مقالة منهجية

تحليل القياس الخلوي الكتلي للاستجابات المناعية الجهازية والمحلية في سرطان الخلايا الكبدية

DOI:

10.3791/67425

⸱

أبريل 25, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Hepatobiliary and Pancreatic Surgery, The First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد هذا البروتوكول طريقة تحليل شاملة لقياس الكتلة (القياس الخلوي حسب وقت الرحلة [CyTOF]) لتقييم الاستجابات المناعية الجهازية والمحلية في سرطان الخلايا الكبدية (HCC). يهدف هذا النهج إلى تقديم رؤى حول المشهد المناعي لسرطان الكبد ، مما يوفر فهما أعمق للبيئة المكروية للورم وآليات المناعة المرتبطة به.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو أحد أكثر أشكال سرطان الكبد شيوعا وفتكا في جميع أنحاء العالم. على الرغم من التقدم في العلاج ، لا يزال تشخيص مرضى سرطان الكبد ضعيفا بسبب التفاعل المعقد للعوامل الوراثية والبيئية والمناعية التي تدفع تطوره. يعد فهم المشهد المناعي لسرطان الكبد أمرا بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة ، لا سيما في مجال العلاج المناعي ، والذي يحمل وعودا كبيرة لتحسين نتائج المرضى. تستخدم هذه الدراسة تقنية القياس الخلوي الكتلي (القياس الخلوي حسب وقت الرحلة [CyTOF]) للتحقيق في الاستجابات المناعية الجهازية والمحلية في المرضى الذين يعانون من سرطان الكبد. من خلال تحليل عينات الدم والأورام المحيطية ، يهدف البحث إلى تحديد مجموعات الخلايا المناعية الفريدة ، وحالاتها الوظيفية المرتبطة بتطور سرطان الكبد. تقدم النتائج نظرة عامة شاملة على المشهد المناعي في سرطان الكبد ، مع تسليط الضوء على المؤشرات الحيوية المحتملة والأهداف العلاجية. يقدم هذا النهج رؤى قيمة حول الآليات المناعية الكامنة وراء سرطان الكبد ويمهد الطريق لتطوير علاجات مناعية أكثر فعالية لهذا الورم الخبيث.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان الخلايا الكبدية (HCC) هو سرطان الكبد الأولي الأكثر شيوعا ومشكلة صحية عالمية كبيرة بسبب ارتفاع معدلات الإصابة والوفيات1. وفقا لمنظمة الصحة العالمية ، يصنف سرطان الكبد خامس أكثر أنواع السرطان شيوعا وثاني سبب رئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان في جميع أنحاءالعالم 2. وهو منتشر بشكل خاص في المناطق التي ترتفع فيها معدلات الإصابة بعدوى التهاب الكبد B وC المزمنة، مثل شرق آسيا وأفريقيا جنوب الصحراءالكبرى3. تشمل عوامل الخطر الرئيسية التهاب الكبد الفيروسي وتليف الكبد ومتلازمة التمثيل الغذائي4. يتطلب سرطان الكبد علاجا طويل الأمد ، ويفرض أعباء مادية ومالية كبيرة ، مما يؤكد الحاجة إلى الوقاية الفعالة والكشف المبكر واستراتيجيات العلاجالمبتكرة 5.

يلعب الجهاز المناعي دورا مهما في تطور سرطان الكبد. الكبد هو عضو نشط مناعيا مع وفرة من الخلايا المناعية ، بما في ذلك البلاعم المقيمة في الكبد ، والخلايا القاتلة الطبيعية (NK) ، والخلايا التائية ، والتي تعتبر ضرورية لمراقبة الخلايا غير الطبيعية والقضاءعليها 6. ومع ذلك ، يمكن أن يتجنب سرطان الكبد المراقبة المناعية عن طريق التعبير عن الجزيئات المثبطة للمناعة ، وتجنيد الخلايا المثبطة للمناعة ، وتغيير البيئة المكروية للورم7،8. لا يعزز هذا الهروب المناعي نمو الورم والورم الخبيث فحسب ، بل يؤثر أيضا على الاستجابة للعلاج المناعي9،10.

تعد الاستجابات المناعية الجهازية والمحلية في البيئة المكروية للورم من العوامل الرئيسية التي تؤثر على تطور السرطان والنتائج العلاجية. تتضمن الاستجابات المناعية الجهازية الخلايا المناعية المنتشرة التي يمكنها التعرف على الخلايا السرطانية البعيدة ومهاجمتها، مثل الخلايا التائية الطرفية والخلايا القاتلة الطبيعية والخلايا الوحيدة التي يمكنها استهداف الخلايا السرطانية في جميع أنحاء الجسم. تركز الاستجابات المناعية المحلية على نشاط الخلايا المناعية داخل البيئة المكروية للورم ، بما في ذلك الخلايا الليمفاوية المتسللة للورم (TILs) ، والضامة المرتبطة بالورم (TAMs) ، والخلايا التائية التنظيمية (Tregs). في حين أن TILs غالبا ما يكون لها تأثيرات سامة للخلايا ضد الخلايا السرطانية ، فإن TAMs و Tregs تساهم عادة في بيئة مثبطة للمناعة تدعم نموالورم 11،12. يمكن للخلايا السرطانية والخلايا اللحمية إعادة تشكيل البيئة المكروية للورم لتعزيز تثبيط المناعة والتهرب من المراقبة المناعية. يحدد التفاعل بين الاستجابات المناعية الجهازية والمحلية الفعالية الإجمالية للمناعة المضادةللورم 11. يمكن أن يساعد فهم هذا التفاعل في تطوير استراتيجيات علاج مناعي أكثر فعالية.

