العزل الأنزيمي للحويصلات الخلالية خارج الخلية للعضلات الهيكلية

الحويصلات خارج الخلية (EVs) هي جزيئات بحجم نانو مرتبطة بالغشاء تطلقها الخلايا في البيئة خارج الخلية. تنقل هذه المركبات الكهربائية الأحماض النووية والبروتينات والدهون لتعديل مسارات الإشارات المتعددة عند امتصاصها بواسطة الخلايا المتلقية. على وجه التحديد ، تورطت المركبات الكهربائية المعزولة من العضلات الهيكلية (SkM-EVs) في تنكس العضلات وتجديدها ونموها عن طريق نقل الحمض النووي الريبي الميكرو التنظيمي العضلي أو عوامل النسخ^1،2،3،4. مع استمرار تطور فهمنا للمجموعات السكانية الفرعية ل SkM-EV وخصائصها ، تظهر هذه الحويصلات واعدة كمؤشرات حيوية للتشخيص المبكر^5،6 وكأهداف علاجية للاضطرابات العصبية العضلية. يوفر هذا المجال المتوسع فرصا مثيرة لكل من التحقيقات المرضية والتطبيقات السريرية.

تركز الأبحاث الحالية على SkM-EVs في الغالب على تلك التي تم الحصول عليها من المواد الطافية لزراعة الخلايا بعد زراعة الخلايا بعد الثقافة خارج الجسم الحي ^2،7،8 ، مما يثير مخاوف بشأن دقة خطوط الخلايا المستهدفة بعد الممرات المتتالية وقابلية خصائص EV للتغيير في البيئات الاصطناعية. هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى عزل SkM-EVs مباشرة عن أنسجة العضلات لتجنب تأثيرات الثقافة خارج الجسم الحي وتمثيل أفضل في الجسم الحي. على الرغم من تطوير العديد من الأساليب لعزل المركبات الكهربائية من أنسجة العضلات^9،10 ، إلا أن الدراسات لا تزال تختلف اختلافا كبيرا في تفاصيل البروتوكول ، مما يؤثر على الاتساق وقابلية المقارنة. هناك حاجة ماسة إلى بروتوكول موحد لعزل وتوصيف SkM-EV لضمان الموثوقية عبر الدراسات ذات الصلة.

بالنظر إلى الخصائص الفسيولوجية للعضلات الهيكلية ، قمنا بتطوير بروتوكول لعزل وتنقية SkM-EVs من عينات عضلات الهيكل العظمي للقوارض باستخدام الانفصال الميكانيكي ، والتفكك الأنزيمي ، والترشيح ، والطرد المركزي التفاضلي. من خلال التحليل الشامل باستخدام قياس التدفق الخلوي النانوي ، ومقايسة BCA ، ومقايسة اللطخة الغربية ، وجدنا أن هذا البروتوكول ينتج باستمرار SkM-EVs ذات نقاء وكمية عالية خلال إطار زمني محدود. يمكن تطبيقه على عينات العضلات الهيكلية في حالات مختلفة ، بما في ذلك إصابات العضلات الحادة والمزمنة. علاوة على ذلك ، مع التعديلات المناسبة ، يمكن تصميم هذه الطريقة لأنسجة العضلات من المرضى البشريين أو النماذج الحيوانية الأخرى. يعد توحيد عملية عزل SkM-EV أمرا ضروريا لضمان الاتساق في جودة SkM-EV ، وتسهيل مقارنات خصائص EV - مثل العائد والحجم وتكوين الحمولة والوظيفة - وتعزيز تطبيقاتها المحتملة كمؤشرات حيوية تشخيصية ، فضلا عن تعزيز فهمنا لأدوارها في مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية.

