يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

استخدام الملقط البصري لتوليد المركبات الهجينة

1.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67422

⸱

مايو 30, 2025

 ,  , 
1Department of Clinical and Experimental Pathology, Institute of General and Experimental Pathology, Wrocław Medical University, 2Department of Optics and Photonics, Faculty of Fundamental Problems of Technology, Wrocław University of Science and Technology

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الورقة ، نقترح بروتوكولا لتصنيع المركبات الهجينة باستخدام ملاقط بصرية. تسمح هذه الطريقة بالتحكم الدقيق في المراحل المبكرة من عملية تكوين الكرة ، والتي لا يمكن تحقيقها بطرق أخرى.

الملخص

لا تزال زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) من بين النماذج الأكثر استخداما في أبحاث السرطان قبل السريرية. ومع ذلك ، يبدو أن النماذج ثلاثية الأبعاد (3D) في المختبر تقيم البيئة في الجسم الحي بشكل أكثر دقة ، بما في ذلك التشكل المعماري الأكثر صلة ، والبيئة المكروية ، والاستجابات للأدوية.

يستخدم الاصطياد البصري شعاعا ليزريا مركزا واحدا أو أكثر للتلاعب بشكل غير جراحي بموضع الهياكل وحركتها وتفاعلها وديناميكياتها على مقياس النانو والميكرو. وجدت الملقط البصري (OT) العديد من التطبيقات في بيولوجيا الخلية. ومع ذلك ، لا تزال إمكاناتها في أبحاث السرطان مقومة بأقل من قيمتها. في هذه الورقة ، نوصي ببروتوكول غير جراحي لتكوين الخلايا الكروية لسرطان الغدد الليمفاوية باستخدام ملاقط بصرية. لا تقوم هذه الطريقة ببناء الكرات الهجينة من جديد فحسب ، بل تتيح أيضا التحكم في عدد الخلايا المرفقة ووقت تكوين الالتصاق ، مما يوفر مصدرا مهما للمعلومات لهندسة الأنسجة. علاوة على ذلك ، يتيح OT دراسة المراحل المبكرة من تكوين الكروي الهجين ، والذي لا يمكن تحقيقه باستخدام التقنيات السائبة القياسية. الأهم من ذلك ، يمكن استخدام النموذج الموصوف لدراسة الحد الأدنى من التغييرات في الالتصاق الناجمة عن الأدوية المضادة للسرطان. يمكن تطبيق هذا البروتوكول بسهولة على أنواع الخلايا الأخرى.

المقدمة

تعمل النماذج الخلوية ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) على تسريع أبحاث السرطان لأنها تشبه بشكل أفضل أنسجة الورم في العديد من الخصائص الوظيفية والهيكلية. وتشمل هذه ، من بين أمور أخرى ، إنتاج المصفوفة خارج الخلية ، والتفاعل بين الخلايا ، والحفاظ على تدرجات المغذيات والأكسجين ، والاستجابات المماثلة للعلاجات1،2،3،4. في الآونة الأخيرة ، لتعكس بشكل أفضل في ظروف الجسم الحي ، تم تطوير نماذج ثلاثية الأبعاد غير متجانسة متقدمة تتضمن أنواعا مختلفة منالخلايا 5،6،7.

سرطان الغدد الليمفاوية اللاهودجكينية للخلايا البائية (B-NHL) هو مجموعة غير متجانسة من الأورام الخبيثة التي تنشأ من الخلايا الليمفاوية البائية ، وهي مكونات لا يتجزأ من الجهازالمناعي 8. يتميز B-NHL بمجموعة متنوعة من العروض السريرية والسمات النسيجية ، ويشمل مجموعة من الاضطرابات ، بدءا من الأشكال البطيئة ذات المسار السريري المطول إلى المتغيرات العدوانية التي تتقدم بسرعة 9,10. غالبا ما يرتبط التسبب في B-NHL والأورام الخبيثة الدموية الأخرى بتأثير البيئة المكروية للورم11،12. على سبيل المثال ، غالبا ما تنتشر خلايا سرطان الغدد الليمفاوية إلى نخاع العظام ، مما قد يؤدي إلى مضاعفات تهدد الحياة13. تم التعرف على الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) ، وهي المكونات الرئيسية لمكانة نخاع العظم ، للتأثير على نمو الورم وتطوره14 ، إلى حد كبير من خلال التفاعلات المباشرة بين الخليةوالخلية 15،16،17 ؛ وبالتالي ، هناك حاجة ملحة لتطوير نماذج تسمح بدراسة مثل هذه التفاعلات. لقد أثبتنا سابقا أن الخلايا الجذعية الجذعية ، عندما يتم زراعتها بشكل مشترك على الهلاميات المائية الاغاروز مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية ، تتجمع ذاتيا في كرويات متعددة الخلايا ، مع الخلايا اللحمية التي تشكل اللب وتكون محاطة بشكل موحد بخلايا سرطان الغددالليمفاوية 18. في هذه الورقة ، نقدم بروتوكولا لتصنيع نموذج ثلاثي الأبعاد للخلايا اللمفاوية واللحمية الهجينة باستخدام ملاقط بصرية.

