مقالة منهجية

نموذج الأغشية الحيوية المجمعة للتليف الكيسي لدراسة التعبير الجيني المرتبط بالعدوى

1.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67477

⸱

أبريل 18, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Infection, Microbiology and Immunology, University of Liverpool, 2Division of Molecular Microbiology, School of Life Sciences, University of Dundee

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تحدد هذه الدراسة إطارا لتطوير نموذج غشاء حيوي متعدد الميكروبات الكلي وتحسين بروتوكول استخراج الحمض النووي الريبي لتقييم التعبير الجيني Pseudomonas aeruginosa الذي يعكس بيئة الرئة للتليف الكيسي. تشمل التطبيقات تقييم التأثيرات المضادة للميكروبات ودراسة بدائل المضادات الحيوية في ظل الظروف ذات الصلة بالتليف الكيسي.

الملخص

طرق الاختبار قبل السريرية القياسية للعلاجات المضادة للميكروبات الجديدة المستخدمة لعلاج التهابات الرئة المزمنة لدى الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي لا تعكس الظروف البيئية لمكانة الرئة المعادية. يمكن أن تؤدي ظروف الاختبار الاختزالية الحالية إلى تطور المركبات على طول خط أنابيب ما قبل السريري دون دليل على نشاطها في ظل التليف الكيسي في ظروف الرئة المناسبة لذلك. قد لا تكون العديد من الأساليب المستخدمة لدراسة مضادات الميكروبات التقليدية مناسبة لبدائل المضادات الحيوية ، بما في ذلك العلاجات المضادة للضراوة مثل عوامل الاستشعار المضادة للنصابات ومثبطات siderophore. يوثق هذا البروتوكول نموذجا حيويا مجمعا ل Pseudomonas aeruginosa لمقارنة المقاومة والتعبير الجيني المرتبط بالعدوى في المزارع أحادية الأنواع ومتعددة الأنواع (المكورات العنقودية الذهبية والمبيضات البيضاء )، وفحص تخفيضات وحدة تشكيل المستعمرات (CFU) والتغيرات في التعبير الجيني ، باستخدام algD كمثال. تم تحسين النموذج لأحجام صغيرة وثابتة من الثقافات البكتيرية للسماح بدراسة المركبات الجديدة في مرحلة اكتشاف خط أنابيب تطوير الدواء ، حيث قد تكون الكميات المركبة محدودة. تشكلت الأغشية الحيوية من النوع الواحد المتصورة الزنجارية في وسط التليف الكيسي الاصطناعي 2 (SCFM2) لمدة 24 ساعة قبل العلاج بالميروبينيم بتركيزات مختلفة (1 و 16 و 256 ميكروغرام / مل) لمدة 24 ساعة أخرى. تم إنشاء الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات عن طريق زراعة المكورات العنقودية الذهبية والمبيضات البيضاء معا في SCFM2 ، ثم التلقيح بالمتصورة الزنجارية لمدة 24 ساعة إضافية ومعالجتها بالميروبينيم. أدى عدم وجود صلة مباشرة بين مقاييس الفعالية المركبة في الاختبارات قبل السريرية ونتائج التجارب السريرية إلى التشكيك على قابلية تطبيق أدوات الفحص المختبري الحالية. يسمح لنا هذا النموذج بفهم تأثير العوامل ذات الصلة على P. aeruginosa التعبير الجيني ، بما في ذلك الجينات التي تساهم في المقاومة والضراوة ، وبالتالي سد هذه الفجوة.

المقدمة

< p class = "jove_content" > التليف الكيسي (CF) هو الاضطراب الوراثي المتنحي الأكثر شيوعا بين السكان القوقازيين < فئة الدعم = "xref" >1. تؤدي الطفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) إلى مجموعة من الأعراض السريرية ، بما في ذلك الإفراط في إنتاج المخاط داخل الجهاز التنفسي. يؤدي ضعف النقل الأيوني إلى إصابة هذا المخاط بالجفاف ، ونتيجة لذلك ، لا يتم إزالته بشكل كاف بواسطة الجهاز المخاطي الهدبي ، مما يزيد من القابلية للإصابة بالالتهابات الرئوية المزمنة < فئة الدعم = "xref" >1. تتكون علم الأحياء الدقيقة لرئة التليف الكيسي من مجموعة متميزة من مسببات الأمراض الانتهازية ، حيث تعتبر المستدمية النزلية والمكورات العنقودية الذهبية كائنات أولية تصيب رئتي الرضع والأطفال المصابين بالتليف الكيسي ، يليها انخفاض هذه الكائنات والاستعمار اللاحق مع Burkholderia spp. ، أو Pseudomonas aeruginosa خلال مرحلة البلوغ < فئة الدعم = "xref">1،2،3، < فئة الدعم = "xref">4. بالإضافة إلى الأنواع البكتيرية ، فإن الكائنات الحية الدقيقة الفطرية شائعة أيضا في بيئة رئة التليف الكيسي ، حيث تعد المبيضات spp و Aspergillus spp من بين الأنواع الفطرية الأكثر عزلة شيوعا< فئة الدعم = "xref" >3،4،5. على الرغم من أن هذه الكائنات تلعب أدوارا مهمة في التهابات الرئة التليفية الكيسية ، إلا أن التقدم في تقنيات الاستزراع والأساليب المستقلة عن الثقافة قد أظهرت أن التهابات الرئة التليفية الكيسية نادرا ما تقتصر على نوع بكتيري واحد ، مما يسلط الضوء على الطبيعة المعقدة متعددة الميكروبات لفئة الرئة التليفية الكيسية < sup class = "xref" >1,6.

على الرغم من هذه المعرفة ، فإن الطرق الحالية في المختبر وفي الجسم الحي لتطوير واختبار المضادات الحيوية لاستخدامها في التهابات الرئة المزمنة تفتقر إلى التشابه التام مع مكانة الرئة CF < sup class = "xref" >7 ، مع التركيز على تحديد الحد الأدنى للتركيز المثبط (MIC) للدواء ضد مزارع النوع الواحد. يوفر هذا اعتبارا محدودا للبيئة المكروية المعدية ، والتي تعد مكونا رئيسيا لأمراض الرئة CF < فئة sup = "xref" >8. على هذا النحو ، تتضمن الطرق عادة نمو البكتيريا كثقافات عوالق ، وهي حالة نمو من المحتمل ألا تعكس حالة البكتيريا داخل رئة التليف الكيسي. هذا مهم بشكل خاص بالنسبة ل P. aeruginosa ، والذي يظهر عادة على شكل مجاميع غشاء حيوي غالبا ما تحتوي أيضا على أنواع بكتيرية وفطرية أخرى< فئة sup = "xref">9. تمثل هذه العوامل تحديات عند اختبار المضادات الحيوية لالتهابات الرئة المزمنة وتسلط الضوء على التباين بين طرق اختبار الحساسية للمضادات الحيوية والنشاط المضاد للميكروبات داخل بيئة الرئة التليفية الكيسية< sup class = "xref" >9,10. تتفاقم هذه التحديات عند فحص بدائل المضادات الحيوية ، مثل العلاجات المضادة للضراوة ، حيث لا تعد فحوصات MIC مؤشرا على النشاط ولا توفر فهما للتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض < فئة الدعم = "xref" >11.

Alginate ، عديد السكاريد خارج الخلية ، هو مكون رئيسي في P. aeruginosa الأغشية الحيوية داخل مكانة الرئة ويزيد من تحمل البكتيريا للمضادات الحيوية والعوامل المناعية ، فضلا عن تعزيز التصاق السطح < فئة sup = "xref" >12. يعتبر الجينات هدفا جذابا لتطوير العلاج المضاد للضروعة ، وقد تم تطوير العديد من العلاجات التي تستهدف التخليق الحيوي للجينات ، مثل تلك التي تستهدف algD ، وهو جين رئيسي في التخليق الحيوي للجينات < sup class = "xref" > 13 ، < sup class = "xref" >14. يمكن استخدام هذه العلاجات جنبا إلى جنب مع العلاجات بالمضادات الحيوية لدى الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي لتعطيل الأغشية الحيوية المتصورة الزائجارية ، وتحويل البكتيريا إلى حالة العوالق. هذا يزيد من فعالية المضادات الحيوية ، حيث يسمح تعطيل مصفوفة الأغشية الحيوية خارج الخلية بزيادة قدرة المضاد الحيوي على الوصول إلى الهدف البكتيري < فئة الدعم = "xref" >15. ومع ذلك ، على الرغم من الأدلة على النشاط في المختبر ، لا يزال عمل هذه العلاجات داخل مكانة الرئة في التليف الكيسي غير واضح.