على الرغم من استخدام قياس التدفق الخلوي التقليدي والكيمياء المناعية على نطاق واسع في الدراسات المناعية ، إلا أنهما يظهران قيودا كبيرة عندما يتعلق الأمر بتحليل المناظر الطبيعية المناعية المعقدة بسبب عدم قدرتهما على إجراء تحليل شامل وعالي الأبعاد. قياس التدفق الخلوي فعال للغاية في الكشف عن العلامات السطحية والوظيفية على مستوى الخلية الواحدة. ومع ذلك ، فإن قدرتها على التحليل المتزامن متعدد العلامات مقيدة ، وغالبا ما تكون محدودة بسبب التداخل الطيفي والقيود العملية على عدد علامات الفلورسنت التي يمكن استخدامها13،14. من ناحية أخرى ، توفر الكيمياء المناعية رؤى قيمة في سياق الأنسجة لعلامات محددة ، ولكنها تعوقه بالمثل العدد المحدود من العلامات القابلة للتحليل والصعوبات الكامنة في تحقيق تقييمات قوية وكمية وعاليةالأبعاد 15.

لتوصيف البيئات المناعية المعقدة بشكل فعال ، تعد التقنيات عالية الأبعاد مثل قياس الكتلة الخلوية (القياس الخلوي حسب وقت الرحلة [CyTOF]) ضرورية. قياس الكتلة الخلوي هو تقنية متقدمة تستخدم قياس الطيف الكتلي لتحليل علامات البروتين المتعددة في الخلايا المفردة. إنه يتيح التحليل متعدد العوامل للخلايا الفردية دون مشكلات التداخل الطيفي التي تظهر في قياس التدفق الخلويالتقليدي 16. باستخدام الأجسام المضادة ذات العلامات المعدنية ، يمكنه قياس عشرات العلامات في وقت واحد ، مما يوفر رؤية شاملة وغير متحيزة للأنماط الظاهرية والوظائف الخلوية17. على سبيل المثال ، Gadalla et al. طور لوحة CyTOF مع أكثر من 40 معلمة لتحليل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMC) والأنسجة السرطانية ، مما يدل على ميزتها في التنميط المناعي عاليالأبعاد 18. لم يكن قياس التدفق الخلوي التقليدي ، مع العدد المحدود من المعلمات التي يمكن اكتشافها ، قادرا على تحديد مجموعات الخلايا النادرة هذه التي تظهر أنماطا ظاهرية فريدة. في المقابل ، مكن قياس الكتلة الخلوي من إجراء تقييم شامل للحالات الوظيفية لهذه الخلايا ، مما يوفر توصيفا أكثر تفصيلا وقوة. استخدم بهبهاني وآخرون قياس الكتلة الخلوي لتحليل عينات نخاع العظام من المرضى الذين يعانون من متلازمات خلل التنسج النقوي (MDS) ، حيث نجحوا في تحديد وتوصيف الخلايا السلفية النادرة الشاذة المكونةللدم 18. عززت قدرة قياس الكتلة الخلوية على اكتشاف أكثر من 40 علامة سطحية وداخل الخلايا في وقت واحد بشكل كبير اكتشاف هذه المجموعات الفرعية للخلايا منخفضةالتردد 19. تتغلب هذه القدرات على القيود التقليدية وتوفر رؤى أعمق في المناظر المناعية ، مما يؤدي إلى التقدم في علم المناعة والتطوير العلاجي. إن القدرة على تحديد الأنماط الظاهرية والوظائف الخلوية بشكل شامل على مستوى الخلية المفردة تعزز بشكل كبير فهم العمليات المناعية وتساعد في تطوير العلاجات المستهدفة.

يوفر قياس الكتلة الخلوي رؤى شاملة لمجموعات الخلايا المناعية الجهازية والمحلية في سرطان الكبد من خلال الكشف في نفس الوقت عن علامات البروتين المتعددة. يمكن لهذه التقنية التمييز بين أنواع مختلفة من الخلايا التائية داخل البيئة المكروية للورم ، مثل الخلايا التائية المستجيبة ، والخلايا التائية التنظيمية (Tregs) ، والخلايا التائية المنهكة ، مما يوضح أدوارها المحددة في تطور الورم. من خلال استخدام قياس الكتلة الخلوية ، يمكن للباحثين تحديد العلامات المناعية المرتبطة بتشخيص سرطان الكبد20. على سبيل المثال ، يمكن أن تكون المجموعات الفرعية للخلايا التائية ذات التعبير العالي لبروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1) بمثابة تنبؤات لاستجابة المريض لمثبطات نقاط التفتيش المناعية21. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يسهل اكتشاف أهداف علاجية جديدة من خلال تحديد جزيئات معينة مثبطة للمناعة ، وبالتالي توفير أساس لاستراتيجيات العلاج الشخصية. إن قدرة التكنولوجيا على اكتشاف علامات متعددة ودقتها أحادية الخلية تجعلها مفيدة بشكل خاص للكشف عن أهداف علاجية جديدة وتصميم علاجات مناعية مركبة. يحمل هذا النهج المتقدم إمكانات كبيرة لتحسين نتائج العلاج في مرضى سرطان الكبد من خلال تقديم فهم مفصل للمشهد المناعي وتمكين تطوير تدخلات علاجية مخصصة.

