هنا ، نقدم بروتوكولا لتصنيع الجسيمات النانوية لأكسيد الزنك (ZnO) باستخدام المستخلص المائي الغني بالبولي إيزوبرين الذي تم الحصول عليه من لحاء شجرة Eucommia ulmoides . تم تقييم إمكانات التئام الجروح التي أظهرتها جسيمات ZnO النانوية المركبة على الخلايا البطانية للوريد السري البشري (HUVECs) باستخدام مقايسة الخدش ، وهي طريقة بسيطة وفعالة من حيث التكلفة وفعالة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
صياغة المواد النانوية القائمة على الزنك باستخدام مستخلص لحاء Eucommia ulmoides وقدرتها على التئام الجروح
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يعمل المستخلص المائي من لحاء Eucommia ulmoides كمصدر غني للمركبات النشطة بيولوجيا مع العديد من الفوائد الصحية. يهدف البروتوكول هنا إلى استكشاف تحضير الجسيمات النانوية لأكسيد الزنك (ZnO) باستخدام المستخلص المائي الغني بالبولي إيزوبرين بوساطة اللحاء Eucommia ulmoides . وفي الوقت نفسه ، يرتبط البروتوكول المقترح بإعداد مواد التئام الجروح عن طريق تسهيل العملية. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم إمكانات التئام الجروح للجسيمات النانوية المركبة (Eu-ZnO-NPs) باستخدام اختبار خدش بسيط على طبقة أحادية للخلية البطانية للوريد السري البشري (HUVEC). بعد 24 ساعة من العلاج ب Eu-ZnO-NPs ، تم تقييم تكاثر الخلايا وهجرة خلايا HUVEC. في نهاية الدراسة ، لوحظ تكاثر الخلايا وهجرتها في طبقة أحادية مخدوشة معالجة بتركيزات مختلفة من Eu-ZnO-NPs ، بينما لوحظت معدلات هجرة وتكاثر الخلايا الضعيفة في الخلايا الضابطة. من بين التركيزات المختارة ، أظهرت 20 ميكروغرام / مل من المواد النانوية Eu-ZnO هجرة أفضل للخلايا وإمكانية معززة لالتئام الجروح.
المقدمة
ثبت أن النباتات الطبية والمركبات المشتقة من النباتات تظهر العديد من الفوائد الصحية1. أفادت منظمة الصحة العالمية (WHO) أن 80٪ من سكان العالم يعتمدون على النباتات الطبية التقليدية في الرعاية الصحية الأولية. الصين معروفة جيدا وشعبية لممارسات الطب الصيني التقليدي (TCM). تم الإبلاغ عن الأعشاب الطبية الصينية لعلاج الأمراض المختلفة واستخدامها لإمكاناتها البيولوجية. تعمل النباتات الطبية كخزانات للمركبات النشطة بيولوجيا والأدوار العلاجية المتعددة. كما تم استخدام النباتات الطبية لعلاج الجروح. هناك عدة أنواع من الأساليب المطبقة لعلاج الجروحالمزمنة 2. كشف تحقيق حديث أن النباتات الطبية شاركت في عملية التئام الجروح من خلال توفير ظروف مواتية للشفاء ، خالية من الالتهابات ، وتجديد الأنسجةالمثبتة 3. وفي الوقت نفسه ، يمكن أن تساعد الخصائص المضادة للبكتيريا والفطريات للمركبات النشطة بيولوجيا الموجودة في النباتات الطبية في علاج الجروح وتثبيت كفاءة التئامالجروح 4.