يعزل هذا البروتوكول الحويصلات خارج الخلية (EVs) عن أنسجة العضلات الهيكلية باستخدام الانفصال الميكانيكي ، والتفكك الأنزيمي ، والترشيح ، والطرد المركزي التفاضلي. يسمح بعزل المركبات الكهربائية عن مجموعات عضلات أطراف القوارض الفردية أو المجمعة ، بما في ذلك الظنبوب الأمامي (TA) ، الباسطة الإصبعية الطولية (EDL) ، النعل (SOL) ، المعدة (GAS) ، وعضلات الفخذ (QUA). تمت الموافقة على استخدام من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة جورجيا ، وامتثلت الدراسة لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدامها في البحث. تم إيواء في مرافق داخل قسم علوم والألبان بجامعة جورجيا. تم استخدام ذكور الفئران البالغة من النوع البري (C57BL / 6J) في هذه الدراسة ، مع التضحية بالأنسجة التي تم حصادها من الفئران في عمر 3 أشهر. وترد تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في جدول المواد.

1. الانفصال الميكانيكي لمجموعات العضلات عن الفأر

1. القتل الرحيم للفئران بثاني أكسيد الكربون₂ ، يليه خلع عنق الرحم (باتباع البروتوكولات المعتمدة مؤسسيا). حلق كلا الطرفين الخلفيين.
2. قم بتأمين ساق الفأر في صفيحة معقمة بحيث يكون الجانب الأمامي من الساق متجها لأعلى (الشكل 1 أ).
3. قم بعمل شق صغير (5 مم) في الجلد على الجانب الجانبي من كاحل الفأر باستخدام مقص التشريح.
4. أدخل شفرة واحدة من المقص بعناية في الشق ، وضعها تحت الجلد ولكن ليس في الأنسجة العضلية الأساسية. ثم قم بقص الجلد لأعلى باتجاه الركبة لإطالة طول الشق.
5. أمسك الجلد على طول الشق باستخدام ملاقط خشنة وقم بتوسيع الفتحة حتى تصبح العضلة مرئية.
6. حدد موقع عضلة TA ، التي تمتد من الركبة إلى الكاحل على الجانب الجانبي من عظم الساق¹¹ ، واستخدم ملاقط حادة للإمساك بطبقة رقيقة من النسيج الضام التي تغطي العضلات وتقشيرها (الشكل 1 ب).
7. بالقرب من الكاحل ، حدد الأوتار في نهاية TA ، أحدهما متصل مباشرة بعضلة TA والآخر ، وتر EDL ، وهو أصغر ويقع بجوار وتر TA على الجانب الجانبي. قطع كلا الأوتار باستخدام مقص التشريح.
8. أمسك كلا الأوتار بملاقط خشنة. بعد ذلك ، استخدم زوجا آخر من الملقط الخشن أو الحاد لفصل الأوتار ، وبالتالي فصل TA عن EDL (الشكل 1C).
9. ارفع TA بواسطة الوتر المقطوع حديثا باستخدام ملاقط خشنة. ثم قم بقطع وتر TA بالقرب من الركبة باستخدام مقص التشريح ، وبالتالي إزالة العضلات. كرر هذه العملية لإزالة EDL ، وتخزين كلتا العضلتين في PBS على الجليد.
10. حرر الساق واقلب الماوس بحيث يكون الوجه الخلفي متجها لأعلى.
11. مع إزالة الجلد الموجود على الساق جزئيا الآن ، قم بقص الجلد بالقرب من الكاحل باستخدام مقص التشريح. بعد ذلك ، استخدم ملاقط خشنة لإمساك الجلد وتقشيره لأعلى باتجاه الجزء الخلفي من الركبة ، مما يؤدي إلى تعريض الغاز.
12. قطع وتر الغاز بالقرب من الكاحل باستخدام مقص التشريح (الشكل 1 د).
13. أمسك وتر الغاز بملاقط خشنة وارفعه لأعلى لكشف الجانب السفلي من GAS.
14. حدد موقع وتر SOL الصغير على الجانب السفلي من GAS بالقرب من الركبة (حيث لا يزال GAS متصلا). اقطع وتر SOL باستخدام مقص التشريح ، مما يتسبب في تقلص SOL لأعلى (الشكل 1E).
15. أمسك وتر SOL المقطوع بملاقط حادة وارفعه برفق ، وبالتالي فصل SOL عن الجانب السفلي من GAS.
16. اقطع نهاية SOL حيث يتم تثبيتها على الطرف المقطوع من GAS باستخدام مقص التشريح ، وبالتالي فصل العضلتين. احتفظ ب SOL في PBS على الجليد.
17. اقطع نهاية الغاز بالقرب من الركبة وضعها في PBS على الجليد.
18. بعد إزالة العضلات الأربع المدرجة أسفل الركبة ، اقلب الماوس بحيث يكون الوجه الأمامي لأعلى.
19. إذا لزم الأمر ، قشر الجلد أكثر باستخدام ملاقط خشنة لكشف QUA. ضع ساق الماوس بزاوية 90 درجة لإجبار QUA على الانثناء. قطع الوتر الأقرب إلى الركبة باستخدام مقص التشريح.
    1. افصل QUA عن عظم الفخذ عن طريق القطع بين العضلة والعظام حتى يتم توصيل QUA فقط بواسطة الوتر القريب (الشكل 1E). ثم اقطع الوتر القريب وقم بإزالة QUA. ضع QUA في PBS على الجليد.
20. تأكد من أنه بعد انفصال العضلات ، يتم الكشف عن الساق والشظية بوضوح (الشكل 1F).
21. اشطف العضلات عدة مرات باستخدام PBS لإزالة الملوثات مثل الفراء والدم (الشكل 1G). ثم جفف العضلات برفق باستخدام مناشف ورقية. استخدم الميزان التحليلي لقياس وزن العضلات، والذي سيتم استخدامه لاحقا لحساب EV الذي تم جمعه لكل جرام من العضلات.