تهدف هذه الدراسة إلى استخدام قياس الكتلة الخلوية لتحليل ملامح الخلايا المناعية الجهازية والمحلية للمرضى الذين يعانون من سرطان الكبد. تتمثل الأهداف في توصيف مجموعات الخلايا المناعية ، وربط هذه الخصائص بالنتائج السريرية والاستجابات العلاجية ، وتحديد علامات مناعية محددة ومجموعات فرعية للخلايا المرتبطة بتشخيص سرطان الكبد. من خلال توضيح أدوار الخلايا المناعية المختلفة في استجابات العلاج ، تسعى هذه الدراسة إلى توفير أساس لاستراتيجيات العلاج الشخصية. من المتوقع أن تؤدي النتائج إلى تحسين العلاجات المناعية الحالية وتقديم رؤى قيمة لتطوير علاجات جديدة ، تهدف في النهاية إلى تحسين البقاء على قيد الحياة بشكل عام ونوعية الحياة لمرضى سرطان الكبد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توضيح خطوات جمع عينات الدم وسرطان الكبد ، وعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) ، وتفكك الخلية المفردة ، والتلوين في الخطة التالية. الكواشف والمواد التجريبية كلها مدرجة في جدول المواد. تم إجراء جميع التجارب بموافقة لجنة الأخلاقيات في المستشفى الأول التابع ، كلية الطب ، جامعة تشجيانغ ، مما يضمن عدم تداخل جمع عينات الورم مع التشخيص المرضي. تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من جميع البشر.

1. عزل PBMCs

  1. اسحب عينة دم من وريد مرضى سرطان الكبد واستخدم أنبوبا مملوءا بمضاد للتخثر لمنع الدم من التجلط. تم الحصول على عينات دم من 4 مرضى (2 ذكور و 2 أنثى) تتراوح أعمارهم بين 50-60 عاما ، بمتوسط عمر 55 عاما. لكل مريض ، اجمع 10-20 مل من الدم المحيطي لضمان حجم كاف لعزل PBMCs اللاحق مع تقليل انزعاج المريض.
  2. اسحب حجما معيدا من الدم (على سبيل المثال ، 6 مل) وأضف حجما متساويا من سائل فصل الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي (Ficol-paque أو Lymphoprep) إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
    ملاحظة: يجب ألا يتجاوز الحجم الكلي 12 مل لإتاحة مساحة للخلط السليم ومنع الفائض ؛ الحد الأقصى للحجم الموصى به لأنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل هو 14 مل.
  3. قم بإمالة أنبوب الطرد المركزي عند 45 درجة وأضف الدم ببطء على طول جدار الأنبوب ، مع وضع الدم ببطء ببطء فوق سائل فصل الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي لتجنب خلط الطبقتين.
    ملاحظة: يمكن استخدام الماصة لإضافة الدم ببطء على طول جدار الأنبوب.
  4. ضع أنبوب الطرد المركزي في جهاز الطرد المركزي واضبط التسارع على 8 والتباطؤ عند 3. جهاز طرد مركزي عند 450 × جم ، 4 درجات مئوية ، لمدة 30 دقيقة. بعد الطرد المركزي ، يتم تشكيل 4 طبقات في أنبوب الاختبار ، من أعلى إلى أسفل: طبقة البلازما ، وطبقة PBMCs (طبقة الغشاء الأبيض) ، وطبقة Ficol-Paque ، وطبقة خلايا الدم الحمراء والخلايا المحببة.
  5. باستخدام ماصة، اجمع طبقة PBMCs بعناية في أنبوب طرد مركزي معقم جديد. أضف 3 أضعاف حجم PBS وأجهزة الطرد المركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. بعد الطرد المركزي ، يتم تشكيل حبيبات في قاع الأنبوب.
  6. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة ، وأضف 1 مل من محلول ملحي مخزن في مصل فوسفات الأجنين بنسبة 2٪ (FBS-PBS) لإعادة تعليق الخلايا ، ثم أضف 3 مل من محلول تحلل خلايا الدم الحمراء (RBC). جهاز طرد مركزي عند 500 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  7. تأكد من عدم وجود خلايا دم حمراء في الجزء السفلي من الأنبوب ، مما يشير إلى أن خلايا الدم الحمراء قد تم تحللها بالكامل. أعد تعليق الخلايا في FBS-PBS بنسبة 2٪ وتابع التجارب اللاحقة مباشرة ، أو أضف محلول الحفظ بالتبريد للخلايا وخزنها عند -80 درجة مئوية لمدة 2-3 أشهر.
    ملاحظة: كمبدأ توجيهي عام، لإعادة التعليق، استخدم 0.5 مل من FBS-PBS بنسبة 2٪ لكل 1 × 106 خلايا. يتم تحديد عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي بعد تلطيخ المحاولات الزرقاء لتمييز الخلايا الحية عن الخلايا الميتة. تساعد هذه النسبة على ضمان التعافي الأمثل للخلايا وقابليتها للحياة أثناء الإجراءات اللاحقة.

2. عزل خلايا الأنسجة السرطانية

ملاحظة: تم تكييف طريقة عزل خلايا الأنسجة السرطانية من Song et al.22.

  1. بعد استئصال سرطان الكبد ، بتوجيه من أخصائي علم الأمراض ، استخدم مشرطا معقما لاستئصال جزء من أنسجة الورم. يجب أن يكون حجم كتلة الأنسجة حوالي 1 سم3 . اشطف أي بقع سطحية باستخدام 1x PBS المبرد مسبقا. اغمر الأنسجة في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل يحتوي على حوالي 5 مل من وسط RPMI 1640 الذي يحتوي على 10٪ FBS. ضع الأنبوب على الجليد وانقله مرة أخرى إلى المختبر لمزيد من المعالجة.
  2. اشطف بقع الدم جيدا وقم بإزالة الأنسجة الضامة الدهنية يدويا باستخدام الملقط لضمان تنظيف كامل للأنسجة باستخدام FBS-PBS المبرد مسبقا بنسبة 2٪. انقل الأنسجة إلى طبق معالج بزراعة الأنسجة يحتوي على محلول هضم. قم بتأمين أنسجة الورم بالملقط وقم بتقطيعها إلى قطع أصغر من 1 مم3 بمشرط. انقل محلول هضم الأنسجة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل ، مع إضافة المزيد من محلول هضم الأنسجة حتى يصبح الحجم الإجمالي حوالي 15 مل.
  3. ضع أنبوب الطرد المركزي الذي يحتوي على خليط هضم الأنسجة في شاكر. قم بإمالتها أو تسويتها وتثبيتها للهضم عند 150 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بتصفية محلول الهضم من خلال مرشح 70 ميكرومتر.
    1. خلال هذا الإجراء ، استخدم مكبس حقنة سعة 1 مل لطحن شظايا الأنسجة. اشطف الفلتر بمحلول FBS-1640 بنسبة 2٪. خذ المرشح وانقله إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل.
  4. جهاز الطرد المركزي للمرشح عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. بعد الطرد المركزي ، تخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الحبيبات بحذر في حوالي 10 مل من محلول بيركول 36٪. ثم قم بطرده مرة أخرى عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
  5. استنشق 1 مل برفق من محلول تحلل كرات الدم الحمراء باستخدام ماصة لإعادة تعليق الخلية. انقل التعليق إلى أنبوب طرد مركزي جديد سعة 15 مل وأضف المخزن المؤقت لتحلل كرات الدم الحمراء للوصول إلى حجم إجمالي يبلغ 10 مل. دع الخليط يجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: يتم استخدام أنبوب طرد مركزي جديد لمنع أي شوائب على جدار الأنبوب من الدخول مرة أخرى إلى تعليق الخلية ، وبالتالي تقليل مخاطر انخفاض إنتاجية الخلية.
  6. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ، ثم أعد تعليق الخلايا بحجم مناسب قدره 2٪ FBS-PBS. كمبدأ توجيهي عام ، استخدم 0.5 مل من FBS-PBS 2٪ لكل 1 × 106 خلايا لإعادة التعليق.
    ملاحظة: يتم تحديد عدد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي بعد تلطيخ المحاولات الأزرق لتمييز الخلايا الحية عن الخلايا الميتة. يعتمد حجم إعادة التعليق على كمية الخلية المطلوبة للتجارب اللاحقة. تساعد هذه النسبة على ضمان التعافي الأمثل للخلايا وقابليتها للحياة أثناء الإجراءات اللاحقة.

3. تلطيخ سيسبلاتين

  1. خذ 3 × 106 خلايا من PBMCs التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.7 والخلايا السرطانية المعزولة في الخطوة 2.6 ، على التوالي. بعد استعادة الخلايا ، أعد تعليقها في 1 مل من PBS بدون Ca2+ و Mg2+. أضف السيسبلاتين إلى التركيز النهائي البالغ 0.5 ميكرومتر ، واخلطه جيدا ، واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين.
    ملاحظة: يتم إجراء تلطيخ سيسبلاتين لتمييز الخلايا الميتة عن الخلايا الحية بناء على سلامة الغشاء. سوف تمتص الخلايا الميتة ذات الأغشية المعرضة للخطر السيسبلاتين وتظهر إشارة إيجابية ، بينما تظل الخلايا الحية غير ملوثة23. يجب أن يكون عدد الخلايا 1 × 106 على الأقل.
  2. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية ، ثم أضف 1 مل من المخزن المؤقت لتلوين الخلية إلى كل أنبوب يحتوي على معلقات الخلية المعدة في الخطوة 3.1 لإيقاف التفاعل. جهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية ، وتأكد من عدم توزيع حبيبات الخلية خطيا على طول جدار الأنبوب بعد الطرد المركزي.

4. حجب مستقبلات FC

  1. قم بإعداد مزيج كتلة 50 ميكرولتر مسبقا لكل عينة: امزج 48 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا ، ثم أضف 2 ميكرولتر من محلول حجب Fc (المخزن المؤقت لتلوين الخلية: محلول حجب Fc = 9: 1).
  2. الخلايا من الخطوة 3.2 في الخليط أعلاه واتركها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

5. حضانة الأجسام المضادة للبروتين الغشائي

  1. لكل عينة خلية تم الحصول عليها من الخطوة 4.2 ، قم بإعداد مزيج الجسم المضاد للبروتين الغشائي بإضافة 1.1 ميكرولتر وحدة من كل جسم مضاد. ثم أضف المخزن المؤقت لتلوين الخلية للوصول إلى الحجم النهائي البالغ 55 ميكرولتر. في هذه المرحلة ، يبلغ الحجم الكلي حوالي 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: يتضمن المزيج أجساما مضادة تستهدف بروتينات الغشاء الرئيسية ، مثل CD163 و CCR3 و CD141 و CD117 و CD4524،25. تم اختيار هذه الأجسام المضادة لخصوصيتها في تحديد علامات البروتين الغشائي وتم الحصول عليها من المصادر المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد للحصول على التفاصيل ، بما في ذلك أرقام الاستنساخ والمصنعين وأرقام الكتالوج).
  2. أضف 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة المحضر إلى كل عينة أنبوبية ، وارفع الحجم الإجمالي إلى 100 ميكرولتر. قم بتدوير العينات برفق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
  3. أضف 2 مل من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا إلى كل عينة ، وجهاز الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2x.
  4. تخلص من المادة الطافية وقم بدوامة السائل المتبقي لفترة وجيزة باستخدام حبيبات الخلية لإعادة تعليق الخلية وتفريقها تماما.

6. تلطيخ بروتين النواة

  1. بمجرد إعادة تعليق الخلايا بالكامل ، أضف 500 ميكرولتر من المحلول المختلط (التثبيت: التثبيت / النفاذية = 3: 1) إلى كل عينة من الخطوة 5.4. امزج العينات برفق واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. تمييع المخزن المؤقت للنفاذية (10x) بالماء منزوع الأيونات. بعد الحضانة ، جهاز الطرد المركزي على وزن 500 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية. أضف 1000 ميكرولتر من 1x المخزن المؤقت للنفاذية إلى كل أنبوب لغسل الخلايا. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق ، ثم تخلص من المادة الطافية.
  3. إعادة تعليق الأجسام المضادة في 1x المخزن المؤقت للنفاذية. تخلص من المادة الطافية ، وأضف 50 ميكرولتر من خليط الجسم المضاد إلى كل أنبوب من الخلايا. قم بتقطيع الخلايا برفق لخلطها ، ثم احتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة.
  4. أضف 1000 ميكرولتر من 1x عازلة نفاذية إلى كل أنبوب ، وجهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.
  5. أضف 1000 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتلوين الخلايا إلى كل أنبوب لإعادة تعليق الخلايا مرة أخرى ، وجهاز الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة عند 1,000 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية.

7. تثبيت الخلية

  1. قم بإعداد محلول فورمالديهايد بنسبة 1.6٪ في PBS ، مع الحاجة إلى 1 مل لكل عينة.
  2. أضف 1 مل من محلول الفورمالديهايد 1.6٪ إلى كل عينة من الخطوة 6.5 ، ودوامة لخلطها جيدا ، واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: بينما يستخدم الفورمالديهايد بشكل شائع لتثبيت الخلايا ، يمكن أيضا استخدام الكواشف البديلة مثل 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) أو الميثانول. يجب أن يعتمد اختيار المثبت على المتطلبات المحددة للتجربة والميزات الخلوية التي يجب ملاحظتها.
  3. جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 800 × جم لمدة 5 دقائق وتخلص من المادة الطافية.

8. تلطيخ الإقحام النووي

  1. تحضير محلول إقحام الخلية: تمييع معرف الخلية Intercalator-Iridium (Ir) مع المخزن المؤقت للإصلاح والنفاذية إلى تركيز نهائي يبلغ 125 نانومتر. تحضير 1 مل من المحلول لكل عينة.
  2. أضف 1 مل من محلول إقحام الخلية المحضر إلى كل عينة ثابتة من الخطوة 7.3. تخلط بلطف ودوامة على الفور. هذا يساعد على تقليل تكوين مجاميع الخلايا.
  3. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة أو عند 4 درجات مئوية طوال الليل. جهاز طرد مركزي بوزن 500 جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية.

9. تحضير تعليق الخلية

  1. أضف 1000 ميكرولتر من مخزن تلطيخ الخلايا إلى الأنبوب من الخطوة 8.3 وجهاز الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2x.
  2. أضف 450 ميكرولتر إلى 900 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات لإعادة تعليق الخلايا. عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم أو عداد الخلايا الآلي بعد تلطيخ التريبان الأزرق. بعد العد ، تابع جمع البيانات وتحليلها باستخدام قياس الكتلة الخلوية.

10. قياس الكتلة الخلوية وتحليل البيانات

  1. احصل على بيانات قياس الكتلة الخلوية باستخدام نظام CyTOF واحفظها كملفات معيار قياس التدفق الخلوي (FCS). تأكد من معايرة الجهاز المناسبة ومراقبة الجودة لتقليل ضوضاء الخلفية وتأثيرات الدفعات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  2. المعالجة المسبقة لمجموعة خلايا CD45+ في ملف FCS باستخدام البرنامج المقترن. إزالة الحطام بناء على حجم الخلية (التشتت الأمامي ، FSC) والحبيبات (التشتت الجانبي ، SSC). استبعاد المضاعفات عن طريق البوابات المتسلسلة لمخططات FSC-A / FSC-H أو SSC-A / SSC-H. القضاء على الخلايا الميتة باستخدام تلطيخ القابلية للحياة ، مثل استبعاد السيسبلاتين. قم ببوابة سكان CD45 + للتركيز على الخلايا المناعية وتصدير السكان المسورين لمزيد من التحليل.
  3. قم بتحويل البيانات بعامل مساعد من 5 وتحديد المجموعات الرئيسية باستخدام برنامج التجميع. قم بإجراء التجميع استنادا إلى خوارزمية تحليل تقدم الشجرة المتمتدة للأحداث الطبيعية للكثافة (SPADE) ، والتي تجمع الخلايا ذات ملفات تعريف تعبير العلامات المتشابهة في مجموعات26. استخدم تضمين الجار العشوائي الهرمي (HSNE) لتقليل الأبعاد وتحديد المجموعات المتميزة26.
  4. قم بإعادة تجميع المجموعات الرئيسية باستخدام حزمة cytofkit في برنامج R للتجميع غير الخاضع للإشراف. تحديد المجموعات الفرعية باستخدام PhenoGraph باستخدام المعلمات الافتراضية.
  5. تطبيق تقريب وإسقاط مشعب موحد (UMAP) لتقليل الأبعاد. قم بإجراء تحليل إحصائي باستخدام اختبار ويلكوكسون ، مع الأخذ في الاعتبار قيمة P < 0.05 على أنها ذات دلالة إحصائية. تصور النتائج باستخدام ggplot2.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لتوضيح الخصائص المناعية المرتبطة بسرطان الكبد ، تم إجراء تحليل شامل لتجمعات الخلايا المناعية. تم جمع عينات أنسجة PBMCs المزدوجة وسرطان الكبد من 4 مرضى يعانون من سرطان الكبد. تم إجراء توصيف القياس الخلوي الكتلي لفحص مجموعات الخلايا المناعية على المستوى البروتيني أحادي الخلية ، باستخدام لوحتين من الأجسام المضادة لكل من عينات أنسجة PBMCs و HCC.

بعد مراقبة الجودة ، تم تضمين 45،326 خلية في تحليل قياس...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستفيد هذه الدراسة من تقنية قياس الكتلة الخلوية لتقديم تحليل متعمق لكل من الاستجابات المناعية الجهازية والمحلية في سرطان الكبد. يتيح تطبيق قياس الكتلة الخلوية في هذا السياق الكشف المتزامن عن علامات متعددة على مستوى الخلية الواحدة ، مما يوفر توصيفا مفصلا للنمط المناعي يعد أمرا بالغ الأهمية لفهم المشهد المناعي المعقد لسرطان الكبد أحدث قياس الكتلة ثورة في الدراسات المناعية من خلال تسهيل تحليل الخلية المفردة عالية الأبعاد. تستخدم هذه التقنية علامات نظائر معدنية نادرة مترافقة مع الأجسام المضا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن أصحاب البلاغ أنه ليس لديهم تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل البرنامج الوطني للبحث والتطوير الرئيسي في الصين (منحة 2019YFA0803000 إلى JS) ، ومؤسسة الشباب الممتاز في Zhejiang Scientific (منحة R22H1610037 إلى JS) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (منحة 82173078 إلى JS) ، ومؤسسة العلوم الطبيعية في مقاطعة Zhejiang (منحة 2022C03037 إلى JS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1×PBSHyCloneSH30256.01
10×PBSHyCloneSH30256.01
100 mm×20 mm tissue-culture-treated culture dishCorning430167
1000 mL pipette tipsRainin30389218
15 mL centrifuge tubeNEST601052
200 mL pipette tipsRainin30389241
40 mm nylon cell strainer/70-mm nylon cell strainerFalcon352340
50 mL centrifuge tubeNEST602052
70 μm syringe fifilterSangon BiotechF613462-9001
Anti-Human CCR2 Antibody (clone: K036C2)BioLegend357224
Anti-Human CCR3 Antibody (clone: 5E8)BioLegend310724
Anti-Human CCR7 Antibody (clone: G043H7)BioLegend353240
Anti-Human CD103 Antibody (clone: Ber-ACT8)BioLegend350202
Anti-Human CD115 Antibody (clone: 9-4D2-1E4)BioLegend347314
Anti-Human CD117 Antibody (clone: 104D2)BioLegend313201
Anti-human CD11b Antibody (clone: 1CRF44) BD562721
Anti-human CD11c Antibody (clone: B-ly6) BD563026
Anti-Human CD123 Antibody (clone: 6H6)BioLegend306002
Anti-Human CD127 Antibody (clone: A019D5)BioLegend351337
Anti-Human CD13 Antibody (clone: WM19)BioLegend301701
Anti-Human CD138 Antibody (clone: MI15)BioLegend356535
Anti-human CD14 Antibody (clone: HCD14)BioLegend325604
Anti-Human CD141 Antibody (clone: M80)BioLegend344102
Anti-Human CD15 Antibody (clone: QA19A61)BioLegend376302
Anti-human CD16 Antibody (clone: B7311) BD561313
Anti-Human CD161 Antibody (clone: HP-3G10)BioLegend339902
Anti-Human CD163 Antibody (clone: GHI/61)BioLegend333603
Anti-Human CD169 Antibody (clone: 7-239)BioLegend346002
Anti-human CD19 Antibody (clone: HIB19)BioLegend302226
Anti-Human CD1c Antibody (clone: L161)BioLegend331501
Anti-Human CD20 Antibody (clone: 2H7)BioLegend302301
Anti-Human CD206 Antibody (clone: 15-2)BioLegend321151
Anti-Human CD24 Antibody (clone: ML5)BioLegend311129
Anti-Human CD25 Antibody (clone: BC96)BioLegend302624
Anti-human CD3 Antibody (clone: UCHT1) BD555916
Anti-Human CD31 Antibody (clone: W18200D)BioLegend375902
Anti-Human CD32 Antibody (clone: FUN-2)BioLegend303232
Anti-Human CD326 Antibody (clone: CO17-1A)BioLegend369812
Anti-Human CD33 Antibody (clone: WM53)BioLegend303402
Anti-human CD4 Antibody (clone: L200) BD563094
Anti-Human CD45 Antibody (clone: HI30) BD563716
Anti-Human CD45RO Antibody (clone: UCHL1)BioLegend304220
Anti-human CD56 Antibody (clone: 5.1H11)BioLegend362510
Anti-Human CD64 Antibody (clone: S18012C)BioLegend399502
Anti-Human CD66b Antibody (clone: 6/40c)BioLegend392917
Anti-human CD68 Antibody (clone: Y1/82A)BioLegend333808
Anti-Human CD69 Antibody (clone: FN50)BioLegend310902
Anti-Human CD7 Antibody (clone: 4H9/CD7)BioLegend395602
Anti-human CD8 Antibody (clone: RPA-T8) BD557750
Anti-Human CD80 Antibody (clone: W17149D)BioLegend375402
Anti-Human CD86 Antibody (clone: BU63)BioLegend374202
Anti-Human FOXP3 Antibody (clone: 206D)BioLegend320101
Anti-Human HLA_ABC Antibody (clone: W6/32)BioLegend311426
Anti-human HLA-DR Antibody (clone: L243)BioLegend307650
Anti-Human IgD Antibody (clone: IA6-2)BioLegend348211
Anti-Human Ki67 Antibody (clone: Ki-67)BioLegend350501
Anti-Human PD_L2 Antibody (clone: MH22B2)BD567783
Anti-Human PD1 Antibody (clone: EH12.2H7)BioLegend329951
Anti-Human PDL1 Antibody (clone: MIH2)BioLegend393602
Anti-human TCR-γδ Antibody (clone: B1) BD740415
Cell cryopreservation

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, C. H., Cheng, Y., Zhang, S., Fan, J., Gao, Q. Changing epidemiology of hepatocellular carcinoma in Asia. Liver Int. 42 (9), 2029-2041 (2022).
  2. Renne, S. L., et al. Hepatocellular carcinoma: A clinical and pathological overview. Pathologica. 113 (3), 203-217 (2021).
  3. Sayiner, M., Golabi, P., Younossi, Z. M. Disease burden of hepatocellular carcinoma: A global perspective. Dig Dis Sci. 64 (4), 910-917 (2019).
  4. Zhang, X., et al. Risk factors and prevention of viral hepatitis-related hepatocellular carcinoma. Front Oncol. 11, 686962(2021).
  5. Zou, H., et al. Economic burden and quality of life of hepatocellular carcinoma in greater China: A systematic review. Front Public Health. 10, 801981(2022).
  6. Li, Y., You, Z., Tang, R., Ma, X. Tissue-resident memory t cells in chronic liver diseases: Phenotype, development and function. Front Immunol. 13, 967055(2022).
  7. Shen, K. Y., Zhu, Y., Xie, S. Z., Qin, L. X. Immunosuppressive tumor microenvironment and immunotherapy of hepatocellular carcinoma: Current status and prospectives. J Hematol Oncol. 17 (1), 25(2024).
  8. Oura, K., Morishita, A., Tani, J., Masaki, T. Tumor immune microenvironment and immunosuppressive therapy in hepatocellular carcinoma: A review. Int J Mol Sci. 22 (11), 5801(2021).
  9. Chen, Y., et al. Effect of infiltrating immune cells in tumor microenvironment on metastasis of hepatocellular carcinoma. Cell Oncol. 46 (6), 1595-1604 (2023).
  10. Du, Q., An, Q., Zhang, J., Liu, C., Hu, Q. Unravelling immune microenvironment features underlying tumor progression in the single-cell era. Cancer Cell Int. 24 (1), 143(2024).
  11. Xu, L., et al. Reshaping the systemic tumor immune environment (stie) and tumor immune microenvironment (time) to enhance immunotherapy efficacy in solid tumors. J Hematol Oncol. 15 (1), 87(2022).
  12. Mao, X., et al. Crosstalk between cancer-associated fibroblasts and immune cells in the tumor microenvironment: New findings and future perspectives. Mol Cancer. 20 (1), 131(2021).
  13. Roederer, M. Spectral compensation for flow cytometry: Visualization artifacts, limitations, and caveats. Cytometry. 45 (3), 194-205 (2001).
  14. Sahaf, B., Rahman, A., Maecker, H. T., Bendall, S. C. Biomarkers for immunotherapy of cancer: Methods and protocols. , Springer. New York, New York, NY. (2020).
  15. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PLoS One. 8 (6), e68519(2013).
  16. Wu, K., et al. Redefining tumor-associated macrophage subpopulations and functions in the tumor microenvironment. Front Immunol. 11, 1731(2020).
  17. Elaldi, R., et al. High dimensional imaging mass cytometry panel to visualize the tumor immune microenvironment contexture. Front Immunol. 12, 666233(2021).
  18. Gadalla, R., et al. Validation of cytof against flow cytometry for immunological studies and monitoring of human cancer clinical trials. Front Oncol. 9, 415(2019).
  19. Ijsselsteijn, M. E., Van Der Breggen, R., Farina Sarasqueta, A., Koning, F., De Miranda, N. A 40-marker panel for high dimensional characterization of cancer immune microenvironments by imaging mass cytometry. Front Immunol. 10, 2534(2019).
  20. Zhang, Q., et al. Mass cytometry-based peripheral blood analysis as a novel tool for early detection of solid tumours: A multicentre study. Gut. 72 (5), 996-1006 (2023).
  21. Zheng, B., et al. Trajectory and functional analysis of pd-1(high) cd4(+)cd8(+) t cells in hepatocellular carcinoma by single-cell cytometry and transcriptome sequencing. Adv Sci. 7 (13), 2000224(2020).
  22. Song, J., et al. Protocol for isolating single cells from human pancreatic cancer tissues and analyzing major immune cell populations using flow cytometry. STAR Protoc. 4 (4), 102679(2023).
  23. Simoni, Y., Chng, M. H. Y., Li, S., Fehlings, M., Newell, E. W. Mass cytometry: A powerful tool for dissecting the immune landscape. Curr Opin Immunol. 51, 187-196 (2018).
  24. Comi, M., et al. Coexpression of cd163 and cd141 identifies human circulating il-10-producing dendritic cells (dc-10). Cell Mol Immunol. 17 (1), 95-107 (2020).
  25. Fan, L., et al. High-dimensional single-cell analysis delineates peripheral immune signature of coronary atherosclerosis in human blood. Theranostics. 12 (15), 6809-6825 (2022).
  26. Sheng, J., et al. Human endogenous retrovirus activation contributes to biliary atresia pathogenesis through re-education of resident macrophages. Biorxiv. , (2022).
  27. Terekhova, M., et al. Single-cell atlas of healthy human blood unveils age-related loss of nkg2c(+)gzmb(-)cd8(+) memory t cells and accumulation of type 2 memory t cells. Immunity. 56 (12), 2836-2854.e9 (2023).
  28. Sathaliyawala, T., et al. Distribution and compartmentalization of human circulating and tissue-resident memory t cell subsets. Immunity. 38 (1), 187-197 (2013).
  29. Lee, S., Vu, H. M., Lee, J. H., Lim, H., Kim, M. S. Advances in mass spectrometry-based single cell analysis. Biology. 12 (3), 395(2023).
  30. Iyer, A., Hamers, A. A. J., Pillai, A. B. Cytof for the masses. Front Immunol. 13, 815828(2022).
  31. Yuan, X., Wang, J., Huang, Y., Shangguan, D., Zhang, P. Single-cell profiling to explore immunological heterogeneity of tumor microenvironment in breast cancer. Front Immunol. 12, 643692(2021).
  32. Serban, G. M., Mănescu, I. B., Manu, D. R., Dobreanu, M. Optimization of a density gradient centrifugation protocol for isolation of peripheral blood mononuclear cells. Acta Marisiensis - Seria Medica. 64 (2), 83-90 (2018).
  33. Shcherbakova, A., et al. Factors affecting cell viability during the enzymatic dissociation of human endocrine tumor tissues. Biology (Basel). 13 (9), 665(2024).
  34. Devine, R. D., Alkhalaileh, H. S., Lyberger, J. M., Behbehani, G. K. Alternative methods of viability determination in single cell mass cytometry. Cytometry A. 99 (10), 1042-1053 (2021).
  35. Gonzalez, V. D., Huang, Y. W., Fantl, W. J. Mass cytometry for the characterization of individual cell types in ovarian solid tumors. Methods Mol Biol. 2424, 59-94 (2022).
  36. Zabransky, D. J., et al. Profiling of syngeneic mouse hcc tumor models as a framework to understand anti-pd-1 sensitive tumor microenvironments. Hepatology. 77 (5), 1566-1579 (2023).
  37. Levine, L. S., et al. Single-cell analysis by mass cytometry reveals metabolic states of early-activated cd8(+) t cells during the primary immune response. Immunity. 54 (4), 829-844.e5 (2021).
  38. Lv, B., et al. Immunotherapy: Reshape the tumor immune microenvironment. Front Immunol. 13, 844142(2022).
  39. Zhou, Z., et al. Deciphering the tumor immune microenvironment from a multidimensional omics perspective: Insight into next-generation car-t cell immunotherapy and beyond. Mol Cancer. 23 (1), 131(2024).
  40. Hsieh, W. C., et al. Spatial multi-omics analyses of the tumor immune microenvironment. J Biomed Sci. 29 (1), 96(2022).
  41. Wang, Z., et al. Gdf15 induces immunosuppression via cd48 on regulatory t cells in hepatocellular carcinoma. J Immunother Cancer. 9 (9), e002787(2021).
  42. Krams, S. M., Schaffert, S., Lau, A. H., Martinez, O. M. Applying mass cytometry to the analysis of lymphoid populations in transplantation. Am J Transplant. 17 (8), 1992-1999 (2017).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Mass CytometryHepatocellular CarcinomaImmune ProfilingCyTOF AnalysisPeripheral BloodTumor Immune ResponseSingle Cell AnalysisImmune Cell SubsetsBiomarker DiscoverySPADE Clustering

مقالات ذات صلة