يعمل نموذج الأغشية الحيوية الكلي المقدم هنا على معالجة هذه المشكلات من خلال إضافة المكورات العنقودية الذهبية و C. albicans ، وهما مستعمران مشتركان شائعان مع المتصورة الزنجارية داخل رئة التليف الكيسي. كما أنه يسمح للف. زنجاري بالنمو في مجاميع الأغشية الحيوية ، كما هو موضح في البيئة التنفسية. يسمح استخدام وسائط محاكاة البلغم وسائط التليف الكيسي الاصطناعي 2 (SCFM2) كبيئة غذائية للنمو بإضافة تأثيرات المضيف ، بما في ذلك الميوسين ، والحمض النووي خارج الخلية (ه) ، وملف تعريف الأحماض الأمينية الذي يكرر ذلك الذي يظهر داخل الرئة التليفية الكيسية < فئة sup = "xref">16.

لالتقاط ظروف رئة التليف الكيسي بشكل أكبر ، تتعرض الأغشية الحيوية للميروبينيم ، وهو مضاد حيوي يوصف بشكل متكرر للأشخاص المصابين بالتليف الكيسي خلال فترات التفاقم الرئوي. يوصى باستخدام مضاد حيوي في هذا النموذج كوسيلة لتكرار الحالات السريرية التي يمكن فيها وصف عامل مضاد للضراوة ، على سبيل المثال ، كعلاج مركب مقترن بالعلاج بالمضادات الحيوية لإدارة أعراض الجهاز التنفسي أثناء التفاقم. علاوة على ذلك ، فإن إدراج meropenem يسمح بتقييم P. aeruginosa الاستجابة النسخية للتعرض للمضادات الحيوية في ظل الظروف ذات الصلة بالعدوى. يمكن استخدام هذا النموذج لتوفير معلومات حول العوامل التي ستكون أهدافا دوائية مناسبة داخل رئة التليف الكيسي. يمكن أيضا تعديل النموذج ليشمل المضادات الحيوية الأخرى ذات الصلة ، مثل التوبراميسين ، ولتقييم التعبير عن الجينات الأخرى ذات الأهمية.

هنا ، يتم استخدام هذا النموذج متعدد الميكروبات الكلي لتقييم آثار وجود المكورات العنقودية الذهبية والمبيضات البيضاء وتركيزات متفاوتة من ميروبينيم (1 و 16 و 256 ميكروغرام / مل) على التعبير عن algD بواسطة P. aeruginosa. يوصف Meropenem لعلاج التهابات الرئة المتصورة الزنجارية في المقام الأول وليس له تأثير مباشر على المكورات العنقودية الذهبية أو المطثية البيضاء ، حيث يبلغ MIC لكل من هذين النوعين المتعايشين >256 ميكروغرام / مل.

سيزيد هذا العمل من فهم كيف يمكن للعوامل ذات الصلة ، مثل العوامل المضيفة داخل SCFM2 والكائنات الحية الدقيقة الاستعمارية المشتركة ، أن تؤثر على التعبير عن الجينات ذات الصلة بعدوى المتصورة الزائفة الزنجارية وسيوفر الأسس لتطوير واختبار العلاجات المضادة للضراوة لاستخدامها في التهابات الجهاز التنفسي الكتيبية المزمنة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الأغشية الحيوية أحادية

النوع
  1. إحياء P. aeruginosa PAO1 من مزارع مخزون الخرز المجمدة عن طريق وضع حبة واحدة على أجار مرق Lysogeny (LB) واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد مزارع PAO1 بين عشية وضحاها عن طريق أخذ مستعمرة واحدة من لوحة الخط وإضافتها إلى 5 مل رطل متوسط. احتضان بين عشية وضحاها (18 ساعة) ثم خفف إلى OD600 من 0.05 (ما يعادل 1 × 108 CFU / مل) ، وقم بتخفيف 1: 100 في SCFM2 المحضر وفقا ل Palmer ، et al.< sup class = "xref">16.
  3. أضف 180 ميكرولتر من اللقاح إلى آبار صفيحة ميكروتيتر مستديرة القاع 96 بئر. تحضير الأغشية الحيوية في ثلاث نسخ بيولوجية للتعداد بواسطة وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs). يتم إجراء ما مجموعه 3 نسخ مكررة لكل نسخة مكررة بيولوجية ل qPCR فقط. إلى 3 آبار منفصلة ، أضف 180 ميكرولتر من SCFM2 المعقم لاستخدامها في عناصر التحكم في الوسائط.
    ملاحظة: تم اختيار الألواح المستديرة السفلية على عكس الألواح التقليدية ذات القاع المسطح نظرا لتفوقها في السماح بالتعرض المتجانس للأغشية الحيوية بأكملها لوسط النمو المحيط < فئة الدعم = "xref">17.
  4. اسمح للأغشية الحيوية بالتشكل على مدار 24 ساعة ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية وتهتز عند 75 دورة في الدقيقة.
< p class = "jove_title" >2. تحضير الأغشية الحيوية متعددة الأنواع

  1. إحياء المتصورة الزنجارية PAO1 و S. aureus SH1000 من مزارع مخزون الخرز المجمدة كما هو موضح أعلاه. قم بإحياء C. albicans CAF2.1 من مزارع مخزون الخرز المجمدة عن طريق وضع حبة واحدة على أجار سكر العنب Saboraud واحتضانها لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد مزارع ليلية من SH1000 و CAF2.1 عن طريق أخذ مستعمرة واحدة من لوحة الخط وإضافة 5 مل من LB (مزارع منفصلة بين عشية وضحاها لكل كائن حي). احتضن بين عشية وضحاها لمدة 18 ساعة. توحيد الثقافات الليلية للمكورات العنقودية الذهبية SH1000 و C. albicans CAF2.1 في LB إلى OD600 القيم 0.1 ، وهو ما يعادل 1 × 109 و 1.2 × 107 CFU / مل ، على التوالي < فئة الدعم = "xref" >17,< sup class = "xref">18.
  3. تمييع المكورات العنقودية الذهبية و C. albicans لتشكيل لقاح واحد يحتوي على كلا النوعين بتركيزات 1 × 106 و 1 × 105 CFU/mL ، على التوالي ، في SCFM2.
  4. أضف 162 ميكرولتر من اللقاح إلى آبار صفيحة ميكروتيتر 96 بئرا. تلقيح الأغشية الحيوية في ثلاث نسخ بيولوجية للتعداد بواسطة وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs). يتم إجراء ما مجموعه 3 نسخ مكررة لكل نسخة مكررة بيولوجية ل qPCR فقط. إلى 3 آبار منفصلة ، أضف 180 ميكرولتر SCFM2 معقم لاستخدامه في عناصر التحكم في الوسائط.
  5. اسمح للأغشية الحيوية بالتشكل لمدة 24 ساعة ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية وتهتز عند 75 دورة في الدقيقة.
  6. قم بإعداد ثقافة PAO1 بين عشية وضحاها عن طريق أخذ مستعمرة واحدة من صفيحة الخط وإضافتها إلى 5 مل من وسط LB. احتضان بين عشية وضحاها (18 ساعة) ، ثم أضف عند OD600 من 0.05 (ما يعادل 1 × 108 CFU / mL) ، ثم قم بتخفيفه إلى 1 × 105 CFU / مل في SCFM2.
  7. أضف 14.2 ميكرولتر من لقاح PAO1 إلى آبار صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا ، مما يؤدي إلى اللقاح النهائي ل PAO1 هو 1 × 104 CFU / mL.
    ملاحظة: هذا الاختلاف في تركيز اللقاح بين الأنواع المختلفة هو ضمان أن المكورات العنقودية الذهبية و C. albicans لا تتفوق على المتصورة الزنجارية وكلها قابلة للاسترداد عن طريق الطلاء الموضعي من الأغشية الحيوية لمدة 24 ساعة حيث لا توجد مضادات حيوية.
  8. اسمح للأغشية الحيوية متعددة الميكروبات بالتشكل على مدار 24 ساعة ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية وتهتز عند 75 دورة في الدقيقة.
< p class = "jove_title" >3. DNase ومعالجة المضادات الحيوية للأغشية الحيوية أحادية الأنواع ومتعددة