2. التفكك الأنزيمي لقطع العضلات المنفصلة

1. قم بإزالة الأوتار العضلية برفق من عينة العضلات باستخدام ملاقط حادة أو ملاقط منشقة أو مشارط أو مقص (الشكل 2 أ).
2. بعد إزالة الأوتار ، قم بقطع العضلات طوليا على طول ألياف العضلات (من الوتر إلى الوتر) إلى قطع عضلية بسمك 1 مم باستخدام مقص أو مشرط لزيادة نسبة مساحة السطح إلى الحجم (الشكل 2 ب ، ج).
   ملاحظة: حاول الحد من تلف الألياف العضلية أثناء القطع. بالنسبة للعضلات الأكبر حجما مثل TA و GAS و QUA ، قم بإجراء تخفيضات إضافية مقارنة بالعضلات الأصغر مثل EDL و SOL لضمان نسبة مساحة السطح إلى الحجم المتساوية تقريبا عبر جميع عينات العضلات (الشكل 2 د).
3. قم بإعداد 10 مل من محلول الإنزيم الهضمي الطازج (DEB) لكل فأر واحتفظ به على الثلج حتى الاستخدام.
   1. لتحضير DEB ، اخلطي 2 مجم من إنزيم الكولاجيناز II لكل 1 مل من Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) مع محلول البنسلين والستربتومايسين بنسبة 1٪. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر بعد الخلط.
   2. تأكد من أن DEB لديه نشاط إنزيمي يزيد عن 250 وحدة. قم بتدوير DEB حتى يتم خلط المحلول جيدا ولم يعد مسحوق إنزيم الكولاجيناز II مرئيا.
4. افصل الأنسجة العضلية إلى أجزاء ، تحتوي كل منها على 20 مجم من الأنسجة العضلية. ثم أضف 1 مل من DEB إلى كل حصة للتفكك الأنزيمي.
5. احتضان خليط DEB والعضلات على شاكر في الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 12 ساعة بسرعة اهتزاز تبلغ 100 دورة في الدقيقة (دورة في الدقيقة) (الشكل 2 ه).