تكتسب المواد النانوية القائمة على المعادن الاهتمام بسبب خصائصها المتوافقة حيويا والقابلة للتحلل. Eucommia ulmoides ، المعروف باسم شجرة المطاط الصينية ، هي نوع محلي في الصين. تستخدم أوراق ولحاء الشجرة في الممارسات الطبية. الأهم من ذلك ، تمت زراعة الأنواع النباتية في المقاطعات الوسطى والغربية من الصين5. أفاد Peng et al.6أن الأوراق واللحاء والزهور السداة كانت صالحة للأكل مع إمكانات علاجية. بالإضافة إلى ذلك ، تعمل E. ulmoides كأفضل مصدر للقشور ، والفينيل بروبانويدات ، والقزحية ، والفلافونويد ، والأحماض الأمينية ، والعناصر النزرة. علاوة على ذلك ، تم استخدام اللحاء في العديد من التطبيقات الطبية الحيوية مثل التحكم في ضغط الدم ، وخفض الدهون ، وتعزيز مضادات هشاشة العظام ونشاط نقص السكرفي الدم 7. ومن ثم ، مما لا شك فيه ، فقد ثبت أن مستخلص لحاء E. ulmoides له تاريخ طويل في الطب الصيني التقليدي. أشارت التقارير السابقة إلى أن بولي إيزوبرين البوليمر الطبيعي غني بلحاء Eucommia ulmoides8. بناء على المعلومات الواردة أعلاه ، يهدف العمل الحالي إلى تصنيع مواد نانوية باستخدام مستخلصات لحاء Eucommia ulmoides . يعد مزيج الزنك مع مستخلص اللحاء خيارا جذابا لتحضير المواد النانوية. بشكل عام ، كان الهدف النهائي من هذا التحقيق هو تصنيع مادة نانوية هجينة جديدة لتطبيقات التئام الجروح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: قبل تحضير المستخلص ، تم غسل مادة اللحاء التي تم الحصول عليها مرتين باستخدام الماء منزوع الأيونات وتجفيفها في مكان مظلل. تم تخزين اللحاء المجفف في الظل في حاوية محكمة الإغلاق.
1. تحضير مستخلص لحاء Eucommia ulmoides
- يقطع اللحاء الذي تم جمعه من شجرة Eucommia ulmoides إلى قطع صغيرة باستخدام المقص.
- اغسل مواد اللحاء المفرومة مرتين بالماء المقطر المزدوج.
- جفف قطع اللحاء تحت 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في ظروف مظللة.
- اضبط مدة عملية التجفيف بناء على كمية اللحاء المستخدمة في الدراسة. تأكد من تجفيف اللحاء تماما قبل تقطيع اللحاء إلى قطع صغيرة. تجنب أشعة الشمس المباشرة.
- انقل 20 جم من اللحاء المجفف بالظل إلى قارورة مخروطية تحتوي على 220 مل من الماء المقطر المزدوج المعقم وسخنها على حرارة 130 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- يتغير لون محلول التفاعل إلى الأصفر الفاتح. تحدث التغييرات في لون المحلول بعد 10 دقائق. اترك المحلول يسخن لمدة 10 دقائق أخرى. اضبط حجم الماء المقطر المزدوج بناء على كمية العينة.
- قم بتخزين المستخلص الخام المحتوي على البولي إيزوبرين عند 4 درجات مئوية لاستخدامه مرة أخرى. يشير تكوين هيكل يشبه الخيط إلى وجود مادة البولي إيزوبرين في المستخلصات.
2. التخليق الحيوي لجسيمات ZnO النانوية بوساطة اللحاء
- أضف 1 م من نيترات الزنك ثنائي هيدرات الزنك (NO3) 2 إلى 50 مل من الماء منزوع الأيونات في قارورة مخروطية سعة 500 مل. يقلب باستمرار باستخدام التقليب المغناطيسي (60 دورة في الدقيقة). يستغرق الزنك (NO3) 2 30 دقيقة ليذوب تماما.
- أضف 15 مل من مستخلص لحاء E. ulmoides بالتنقيط إلى 20 مل من محلول ثنائي هيدرات نترات الزنك 1 M (Zn (NO3) 2).
- ضع خليط التفاعل المغطى على محرك مغناطيسي ، وقم بتشغيل النمام ، وقم بالدوران عند (60 دورة في الدقيقة) لمدة 3 ساعات.
- أضف 1 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم هيدروكسيد الصوديوم (3 مل) محلول قطريا إلى خليط التفاعل لضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9. أضف هيدروكسيد الصوديوم حتى يتحول خليط المحلول إلى اللون الأبيض اللبني ولا يزيد الرقم الهيدروجيني عن 9. يصبح المحلول لونه أبيض حليبي عندما تتشكل جسيمات ZnO النانوية.
- قد يختلف تحضير 1 متر من نيترات الزنك ثنائي هيدرات الزنك (NO3)2 حجم محلول بناء على الاحتياجات التجريبية. تأكد من استخدام مستخلصات اللحاء الطازجة. إذا تجاوز الرقم الهيدروجيني 10 ، فسيؤدي ذلك إلى تراكم الجسيمات النانوية.
- انقل Eu-ZnO-NPs المركبة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل وقم بطرده عند 100 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن تجنب الشوائب عن طريق الغسيل الفوري. - اجمع Eu-ZnO-NPs المغسولة في طبق زجاجي وجففها عند 45-50 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في فرن الهواء الساخن.
ملاحظة: إذا تم الاحتفاظ ب Eu-ZnO-NPs لأكثر من 30 دقيقة ، فقد يؤثر ذلك على الطبيعة الفيزيائية والكيميائية للجسيمات النانوية
3. تأكيد الحجم باستخدام TEM
- قم بإعداد 1 مجم / مل من الجسيمات النانوية في DDH2O وقم بتحميل 5 ميكرولتر من عينة Eu-ZnO-NP في الشبكة النحاسية وانتظر حتى تجف تماما. دوامة العينة قبل التحميل على الشبكة النحاسية.
- قم بتحميل الشبكة النحاسية التي تحتوي على Eu-ZnO-NPs على حامل عينة TEM واحصل على صور بتكبير 50x و 100x.
ملاحظة: يجب التقاط الشبكات باستخدام الملقط خلال هذه الخطوة.
4. تقييم السمية الخلوية
- البذور 1 × 104 HUVECs في كل بئر من صفيحة 96 بئر وضعها في حاضنة 5٪ CO2 37 °C.
- أضف 10 ميكرولتر بتركيزات مختلفة 0 و 10 و 20 و 30 و 40 و 50 ميكروغرام / مل من Eu-ZnO-NPs في الخلايا المتقاربة بنسبة 90٪ واحتضانها لمدة 24 ساعة.
- بعد الحضانة ، قم بإزالة الوسط القديم دون إزعاج الخلايا ، وأضف 10 ميكرولتر من محلول CCK-8 إلى كل بئر يحتوي على 90 ميكرولتر من وسط DMEM الطازج ، واحتضنه في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪ 2 ، 37 درجة مئوية.
- قم بقياس امتصاص الخلايا المعالجة بمحلول CCK8 عند 450 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
ملاحظة: تم قياس الامتصاص على الفور في غضون 15 دقيقة لتجنب التغيرات في الامتصاص.
5. تحضير خلايا HUVEC لمقايسة الخدش
- زرع كمية مناسبة (1 × 105) من HUVECs في 12 صفيحة استزراع آبار تحتوي على وسط النسر المعدل من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بكتيريا بقرية واحتضانها في حاضنة 5٪ CO2 37 °C.
- قبل إجراء فحص الخدش ، تحقق من التقاء باستخدام المجهر المقلوب.
ملاحظة: لإجراء فحص الخدش ، سيتم استخدام 6 ألواح بئر أو 12 لوحة بناء على المتطلبات ، وستختلف كثافة الخلية باختلاف لوحات الاستزراع. يعد استخدام 70٪ -80٪ من الخلايا المتجانسة مثاليا ويوصى به لفحص الخدش. قد يختلف حجم وسيط DMEM بناء على لوحات الاستزراع المستخدمة في الدراسة. على سبيل المثال ، تتطلب 6 ألواح آبار 1-1.5 مل من وسط الاستزراع ، و 12 لوحة بئر تتطلب 0.5-1.0 مل من وسط النمو.
- قبل إجراء فحص الخدش ، تحقق من التقاء باستخدام المجهر المقلوب.
- قم بعمل خدش برفق باستخدام طرف ماصة معقم سعة 200 ميكرولتر في الجرح التمثيلي بعرض جرح يبلغ 200 ميكرومتر.
- تأكد من أن الطرف المستخدم في عمل خدوش على طبقة أحادية الخلية يتلامس مع سطح الخلايا.
ملاحظة: في كل مرة يتم فيها إجراء خدش ، استخدم الطرف المعقم. - قم بإزالة الوسط الكامل واغسل الطبقة الأحادية HUVEC باستخدام 1 مل من 1x PBS لإزالة الخلايا المنفصلة.
ملاحظة: تأكد من إزالة الخلايا أحادية الطبقة المنفصلة تماما من الآبار المعنية. تأكد من عدم حدوث أي ضرر في المنطقة الناتجة عن الجرح. - لتقييم إمكانات التئام الجروح لمركبات Eu-ZnO-NPs المركبة ، أضف تركيزات 0 (تحكم) و 10 و 20 ميكروغرام / مل من الجسيمات النانوية Eu-ZnO جنبا إلى جنب مع وسط كامل مع 10٪ FBS في الآبار. حافظ على الألواح التجريبية عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪.
ملاحظة: لا تزعج طبقة خلية أحادية اللون أثناء إضافة الوسط الجديد الكامل. تأكد من بقاء الخلايا أحادية الطبقة دون إزعاج أثناء الحضانة. - احصل على صورة مجهرية في 0 ساعة و 24 ساعة باستخدام مجهر مقلوب. استخدم أداة التعليقات التوضيحية لقياس إغلاق الجرح في فترات زمنية مختلفة.
- احسب النسبة المئوية لإغلاق الجرح باستخدام الصيغة التالية: إغلاق الجرح (٪) = [(هجرة الخلايا (بالميكرومتر) عند 0 ساعة - هجرة الخلايا (بالميكرومتر) عند 24 ساعة) / هجرة الخلايا (بالميكرومتر) عند 0 ساعة] × 100.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يهدف هذا البحث إلى تصنيع الجسيمات النانوية باستخدام لحاء شجرة Eucommia ulmoides . تم تجفيف مادة اللحاء تماما في بيئة مظللة (الشكل 1). تم استخدام مواد اللحاء لتحضير المستخلص الخام المائي بالماء الساخن عن طريق تسخين العينات عند 130 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قد يؤدي التغيير الطفيف في درجة الحرارة والمدة إلى تعطيل المركبات النباتية وجعلها غير مناسبة لتحضير المستخلص المائي. مستخلصات اللحاء الخام المائي من E. ulmoides تم تحضيرها واستخدامها لتخليق الجسيمات النانوية (
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ال E. ulmoides لحاء, ويعتقد أن البذور, والأوراق تظهر العديد من الفوائد الصحية. أظهرت نتائجنا أن تخليق الجسيمات النانوية EU-ZnO تم تحقيقه باستخدام نهج بسيط وفعال من حيث التكلفة. تم استخدام المستخلص المائي لتصنيع الجسيمات النانوية. قد يتسبب تسخين مادة اللحاء في درجات حرارة عالية في تدهور بعض المكونات النباتية وتقليل كفاءة الاستخراج. يمكن للمكونات النباتية الموجودة في المستخلص العشبي المائي أن تقلل من أيونات المعادن لتكوين جزيئات نانوية. يستخدم ثنائي هيدرات نترات الزنك لتحضير جسيما...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا بصدق قسم بيولوجيا الخلية ، جامعة سنترال ساوث ، تشانغشا ، الصين ، على توفير مرافق الأجهزة.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 12 لوحة بئر | NEST | 703011 | تستخدم لزراعة الخلايا والفحص |
| جهاز الطرد المركزي | SCILOGEX | SC1406 | تستخدم لفصل الجسيمات النانوية عن الخليط الغروي أنبوب |
| الطرد المركزي &ndash ؛ 15 مل لتر | biofil | CFT-312150 | لطرد المركزي للمحلول المركب ؛ |
| أنبوب الطرد المركزي – 5 مل | Biosharp | BS-50-CM-S | لتخزين الجسيمات النانوية |
| CO2< / sub> حاضنة | حراري علمي | 3010 | لثقافة خلايا HUVEC |
| منزوعة الضوضاء في الماء | Millipore | غير قابل للتطبيق | لتحضير المستخلص |
| DMEM متوسط | Cytiva | SH30243.01 | يستخدم لعمل زراعة الخلايا |
| قمع | حراري علمي | 42600060 | لعقد ورق الترشيح أثناء الترشيح |
| أكواب زجاجية | البورسليكات ؛ | 1102-50 | يستخدم لتحضير المستخلص المائي |
| فرن الهواء الساخن | Genetimes | غير قابل للتطبيق | تستخدم لتجفيف الجسيمات النانوية وتجميعها في شكل مسحوق |
| النمام المغناطيسي | KYLIN-BELL | GL-5250-A | يستخدم لتخليق الجسيمات النانوية |
| مجهر | نيكون كسوف | TS2 | يستخدم لالتقاط الصور المصغرة |
| طبق بتري | NEST | 753001 | يستخدم لجمع الجسيمات النانوية ؛ |
| ماصة 1 مل | مختبر العلوم | YEA17AD0055580 | لأخذ/إضافة الحجم المحدد للمحلول/ |
| استخراج أطراف الماصة 1 مل | SAINING | 3014200-T | لأخذ / إضافة الحجم المحدد للمحلول / استخراج |
| PTFE خلاط مغناطيسي تحريك قضبان | LAN | RAN غير قابل للتطبيق | تستخدم لعملية تخليق المواد النانوية |
| هيدروكسيد الصوديوم | Sigma Alrich | 71690 | يستخدم لضبط درجة الحموضة أثناء التوليف |
| مقص غير قابل للصدأ | Deli | 6034 | يستخدم لتقطيع مواد اللحاء |
| قارورة ثقافة الأنسجة T25 | NEST | 707001 | تستخدم للحفاظ على الخلايا ؛ |
| ميزان الوزن | رادواج | AS220R2 | تستخدم لوزن المواد الكيميائية ؛ |
| ورق ترشيح Whatman رقم 1 | Newstar | GB / T1914-2017 | يستخدم لتصفية المستخلص لتخليق |
| نترات الزنك ؛ | سيجما ألريتش | 13778-30-8 | تستخدم كسلائف للجسيمات النانوية التوليف S |
المراجع
- Williamson, E. M., Liu, X., Izzo, A. A. Trends in use, pharmacology, and clinical applications of emerging herbal nutraceuticals. Br. J. Pharmacol. 177 (6), 1227-1240 (2020).
- Cedillo-Cortezano, M., Martinez-Cuevas, L. R., López, J. A. M., Barrera López, I. L., Escutia-Perez, S., Petricevich, V. L. Use of medicinal plants in the process of wound healing: a literature review. Pharmaceuticals. 17 (3), 303(2024).
- Budovsky, A., Yarmolinsky, L., Ben-Shabat, S. Effect of medicinal plants on wound healing. Wound Repair Regen. 23 (2), 171-183 (2015).
- Yazarlu, O., et al. Perspective on the application of medicinal plants and natural products in wound healing: A mechanistic review. Pharmacol Res. 174, 105841(2021).
- Zhu, M. Q., Sun, R. C. Eucommia ulmoides Oliver: a potential feedstock for bioactive products. J Agric Food Chem. 66 (22), 5433-5438 (2018).
- Peng, M., Zhou, Y., Liu, B. Biological properties and potential application of extracts and compounds from different medicinal parts (bark, leaf, staminate flower, and seed) of Eucommia ulmoides: A review. Heliyon. 10 (6), e27870(2024).
- Xing, Y. Y., et al. Inhibition of rheumatoid arthritis using bark, leaf, and male flower extracts of Eucommia ulmoides. Evid Based Complement Alternat Med. 2020, 3260278(2020).
- Guo, M., et al. Quantitative detection of natural rubber content in Eucommia ulmoides by portable pyrolysis-membrane inlet mass spectrometry. Molecules. 28 (8), 3330(2023).
- Yusof, H. M., Rahman, N. A., Mohamad, R., Zaidan, U. H., Samsudin, A. A. Biosynthesis of zinc oxide nanoparticles by cell-biomass and supernatant of Lactobacillus plantarum TA4 and its antibacterial and biocompatibility properties. Sci Rep. 10, 19996(2020).
- Gosens, I., et al. Impact of agglomeration state of nano-and submicron sized gold particles on pulmonary inflammation. Part Fibre Toxicol. 7 (1), 37(2010).
- Zare, Y. Study of nanoparticles aggregation/agglomeration in polymer particulate nanocomposites by mechanical properties. Compos A Appl Sci Manuf. 84, 158-164 (2016).
- Kim, M. G., et al. Effects of calcination temperature on the phase composition, photocatalytic degradation, and virucidal activities of TiO2 nanoparticles. ACS Omega. 6 (16), 10668-10678 (2021).
- Aydin Acar, C., Gencer, M. A., Pehlivanoglu, S., Yesilot, S., Donmez, S. Green and eco-friendly biosynthesis of zinc oxide nanoparticles using Calendula officinalis flower extract: Wound healing potential and antioxidant activity. Int Wound J. 21 (1), e14413(2024).
- Sana, S. S., et al. Crotalaria verrucosa leaf extract mediated synthesis of zinc oxide nanoparticles: assessment of antimicrobial and anticancer activity. Molecules. 25 (21), 4896(2020).
- Zhang, H., Liang, Z., Zhang, J., Wang, W. P., Zhang, H., Lu, Q. Zinc oxide nanoparticle synthesized from Euphorbia fischeriana root inhibits the cancer cell growth through modulation of apoptotic signaling pathways in lung cancer cells. Arab J Chem. 13 (7), 6174-6183 (2020).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