الأنواع
  1. أضف 2 ميكرولتر من DNase I مباشرة إلى الآبار التي تحتوي على الأغشية الحيوية بتركيز نهائي قدره 50 ميكروغرام / مل ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، ورجها عند 75 دورة في الدقيقة.
    ملاحظة: يضاف هذا لتخفيف الأغشية الحيوية اللزجة للسماح باختراق أفضل لمضادات الميكروبات ، مما يعكس جرعة rhDNase (DNase البشري المؤتلف) التي يتناولها العديد من الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي كاستراتيجية لإدارة التفاقم الرئوي.
  2. تحضير مخزون مضاد حيوي من ميروبينيم إلى 2.56 مجم / مل ، باستخدام الماء المقطر كمخفف. يخفف بشكل متسلسل بمعامل 2 لتحقيق تركيزات 0.01 مجم / مل - 2.56 مجم / مل.
  3. أضف 20 ميكرولتر من كل تخفيف ميروبينيم إلى الأغشية الحيوية لتحقيق نطاق جرعة من 1 ميكروغرام / مل - 256 ميكروغرام / مل. أضف 20 ميكرولتر من الماء المقطر إلى الأغشية الحيوية للتحكم السلبي بدلا من المضاد الحيوي.
  4. أغلق صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا بغشاء شفاف واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ، مع الرج عند 75 دورة في الدقيقة.
< ص الفئة = "jove_title">4. تعداد الخلايا القابلة للحياة والنشاط الأيضي

ملاحظة: الخطوات التالية مخصصة للأغشية الحيوية المخصصة للقياس الكمي ل CFU فقط.

  1. أضف 10 ميكرولتر من السليولاز (100 مجم / مل ، 0.05 م عازلة سترات) إلى الأغشية الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، مع الرج عند 140 دورة في الدقيقة. يستخدم السليلاز بانتظام لتعطيل الهياكل العظمية السليلوز داخل الأغشية الحيوية < sup class = "xref" > 19 ، < sup class = "xref" > 20 ، < sup class = "xref" >21. قم بتعطيل الأغشية الحيوية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل إذا لزم الأمر حتى لا توجد كتل مرئية.
  2. أضف 10 ميكرولتر من محلول ريزازورين 0.02٪ لتقييم النشاط الأيضي للأغشية الحيوية للاختبار والتحكم في الأغشية الحيوية واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، مع الاهتزاز عند 140 دورة في الدقيقة.
  3. قم بقياس تألق كل بئر باستخدام طول موجة إثارة يبلغ 540 نانومتر وطول موجة انبعاث يبلغ 590 نانومتر في قارئ الصفيحة الدقيقة.
  4. تصحيح تألق الخلفية عن طريق طرح قيم التألق من عينات الوسائط الفارغة وحساب النسبة المئوية للانخفاض على أنه (متوسطالأغشية الحيوية المعالجة بالمضادات الحيوية F / متوسطالمراقبة السلبية F) × 100٪.
  5. تعداد محتويات الآبار ، التي تحتوي على كل من الأغشية الحيوية المعطلة والخلايا العوالق ، عن طريق التخفيف المتسلسل والطلاء الموضعي على أجار انتقائي على النحو التالي:
    أجار Pseudomonas الانتقائي المكمل ب 1٪ من الجلسرين ومكملات CN لتعداد المتصورة الزائفة الزنجارية
    أجار ملح مانيتول لتعداد المكورات العنقودية الذهبية |< / > خميرة الببتون سكر العنب أجار المكملة بالبنسلين (250 وحدة / مل) ، ستربتومايسين (250 ميكروغرام / مل ، كبريتات الجنتاميسين (30 ميكروغرام / مل) ، والفانكومايسين (3 ميكروغرام / مل) لتعداد المطثية البيضية.< / > ملاحظة: تم تعداد محتويات الآبار بالكامل بسبب تحديات فصل الأغشية الحيوية العائمة الحرة عن الخلايا العوالق. ومع ذلك ، فإن هذا النهج يعكس بشكل أكثر دقة الظروف الموجودة في رئة التليف الكيسي. قد يكون التكثيف موجودا على الغطاء بعد الحضانة. لضمان عدم وجود تلوث بين الآبار ، ضع أدوات التحكم المعقمة على أجار انتقائية.
  6. بعد الطلاء الموضعي على أجار الانتقائي ، احتضن الألواح لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية قبل التعداد.
فئة

5. تحضير الأغشية الحيوية لاستخراج الحمض النووي الريبي

ملاحظة: جميع الخطوات من هذه النقطة فصاعدا مخصصة للأغشية الحيوية المخصصة لتحليل RT-qPCR فقط.

  1. قم بإزالة صفيحة الميكروتيتر المكونة من 96 بئرا التي تحتوي على الأغشية الحيوية من الحاضنة 37 درجة مئوية وانقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1 مل. عند النقل ، تأكد من تجميع مكررات الأغشية الحيوية لكل تكرار بيولوجي يتم إجراؤه. هذا يضمن وجود كتلة حيوية كافية لاستخراج الحمض النووي الريبي.
  2. جهاز طرد مركزي الأنابيب سعة 1.5 مل التي تحتوي على الأغشية الحيوية عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق. إذا قمت بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي في نفس اليوم ، فانتقل إلى الخطوة 6.2.1. إذا لم يتم إجراء استخراج الحمض النووي الريبي في نفس اليوم ، فقم بإزالة المادة الطافية وتخزين الحبيبات في 250 ميكرولتر من محلول تثبيت الحمض النووي الريبي عند -20 درجة مئوية. تم استخدام هذا المحلول لتخزين الكريات البكتيرية في العديد من الدراسات< فئة الدعم = "xref">22،23.
فئة

6. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. استخرج الحمض النووي الريبي البكتيري أحادي النوع والأغشية الحيوية متعددة الأنواع باستخدام مجموعة تجارية. قم بإعداد المخازن المؤقتة وفقا للتعليمات الواردة في إرشادات الشركة المصنعة.
  2. قم بإزالة مادة الوسائط الثقافية وتخلص منها. إذا تم تخزين الحبيبات في محلول تثبيت ، فقم بإذابة الثلج إلى درجة حرارة الغرفة وجهاز الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 600 ميكرولتر من كاشف استخراج الحمض النووي الريبي, ثم قم بتعطيلها يدويا باستخدام إبرة 0.2 مم متصلة بحقنة 2 مل (شفط 5x-10x أو حتى تتعطل الحبيبات تماما).
  3. قم بتنفيذ خطوات تنقية الحمض النووي الريبي وفقا للتعليمات الواردة في إرشادات الشركة المصنعة.
  4. حدد كمية الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية ومجموعة فحص الحمض النووي الريبي BR والأنابيب. الحدود التي يمكن اكتشافها للحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة الفحص هي 10 - 1200 نانوغرام / ميكرولتر ، وبالتالي فإن الحد الأدنى المقبول للإنتاج المقبول للحمض النووي الريبي لهذا البروتوكول هو 10 نانوغرام / ميكرولتر.
    1. قم بإعداد العدد المطلوب من الأنابيب للعينات والمعايير (مطلوب 2 معيار).
    2. قم بإعداد محلول العمل بإضافة 199 ميكرولتر من المخزن المؤقت و 1 ميكرولتر من الكاشف لكل عدد من العينات (+ 2 معيار و 2 للخطأ).
    3. أضف 190 ميكرولتر من محلول العمل و 10 ميكرولتر من المعيار 1 والمعيار 2 في أنابيب منفصلة.
    4. أضف 199 ميكرولتر من محلول العمل و 1 ميكرولتر من عينة الحمض النووي الريبي في أنابيب منفصلة. دوامة لمدة 30 ثانية ثم تخزينها في مكان مظلم لمدة 5 دقائق.
    5. في مقياس الفلور، حدد الحمض النووي الريبي > الحمض النووي الريبي واسع النطاق واتبع التعليمات.
    6. تقييم جودة الحمض النووي الريبي باستخدام مقياس الطيف الضوئي. قم بإفراغ مقياس الطيف الضوئي عن طريق سحب 1 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase على مقياس الطيف الضوئي. امسح الماء باستخدام منديل خال من النسالة واضبط نسبة الامتصاص على 260/280 نانومتر. الماصة 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي. إذا كان الحمض النووي الريبي نقيا ، ملاحظة ذروة واحدة بين 260 و 280 نانومتر ، وستظهر نسبة ~ 2.0.
  5. قم بتحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام مجموعة توليف (كدنا). بالنسبة لأي عينات من الحمض النووي الريبي تتجاوز 50 نانوغرام / ميكرولتر ، قم أولا بتخفيفها إلى 50 نانوغرام / ميكرولتر باستخدام ماء خال من DNase / RNase.
    1. باستخدام الأنابيب ، قم بإعداد مزيج تفاعل (كدنا) وفقا للجدول 1.
    2. ضع الأنابيب في جهاز تدوير حراري باستخدام الشروط التالية: 25 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، 42 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. إما أن تستخدم (كدنا) على الفور أو قم بتخزينها مجمدة عند -20 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >7. qPCR

