيص هذه المجموعة البحثية للبحث عن القنوات الأيونية المتعلقة ب Ca^{2 +} ، مثل STIM1 / Orai1 و STIM1 / Orai3 و TRPA1¹⁰ و TRPV1 ، وهي على دراية جيدة بالتطبيق والاستخدام التفصيلي لأنظمة التصوير Ca²⁺ أحادية الخلية. توضح هذه الدراسة الاستخدام المحدد لتصوير Ca²⁺ أحادي الخلية لأغراض بحثية مختلفة ، بهدف تزويد القراء بفهم شامل لتطبيقاته الواسعة واستخدامه التفصيلي. بالمقارنة مع الدراسات ذات الصلة المنشورة سابقا²¹ ، يقدم هذا البحث منظورا ومنهجية جديدة لتطبيق تصوير Ca²⁺ أحادي الخلية من زوايا مختلفة وبالاقتران مع أنظمة أخرى. على سبيل المثال ، يمكن تحميل الخلايا الأولية أو خطوط الخلايا ذات التعبير الداخلي للجينات المستهدفة مباشرة بمسبار Fura-2 لمراقبة التغيرات في إشارات Ca²⁺ داخل الخلايا في الوقت الفعلي تحت عوامل محفزة مختلفة باستخدام نظام التصوير Ca²⁺ أحادي الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء الإفراط في التعبير عن البلازميدات التي تحتوي على بروتينات الفلورسنت في خطوط الخلايا. في البداية ، يتم تحميل الخلايا بمسبار Fura-2 ، كما هو موضح سابقا. بعد ذلك ، يتم اختيار الخلايا ذات التعبير الناجح عن البروتين المستهدف بناء على إشارات FITC أو TRITC ، والتي يتم تمييزها بعد ذلك للمراقبة اللاحقة في الوقت الفعلي لإشارات Fura-2 Ca² +.

التصوير أحادي الخلية Ca²⁺ هو نظام كشف يمكن دمجه مع العديد من الإعدادات التجريبية الأخرى وفقا للأهداف التجريبية. على سبيل المثال ، إذا كانت هناك حاجة إلى اكتشاف استجابة القنوات الأيونية الحساسة لدرجة الحرارة للتغيرات في درجات الحرارة ، فيمكن دمج النظام مع نظام تشغيل التحكم في درجة الحرارة وجهاز التروية لمراقبة التغيرات في إشارات Ca²⁺ داخل الخلايا في وقت واحد عن طريق التحكم في درجة حرارة محلول المخزن المؤقت خارج^{الخلية 19}. يؤكد هذا النهج استجابة القنوات الأيونية ذات الصلة لدرجة الحرارة. علاوة على ذلك ، يمكن أيضا إقران التصوير أحادي الخلية Ca²⁺ بأجهزة توصيل الأدوية ذات الصلة أو أجهزة تحفيز الخلايا الأخرى للتجارب ذات الصلة.

في الواقع ، لا يسمح نظام التصوير أحادي الخلية Ca²⁺ بالمراقبة في الوقت الفعلي لنسبة 340/380 فحسب ، بل يسمح أيضا بقيم FITC أو TRITC من خلال إعدادات محددة. علاوة على ذلك ، فإن تقنية تصوير الكالسيوم أحادية الخلية قابلة للتطبيق للكشف عن التغيرات في تركيز أيونات الكالسيوم ليس فقط في السيتوبلازم ولكن أيضا في الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، مما يدل على تطبيقاتها واسعة النطاق¹⁹. يتم حفظ البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة هذا النظام بشكل موحد بتنسيق ".xlsx" ، والذي يمكن تحليله بسرعة للحصول على النتائج. يسهل منحنى التغيير فهما سريعا لحالة تنشيط الخلايا وخصائصها ، مما يؤدي إلى إنشاء نظام مراقبة إشارة Ca^{2 +} مناسب. من المتوقع أن يعزز هذا التقرير البحثي بشكل فعال التطبيق الواسع النطاق لنظام التصوير أحادي الخلية Ca²⁺ في مجال أبحاث الطب الصيني التقليدي ويساهم في فك تشفير الطب الصيني التقليدي.