3. الترشيح والطرد المركزي منخفض السرعة لإثراء SkM-EV

ملاحظة: اضبط جهاز الطرد المركزي المبرد على 4 درجات مئوية وقم بتشغيله حتى يصل إلى درجة الحرارة المحددة. احتفظ بجميع الأنابيب والعينات المطلوبة على الثلج حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

1. باتباع إجراءات الهضم الأنزيمي ، تأكد من عدم وجود قطع عضلية يمكن تمييزها (الشكل 3 أ). قبل الطرد المركزي المبرد ، استخرج 10 ميكرولتر من المحلول من خليط DEB والعضلات وانقله إلى أنبوب 0.2 مل لاختبار صلاحية الخلية إذا لزم الأمر.
2. قم بإعداد وتسمية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الجديدة الفارغة سعة 1.5 مل. قم بإعداد مرشح 0.45 ميكرومتر وحقنة سعة 5 مل عن طريق إزالة المكبس (لا تتخلص منه) وشد المحور في الطرف العلوي من المرشح 0.45 ميكرومتر. ضع المرشح بحيث يتم وضع الطرف السفلي في أنبوب فارغ مسمى حديثا (الشكل 3 د). قم بتصفية 1x PBS من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
3. قم بالطرد المركزي للخليط لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم و 4 درجات مئوية لحبيبات أي حطام (الشكل 3 ب). انقل المادة الطافية (حوالي 1 مل) إلى المحقنة باستخدام ماصة دقيقة P200 (الشكل 3C,E).
4. أعد إدخال مكبس المحقنة وادفع المادة الطافية ببطء عبر الفلتر ، مما يسمح لها بالمرور والتجمع في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل المسمى حديثا (الشكل 3F).
5. قم بإزالة المكبس مرة أخرى وقم بإدخال الماصة تقريبا 200 ميكرولتر من 1x PBS في المحقنة.
6. أعد إدخال المكبس وادفع ببطء 200 ميكرولتر من 1x PBS عبر المرشح (الشكل 3G) لإزالة أي مادة طافية متبقية من المرشح وفي أنبوب الطرد المركزي الدقيق المسمى 1.5 مل.
7. كرر عملية الترشيح للأنابيب الأخرى ، باستخدام مرشح جديد لكل عينة من الأنسجة.
8. بعد الترشيح ، تأكد من أن المحلول شفاف وخالي من قطع العضلات المتبقية (الشكل 3H).

4. الطرد المركزي الفائق التفاضلي لتنقية SkM-EV

ملاحظة: اضبط جهاز الطرد المركزي المبرد على 4 درجات مئوية وقم بتشغيله حتى يصل إلى درجة الحرارة المحددة. احتفظ بجميع الأنابيب والعينات اللازمة على الثلج وجاهزة للاستخدام.

1. انقل المحلول المفلتر إلى أنابيب دقيقة جديدة سعة 1.5 مل (مناسبة لما يصل إلى 200,000 × جم). قم بموازنة جميع الأنابيب الدقيقة مع 1x PBS إضافي لضمان حجم متساو قبل وضعها في جهاز الطرد المركزي الفائق الصغر.
2. بعد التأكد من أن حجم جميع الأنابيب متساو ، أغلق الأنابيب وضعها في دوار جهاز الطرد المركزي الفائق لتكون متوازنة (الشكل 4 أ).
3. قم بتشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق الصغر واضبطه على العمل لمدة ساعة واحدة عند 100,000 × جم و 4 درجات مئوية (الشكل 4 ب).
4. ضع الدوار المحمل بالأنابيب في جهاز الطرد المركزي الفائق ، وأغلق الغطاء ، وقم بتشغيل الفراغ (الشكل 4C).
5. بمجرد أن يصل الفراغ إلى المستوى 2 ، اضغط على زر البدء وانتظر حتى تكتمل عملية الطرد المركزي (الشكل 4D).
6. بعد اكتمال دورة الطرد المركزي الفائق ، انقر فوق زر التفريغ لإعادة ضغط الغرفة قبل إزالة الدوار والأنابيب. احتفظ بالأنابيب على الجليد وضعها في وضع مستقيم لتجنب إزعاج الحبيبات.
7. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة دقيقة P200 ، وتجنب اضطراب الحبيبات (الشكل 4E).
8. أخرج الطرف ، ثم أضف 50 ميكرولتر من 1x PBS إلى الأنبوب بعد إزالة المادة الطافية باستخدام ماصة دقيقة P200. بالنسبة لعينات GAS و QUA ، أضف ما يصل إلى 500 ميكرولتر من 1x PBS للمساعدة في الذوبان (الشكل 4F).
9. أعد تعليق الحبيبات عن طريق سحب العينة برفق لأعلى ولأسفل باستخدام ماصة دقيقة P20 (أو ماصة دقيقة P200 إذا تمت إضافة 500 ميكرولتر) حتى يتم تفكيكها بالكامل وعدم رؤيتها.
10. أغلق الأنبوب وقم بتخزينه عند 4 درجات مئوية للتخزين قصير الأجل (أقل من أسبوع واحد) ، أو -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل ، أو ضع الأنبوب مرة أخرى على الجليد إذا تم تمييز العينة على الفور باستخدام قياس التدفق الخلوي النانوي أو اللطخة الغربية أو فحوصات أخرى.

باتباع هذا البروتوكول ، تم استخراج حويصلات العضلات الهيكلية خارج الخلية (SkM-EVs) بنجاح من مجموعات عضلية مختلفة ، بما في ذلك الظنبوب الأمامي (TA) ، الباسطة الأصابع الطويلة (EDL) ، النعل (SOL) ، المعدة (GAS) ، وعضلات الفخذ (QUA) من الفئران البرية. تم إجراء التوصيف اللاحق لهذه SkM-EVs من خلال قياس التدفق الخلوي النانوي ، لتوضيح ميزاتها المميزة كما هو موضح في الجدول 1. من اللافت للنظر ، من مجرد 1 غرام من الأنسجة العضلية ، تم الحصول على عائد مثير للإعجاب يبلغ 1.18e14 ± 4.86e13 SkM-EVs ، بمتوسط حجم جسيمات يبلغ 73.93 نانومتر ± 2.70 نانومتر ومتوسط حجم الجسيمات 72.55 نانومتر ± 2.42 نانومتر. أظهر توزيع الحجم تباينا قدره 13.28 نانومتر ± 1.71 نانومتر (الشكل 5) ، بما يتماشى بدقة مع التعريف المعترف به للمركباتالكهربائية 12،13.

لضمان سلامة SkM-EVs المعزولة ، تم استخدام MemGlow-488 ، وهو مسبار غشاء فلوروجيني ، لتسمية بنية الدهون داخل عينات SkM-EV (الشكل 5) ، مما يكشف عن الحفاظ المذهل على 96.40٪ ± 2.42٪ من الأغشية المغلفة بالدهون عبر السكان المعزولين. بالإضافة إلى ذلك ، تم تقييم نقاء SkM-EVs بدقة باستخدام مقايسة بروتين حمض البيسنكونينيك (BCA) ، والتي كشفت عن 4.82 ميكروغرام ± 2.28 ميكروغرام من البروتينات الموجودة لكل تريليون EVs. أظهر تحليل اللطخة الغربية التعبير عن العلامات الإيجابية للمركبات الكهربائية (CD8114 و Alix15) في SkM-EVs المعزولة ، مما يؤكد نقائها وغياب ملوثات التوبولين الخلوية (الشكل 6).

بعد ذلك ، تم إجراء فحوصات جدوى الخلية باستخدام صبغة التريبان الزرقاء لتحديد جدوى الخلايا المقيمة في العضلات أثناء عملية العزل. أكدت هذه الاختبارات أن البروتوكول لم يضعف بشكل كبير الخلايا المقيمة في العضلات ، مسجلا قابلية للخلية للحياة تبلغ حوالي 55٪. يمكن تطبيق مزيد من التحليل والتوصيف على SkM-EVs لاستكشاف وفهم دورها كوسطاء حيويين للتواصل بين الخلايا في نمو العضلات وعلم وظائف الأعضاء.

الشكل 1: إجراء الانفصال الميكانيكي لمجموعات عضلات الفئران. (أ) يتم تثبيت ساق الفأر في صفيحة معقمة بحيث يكون الجانب الأمامي متجها لأعلى. (ب) يوجد TA ، وتستخدم الملقط الحاد للاستيلاء على الطبقة الرقيقة من النسيج الضام الذي يغطي العضلة وتقشيرها. (ج) يتم تحديد بلد كهرباء لبنان المجاور للمساعد التقني وفصله بعناية عن المستشار الفني. (د) يتم تحديد موقع وقطع أوتار الغاز و SOL. (ه) يتم تحديد عضلة QUA وفصلها بعناية عن عظم الفخذ. (و) بعد انفصال العضلات ، ينكشف الظنبوب والشظية بوضوح. (ز) يتم شطف العضلات المنفصلة عدة مرات باستخدام PBS لإزالة أي ملوثات ، مثل الفراء والدم. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: التفكك الأنزيمي لقطع العضلات المنفصلة. (أ) تتم إزالة أوتار العضلات برفق من عينة العضلات. (ب-د) يستخدم المقص أو المشرط لقطع العضلات طوليا على طول ألياف العضلات (من الوتر إلى الوتر) إلى قطع عضلية بسمك 1 مم ، مما يضمن التوحيد في الحجم لتسهيل التفكك الأنزيمي. (ه) يتم تحضين خليط DEB والعضلات على الخلاط داخل الحاضنة لمدة 12 ساعة عند 37 درجة مئوية بسرعة اهتزاز تبلغ 100 دورة في الدقيقة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: الترشيح والطرد المركزي منخفض السرعة لإثراء SkM-EVs. (أ) بعد الهضم الأنزيمي ، يجب ألا تكون هناك قطع عضلية واضحة في الخليط. (ب) يتم طرد الخليط لمدة 10 دقائق عند 1,000 × جم و 4 درجات مئوية لتكسير أي حطام متبقي. (C-E) باستخدام ماصة سعة 200 ميكرولتر ، يتم نقل المادة الطافية بعناية 200 ميكرولتر في المرة الواحدة إلى حقنة. (و) يعاد إدخال مكبس المحقنة، ويتم دفع المادة الطافية ببطء عبر المرشح لإزالة أي حطام متبقي. (ز) يتم إعادة إدخال المكبس ، ويتم دفع 200 ميكرولتر من 1x PBS ببطء عبر المرشح لغسله. (ح) بعد الترشيح ، يجب أن يكون المحلول شفافا وخاليا من أي قطع عضلية متبقية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4: الطرد المركزي الفائق التفاضلي لتنقية SkM-EV. (أ) بعد التأكد من تساوي حجم جميع الأنابيب ، يتم إغلاق الأنابيب ووضعها في دوار الطرد المركزي الفائق ، مما يضمن التوازن المناسب. (ب) يتم تشغيل جهاز الطرد المركزي الفائق الصغر وضبطه على 100,000 جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية. (ج) يتم تحميل الدوار المتوازن مع الأنابيب في جهاز الطرد المركزي الفائق الصغر. الغطاء مغلق ، ويتم تشغيل المكنسة الكهربائية. (د) بمجرد أن يصل الفراغ إلى المستوى 2 ، يتم الضغط على زر البدء للسماح لجهاز الطرد المركزي الفائق بالعمل حتى الانتهاء. (ه) تتم إزالة المادة الطافية بعناية دون إزعاج الحبيبات (يشار إليها بالسهم). (و) بعد إزالة المادة الطافية ، يضاف 50 ميكرولتر من 1x PBS إلى الأنبوب باستخدام ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر أو 100 ميكرولتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 5: نمط توزيع الحجم وتلوين MemGlow-488. نمط توزيع الحجم وتلوين MemGlow-488 ل SkM-EVs المعزولة من مجموعات العضلات المختلفة ، بما في ذلك TA (A ، B) و EDL (C ، D) و SOL (E ، F) و GAS (G ، H) و QUA (I ، J). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تحليل اللطخة الغربية. تحليل اللطخة الغربية للتوبولين و CD81 و Alix في SkM-EVs وتقليص العضلات والهيكل العظمي. يتم تحميل كميات متساوية من البروتين (5 ميكروغرام لكل حارة) على الجل لكل عينة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول 1: توصيف SkM-EVs المعزولة. يتم قياس توزيع الحجم ومحتوى البروتين عن طريق قياس التدفق الخلوي النانوي ومقايسة بروتين BCA ، على التوالي.

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.