  1. قم بإجراء qPCR باستخدام qPCR Master Mix. استخدم بادئات algD وجين التدبير المنزلي (16S) التالية (الجدول 2).
    ملاحظة: تم تصميم البادئات باستخدام أداة NCBI-primer Blast عبر الإنترنت مع الإشارة إلى تسلسل الجينوم الكامل ل P. aeruginosa ، ثم تم تصنيعها من خلال بائع تجاري. تم التحقق من صحة البادئات للتأكد من نوعيتها في الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات من خلال مطابقة التسلسل باستخدام أداة NCBI-primer Blast.
  2. قم بتخفيف البادئات إلى 4 ميكرومتر (4 مساء / ميكرولتر) عن طريق تخفيف 20 ميكرولتر من البرايمر في 480 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase. يمكن تجميدها لاستخدامات متعددة.
  3. قم بإعداد حل العمل للمزيج الرئيسي qPCR وفقا للتعليمات الواردة في الجدول 3.
    ملاحظة: يحتوي محلول عمل algD على محلول كاف لتكرارات بيولوجية 3x و 3x تكرارات تقنية لكل تركيز ميروبينيم ، و 6x عناصر تحكم سلبية ، وخطأ 2x. تحتوي حلول العمل 16S على حل كاف لمعايير 2x لتركيز الحمض النووي الريبي المعروف وخطأ 2x.
  4. أضف 18 ميكرولتر من محلول عمل algD إلى أنابيب تفاعل qPCR المناسبة. سيشمل ذلك ما مجموعه 36 أنبوبا لتحليل تعبير algD و 6 أنابيب للضوابط السلبية.
  5. أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي إلى كل أنبوب من أنابيب تفاعل qPCR أو 2 ميكرولتر من الماء الخالي من DNase / RNase إلى عناصر التحكم السلبية.
  6. أضف 18 ميكرولتر من محلول العمل 16S إلى أنابيب تفاعل qPCR المناسبة. سيشمل ذلك ما مجموعه 2 أنابيب. أضف 2 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي بتركيز معروف إلى أنابيب تفاعل qPCR.
  7. قم بإجراء qPCR وفقا للشروط التالية: دقيقتان عند 95 درجة مئوية ، 15 ثانية عند 95 درجة مئوية (40 دورة) ، دقيقة واحدة عند 60 درجة مئوية.
  8. قم بتحليل نتائج qPCR باستخدام طريقة 2-ΔΔCt ، كما هو موضح سابقا < فئة الدعم = "xref" >24. عند تحليل تعبير algD ، استخدم تعبير algD عند 0 ميكروغرام / مل كعنصر تحكم في تركيبات الأغشية الحيوية المعنية والنظر في تعبير تغيير الطية ذي الصلة بالثقافات غير المعالجة

النتائج

تسلط النتائج الموضحة في الشكل 1A الضوء على مرونة الغشاء الحيوي المكون من نوع واحد من بكتيريا Pseudomonas عند تعريضه للعلاج بـ meropenem، حيث لم يُلاحظ أي انخفاض معنوي عند أي من الجرعات المختبرة. أظهرت مجموعة الضبط السالبة، التي لم تتعرض لـ meropenem، استعادة قدرها 8.31 ± 0.07 Log10CFU/mL، بينما حدث أكبر انخفاض في الخلايا الحية عند تركيز 16 µg/mL، مما أدى إلى استعادة قدرها 8.06 ± 0.10 Log10CFU/mL. ومع ذلك، فإن هذا المستوى من المقاومة متوقع، حيث تشير الدراسات السابقة إلى أن الأغشية الحيوية لبكتيريا P. aeruginosa أكثر مقاومة بكثير لـ meropenem مقارنة بنظيراتها من الخلايا السابحة، إذ يتطلب القضاء على البكتيريا في الأغشية الحيوية تركيزاً >256 µg/mL25,26، مقارنة بالخلايا السابحة التي تبلغ قيمة الـ MIC لها 2 µg/mL.

الشكل 1B يوضح متوسط نسبة الانخفاض في النشاط الأيضي للأغشية الحيوية من P. aeruginosa أحادية المزرعة لكل تركيز من المضاد الحيوي مقارنة بالغشاء الحيوي الضابط، الذي لم يتعرض للميروبينيم. ويشير الانخفاض في الفلورة إلى حدوث نشاط أيضي أقل، وهو ما يُتخذ كمؤشر على انخفاض عدد الخلايا الحية. وقد أظهرت المزارع المعالجة بالميروبينيم زيادة في النشاط الأيضي (يُشار إليها بنسبة انخفاض سالبة)، مما يدل على عدم وجود نشاط مبيد للبكتيريا (أو وجود نشاط محدود جداً).

قد يشير ارتفاع النشاط الأيضي دون زيادة في استعادة CFU إلى الاستجابة الأيضية للبكتيريا عند التعرض للمضاد الحيوي. وبالنظر إلى الغشاء الحيوي أحادي النوع ومتعدد الأنواع (الشكل 2)، اختلف النمو الإجمالي لبكتيريا P. aeruginosa بشكل طفيف فقط، حيث كانت استعادة الخلايا القابلة للحياة من الغشاء الحيوي أحادي النوع أعلى بمقدار 0.74 ± 0.17 Log10CFU/mL مقارنة بما شوهد في الغشاء الحيوي متعدد الميكروبات في حالة عدم وجود مضاد حيوي. وقد تم استعادة S. aureus من الغشاء الحيوي متعدد الميكروبات بمقدار 6.95 ± 0.11 Log10CFU/mL، واستعادة C. albicans بمقدار 1.66 ± 2.88 Log10CFU/mL. ومع ذلك، فإن C. albicans تتواجد فقط في الحالات التي لم يتم فيها إضافة الميروبينيم، ولم يتم استعادتها من أي أغشية حيوية تم إعطاؤها المضاد الحيوي. وبما أن الميروبينيم ليس له تأثير مباشر على Candida، وهو ما ثبت في مقايسات MIC السابقة التي أجريت في المختبر على مزرعة أحادية من C. albicans حيث كانت قيمة MIC للميروبينيم >256 µg/mL، فمن المحتمل أن تكون استجابة الإجهاد البكتيري للأنواع الأخرى المتعايشة، S. aureus و P. aeruginosa، تجاه التعرض للمضاد الحيوي هي التي تؤدي إلى خلق ظروف معادية للفطر.

بما أن الأغشية الحيوية لـ P. aeruginosa ، سواء في المزارع الأحادية أو مع مسببات الأمراض التي تستوطن بشكل مشترك، لا تُظهر أي انخفاض في استعادة الخلايا القابلة للحياة عند استخدام تركيزات من الميروبينيم تصل إلى 256 µg/mL، فإن هذا يسلط الضوء على الحاجة إلى علاجات بديلة، مثل علاجات مضادات الضراوة، لمكافحة مثل هذه العدوى المزمنة سريرياً، والتي قد تعمل بالتزامن مع مضادات الميكروبات لتقليل الحمل البكتيري بشكل فعال.

تعبير جين algD في أغشية حيوية أحادية النوع من P. aeruginosa PAO1
تم تقييم تعبير algD في بكتيريا P. aeruginosa PAO1 المعرضة لتركيزات مختلفة من الميروبينيم (1، و16، و256 µg/mL) والمنماة في وسط SCFM2 باستخدام تقنية SYBR-Green RT-qPCR. ثم تم تحليل التعبير باستخدام طريقة 2-ΔΔCt، مع استخدام 16S كجين تحكم (الشكل 3). لم يختلف تعبير algD بشكل ملحوظ بين تركيزات الميروبينيم المستخدمة، مما يشير إلى أن تعبير algD في سلالة PAO1 عند نموها كغشاء حيوي أحادي النوع لا يتأثر بشدة بوجود الميروبينيم.

algD التعبير في P. aeruginosa الأغشية الحيوية متعددة الأنواع لسلالة PAO1
تعبير algD كما تم تقييمه في *P. aeruginosa* سلالة PAO1 التي نمت في أغشية حيوية تتكون من *S. aureus* SH100 و *C. albicans* CAF2.1 لتقييم ما إذا كان وجود الكائنات المتعايشة يؤثر على تعبير algD أو الاستجابة للميروبينيم في سلالة PAO1. ولم تظهر فروق ذات دلالة إحصائية في algD لوحظ التعبير في الفترة ما بين 0-16 µg/mL التعرض للميروبينيم. ومع ذلك، عند 256 µg/mL، والتعبير عن algD كان أعلى بكثير مقارنة بتركيزات المضادات الحيوية الأخرى (0 µg/mL مقابل 256 µg/mLp = 0.0075, 1 µg/mL مقابل 256 µg/mL p = 0.035, 16 µg/mL مقابل 256 µg/mL (p = 0.0048) بمقدار أعلى بنحو 7 أضعاف مقارنة بحالة المجموعة الضابطة (الشكل 4). وهذا يسلط الضوء على أنه، عند تنميتها في وجود S. aureus و C. albicans، هناك زيادة في تعبير algD عند أعلى تركيز من الميروبينيم، مقارنةً بما كان عليه الوضع عندما *P. aeruginosa* تنمو بمفردها، مما يشير إلى زيادة في إنتاج الألجينات في الوسط متعدد الميكروبات. وعلى الرغم من إظهار اختلافات في algD التعبير بين الأغشية الحيوية أحادية النوع ومتعددة الأنواع، فمن غير الواضح ما إذا كانت هذه الزيادة في التعبير مدفوعة بوجود نوع محدد (S. aureus أو (C. albicans) أو ما إذا كانت التفاعلات التي تشمل كلا الكائنين الدقيقين هي التي تدفع هذا التغير في التعبير الجيني.

تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية فهم تأثير العلاجات والبيئة على التعبير الجيني، لا سيما في سياق الاختبارات المستقبلية للعلاجات التي تستهدف الضراوة.

مخططات شريطية لتثبيط النمو البكتيري لكل من P. aeruginosa و S. aureus و C. albicans مقابل التركيز.
الشكل 1: أغشية حيوية أحادية النوع تتكون من Pseudomonas aeruginosa PAO1. تم استزراع الأغشية الحيوية لمدة 24 h في SCFM2، وعولجت بـ 50 µg/mL من DNase I لمدة 1 h، ثم عولجت بالميروبينيم بتركيزات مختلفة لمدة 24 h إضافية. (أ) متوسط Log10CFU/mL. يشير الخط المنقط إلى انخفاض بمقدار 2-log (ما يعادل انخفاض بنسبة 99 %) في استعادة P. aeruginosa مقارنة بالمجموعة الضابطة السالبة. (ب) نسبة الانخفاض في وحدات الفلورة النسبية. يشير الخط المنقط إلى انخفاض بنسبة 50% في الفلورة، وهي النقطة الأولى التي تعتبر القيمة فوقها هي قيمة MIC50. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

تركيز الميروبينيم مقابل النمو البكتيري (أ) وانخفاض الفلورة (ب) في الرسوم البيانية.
الشكل 2أغشية حيوية متعددة الأنواع تتكون من الزائفة الزنجارية (*Pseudomonas aeruginosa*) PAO1، المكورات العنقودية الذهبية (Staphylococcus aureus) SH1000، و Candida albicans CAF2.1تم استنبات الغشاء الحيوي الرقيق لمدة 24 ساعة في وسط SCFM2، ثم عولج بـ 50 µg/mL بواسطة DNase I لمدة ساعة واحدة، ثم عولجت بـ meropenem بتركيزات مختلفة لمدة 24 ساعة إضافية. يشير الخط المقطع إلى انخفاض بمقدار لوغاريتمين (ما يعادل انخفاضاً بنسبة 99%) في *P. aeruginosa* الاستعادة من المجموعة الضابطة السالبة. وقد تم تحديد الدلالة الإحصائية باستخدام تحليل التباين ثنائي الاتجاه (two-way ANOVA) حيث **** p < 0.0001. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

رسم بياني شريطي للتعبير النسبي مقابل التركيز (µg/ml)، يوضح نتيجة التحليل الإحصائي (ns).
الشكل 3: تعبير algD المستخلص من نوع واحد يتكون من P. aeruginosa PAO1. تم استزراع الأغشية الحيوية لمدة 24 h في SCFM2، وعولجت بـ 50 µg/mL من DNase I لمدة 1 h، وعُرّضت لتركيزات متفاوتة من meropenem (0, 1, 16, 256 µg/mL). تم تحليل التعبير الجيني باستخدام طريقة 2-ΔΔCt. استُخدم الجين المرجعي 16S في التحليل. حُددت الدلالة الإحصائية بواسطة اختبار توكي للمقارنات المتعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

مخطط شريطي للتعبير النسبي مقابل التركيز؛ الدلالة الإحصائية؛ تحليل التعبير الجيني.
الشكل 4: تعبير algD المستخلص من أغشية حيوية متعددة الأنواع تتكون من P. aeruginosa PAO1، وS. aureus SH1000، وC. albicans CAF2.1. تم استزراع الأغشية الحيوية في وسط SCFM2، وعولجت بـ 50 µg/mL من DNase I لمدة 1 h، ثم عولجت بـ meropenem بتركيزات مختلفة (0، 1، 16، 256 µg/mL) لمدة 24 h إضافية. تم تحليل التعبير الجيني باستخدام طريقة 2-ΔΔCt. استُخدم الجين المرجعي 16S في التحليل. **p < 0.01 كما تم تحديده بواسطة اختبار Tukey للمقارنات المتعددة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الحجم لكل تفاعل cDNA (μL)
مزيج تفاعل iscript بتركيز 5X4
إنزيم النسخ العكسي iScript1
ماء خالٍ من إنزيمي DNase وRNase14
٢.٥ نانوغرام من الحمض النووي الريبوزي (RNA)1
إجمالي حجم التفاعل 20

الجدول 1: المحاليل العاملة للمزيج الرئيسي لـ cDNA. المكونات والأحجام المطلوبة لكل تفاعل cDNA.

جينبادئ أماميالبادئ العكسي
algDCGCCGAGATGATCAAGTACATGTAGTAGCGCGACAGGTTG
16SACCGCATACGTCCTACGGCGAAGACCTTCTTCACACACG

الجدول 2: algD و 16S بادئات qPCR الأمامية والعكسية.

الحجم لكل تفاعل (µL)algD حجم التشغيل (µL)16S حجم التشغيل (µL)
GoTaq qPCR Master Mix (2X)1044040
البادئ الأمامي1444
البادئ العكسي1444
ماء خالٍ من إنزيمات DNase وRNase626424
إجمالي 1879272

الجدول 3: المحاليل العاملة للمزيج الرئيسي لـ qPCR. المكونات والأحجام المطلوبة لمحاليل المزيج الرئيسي لـ qPCR الخاصة بـ algD و 16S .

الشكل التكميلي 1: أغشية حيوية متعددة الأنواع تتكون من Pseudomonas aeruginosa LESB58، وStaphylococcus aureus SH1000، وCandida albicans CAF2.1. تم استزراع الأغشية الحيوية لمدة 24 h (n = 3) في SCFM2، وعولجت بـ 50 µg/mL من DNase I لمدة 1 h، ثم عولجت بالميروبينيم بتركيزات مختلفة لمدة 24 h إضافية. يشير الخط المنقط إلى انخفاض بمقدار 2-log (ما يعادل انخفاض بنسبة 99%) في استعادة P. aeruginsoa مقارنة بمجموعة الضبط السالبة. أُجري التحليل الإحصائي باستخدام تحليل التباين الثنائي two-way ANOVA. *p=0.0242, ** p=0.0013, **** p <0.0001. يرجى النقر هنا لتنزيل هذا الشكل.