ومع ذلك ، فإن تطبيق تقنية تصوير الكالسيوم أحادية الخلية له قيود معينة ، مثل عدم القدرة على تحقيق فحص عالي الإنتاجية. على سبيل المثال ، في بعض التجارب ، عندما يكون من الضروري فحص ناهضات أو مضادات قناة معينة ، يتطلب تصوير الكالسيوم الفحص واحدا تلو الآخر ، وهو ما يستغرق وقتا طويلا للغاية. في مثل هذه الحالات ، قد تحتاج هذه التقنية إلى الجمع بين تقنيات أخرى ، مثل FLIPR²² ، لإجراء فحص عالي الإنتاجية قبل التحقق من صحة النتائج باستخدام تصوير الكالسيوم أحادي الخلية. بالإضافة إلى ذلك ، يتم إنشاء الصور التي تم الحصول عليها من تصوير الكالسيوم أحادي الخلية من الفحص المجهري الفلوري التقليدي ، والذي يتميز بدقة أقل مقارنة بالفحص المجهري متحد البؤر¹⁵. لذلك ، فإن الجمع الفعال بين تقنية تصوير الكالسيوم أحادية الخلية والتقنيات الأخرى للاستفادة من مزايا كل منها هو نهج مهم لمواجهة التحديات في هذا المجال.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم الشكر والتقدير إلى Bailong Xiao من جامعة Tsinghua لمشاركة نظام التصوير أحادي الخلية Ca²⁺ ونظام التشغيل للتحكم في درجة الحرارة ، وكذلك على الدعم والمساعدة في هذا المشروع. تم تمويل هذا البحث من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (32000705) ، وبرنامج رعاية النخبة الطلابية الشباب من قبل الجمعية الصينية للطب الصيني (CACM-(2021-QNRC2-B11)) ، وصناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (2020-JYB-XJSJJ-026) ، (2024-JYB-KYPT-06).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
كاميرا	نيكون
كابسايسين	سيجما	211275
CL-100 وحدة تحكم في درجة الحرارة	Warner Instruments
حمض السيكلوبيازونيك (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 ضوء	Sutter Instrument Company
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
برنامج التصوير الفلوري (MetaFluor ، برنامج مدفوع)			الجزيئية
المجهر الفلوري	نيكون
Fura-2 / AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES & nbsp;	سيجما	H3375
ليبوفيكتامين 3000	إنفيتروجين	L3000008
بلورونيك F-127	؛ Beyotime	ST501
بولي D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 جهاز تسخين / تبريد دوران السائل	هارفارد جهاز
مصدر الضوء الأبيض	نيكون

الأجهزة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Murthy, K. S. Signaling for contraction and relaxation in smooth muscle of the gut. Annu Rev Physiol. 68, 345-374 (2006).
Buzsáki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--eeg, ecog, lfp and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
Rogers, D. F. Physiology of airway mucus secretion and pathophysiology of hypersecretion. Respir Care. 52 (9), 1134-1146 (2007).
Mitra, R., Hasan, G. Store-operated Ca(2+) entry regulates neuronal gene expression and function. Curr Opin Neurobiol. 73, 2022(2022).
Landstrom, A. P., Dobrev, D., Wehrens, X. H. T. Calcium signaling and cardiac arrhythmias. Circ Res. 120 (12), 1969-1993 (2017).
Zheng, C., Zhang, B. Combined deficiency of coagulation factors v and viii: An update. Semin Thromb Hemost. 39 (6), 613-620 (2013).
Ahmadian Elmi, M., Motamed, N., Picard, D. Proteomic analyses of the g protein-coupled estrogen receptor gper1 reveal constitutive links to endoplasmic reticulum, glycosylation, trafficking, and calcium signaling. Cells. 12 (21), 2571(2023).
Prakriya, M., et al. Orai1 is an essential pore subunit of the crac channel. Nature. 443 (7108), 230-233 (2006).
Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: A heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389 (6653), 816-824 (1997).
Liu, X., et al. Stim1 thermosensitivity defines the optimal preference temperature for warm sensation in mice. Cell Res. 29 (2), 95-109 (2019).
Bharate, S. S., Bharate, S. B. Modulation of thermoreceptor trpm8 by cooling compounds. ACS Chem Neurosci. 3 (4), 248-267 (2012).
Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483 (7388), 176-181 (2012).
Behera, S., et al. Analyses of Ca2+ dynamics using a ubiquitin-10 promoter-driven yellow cameleon 3.6 indicator reveal reliable transgene expression and differences in cytoplasmic Ca2+ responses in arabidopsis and rice (oryza sativa) roots. New Phytol. 206 (2), 751-760 (2015).
Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
Liu, X., et al. Molecular mechanism analysis of stim1 thermal sensation. Cells. 12 (22), 2613(2023).
Wang, S., et al. ATF6 safeguards organelle homeostasis and cellular aging in human mesenchymal stem cells. Cell Discov. 4, 2(2018).
Jiang, F., et al. The mechanosensitive piezo1 channel mediates heart mechano-chemo transduction. Nat Commun. 12 (1), 869(2021).
Tao, Y., et al. Enhanced Orai1-mediated store-operated Ca(2+) channel/calpain signaling contributes to high glucose-induced podocyte injury. J Biol Chem. 298 (6), 101990(2022).
Guo, L., et al. Disruption of er ion homeostasis maintained by an er anion channel clcc1 contributes to als-like pathologies. Cell Res. 33 (7), 497-515 (2023).
Gouin, O., et al. Trpv1 and trpa1 in cutaneous neurogenic and chronic inflammation: Pro-inflammatory response induced by their activation and their sensitization. Protein Cell. 8 (9), 644-661 (2017).
Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using fura-2 am. J Vis Exp. (23), e1067(2009).
Wang, Y., et al. A lever-like transduction pathway for long-distance chemical- and mechano-gating of the mechanosensitive piezo1 channel. Nat Commun. 9 (1), 1300(2018).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Fura 2 AM TRPV1

تصوير الكالسيوم أحادي الخلية لدراسة تنشيط قنوات أيونات الكالسيوم

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة