مقالة منهجية

العزل الأنزيمي للحويصلات الخلالية خارج الخلية للعضلات الهيكلية

DOI:

10.3791/67439

⸱

فبراير 7, 2025

 ,  ,  , 
1Regenerative Bioscience Center, Department of Animal and Dairy Science, College of Agricultural and Environmental Science, University of Georgia

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يهدف هذا البروتوكول إلى عزل وتنقية الحويصلات الخلالية خارج الخلية للعضلات الهيكلية (SkM-EVs) من أنسجة عضلات القوارض من خلال الانفصال الميكانيكي ، والتفكك الأنزيمي ، والترشيح ، والطرد المركزي التفاضلي. إنه يدل على الاتساق والموثوقية. توفر SkM-EVs المعزولة رؤى حول توازن العضلات وأمراضها ، مع تطبيقات محتملة كمؤشرات حيوية تشخيصية أو مركبات علاجية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EVs) عبارة عن جزيئات نانوية محاطة بطبقة ثنائية الدهنية تطلقها الخلايا لنقل البضائع النشطة بيولوجيا ، مثل البروتينات والحمض النووي الريبي والحمض النووي للاتصال بين الخلايا. يوفر التحقيق في الحديث المتبادل بوساطة EV بين الخلايا في توازن العضلات وأمراضها إمكانات كبيرة لتعزيز فهمنا لنمو العضلات وتجديدها وضمورها. ومع ذلك ، تواجه البروتوكولات الحالية لعزل المركبات الكهربائية المشتقة من عضلات الهيكل العظمي (SkM-EVs) تحديات في تحقيق نقاء وعائد عاليين ، ويرجع ذلك أساسا إلى صعوبات إطلاق المركبات الكهربائية من الأنسجة العضلية دون المساس بالأغشية الخلوية. تقدم هذه المقالة بروتوكولا فعالا لعزل SkM-EV ، بما في ذلك الانفصال الميكانيكي ، والتفكك الأنزيمي ، والترشيح ، والطرد المركزي الفائق. تم تحسين هذه الخطوات لتعزيز إطلاق EV من أنسجة العضلات ، مما ينتج عنه SkM-EVs عالية النقاء. بعد ذلك ، يتم إجراء قياس التدفق الخلوي النانوي ، ومقايسة BCA ، ومقايسة اللطخة الغربية لتوصيف كمية ونوعية SkM-EVs المعزولة. يبشر هذا البروتوكول بإنشاء منصة موثوقة للحصول على مركبات كهربائية مشتقة من الأنسجة لتطوير الأبحاث الأساسية وتشخيص الأمراض وتوصيل الأدوية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات بحجم نانو مرتبطة بالغشاء تطلقها الخلايا في البيئة خارج الخلية. تنقل هذه المركبات الكهربائية الأحماض النووية والبروتينات والدهون لتعديل مسارات الإشارات المتعددة عند امتصاصها بواسطة الخلايا المتلقية. على وجه التحديد ، تورطت المركبات الكهربائية المعزولة من العضلات الهيكلية (SkM-EVs) في تنكس العضلات وتجديدها ونموها عن طريق نقل الحمض النووي الريبي الميكرو التنظيمي العضلي أو عوامل النسخ1،2،3،4. مع استمرار تطور فهمنا للمجموعات السكانية الفرعية ل SkM-EV وخصائصها ، تظهر هذه الحويصلات واعدة كمؤشرات حيوية للتشخيص المبكر5،6 وكأهداف علاجية للاضطرابات العصبية العضلية. يوفر هذا المجال المتوسع فرصا مثيرة لكل من التحقيقات المرضية والتطبيقات السريرية.

تركز الأبحاث الحالية على SkM-EVs في الغالب على تلك التي تم الحصول عليها من المواد الطافية لزراعة الخلايا بعد زراعة الخلايا بعد الثقافة خارج الجسم الحي 2،7،8 ، مما يثير مخاوف بشأن دقة خطوط الخلايا المستهدفة بعد الممرات المتتالية وقابلية خصائص EV للتغيير في البيئات الاصطناعية. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى عزل SkM-EVs مباشرة عن أنسجة العضلات لتجنب تأثيرات الثقافة خارج الجسم الحي وتمثيل أفضل في الجسم الحي. على الرغم من تطوير العديد من الأساليب لعزل المركبات الكهربائية من أنسجة العضلات9،10 ، إلا أن الدراسات لا تزال تختلف اختلافا كبيرا في تفاصيل البروتوكول ، مما يؤثر على الاتساق وقابلية المقارنة. هناك حاجة ماسة إلى بروتوكول موحد لعزل وتوصيف SkM-EV لضمان الموثوقية عبر الدراسات ذات الصلة.

بالنظر إلى الخصائص الفسيولوجية للعضلات الهيكلية ، قمنا بتطوير بروتوكول لعزل وتنقية SkM-EVs من عينات عضلات الهيكل العظمي للقوارض باستخدام الانفصال الميكانيكي ، والتفكك الأنزيمي ، والترشيح ، والطرد المركزي التفاضلي. من خلال التحليل الشامل باستخدام قياس التدفق الخلوي النانوي ، ومقايسة BCA ، ومقايسة اللطخة الغربية ، وجدنا أن هذا البروتوكول ينتج باستمرار SkM-EVs ذات نقاء وكمية عالية خلال إطار زمني محدود. يمكن تطبيقه على عينات العضلات الهيكلية في حالات مختلفة ، بما في ذلك إصابات العضلات الحادة والمزمنة. علاوة على ذلك ، مع التعديلات المناسبة ، يمكن تصميم هذه الطريقة لأنسجة العضلات من المرضى البشريين أو النماذج الحيوانية الأخرى. يعد توحيد عملية عزل SkM-EV أمرا ضروريا لضمان الاتساق في جودة SkM-EV ، وتسهيل مقارنات خصائص EV - مثل العائد والحجم وتكوين الحمولة والوظيفة - وتعزيز تطبيقاتها المحتملة كمؤشرات حيوية تشخيصية ، فضلا عن تعزيز فهمنا لأدوارها في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعزل هذا البروتوكول الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن أنسجة العضلات الهيكلية باستخدام الانفصال الميكانيكي ، والتفكك الأنزيمي ، والترشيح ، والطرد المركزي التفاضلي. يسمح بعزل المركبات الكهربائية عن مجموعات عضلات أطراف القوارض الفردية أو المجمعة ، بما في ذلك الظنبوب الأمامي (TA) ، الباسطة الإصبعية الطولية (EDL) ، النعل (SOL) ، المعدة (GAS) ، وعضلات الفخذ (QUA). تمت الموافقة على استخدام من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة جورجيا ، وامتثلت الدراسة لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدامها في البحث. تم إيواء في مرافق داخل قسم علوم والألبان بجامعة جورجيا. تم استخدام ذكور الفئران البالغة من النوع البري (C57BL / 6J) في هذه الدراسة ، مع التضحية بالأنسجة التي تم حصادها من الفئران في عمر 3 أشهر. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. الانفصال الميكانيكي لمجموعات العضلات عن الفأر

  1. القتل الرحيم للفئران بثاني أكسيد الكربون2 ، يليه خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). حلق كلا الطرفين الخلفيين.
  2. قم بتأمين ساق الفأر في صفيحة معقمة بحيث يكون الجانب الأمامي من الساق متجها لأعلى (الشكل 1 أ).
  3. قم بعمل شق صغير (5 مم) في الجلد على الجانب الجانبي من كاحل الفأر باستخدام مقص التشريح.
  4. أدخل شفرة واحدة من المقص بعناية في الشق ، وضعها تحت الجلد ولكن ليس في الأنسجة العضلية الأساسية. ثم قم بقص الجلد لأعلى باتجاه الركبة لإطالة طول الشق.
  5. أمسك الجلد على طول الشق باستخدام ملاقط خشنة وقم بتوسيع الفتحة حتى تصبح العضلة مرئية.
  6. حدد موقع عضلة TA ، التي تمتد من الركبة إلى الكاحل على الجانب الجانبي من عظم الساق11 ، واستخدم ملاقط حادة للإمساك بطبقة رقيقة من النسيج الضام التي تغطي العضلات وتقشيرها (الشكل 1 ب).
  7. بالقرب من الكاحل ، حدد الأوتار في نهاية TA ، أحدهما متصل مباشرة بعضلة TA والآخر ، وتر EDL ، وهو أصغر ويقع بجوار وتر TA على الجانب الجانبي. قطع كلا الأوتار باستخدام مقص التشريح.
  8. أمسك كلا الأوتار بملاقط خشنة. بعد ذلك ، استخدم زوجا آخر من الملقط الخشن أو الحاد لفصل الأوتار ، وبالتالي فصل TA عن EDL (الشكل 1C).
  9. ارفع TA بواسطة الوتر المقطوع حديثا باستخدام ملاقط خشنة. ثم قم بقطع وتر TA بالقرب من الركبة باستخدام مقص التشريح ، وبالتالي إزالة العضلات. كرر هذه العملية لإزالة EDL ، وتخزين كلتا العضلتين في PBS على الجليد.
  10. حرر الساق واقلب الماوس بحيث يكون الوجه الخلفي متجها لأعلى.
  11. مع إزالة الجلد الموجود على الساق جزئيا الآن ، قم بقص الجلد بالقرب من الكاحل باستخدام مقص التشريح. بعد ذلك ، استخدم ملاقط خشنة لإمساك الجلد وتقشيره لأعلى باتجاه الجزء الخلفي من الركبة ، مما يؤدي إلى تعريض الغاز.
  12. قطع وتر الغاز بالقرب من الكاحل باستخدام مقص التشريح (الشكل 1 د).
  13. أمسك وتر الغاز بملاقط خشنة وارفعه لأعلى لكشف الجانب السفلي من GAS.
  14. حدد موقع وتر SOL الصغير على الجانب السفلي من GAS بالقرب من الركبة (حيث لا يزال GAS متصلا). اقطع وتر SOL باستخدام مقص التشريح ، مما يتسبب في تقلص SOL لأعلى (الشكل 1E).
  15. أمسك وتر SOL المقطوع بملاقط حادة وارفعه برفق ، وبالتالي فصل SOL عن الجانب السفلي من GAS.
  16. اقطع نهاية SOL حيث يتم تثبيتها على الطرف المقطوع من GAS باستخدام مقص التشريح ، وبالتالي فصل العضلتين. احتفظ ب SOL في PBS على الجليد.
  17. اقطع نهاية الغاز بالقرب من الركبة وضعها في PBS على الجليد.
  18. بعد إزالة العضلات الأربع المدرجة أسفل الركبة ، اقلب الماوس بحيث يكون الوجه الأمامي لأعلى.
  19. إذا لزم الأمر ، قشر الجلد أكثر باستخدام ملاقط خشنة لكشف QUA. ضع ساق الماوس بزاوية 90 درجة لإجبار QUA على الانثناء. قطع الوتر الأقرب إلى الركبة باستخدام مقص التشريح.
    1. افصل QUA عن عظم الفخذ عن طريق القطع بين العضلة والعظام حتى يتم توصيل QUA فقط بواسطة الوتر القريب (الشكل 1E). ثم اقطع الوتر القريب وقم بإزالة QUA. ضع QUA في PBS على الجليد.
  20. تأكد من أنه بعد انفصال العضلات ، يتم الكشف عن الساق والشظية بوضوح (الشكل 1F).
  21. اشطف العضلات عدة مرات باستخدام PBS لإزالة الملوثات مثل الفراء والدم (الشكل 1G). ثم جفف العضلات برفق باستخدام مناشف ورقية. استخدم الميزان التحليلي لقياس وزن العضلات، والذي سيتم استخدامه لاحقا لحساب EV الذي تم جمعه لكل جرام من العضلات.

2. التفكك الأنزيمي لقطع العضلات المنفصلة

  1. قم بإزالة الأوتار العضلية برفق من عينة العضلات باستخدام ملاقط حادة أو ملاقط منشقة أو مشارط أو مقص (الشكل 2 أ).
  2. بعد إزالة الأوتار ، قم بقطع العضلات طوليا على طول ألياف العضلات (من الوتر إلى الوتر) إلى قطع عضلية بسمك 1 مم باستخدام مقص أو مشرط لزيادة نسبة مساحة السطح إلى الحجم (الشكل 2 ب ، ج).
    ملاحظة: حاول الحد من تلف الألياف العضلية أثناء القطع. بالنسبة للعضلات الأكبر حجما مثل TA و GAS و QUA ، قم بإجراء تخفيضات إضافية مقارنة بالعضلات الأصغر مثل EDL و SOL لضمان نسبة مساحة السطح إلى الحجم المتساوية تقريبا عبر جميع عينات العضلات (الشكل 2 د).
  3. قم بإعداد 10 مل من محلول الإنزيم الهضمي الطازج (DEB) لكل فأر واحتفظ به على الثلج حتى الاستخدام.
    1. لتحضير DEB ، اخلطي 2 مجم من إنزيم الكولاجيناز II لكل 1 مل من Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مع محلول البنسلين والستربتومايسين بنسبة 1٪. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر بعد الخلط.
    2. تأكد من أن DEB لديه نشاط إنزيمي يزيد عن 250 وحدة. قم بتدوير DEB حتى يتم خلط المحلول جيدا ولم يعد مسحوق إنزيم الكولاجيناز II مرئيا.
  4. افصل الأنسجة العضلية إلى أجزاء ، تحتوي كل منها على 20 مجم من الأنسجة العضلية. ثم أضف 1 مل من DEB إلى كل حصة للتفكك الأنزيمي.
  5. احتضان خليط DEB والعضلات على شاكر في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة بسرعة اهتزاز تبلغ 100 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) (الشكل 2 ه).

3. الترشيح والطرد المركزي منخفض السرعة لإثراء SkM-EV

ملاحظة: اضبط جهاز الطرد المركزي المبرد على 4 درجات مئوية وقم بتشغيله حتى يصل إلى درجة الحرارة المحددة. احتفظ بجميع الأنابيب والعينات المطلوبة على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

  1. باتباع إجراءات الهضم الأنزيمي ، تأكد من عدم وجود قطع عضلية يمكن تمييزها (الشكل 3 أ). قبل الطرد المركزي المبرد ، استخرج 10 ميكرولتر من المحلول من خليط DEB والعضلات وانقله إلى أنبوب 0.2 مل لاختبار صلاحية الخلية إذا لزم الأمر.
  2. قم بإعداد وتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة الفارغة سعة 1.5 مل. قم بإعداد مرشح 0.45 ميكرومتر وحقنة سعة 5 مل عن طريق إزالة المكبس (لا تتخلص منه) وشد المحور في الطرف العلوي من المرشح 0.45 ميكرومتر. ضع المرشح بحيث يتم وضع الطرف السفلي في أنبوب فارغ مسمى حديثا (الشكل 3 د). قم بتصفية 1x PBS من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  3. قم بالطرد المركزي للخليط لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم و 4 درجات مئوية لحبيبات أي حطام (الشكل 3 ب). انقل المادة الطافية (حوالي 1 مل) إلى المحقنة باستخدام ماصة دقيقة P200 (الشكل 3C,E).
  4. أعد إدخال مكبس المحقنة وادفع المادة الطافية ببطء عبر الفلتر ، مما يسمح لها بالمرور والتجمع في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل المسمى حديثا (الشكل 3F).
  5. قم بإزالة المكبس مرة أخرى وقم بإدخال الماصة تقريبا 200 ميكرولتر من 1x PBS في المحقنة.
  6. أعد إدخال المكبس وادفع ببطء 200 ميكرولتر من 1x PBS عبر المرشح (الشكل 3G) لإزالة أي مادة طافية متبقية من المرشح وفي أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى 1.5 مل.
  7. كرر عملية الترشيح للأنابيب الأخرى ، باستخدام مرشح جديد لكل عينة من الأنسجة.
  8. بعد الترشيح ، تأكد من أن المحلول شفاف وخالي من قطع العضلات المتبقية (الشكل 3H).

4. الطرد المركزي الفائق التفاضلي لتنقية SkM-EV

ملاحظة: اضبط جهاز الطرد المركزي المبرد على 4 درجات مئوية وقم بتشغيله حتى يصل إلى درجة الحرارة المحددة. احتفظ بجميع الأنابيب والعينات اللازمة على الثلج وجاهزة للاستخدام.

  1. انقل المحلول المفلتر إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 1.5 مل (مناسبة لما يصل إلى 200,000 × جم). قم بموازنة جميع الأنابيب الدقيقة مع 1x PBS إضافي لضمان حجم متساو قبل وضعها في جهاز الطرد المركزي الفائق الصغر.
  2. بعد التأكد من أن حجم جميع الأنابيب متساو ، أغلق الأنابيب وضعها في دوار جهاز الطرد المركزي الفائق لتكون متوازنة (الشكل 4 أ).
  3. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق الصغر واضبطه على العمل لمدة ساعة واحدة عند 100,000 × جم و 4 درجات مئوية (الشكل 4 ب).
  4. ضع الدوار المحمل بالأنابيب في جهاز الطرد المركزي الفائق ، وأغلق الغطاء ، وقم بتشغيل الفراغ (الشكل 4C).
  5. بمجرد أن يصل الفراغ إلى المستوى 2 ، اضغط على زر البدء وانتظر حتى تكتمل عملية الطرد المركزي (الشكل 4D).
  6. بعد اكتمال دورة الطرد المركزي الفائق ، انقر فوق زر التفريغ لإعادة ضغط الغرفة قبل إزالة الدوار والأنابيب. احتفظ بالأنابيب على الجليد وضعها في وضع مستقيم لتجنب إزعاج الحبيبات.
  7. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة دقيقة P200 ، وتجنب اضطراب الحبيبات (الشكل 4E).
  8. أخرج الطرف ، ثم أضف 50 ميكرولتر من 1x PBS إلى الأنبوب بعد إزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة P200. بالنسبة لعينات GAS و QUA ، أضف ما يصل إلى 500 ميكرولتر من 1x PBS للمساعدة في الذوبان (الشكل 4F).
  9. أعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة دقيقة P20 (أو ماصة دقيقة P200 إذا تمت إضافة 500 ميكرولتر) حتى يتم تفكيكها بالكامل وعدم رؤيتها.
  10. أغلق الأنبوب وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل (أقل من أسبوع واحد) ، أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل ، أو ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد إذا تم تمييز العينة على الفور باستخدام قياس التدفق الخلوي النانوي أو اللطخة الغربية أو فحوصات أخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج حويصلات العضلات الهيكلية خارج الخلية (SkM-EVs) بنجاح من مجموعات عضلية مختلفة ، بما في ذلك الظنبوب الأمامي (TA) ، الباسطة الأصابع الطويلة (EDL) ، النعل (SOL) ، المعدة (GAS) ، وعضلات الفخذ (QUA) من الفئران البرية. تم إجراء التوصيف اللاحق لهذه SkM-EVs من خلال قياس التدفق الخلوي النانوي ، لتوضيح ميزاتها المميزة كما هو موضح في الجدول 1. من اللافت للنظر ، من مجرد 1 غرام من الأنسجة العضلية ، تم الحصول على عائد مثير للإعجاب يبلغ 1.18e14 ± 4.86e13 SkM-EVs ، بمتوسط حجم جسيمات يبل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يبدأ البروتوكول بتشريح مجموعات عضلات الأطراف الخلفية من الفئران أو الحصول على أنسجة عضلية بشرية بعد الوفاة بناء على البروتوكولات المتاحة16. تتكون إجراءات عزل حويصلات العضلات الهيكلية خارج الخلية التالية (SkM-EVs) من ثلاثة أقسام أساسية: الهضم الأنزيمي الخفيف للأنسجة لتحرير SkM-EVs الخلالية ، والترشيح والطرد المركزي منخفض السرعة ، والطرد المركزي الفائق. أخيرا ، يتم تطبيق تقنيات مختلفة لتوصيف SkM-EVs المعزولة.

بالنظر إلى الاختلافات الكبيرة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من قبل وزارة الدفاع W81XWH2210261 (إلى ياو ياو).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.6 مل أنابيب الطرد المركزيThermoFisher Scientific05-408-120
1.5 مل أنبوب صغير (C)   ؛Eppendorf5720411009
1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقةThermoFisher Scientific3448واضح ، متخرج ، غير معقم
BD 5 مل حقنةBecton Dickinson14-827-52   ؛طرف لوير لوك
شرائح عد الخلايا ، غرفة مزدوجة لعداد الخلاياBio-Rad145-0011
جهاز طرد مركزي 5430REppendorf22620667
محلولالتنظيف NanoFCM Inc.
كولاجيناز الثانيورثينجتون للكيمياء الحيويةLS004176
DPBS (10x) سائل (-كالسيوم ، -مغنيسيوم)CytivaSH30378.02التخفيف النهائي المستخدم هو 1x
DPBS / معدل (1x)CytivaSH30264.02
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)Genesee Scientific25-500
E-POD Pure موزع المياه عن بعدMillipore SigmaZRXSP0D01
FA-45-30-11 Micro CentrifugeRotor Eppendorf05-401-503
Fisher Vortex Genie 2ThermoFisher Scientific12-812
Flow NanoAnalyzerNanoFCM Inc.
Heratherm OGS60 فرن البروتوكول العامThermoFisher Scientific51028112الحمل الحراري بالجاذبية ، 2.3 قدم مكعب 120 فولت
MemGlow-488 ProbeCytoskeleton Inc.MG01-02
ميليباك الخاصة ميليبورميليبور سيجماTANKMPK02
بنسلين ستربتومايسينجيبكو15070063
Pipet-Lite LTS ماصة L-1000XLS +Rainin17014382
Pipet-Lite LTS ماصة L-200XLS +Rainin17014391
Pipet-Lite LTS ماصة L-20XLS +Rainin17014392
نصائح الماصة ER LTS 1000 & micro; L F 768G / 8Rainin30808038
أطراف الماصة ER LTS 20 & micro; L F 960G / 10Rainin30807966
أطراف الماصة ER LTS 200 & micro; LF 960G / 10Rainin30807967
الخرز مراقبة الجودةNanoFCM Inc.
S110-AT دوار بزاوية ثابتةThermoFisher Scientific455391،10،000 دورة في الدقيقة
S16 exo 65-155nm حباتNanoFCM Inc.
مقصSPI ، الولايات المتحدة الأمريكية
Sorvall mX 150+ أجهزة الطرد المركزي الدقيقةThermoFisher Scientific50135641
TC 20 عداد الخلايا الآليBio-Rad1450102
Trypan Blue SolutionCorning25-900-CI
ملاقطSPI ، الولايات المتحدة الأمريكية
VWR 15 مل أنابيب الطرد المركزيأفانتور89039-668
واتمان بوراديسك 13 مرشحاتCytiva6782-13040.45 & micro; م حجم المسام
من النوع البري C57BL / 6J الفئرانجاكسون مختبرالأسهم # 000664
الدقيقة شركة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamaguchi, A., et al. Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level. Elife. 12, 89512(2023).
  2. Yamaguchi, A., et al. Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages. Front Immunol. 14, 1099799(2023).
  3. Takada, Y., et al. Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells. Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).
  4. Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques. Alcohol. 108, 1-9 (2023).
  5. Kargl, C. K., et al. Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice. Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).
  6. Vann, C. G., et al. Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle. Front Physiol. 13, 937899(2022).
  7. Anakor, E., et al. The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes. Cells. 11 (5), 845(2022).
  8. Mendhe, B., et al. Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury. Cells. 12 (4), 557(2023).
  9. Madison, R. D., Robinson, G. A. Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy. Neuroscience. 419, 46-59 (2019).
  10. Hanson, B., et al. EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method. Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).
  11. Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles. J Vis Exp. 190, e64557(2022).
  12. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  13. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  14. Fan, Y., et al. Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).
  15. Baietti, M. F., et al. Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes. Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).
  16. Shanely, R. A., et al. Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique. J Vis Exp. (91), e51812(2014).
  17. Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury. Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).
  18. Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).
  19. Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells. Regen Ther. 7, 1-7 (2017).
  20. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells. J Vis Exp. (86), e50846(2014).
  21. Mozzetta, C. Isolation and culture of muscle stem cells. Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).
  22. Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers. Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).
  23. Ma, S., et al. Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk. Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BCA

مقالات ذات صلة