المناقشة

تظهر هذه النتائج أنه على الرغم من استخدامه المتكرر في إدارة التفاقم الرئوي لدى الأشخاص المصابين بالتليف الكيسي ، إلا أن الميروبينيم لم يؤثر بشكل كبير على نمو المتصورة الزنجارية في نموذج الأغشية الحيوية أحادي النوع أو متعدد الأنواع. ولوحظت زيادة طفيفة في التعافي من المتصورة الزنجارية في كلا النموذجين بعد المعالجة ب 128 ميكروغرام/مل و256 ميكروغرام/مل ميروبينيم، كما لوحظ أيضا بالنسبة للمكورات العنقودية الذهبية في الأغشية الحيوية متعددة الأنواع. ومع ذلك ، كانت هذه الزيادات ضئيلة. قد يكون الانخفاض في C. albicans عند تعرضه للميروبينيم بسبب الظروف المعادية للفطر الذي تخلقه البكتيريا استجابة لإجهاد مضادات الميكروبات. لم يلاحظ وجود فروق ذات دلالة إحصائية في تعبير algD بين تركيزات الميروبينيم عندما P. aeruginosa نمت كغشاء حيوي أحادي النوع. ومع ذلك ، كان تعبير algD أعلى بشكل ملحوظ في الأغشية الحيوية متعددة الأنواع عند معالجتها ب 256 ميكروغرام / مل ميروبينيم ، مما يشير إلى أنه قد يزداد إنتاج الألجينات في ظل هذه الظروف. تظهر الاختلافات في تعبير algD التي لوحظت بين تركيبات الأغشية الحيوية وتركيزات الميروبينيم كيف يمكن أن يؤثر وجود العوامل ذات الصلة على التعبير الجيني المرتبط بالعدوى ويسلط الضوء على أهمية مراعاة استخدام مضادات الميكروبات وحالة العدوى متعددة الميكروبات عند تطوير واختبار بدائل المضادات الحيوية.

على الرغم من فائدة النماذج ، إلا أن هناك العديد من الاعتبارات لضمان التطبيق الناجح. يعد إنشاء المكورات العنقودية الذهبية و C. albicans داخل الأغشية الحيوية أمرا ضروريا قبل الإصابة بالمتصورة الزنجارية ، بسبب مخاطر تفوق المكورات العنقودية الذهبية والمثيثية البيضاء على الجرام السالب. في نموذج الأغشية الحيوية هذا ، يبدو أن C. albicans شريك ضعيف بسبب معدلات البقاء على قيد الحياة المنخفضة بشكل ملحوظ مقارنة ب S. aureus و P. aeruginosa ، حتى في حالة عدم وجود مضادات حيوية. يشير هذا إلى أن الخميرة إما تتفوق على الموارد أو تتأثر سلبا بالتفاعلات بين الأنواع داخل الأغشية الحيوية27،28. غياب المطثية البيضاء في وجود الميروبينيم ، على الرغم من أن المضاد الحيوي ليس له نشاط مباشر مضاد للفطريات ، يدعم فكرة أن استجابة الإجهاد من المكورات العنقودية الذهبية إلى الموروبينيم قد تخلق بيئة غير مضيافة ل C. البيضاء29،30. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن اختيار السلالة يمكن أن يكون له تأثير على كمية المطثية البيضاء التي يمكن استردادها من نموذج الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات. لوحظت اتجاهات مختلفة عند استخدام P. aeruginosa LESB58 بدلا من PAO1 (الشكل التكميلي 1). مع LESB58 ، يمكن استرداد C. albicans في جميع تركيزات الميروبينيم ويظهر في الواقع زيادة طفيفة مع انخفاض تركيز المتصورة الزنجارية نتيجة لمضادات الميكروبات ، مما يسمح بتكوين المجتمع بالتغيير. ومع ذلك ، على الرغم من هذه الاختلافات ، يتم استخدام PAO1 في هذا النموذج نظرا لكونه سلالة مرجعية معملية ، والتي توفر خط أساس متسقا ومميزا جيدا للدراسات المقارنة. هذا الاتساق أمر بالغ الأهمية لقابلية التكاثر ولاستخلاص استنتاجات موثوقة حول التفاعلات داخل الأغشية الحيوية.

قد يكون من الصعب استخراج كميات كبيرة من الحمض النووي الريبي من البكتيريا المزروعة في SCFM2 ، بسبب الطبيعة اللزجة للوسائط. لذلك ، فإن تعطيل الأغشية الحيوية بإبر 0.2 مم قبل استخراج الحمض النووي الريبي هو خطوة مهمة لزيادة إنتاجية الحمض النووي الريبي وضمان استخراج تركيزات كافية (≥10 نانوغرام / ميكرولتر) ل RT-qPCR. الحمض النووي الريبي شديد التأثر بالتدهور31 ، لذلك بعد الاستخراج ، تأكد من تنفيذ جميع الأنشطة النهائية التي تستخدم الحمض النووي الريبي على الجليد. يمكن أن يؤدي الذوبان المنتظم للتجميد لبادئات الحمض النووي الريبي و cDNA و qPCR إلى زيادة احتمالية تدهور المنتج. لذلك ، يجب أن تكون محدودة قدر الإمكان. التحدي الشائع الآخر في تطبيق هذه النماذج هو خطر التلوث أثناء استخراج الحمض النووي الريبي أو اختبار qPCR. يمكن تقليل هذا الخطر إلى الحد الأدنى عن طريق رش المعدات بمحلول تحلل الحمض النووي قبل استخراج الحمض النووي الريبي وباستخدام أطراف الماصة الخالية من DNase / RNase طوال الإجراء. سيساعد الاستبدال المنتظم للمياه الخالية من DNase / RNase أيضا في تقليل مخاطر التلوث في اختبار qPCR.

اختار هذا البروتوكول التركيز على algD باعتباره الجين محل الاهتمام نظرا لضرورته في إنتاج الجينات ، والذي يوصف بأنه عامل ضراوة رئيسي ل P. aeruginosa أثناء كل من الالتهابات الحادةوالمزمنة 32. وبالتالي ، تتم دراسة الجينات بشكل متزايد كهدف للعلاجات المضادة للضراوة33،34. على الرغم من استخدام هذا النموذج لتقييم التعبير عن algD ، إلا أنه يمكن تطبيقه لتقييم التعبير عن جينات المتصورة الزنجارية الأخرى لأهداف الأدوية المضادة للضراوة. تم استخدام Meropenem في هذه الدراسة بسبب الأدلة التي تشير إلى أن المضاد الحيوي يؤثر على التعبير عن جينات التخليق الحيوي للألجينات ، خاصة عندما ينمو المتصورة الزنجارية في وجود C. albicans35. علاوة على ذلك ، غالبا ما يوصف الميروبينيم سريريا لعلاج وإدارة التهابات الجهاز التنفسي المتصورة الزنجارية ، مما يسلط الضوء على توظيفه ذي الصلة في هذا النموذج36. ومع ذلك ، فإن إضافة مضادات حيوية مختلفة ، أو حتى علاجات مزدوجة ، ممكنة أيضا مع هذه النماذج. سيسمح دمج المضادات الحيوية في هذا النموذج أيضا باستخدام هذا النموذج لدراسة التغيرات التطورية في آليات المقاومة البكتيرية ، مثل تطوير المقاومة بوساطة البورين بواسطة المتصورة الزنجارية للكاربابينيم37. يمكن تكييف نموذج الأغشية الحيوية متعدد الميكروبات هذا ليشمل الأنواع الأخرى ذات الصلة ، على سبيل المثال البكتيريا المتعايشة مثل Rothia sp. و Streptococcus sp. أو استبداله بالميكروبات الأخرى المسببة للعدوى مثل Aspergillus sp. لتعكس متطلبات الدواء المرشح الذي يتم فحصه.

تم تطوير نماذج الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات التي تحاكي رئة التليف الكيسي سابقا38. يعتمد النموذج الموصوف هنا على العمل السابق بهدف زيادة الإنتاجية باستخدام إعداد قابل للزراعة الميكروبية صغيرة الحجم. هذا مفيد لاختبار المركبات الجديدة حيث قد تكون المواد المتاحة محدودة. نظرا لأن النموذج صغير الحجم وثابت ، فمن الممكن زراعة الأغشية الحيوية في توافر الأكسجين المختلفة لتعكس عن كثب البيئة الهوائية الدقيقة في الرئتين39،40. لسهولة التكاثر ولأسباب تتعلق بالفعالية من حيث التكلفة ، نمت الأغشية الحيوية التي تم الإبلاغ عنها في هذه الدراسة بشكل هوائي.

على الرغم من الأفكار القيمة المكتسبة من هذه الدراسة ، يجب الاعتراف بالعديد من القيود. أولا ، يحد غياب الخلايا المضيفة من فائدتها لدراسة عوامل الضراوة التي لها هدف خلوي مباشر للثدييات. يحدد هذا تحديات إنشاء نماذج في المختبر مناسبة لدراسة عوامل الضراوة ويسلط الضوء على الحاجة إلى مزيد من التطوير للنماذج التي تكرر البيئة المعادية للعدوى المزمنة. علاوة على ذلك ، على الرغم من اعتباره عاملا من عوامل الضراوة ، إلا أن الألجينات هي سمة رئيسية للأغشية الحيوية ويتم إنتاجها بواسطة المتصورة الزنجارية في كل من المختبر والبيئة. قد يكون استخدام النماذج في المختبر لدراسة عوامل المضادات الحيوية أقل صعوبة من استخدام النماذج لدراسة العلاجات الأخرى المضادة للضراوة ، مثل العوامل المضادة للسموم الخارجية ، حيث يكون للهدف تأثير مباشر على الخلايا حقيقية النواة41.

في حين أن اختيار سلالة المتصورة الزنجارية من PAO1 مناسب للتكرار والتوحيد القياسي للنموذج في المختبر ، فقد يكون من المرغوب فيه تضمين عزلات من العدوى المزمنة. سيتم إجراء التجارب المستقبلية باستخدام هذا النموذج مع سلالة معزولة من عينات المرضى لمراقبة تأثير مضادات الميكروبات على السلالات التي تتكيف مع مكانة الجهاز التنفسي.

يسمح استخدام SCFM2 كمحاكي للبلغم في هذا النموذج في المختبر بالمراقبة الموحدة والقابلة للتكرار للتغيرات السلوكية للأغشية الحيوية الإجمالية المزروعة في بيئة ذات صلة بمجرى الهواء أثناء العلاج بالمضادات الحيوية. تم اختيار SCFM2 على الإصدار الأصلي من SCFM بسبب إدراج الحمض النووي خارج الخلية (eDNA) والميوسين ، وهما عاملان مهمان في دعم تكوين الأغشية الحيوية. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن المتغيرات الأخرى لوسائط البلغم الاصطناعية متوفرة أيضا ، مثل SCFM3 ، الذي يحتوي على حمض p-aminobenzoic و NAD + و adenine و guanine و xanthin و hypoxanthine42 و SCFM4 ، وهي نسخة تعاني من نقص الحديد. علاوة على ذلك ، فإن استخدام وسائط البلغم الاصطناعية ، مثل وسط الرئة التليف الكيسي (CFLM) ووسط الجيوب الأنفية التليفية الكيسية (CFSM) ، الذي طوره Ruhluel وزملاؤه43 ، سيسمح بتقسيم الشعب الهوائية لتصور سلوك وتأثير العلاجات المضادة للضراوة على الأغشية الحيوية متعددة الميكروبات في بيئات مختلفة.

في حين أن AlgD هو إنزيم رئيسي في مسار التخليق الحيوي للألجينات ، إلا أن مستوى التعبير عنه وحده لا ينبغي أن يؤخذ كمؤشر على إنتاج الجينات. يمكن أن تؤثر عوامل أخرى ، مثل تعديلات ما بعد النسخ وما بعد الترجمة ، بالإضافة إلى الآليات التنظيمية ، على كمية الجينات المنتجة ، مما يؤدي إلى تقليل تكوين الأغشية الحيوية ، وزيادة القابلية للإجهاد البيئي ، وتعزيز حساسية المضادات الحيوية حيث يتم تقليل إنتاج الألجينات12،14. هناك العديد من العلاجات المضادة للضراوة قيد التطوير والتي تستهدف بروتين الجينات حيث لن يكون هذا النموذج مناسبا لتحديد فعاليتها وحيث سيكون من المفيد قياس إنتاج الألجينات مباشرة أو قراءة وظيفية44. أيضا ، قد تستهدف بعض العلاجات المضادة للضراوة مراحل مختلفة من التخليق الحيوي أو التنظيم للجينات ، لذا فإن قياس إنتاج الألجينات يلتقط بشكل مباشر التأثير الصافي للعلاج على عامل الضراوة44. ومع ذلك ، فإن العديد من العلاجات المضادة للفوعة في الدراسات الحالية تستهدف جينات الجينات الرئيسية ، ونماذج التعبير الجيني مثل هذه ستكون مناسبة لدراسة آثار هذه العلاجات13،14. يمكن أيضا تكييف تقنيات مثل هذه بسهولة للفحص عالي الإنتاجية ، مما يسمح بالتقييم السريع لعينات أو ظروف متعددة ، وهو أمر مفيد في الدراسات واسعة النطاق التي تتضمن الفحص الأولي للمركبات المضادة للضراوة المحتملة.

بشكل عام ، تمثل نماذج الأغشية الحيوية أحادية الأنواع والأنواع المتعددة أدوات قيمة لدراسة التعبير عن الجينات ذات الصلة بالعدوى من المتصورة الزنجارية في ظل الظروف المناسبة للتليف الكيسي. أحدث الطرح الواسع النطاق للعلاج المغير ثورة في مشهد الرعاية الصحية للتليف الكيسي. ومع ذلك ، على الرغم من مجموعة الفوائد السريرية لمعدلات التليف الكيسي ، فقد أظهرت الدراسات أن السلالات النسيلية من الزائفة لا تزالموجودة ، مما يسلط الضوء على أن العلاجات الجديدة لإدارة التهابات الرئة المتصورة الزنجارية لا تزال مطلوبة45،46. على الرغم من القيود التي تمت مناقشتها ، يمكن أن يكون تطبيق هذه النماذج مفيدا في مرحلة الاكتشاف لخط أنابيب تطوير الأدوية لتقييم فعالية المركبات داخل مكانة الرئة CF وتفاعلات المركبات الجديدة المضادة للضراوة مع المضادات الحيوية المعروفة داخل هذه البيئة.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

HL و DN و JF تلقوا دعما منحيا لمركز البحوث الاستراتيجية (SRC) إطار ما قبل السريري القائم على الأدلة لتطوير العلاجات المضادة للميكروبات في التليف الكيسي (PIPE-CF; رقم المشروع SRC 022) من صندوق التليف الكيسي في المملكة المتحدة ومؤسسة التليف الكيسي الأمريكية. يتم دعم TH من قبل برنامج MRC Discovery Medicine North لتدريب الدكتوراه في شراكة الدكتوراه. نحن نقدر التمويل من CF Trust و CF Foundation (SRC022) وبرنامج MRC DiMEN DTP

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
غشاء مانع للتسرب سهل التنفس لألواح متعددة الآبار   ;سيجما ألدريتش Z763624
موقد
السليولاز (100 مجم / مل)كامبريدج بيوساينس   ؛HY-B2220-5g
CN الملحق  سيجما ألدريتش 1.07624
طقم Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2050
Dnase I & nbsp ؛ثيرمو فيشر العلميEN0521
مياه خالية من DNase / RnaseVWRJ60610. XC
كبريتات الجنتاميسين (30 & micro; g / mL)Sigma Aldrich  ؛G3632
الجلسرين (1٪)ثيرمو فيشر العلمي15514029
GoTaq qPCR Master Mix Promega A6101
iScript Cdna Synthesis Kit  Bio-Rad1708890
البنسلين (250 وحدة / مل)مستلزمات مختبرات ScientficP3032-10MU
Qubit 4 FluorometerThermo Fisher ScientificQ33238
Qubit RNA BR Assay Kit   ؛أنابيب Thermo Fisher ScientificQ10210
ThermoFisher ScientificQ32856
محلول ريزازورين (0.02٪)Thermo Fisher ScientificR12204
RNAlater SolnInvitrogenAM7021
Streptomycin (250 & micro; g / mL)Sigma Aldrich  ؛S9137
Thermal cycler (استخدمنا T100 Thermal Cycler) Biorad1861096
TRIzol Reagent   ؛Invitrogen15596026
Vancomycin (3 & micro; g / mL)Sigma Aldrich  ؛1709007
بنسن