منذ أكثر من 35 عاما ، أبلغت آشكين لأول مرة عن ظاهرة الاصطياد البصري غير الغازي للفيروسات والبكتيريا بواسطة شعاع الليزرالمركز 19. في الوقت الحاضر ، تتمتع الملقط البصري (OT) بتأثير متزايد ديناميكيا في المجال الطبي الحيوي ، بما في ذلك أبحاث بيولوجيا الخلية20،21،22،23. سمح OT بدراسة ليس فقط الخصائص الفيزيائية والميكانيكية للخلية الفردية24،25،26ولكن أيضا التفاعلات المباشرة بين الخلية والخلية على مستوى خلية واحدة ، والمزيد من الترتيب الخلوي ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد وهيكلة27،28،29. تعتمد تقنية الاصطياد البصري على القوى البصرية لترتيب عدد قليل من البيكونوتون التي تمارس كإشعاع كهرومغناطيسي (فوتونات) ، والتي تغير زخمها عندما تتفاعل مع المادة30. نتيجة لذلك ، باستخدام واحد أو أكثر من أشعة الليزر ، يمكن للمشغلين معالجة المواضع والحركة وديناميكيات الأجسام بشكل انتقائي في المقياس الجزئيوالنانوي 20. من الناحية العملية ، تسمح تقنية الاصطياد البصري بالاصطياد الانتقائي وغير المدمر للخلايا الحية ، ووضعها على اتصال بسطح خلية أو جزيء آخر وبدء عملية الالتصاق31. باستخدام الوظائف المذكورة أعلاه ، حاولنا أولا وضع خلية لمفومة واحدة بصريا على طبقة أحادية من الخلايا اللحمية للتحقيق في خصائصها اللاصقة. بعد ذلك ، شرعنا في تقييم قدرة الملقط البصري على إعادة إنشاء كروي متعدد الخلايا فعليا في وضع الوقتالفعلي 33. لتحقيق ذلك ، تم احتجاز خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الفردية واحدة تلو الأخرى وربطها بجسم كروي ثلاثي الأبعاد معد مسبقا. كان التطبيق الآخر للاصطياد البصري هو قياس الحد الأدنى من وقت التصاق الخلية وتقييم التغيرات الدقيقة في الالتصاق الناتجة عن العلاج المضاد للسرطان34،35. على الرغم من أن النماذج ثلاثية الأبعاد تستخدم على نطاق واسع في أبحاث السرطان ، إلا أن دراسة المراحل المبكرة من تكوين الكرة الكروية لا تزال صعبة. ويرجع ذلك أساسا إلى التوافر المحدود للطرق التي تسمح بلمس العالم الصغير بدقة عالية وتأثير طفيف التوغل في نفس الوقت. على العكس من ذلك ، لم يتم تحقيق الإمكانات الكاملة ل OT في نطاق الترتيب الخلوي وهيكله في 3D. وبالتالي ، في هذه الورقة ، يتم وصف سير عمل مشترك لإنشاء بناء سرطان الغدد الليمفاوية ثلاثي الأبعاد باستخدام تقنيات ثلاثية الأبعاد القياسية والتلاعب في الملقط البصري خطوة بخطوة. الأهم من ذلك ، يمكن تكييف البروتوكول بسهولة للاستخدام مع أنواع الخلايا الأخرى ذات الأهمية في الأورام الخبيثة الدموية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصنيع القوالب الدقيقة القائمة على هلام الاغاروز

ملاحظة: تعتبر تقنيات التعقيم المناسبة ضرورية عند التعامل مع جميع مزارع الخلايا. يتم سرد جميع الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول في جدول المواد. قم بإعداد ثلاثة مواد هلامية مع الخلايا الجذعية الجذعية لتجربة واحدة كما هو موضح في الشكل 1 أ.

figure-protocol-1
الشكل 1: تحضير الخلايا اللحمية الوسيطة (MSC) الكرويات. (أ) رسم توضيحي يصور خطوة تحضير قوالب الاغاروز الدقيقة. (ب) بذر الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) ، وزراعة اللحمة الوسيطة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. ابدأ بتحضير قوالب الاغاروز الدقيقة. اشطف طبق بتري ثلاثي الأبعاد (انظر جدول المواد) بالماء منزوع الأيونات (3x) وضعه تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة لإجراء التعقيم.
  2. أولا ، قم بإعداد محلول الاغاروز 2٪. قم بقياس 1 جم من مسحوق الاغاروز المعقم النقي عالي الجودة (انظر جدول المواد) وضعه في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل. أضف 50 مل من محلول كلوريد الصوديوم المعقم بنسبة 0.9٪ (انظر جدول المواد) إلى الاغاروز واخلطه جيدا. قم بربط غطاء الأنبوب المخروطي حتى يصبح آمنا ولكنه لا يزال مفكوكا.
  3. استخدم فرن الميكروويف لغلي مسحوق الاغاروز وإذابة الثلج تماما. توقف عن الطهي في الميكروويف كل 10 ثوان وقم بتدوير الأنبوب المخروطي بعناية لضمان ذوبان الاغاروز. تجنب تكوين فقاعات أثناء خلط أو سحب اللاغاروس. يبرد الاغاروز إلى حوالي 70 درجة مئوية.
    ملاحظة: تأكد من عدم وجود بقايا من مسحوق شفاف غير مذاب.
    تنبيه: الاغاروز المنصهر شديد الحرارة ويمكن أن يسبب حروقا شديدة في الجلد.
  4. اعمل في خزانة التدفق الصفحي باستخدام تقنيات معقمة. قم بإعداد الهلاميات المائية عن طريق ملء القوالب الدقيقة المعقمة مسبقا ب 500 ميكرولتر من الاغاروز. استنشط أي فقاعات قد تكون محاصرة في السمات الصغيرة للقالب الدقيق باستخدام ماصة.
  5. بعد 15 دقيقة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، عندما يتجمد الاغاروز ، قم بإزالة المواد الهلامية بعناية من القوالب الدقيقة إلى صفيحة معقمة من 6 آبار. لا تتلف بنية الجل. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية ، تحقق تحت المجهر مما إذا كانت القوالب الدقيقة قد تم تحضيرها بشكل صحيح وتأكد من أن الحواف سليمة. تحقق من وجود أي فجوات يمكن أن يتسرب من خلالها الوسيط.
  6. أضف ما يكفي من محلول ملحي عازل للفوسفات 1x (PBS) لتغطية القوالب الدقيقة بالكامل قبل وضع اللوحة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة للتعقيم.
    ملاحظة: يمكن تخزين قوالب الاغاروز الدقيقة قبل الاستخدام لمدة تصل إلى أسبوعين في أنبوب مخروطي مغطى ب 1x PBS في ظروف الثلاجة (4 درجات مئوية).
  7. قبل استخدام القوالب الدقيقة لإنتاج الكرات ، قم بموازنة الجل عن طريق تغطيته بالكامل في وسط RPMI (4.0 مل / بئر للوحة 6 آبار) واحتضانها لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.

2. تحضير الخلايا اللحمية الوسيطة (MSCs) الكروية

  1. استزراع خط الخلايا HS-5 (انظر جدول المواد) ، وهو خط خلوي لحمي وسيط بشري ، في وسط مزرعة RPMI 1640 مكمل بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين - ستربتومايسين (انظر جدول المواد) في حالة قياسية ، مما يضمن تغيير الوسط كل 48 ساعة.
  2. عندما تكون خلايا HS-5 متقاربة بنسبة 90٪ تقريبا ، قم بإجراء مرور الخلية على النحو التالي:
    1. قم بإزالة وسائط الاستزراع باستخدام ماصة مصلية.
    2. اغسل الخلايا بإضافة 1x PBS والتحريك والشفط لإزالة أي وسائط متبقية.
    3. افصل الخلايا عن قاع قارورة المزرعة عن طريق إضافة 2 مل من محلول التربسين-EDTA (انظر جدول المواد) إلى قارورة زراعة الخلية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لتسهيل انفصال الخلية.
    4. أوقف التربسينية بإضافة 2 مل من وسط الثقافة الكامل.
    5. باستخدام ماصة سعة 5 مل ، قم بتعليق الخلايا برفق ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل.
    6. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 × جم لمدة 7 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا في 1 مل من وسط المزرعة الطازجة.
    7. خذ 10 ميكرولتر من حبيبات الخلية وانقلها إلى أنبوب 0.5 مل. ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول تريبان الأزرق 0.4٪ (انظر جدول المواد) واحسب الخلايا في عداد الخلايا الأوتوماتيكي (انظر جدول المواد).
    8. بناء على كثافة الخلايا التي تم الحصول عليها أعلاه ، قم بتخفيف الخلايا إلى 2 × 105 خلايا / مل من الوسط.
  3. قم بإزالة وسط زراعة الخلايا من قالب الاغاروز الصغير.
  4. قم بزرع 190 ميكرولتر من تعليق الخلية المذكور أعلاه بعناية (الخطوة 2.2.8) في غرفة بذر الخلية في قالب الاغاروز الصغير. سيحتوي البئر الواحد على ما يقرب من 150 خلية (38.000 خلية / هلام).
  5. احتضان الخلايا في قالب الاغاروز الدقيق في حاضنة (5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، 37 درجة مئوية ، جو رطب) لمدة 30 دقيقة حتى تستقر الخلايا في قاع الجل. بعد 30 دقيقة ، قم بإزالة اللوحة التي تحتوي على قالب دقيق من الحاضنة ، وأضف ببطء وسيطا إضافيا إلى الجزء الخارجي من المواد الهلامية ، وتغطيتها بالكامل (على سبيل المثال ، 4.0 مل / بئر للوحة 6 آبار).
    ملاحظة: لا تقم بإضافة الوسيط مباشرة إلى قالب الجل الاغاروز ، ولكن في طبق الثقافة ، وتجنب إتلاف الكرات الكروية المتكونة حديثا.
  6. ضع الجل في حاضنة عند 37 درجة مئوية في جو رطب بنسبة 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 72 ساعة حتى تتشكل كرويات موحدة. (الشكل 1 ب).
    ملاحظة: يوصى بمراقبة التكوين الكروي لمدة 3 أيام التالية تحت المجهر المقلوب. بشكل عام ، تبدأ الخلايا اللحمية الوسيطة في تكوين كرويات في غضون 24 ساعة ، ولكن قد تكون هذه العملية أسرع أو أبطأ مع ممرات وكثافات الخلايا المختلفة. بعد 72 ساعة من الحضانة على قالب الاغاروز المجهري ، تشكل الخلايا اللحمية الوسيطة كرويات موحدة نسبيا. ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنها قد تختلف في الحجم والشكل على الرغم من احتضانها في ظروف متطابقة. يجب استبدال الوسيط عندما يتغير من اللون الأرجواني والأحمر إلى الأصفر.

3. زراعة خلايا سرطان الغدد الليمفاوية والتحضير للاصطياد البصري

ملاحظة: تنمو خطوط الخلايا الدموية ، بما في ذلك خلايا سرطان الغدد الليمفاوية ، تطفو بحرية في وسط الاستزراع في قوارير مصممة لزراعة التعليق دون أي ارتباط بلوحة أو وعاء المزرعة. للحفاظ على خصائص الخلية المثلى ، يوصى بالبدء في تحضير العينة في موعد لا يتجاوز 30 دقيقة قبل إجراء تجميع المركبات الهجينة باستخدام الملقط البصري. الأهم من ذلك ، أن البروتوكول الموضح في هذا القسم مخصص لخط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية البشرية Ri-1 ، ولكن هناك بروتوكول مماثل ينطبق على خطوط الخلايا السرطانية الدموية الأخرى.

  1. استزراع خط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية Ri-1 (انظر جدول المواد) في وسط RPMI 1640 مكمل بنسبة 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
  2. احتفظ بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية في الحاضنة في ظل ظروف الاستزراع القياسية ، بما في ذلك 37 درجة مئوية والهواء المرطب مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2. حافظ على الثقافات بين 3-5 × 105 خلايا / مل في المرحلة اللوغاريتمية عن طريق المرور كل 2-3 أيام.
  3. اجمع الخلايا وانقل المعلق إلى أنبوب بوليسترين سعة 15 مل. الطرد المركزي للخلايا عند 300 × جم لمدة 7 دقائق في درجة حرارة الغرفة للحصول على حبيبات الخلية. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من الوسط الطازج ، ثم قم بتسخين الماصة برفق حتى يتم الحصول على تعليق متجانس.
  4. استنشق 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب طرد مركزي جديد وأضف 10 ميكرولتر من أزرق التريبان. قم بتثبيت المعلق جيدا قبل نقل 10 ميكرولتر إلى غرفة العد لتحديد كثافة الخلية وقابليتها للبقاء (عادة ما تكون أعلى من 95٪).
  5. قم بتخفيف معلق الخلية للوصول إلى كثافة نهائية تبلغ 1 × 104 خلايا / مل. حافظ على خلايا سرطان الغدد الليمفاوية عند 37 درجة مئوية حتى التلاعب البصري.

4. إعداد نظام الملقط البصري

ملاحظة: تم تطوير البروتوكول أدناه خصيصا للملاقط البصريةالمصممة خصيصا 36 (الشكل 2 أ). ومع ذلك ، يمكن استخدام هذا الاختبار مع أنظمة الاصطياد الأخرى المتاحة تجاريا. بغض النظر عن نوع المعدات المتوفرة ، تظل الخطوات الأساسية لإعداد النظام (على سبيل المثال ، بدء تشغيل الليزر وبرامج الكمبيوتر ، وتركيب العينة ، واختبار إمكانية تحريك الخلية في مصيدة بصرية) كما هي. أجريت جميع التجارب في درجة حرارة الغرفة ، أي 25 درجة مئوية.

figure-protocol-2
الشكل 2: رسم تخطيطي يوضح آلية عمل توليد المركبات الهجينة بواسطة ملاقط بصرية. (أ) إعداد ملاقط بصرية مصممة خصيصا. (ب) عملية ربط خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الفردية بسطح الخلايا الجذعية الكروية. تم احتجاز خلية لمفومة واحدة بصريا وربطها بسطح كروي لحمي حتى تم تشكيل اتصال مستقر. استمرت هذه العملية حتى تم تغطية سطح النجمة الكروية بالكامل بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية. (ج) تم الحصول على صورة تمثيلية للتلوين الكيميائي المناعي للقسم الكروي الهجين باستخدام جسم مضاد للفأر أحادي النسيلة مضاد ل CD20 ضد CD20. تم إجراء التلوين المناعي باستخدام جسم مضاد للفأر أحادي النسيلة مضاد للإنسان ضد CD20 على صبغة تلقائية (انظر جدول المواد) ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. قم بتشغيل مصدر ضوء المجهر.
  2. ارتد زجاجا واقيا آمنا لليزر.
  3. قم بتشغيل الليزر واضبط الطاقة للحصول على صلابة مصيدة تبلغ حوالي 50 pN / μm في نظام الملقط البصري. قبل المتابعة ، انتظر لمدة 10 دقائق ، مما يسمح لشعاع الليزر بالاستقرار.
    ملاحظة: في النظام المصمم خصيصا ، يتم تحقيق صلابة المصيدة المعطاة لقوة الليزر البالغة 100 ميجاوات عند مدخل هدف المجهر المقاس بحبة البوليسترين 3 ميكرومتر. تم تأكيد الحد الأدنى من التوغل على خلايا سرطان الغدد الليمفاويةسابقا 32،33 ، مع الحفاظ على القدرة على التلاعب بالخلايا الحية.
  4. في غضون ذلك ، ابدأ تشغيل برنامج الكمبيوتر. في نافذة البرنامج ، ستظهر صورة لعينة المجهر. استخدم العلامات المرئية على الشاشة لتحريك التراكب اللوني البصري في الاتجاه المطلوب.
  5. بمجرد أن يصبح النظام جاهزا ، أضف 30 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى مركز الهدف السفلي.
    ملاحظة: يستخدم النظام المصمم خصيصا هدف الغمر في الماء. ومع ذلك ، قد تختلف وسائط الغمر اعتمادا على إعداد المستخدم.
  6. ضع طبق زراعة خلية مقاس 35 مم (انظر جدول المواد) بقاع زجاجي على مرحلة المجهر. ثبت الطبق مع الحاملات.
  7. ارفع الهدف باستخدام برغي المجهر المجهري حتى تلامس حبة الماء القاع الزجاجي للطبق.
  8. باستخدام المسمار الميكرومتري ، اضبط المرحلة المجهرية برفق حتى يرى المرء شعاع الليزر مركزا بشكل حاد في نقطة مضيئة واحدة على الشاشة. ستكون صورة لعينة المجهر موجودة في نافذة البرنامج. استخدم العلامات المرئية على الشاشة لتحريك التراكب اللوني البصري في أي اتجاه مرغوب.
  9. أضف 100 ميكرولتر من تعليق خلايا سرطان الغدد الليمفاوية المعد مسبقا (انظر النقطة 3.5) إلى وسط الطبق ذو القاع الزجاجي. دعهم يغرقون في قاع الطبق لمدة 5 دقائق تقريبا.
  10. باستخدام حركات مرحلة المجهر ، ابحث عن خلية سرطان الغدد الليمفاوية العائمة. اسمح للتراكب اللوني البصري بضرب العينة بالنقر فوق مؤشر التراكب اللوني على الشاشة. حاول نقل الخلية إلى الموقع المطلوب. يجب أن تكون الخلية مفيدة للتلاعب ، وأن تكون قادرة على التحرك بسهولة في الاتجاه المحدد.
    ملاحظة: وفقا لملاحظتنا ، فإن ما بين 5 إلى 10٪ من خلايا سرطان الغدد الليمفاوية المضافة إلى الطبق الزجاجي سوف تلتصق بشكل دائم بالقاع بعد فترة الحضانة. ستزداد هذه النسبة مع مدة التلاعب وقد تصل إلى 30٪ بعد 60 دقيقة. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الخسائر ، فإن عدد الخلايا المضافة في البداية إلى الطبق سيسمح بالمعايرة الفعالة للنظام وتغطية الكروية بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية.

5. توليد الكرويات الهجينة باستخدام ملاقط بصرية

  1. قم بإزالة كروي لحمي واحد بعناية من بئر قالب الاغاروز بطرف ماصة (100-1000 ميكرولتر) وضعه على طبق سفلي زجاجي مجهري مقاس 35 مم.
  2. أضف 2 مل من وسط زراعة RPMI واحتضنه لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية في ظل الظروف القياسية. خلال هذا الوقت ، سوف يلتصق الكروي بلطف بالزجاج ، مما يمنع الحركة أثناء التلاعب.
  3. ضع الطبق الذي يحتوي على الكروية على مرحلة المجهر وقم بتثبيت الطبق على المرحلة المجهرية مع الحاملات.
  4. أضف بعناية 100 ميكرولتر من محلول خلايا سرطان الغدد الليمفاوية بكثافة نهائية تبلغ 1 × 104 خلايا / مل (الخطوة 3.5). دعهم يغرقون في قاع الطبق لمدة 5 دقائق تقريبا.
  5. باستخدام حركات مرحلة المجهر ، ابحث عن خلية سرطان الغدد الليمفاوية العائمة. اسمح للتراكب اللوني البصري بضرب الخلية المحددة بالنقر فوق مؤشر التراكب اللوني على الشاشة. بمجرد أن يتم احتجاز الخلية ونقلها ، حرك مرحلة المجهر لتوصيل الخلية إلى ملامسة السطح الكروي اللحمي.
  6. ابدأ بربط خلية سرطان الغدد الليمفاوية بسطح اللحمة الكروية لمدة 10 ثوان. بعد ذلك ، تحقق مما إذا كانت الخلية مرتبطة بشكل دائم بثلاث محاولات متكررة لفصل خلية سرطان الغدد الليمفاوية باستخدام الملقط البصري.
  7. إذا تم كسر الاتصال الخلوي ، فقم بتوصيل خلية سرطان الغدد الليمفاوية بالسطح الكروي مرة أخرى باستخدام المصيدة البصرية ؛ ومع ذلك ، هذه المرة لفترة أطول من الوقت ، حوالي 20 ثانية.
    ملاحظة: من الضروري تحديد فترات زمنية محددة للفك الوحيدي الخلية لكل خط خلية على حدة. في التلاعب الأولي ، ثبت أن خلايا سرطان الغدد الليمفاوية لخط خلايا Ri-1 تظهر خاصية لاصقة قوية للسكرات اللحمية ، وترتبط في الغالب في 10-20 ثانية بسطحها. وبالتالي ، كانت الفترات الزمنية المحددة للتلامس لمحاصرة خلية Ri-1 المفردة 10 و 20 و 30 ثانية. نظرا لطبيعة الإجراء التي تستغرق وقتا طويلا ، يوصى باستخدام خطوط الخلايا بحد أدنى من وقت الالتصاق لا يزيد عن 30 ثانية لتكوين كروي باستخدام ملاقط بصرية.
  8. كرر الإجراء مع خلايا سرطان الغدد الليمفاوية اللاحقة حتى يتم تغطية سطح اللحمة الكروية بالكامل بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية.
  9. لتغطية السطح المتاح للجسم الكروي بشكل موحد بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية ، من الضروري تغيير موضع المصيدة البصرية في حجم العينة المجهرية. من خلال تغيير مستوى التصوير باستخدام برغي المجهر المجهري ، يمكن للمرء تغيير موضع المصيدة البصرية ، مما يتيح حركة أكثر عمقا للأجسام المحاصرة في العينة.
  10. لتمثيل الكروي المتشكل تلقائيا بشكل أفضل ، قم بتغطية قلب الخلايا اللحمية ب 2-3 طبقات من خلايا سرطان الغدد الليمفاوية.
  11. انقل الطبق ذو القاع الزجاجي الذي يحتوي على الكروي إلى حاضنة لمدة ساعة واحدة من الحضانة في ظل الظروف القياسية.
    ملاحظة: يمكن استزراع الكروي الهجين على المدى الطويل في 20 ميكرولتر من وسط RPMI في قطرة معلقة.

6. تحديد الجدوى الكروية

  1. قم بتقييم جدوى كروي الخلية باستخدام مجموعة تلطيخ حية / ميتة (انظر جدول المواد). قم بإزالة وسط الثقافة برفق واغسل الكروي مباشرة باستخدام 100 ميكرولتر من 1x PBS.
  2. احتضان الكروي في 100 ميكرولتر من محلول 1x PBS يحتوي على 1 ميكرومتر من الكالسين-AM، و 2 ميكرومتر من homodimer الإيثيديوم-1 لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  3. راقب الكرويات باستخدام المجهر الفلوري (انظر جدول المواد) والتقط الصور (انظر جدول المواد).
    ملاحظة: ليست هناك حاجة لغسل الكرة الكروية بعد تلطيخها. مستويات مضان الخلفية منخفضة بطبيعتها مع هذا الاختبار لأن الأصباغ غير فلورية تقريبا قبل التفاعل مع الخلايا.
  4. باستخدام برنامج ImageJ (انظر جدول المواد) ، حدد الجدوى الكروية عن طريق حساب نسبة المساحة الملطخة باللون الأخضر (الخلايا الحية) إلى المساحة الإجمالية الملطخة باللون الأحمر (الخلايا الميتة) والأخضر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

أظهرت نتائجنا السابقة أن الخلايا اللحمية الوسيطة المزروعة بخلايا سرطان الغدد الليمفاوية تشكل النواة اللحمية المتجانسة التي ترتبط بها الخلايا السرطانية بشكل موحد18. في هذه الدراسة ، نجحنا في تصميم الكرة الكروية البشرية الهجينة التي تتكون من خلايا لحمة وسيطة وخلايا سرطان الغدد الليمفاوية باستخدام ملاقط بصرية مصممة خصيصا. يوضح الشكل 2 ب درويا تمثيليا في مجهر المجال الساطع ، وهو جزء أساسي من نظام الملقط البصري. في المقابل ، يعرض الشكل 2C التل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة ، تم تصميم الكرويات الهجينة لخلايا اللحمة اللحمية المتوسطة وخلايا سرطان الغدد الليمفاوية في الوقت الفعلي باستخدام الملقط البصري. التقنيات الجديدة القائمة على الليزر ، بما في ذلك أنظمة الاصطياد ، متاحة الآن تجاريا وأصبحت شائعة بشكل متزايد. ومع ذلك ، حتى الآن ، لا تزال غالبية الملقط البصري عبارة عن أدوات مصممة خصيصا. وبالتالي ، يمكن أن تختلف المعايرة وإجراءات التشغيل والهندسة التجريبية بين المختبرات38،39. يصف هذا الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يعرب المؤلفون عن امتنان صادق نيكولاس تزارنيك ، الذي أدى تحريره الدقيق إلى تحسين وضوح الدراسة بشكل كبير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
µ-طبق 35 مم, ارتفاع الزجاج القاعIBIDI81158
12-256 mico-mould 3D PetriDish شركة Microtissue Inc. ، RI ، الولايات المتحدة الأمريكية12-256TR
3 & micro ؛ م البوليسترين المجهريPolysciences17134-15
الجسم المضاد CD20 (استنساخ L26)الآلي DakoIS604
، EVENanoEntekEVE / EVE-MC
Autostainer Link 48DakoD09634
Camera أوليمبوسU-TV0.63XC
CelCulture حاضنة CO2Esco Technologies، Inc.الخلايا CCL
، خط خلية EVENanoEntekNE-EVS
HS-5ATCCCRL-3611
خط الخلية Ri-1 & nbsp ؛DSMZ ACC 585
مصل الأبقار الجنينيGibcoA5256701
المجهر الفلوري OlympusBX43
ImageJالمعاهد الوطنية للصحة ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية
المجهر المقلوبأوليمبوسIX73
مجموعة الكاشف الحي / الميت   ؛ثيرمو فيشر ScientificL3224
البنسلين الستربتومايسين (10،000 وحدة / مل)جيبكو15140122
فوسفات ملحي مخزن ، درجة الحموضة 7.4جيبكو10010023
RPMI 1640 متوسطجيبكو11875093
محلول كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش7647-14-5
محلول كلوريد الصوديوم 0.9٪ ، معقمكواشف ITW ReITW ، وكلاء SRL ، SRLA1671
Trypan Blue Solution ، 0.4٪Gibco15250061
TrypLE Express Enzyme (1X) ، بدون فينول أحمرGibco12604013
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، فينول أحمرGibco25300096
UltraPure AgaroseInvitrogen16500500
<قوي > إعداد ملاقط بصرية < / قوي>
مرايا ثنائية اللونThorlabsDMSP805R
كاميرا رقميةMikrotron GmbHMC1362
نظام المسح الضوئي Galvano-mirror XYThorlabsGVS002
المجهر المقلوب  أوليمبوسIX71
1عدسة ThorlabsAC254-050-B-ML
2ThorlabsAC508-200-B-ML
Nd: YAG 1064 نانومترليزر ليزر الكمVentus
عداد الخلايا شرائح عد برنامج عدسة

المراجع

  1. Brancato, V., Oliveira, J. M., Correlo, V. M., Reis, R. L., Kundu, S. C. Could 3D models of cancer enhance drug screening. Biomaterials. 232, 119744(2020).
  2. Fontoura, J. C., et al. Comparison of 2D and 3D cell culture models for cell growth, gene expression and drug resistance. Mater Sci Eng. C. 107, 110264(2020).
  3. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  4. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiology (Bethesda). 32 (4), 266-277 (2017).
  5. Barbosa, M. A. G., Xavier, C. P. R., Pereira, R. F., Petrikaitė, V., Vasconcelos, M. H. 3D cell culture models as recapitulators of the tumor microenvironment for the screening of anti-cancer drugs. Cancers (Basel). 14 (1), 190(2021).
  6. Jubelin, C., et al. Three-dimensional in vitro culture models in oncology research. Cell Biosci. 12, 155(2022).
  7. Pape, J., Emberton, M., Cheema, U. 3D cancer models: the need for a complex stroma, compartmentalization and stiffness. Front Bioeng Biotechnol. 9, 660502(2021).
  8. Singh, R., et al. Non-Hodgkin's lymphoma: A review. J Family Med Prim Care. 9 (4), 1834-1840 (2020).
  9. Campo, E., et al. The International consensus classification of mature lymphoid neoplasms: a report from the clinical advisory committee. Blood. 140 (11), Erratum in: Blood. 141 (4), 437 (2023). 1229-1253 (2022).
  10. Swerdlow, S. H., et al. The 2016 revision of the World Health Organization classification of lymphoid neoplasms. Blood. 127 (20), 2375-2390 (2016).
  11. Ng, W. L., Ansell, S. M., Mondello, P. Insights into the tumor microenvironment of B cell lymphoma. J Exp Clin Cancer Res. 41, 362(2022).
  12. Mancini, S. J. C., et al. Deciphering tumor niches: lessons from solid and hematological malignancies. Front Immunol. 12, 766275(2021).
  13. Zhang, Q. Y., Foucar, K. marrow involvement by Hodgkin and non-Hodgkin lymphomas. Hematol. Oncol Clin North Am. 23 (4), 873-902 (2009).
  14. Gao, Q., et al. marrow mesenchymal stromal cells: Identification, classification, and differentiation. Front Cell Dev Biol. 9, 787118(2022).
  15. Lwin, T., et al. Lymphoma cell adhesion-induced expression of B cell-activating factor of the TNF family in bone marrow stromal cells protects non-Hodgkin's B lymphoma cells from apoptosis. Leukemia. 23 (1), 170-177 (2009).
  16. Kumar, A., Bhattacharyya, J., Jaganathan, B. G. Adhesion to stromal cells mediates imatinib resistance in chronic myeloid leukemia through ERK and BMP signaling pathways. Sci Rep. 7 (1), 9535(2017).
  17. Cuiffo, B. G., Karnoub, A. E. Mesenchymal stem cells in tumor development: emerging roles and concepts. Cell Adh Migr. 6 (3), 220-230 (2012).
  18. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Rymkiewicz, G. Development and characterization of 3D hybrid spheroids for the investigation of the crosstalk between B-Cell non-Hodgkin lymphomas and mesenchymal stromal cells. OncoTargets Ther. 15, 683-697 (2022).
  19. Ashkin, A., Dziedzic, J. M. Optical trapping and manipulation of viruses and bacteria. Science. 235, 1517-1520 (1987).
  20. Spyratou, E. Advanced biophotonics techniques: The role of optical tweezers for cells and molecules manipulation associated with cancer. Front Phys. 10, 247-285 (2022).
  21. Choudhary, D., Mossa, A., Jadhav, M., Cecconi, C. Bio-molecular applications of recent developments in optical tweezers. Biomolecules. 9 (1), 23(2019).
  22. Nussenzveig, H. M. Cell membrane biophysics with optical tweezers. Eur Biophys J. 47 (5), 499-514 (2018).
  23. Zhang, X., Ma, L., Zhang, Y. High-resolution optical tweezers for single-molecule manipulation. Yale J Biol Med. 86 (3), 367-383 (2013).
  24. Li, X., et al. Optical tweezers study of membrane fluidity in small cell lung cancer cells. Opt Express. 29 (8), 11976-11986 (2021).
  25. Wullkopf, L., et al. Cancer cell's ability to mechanically adjust to extracellular matrix stiffness correlates with their invasive potential. Mol Biol Cell. 29, 2378-2385 (2018).
  26. Yousafzai, M. S., et al. Effect of neighboring cells on cell stiffness measured by optical tweezers indentation. J Biomed Opt. 21 (5), 57004(2016).
  27. Gupta, S. K., et al. Quantification of cell-matrix interaction in 3D using optical tweezers. Multi-Scale Extracellular Matrix Mechanics and Mechanobiology. Studies in Mechanobiology, Tissue Engineering and Biomaterials. Zhang, Y. , Springer. Berlin/Heidelberg, Germany. 283-310 (2020).
  28. Ma, Z., et al. Laser patterning for the study of MSC cardiogenic differentiation at the single-cell level. Light Sci Appl. 2, 68(2013).
  29. Kirkham, G. R., et al. Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers. Sci Rep. 5, 8577(2015).
  30. Pesce, G., et al. Optical tweezers: theory and practice. Eur Phys J Plus. 135, 949(2020).
  31. Avsievicha, T., Zhua, R., Popovb, A., Bykova, A., Meglinski, I. The advancement of blood cell research by optical tweezers. Rev Phys. 5, 100043(2020).
  32. Duś-Szachniewicz, K., et al. Physiological hypoxia (physioxia) impairs the early adhesion of single lymphoma cell to marrow stromal cell and extracellular matrix. Optical tweezers study. Int J Mol Sci. 19, 1880(2018).
  33. Duś-Szachniewicz, K., Gdesz-Birula, K., Nowosielska, E., Ziółkowski, P., Drobczyński, S. Formation of lymphoma hybrid spheroids and drug testing in real time with the use of fluorescence optical tweezers. Cells. 11 (13), 2113(2022).
  34. Hu, S., Gou, X., Han, H., Leung, A. Y., Sun, D. Manipulating cell adhesions with optical tweezers for study of cell-to-cell interactions. J Biomed Nanotechnol. 9 (2), 281-285 (2013).
  35. Johansen, P., Fenaroli, F., Evensen, L., Griffiths, G., Koster, G. Optical micromanipulation of nanoparticles and cells inside living zebrafish. Nat Commun. 7, 10974(2016).
  36. Drobczyński, S., Duś-Szachniewicz, K. Real-time force measurement in double wavelength optical tweezers. J Opt Soc AmB. 34, 38-43 (2017).
  37. Pavlasova, G., Mraz, M. The regulation and function of CD20: an "enigma" of B-cell biology and targeted therapy. Haematologica. 105 (6), 1494-1506 (2020).
  38. Gieseler, J., et al. Optical tweezers- from calibration to applications: a tutorial. Adv Opt Mater. 13, 74-241 (2021).
  39. Bustamante, C. J., Chemla, Y. R., Liu, S., Wang, M. D. Optical tweezers in single-molecule biophysics. Nat Rev Methods Primers. 1, 25(2021).
  40. Mitrakas, A. G., et al. Applications and advances of multicellular tumor spheroids: Challenges in their development and analysis. Int J Mol Sci. 24 (8), 6949(2023).
  41. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: systems biology of HEK293 cell line development. Sci Rep. 10, 18996(2020).
  42. Ling, Y., et al. A cell-laden microfluidic hydrogel. Lab on a Chip. 7 (6), 756-762 (2007).
  43. Azizipour, N., Avazpour, R., Sawan, M., Ajji, A., Rosenzweig, H. Surface optimization and design adaptation toward spheroid formation on-chip. Sensors. 22 (9), 3191(2022).
  44. Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620(2019).
  45. Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase. Cancer Cell Int. 21, 152(2021).
  46. Feng, Q., Li, D., Li, Q., Cao, X., Dong, H. Microgel assembly: Fabrication, characteristics, and application in tissue engineering and regenerative medicine. Bioact Mater. 9, 105-119 (2021).
  47. Volpe, G., et al. Roadmap for optical tweezers. J Phys Photonics. 5, 022501(2023).
  48. Pradhan, M., Pathak, S., Mathur, D., Ladiwala, U. Optically trapping tumor cells to assess differentiation and prognosis of cancers. Biomed Opt Express. 7, 943(2016).
  49. Duś-Szachniewicz, K., et al. Differentiation of single lymphoma primary cells and normal B-cells based on their adhesion to mesenchymal stromal cells in optical tweezers. Sci Rep. 9, 9885(2019).
  50. Gdesz-Birula, K., Drobczyński, S., Sarat, K., Duś-Szachniewicz, K. Sonidegib Inhibits the adhesion of acute myeloid leukemia to the bone marrow in hypoxia: An optical tweezer study. Biomedicines. 13, 578(2025).
  51. Matheson, A. B., et al. Optical tweezers with integrated multiplane microscopy (OpTIMuM): A new tool for 3D microrheology. Sci Rep. 11, 5614(2021).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

زراعة الخلايا ثلاثية الأبعادخلايا الليمفوماالكريات السدويةالاحتجاز البصريالتصاق الخلايامجهر الفلورسنتقالب أغاروز دقيقهندسة الأنسجة
استخدام الملقط البصري لتوليد المركبات الهجينة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.