المراجع

  1. Blanchard, A. C., Waters, V. J. Opportunistic pathogens in Cystic Fibrosis: Epidemiology and pathogenesis of lung infection. J Pediatric Infect Dis Societ. 11 (Supplement_2), S3-S12 (2022).
  2. Kordes, A., et al. Genetically diverse Pseudomonas aeruginosa populations display similar transcriptomic profiles in a cystic fibrosis explanted lung. Nat Comm. 10 (1), 3397(2019).
  3. Chotirmall, S. H., Greene, C. M., McElvaney, N. G. Candida species in cystic fibrosis: A road less travelled. Med Mycol. 48 (Supplement_1), S114-S124 (2010).
  4. Françoise, A., Héry-Arnaud, G. The microbiome in Cystic fibrosis pulmonary disease. Genes (Basel). 11 (5), 536(2020).
  5. Haiko, J., Saeedi, B., Bagger, G., Karpati, F., Özenci, V. Coexistence of Candida species and bacteria in patients with cystic fibrosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 38 (6), 1071-1077 (2019).
  6. Filkins, L. M., O’Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS pathogens. 11 (12), e1005258(2015).
  7. Barton, T. E., Frost, F., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Challenges and opportunities in the development of novel antimicrobial therapeutics for cystic fibrosis. J Med Microbiol. 71 (12), (2022).
  8. Akkerman-Nijland, A. M., et al. The pharmacokinetics of antibiotics in cystic fibrosis. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 17 (1), 53-68 (2021).
  9. Lindgren, N. R., McDaniel, M. S., Novak, L., Swords, W. E. Acute polymicrobial airway infections: analysis in cystic fibrosis mice. Microbiology (Reading). 169 (1), 001290(2023).
  10. Hurley, M. N., Ariff, A. H. A., Bertenshaw, C., Bhatt, J., Smyth, A. R. Results of antibiotic susceptibility testing do not influence clinical outcome in children with cystic fibrosis. Journal of Cystic Fibrosis. 11 (4), 288-292 (2012).
  11. Totsika, M. Benefits and challenges of antivirulence antimicrobials at the dawn of the post-antibiotic era. Curr Med Chem. 6 (1), 30-37 (2016).
  12. Davarzani, F., et al. Evaluation of antibiotic resistance pattern, alginate and biofilm production in clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Iran J Public Health. 50 (2), 341-349 (2021).
  13. Ambutsi, M., Okoth, P. Comparative genomic analysis of gene clusters of Pseudomonas aeruginosa that define specific biofilm formation in deciphering target regions for novel treatment options. Sci African. 13, e00910(2021).
  14. Dai, J., Luo, W., Hu, F., Li, S. In vitro inhibition of Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilm formation by DZ2002 through regulation of extracellular DNA and alginate production. Front Cell Infect Microbiol. 13, 1333773(2024).
  15. Olson, M. E., Ceri, H., Morck, D. W., Buret, A. G., Read, R. R. Biofilm bacteria: formation and comparative susceptibility to antibiotics. Can J Vet Res. 66 (2), 86-92 (2002).
  16. Palmer, K. L., Aye, L. M., Whiteley, M. Nutritional cues control Pseudomonas aeruginosa multicellular behavior in cystic fibrosis sputum. J Bacteriol. 189 (22), 8079-8087 (2007).
  17. Pascoe, B., et al. Dormant cells of Staphylococcus aureus are resuscitated by spent culture supernatant. PLoS One. 9 (2), e85998(2014).
  18. Caldeira, J., Almeida, G., Macedo, A. L., Silva, J. P. M., Albergaria, H. Saccharomycin, a biocide from S. cerevisiae that kill-off other yeasts. Ann Med. 51 (Suppl 1), 94-95 (2019).
  19. Redman, W. K., Welch, G. S., Rumbaugh, K. P. Assessing biofilm dispersal in murine wounds. J Vis Exp. (174), e62136(2021).
  20. Zhang, J., et al. Cellulase promotes mycobacterial biofilm dispersal in response to a decrease in the bacterial metabolite gamma-aminobutyric acid. Int J Mol Sci. 25 (2), 1051(2024).
  21. Kamali, E., Jamali, A., Izanloo, A., Ardebili, A. In vitro activities of cellulase and ceftazidime, alone and in combination against Pseudomonas aeruginosa biofilms. BMC Microbiol. 21 (1), 347(2021).
  22. Cao, P., et al. A Pseudomonas aeruginosa small RNA regulates chronic and acute infection. Nature. 618 (7964), 358-364 (2023).
  23. Tremblay, J., Déziel, E. Gene expression in Pseudomonas aeruginosa swarming motility. BMC Genom. 11 (1), 587(2010).
  24. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  25. Aaron, S. D., et al. Single and combination antibiotic susceptibilities of planktonic, adherent, and biofilm-grown Pseudomonas aeruginosa isolates cultured from sputa of adults with cystic fibrosis. J Clin Microbiol. 40 (11), 4172-4179 (2002).
  26. Haagensen, J., et al. Spatiotemporal pharmacodynamics of meropenem- and tobramycin-treated Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Antimicrob Chemother. 72 (12), 3357-3365 (2017).
  27. Jing, Q., et al. Staphylococcus aureus wraps around Candida albicans and synergistically escapes from Neutrophil extracellular traps. Front Immunol. 15, 1422440(2024).
  28. Wu, Y. M., et al. Enhanced virulence of Candida albicans by Staphylococcus aureus: Evidence in clinical bloodstream infections and infected Zebrafish embryos. J Fungi. 7 (12), 1099(2021).
  29. Ruiz-Sorribas, A., Poilvache, H., Van Bambeke, F. Pharmacodynamics of Moxifloxacin, Meropenem, Caspofungin, and their combinations against in vitro polymicrobial interkingdom biofilms. Antimicro Agents Chemother. 66 (2), e02149-e02121 (2022).
  30. Pohl, C. H. Recent advances and opportunities in the study of Candida albicans polymicrobial biofilms. Front Cell Infect Microbiol. 12, 836379(2022).
  31. Aburayyan, W. S. High-throughput RNA extraction method for P. aeruginosa and S. pyogenes biofilms. J Appl Pharma Sci. 13 (3), 97-105 (2023).
  32. Ramsey, D. M., Wozniak, D. J. Understanding the control of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis and the prospects for management of chronic infections in cystic fibrosis. Mol Microbiol. 56 (2), 309-322 (2005).
  33. Kim, S. K., et al. Inhibition of Pseudomonas aeruginosa alginate synthesis by Ebselen oxide and its analogues. ACS Infectious Diseases. 7 (6), 1713-1726 (2021).
  34. Gao, F., et al. Protective effects of anti-alginate monoclonal antibody against Pseudomonas aeruginosa infection of HeLa cells. Micro Pathogen. 145, 104240(2020).
  35. Alam, F., Blair, J. M. A., Hall, R. A. Transcriptional profiling of Pseudomonas aeruginosa mature single- and dual-species biofilms in response to meropenem. Microbiology (Reading). 169 (1), 001271(2023).
  36. Farrington, N., et al. Molecular pharmacodynamics of meropenem for nosocomial pneumonia caused by Pseudomonas aeruginosa. mBio. 15 (2), e03165-e03123 (2024).
  37. Meletis, G., Exindari, M., Vavatsi, N., Sofianou, D., Diza, E. Mechanisms responsible for the emergence of carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa. Hippokratia. 16 (4), 303-307 (2012).
  38. O'Brien, T. J., Hassan, M. M., Harrison, F., Welch, M. An in vitro model for the cultivation of polymicrobial biofilms under continuous-flow conditions. F1000Res. 10, 801(2021).
  39. Guss, A. M., et al. Phylogenetic and metabolic diversity of bacteria associated with cystic fibrosis. ISME J. 5 (1), 20-29 (2011).
  40. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031(2020).
  41. Hibbert, T. M., Whiteley, M., Renshaw, S. A., Neill, D. R., Fothergill, J. L. Emerging strategies to target virulence in Pseudomonas aeruginosa respiratory infections. Crit Rev Microbiol. , 1-16 (2023).
  42. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  43. Ruhluel, D., O'Brien, S., Fothergill, J. L., Neill, D. R. Development of liquid culture media mimicking the conditions of sinuses and lungs in cystic fibrosis and health. F1000Res. 11, 1007(2022).
  44. Yin, R., Cheng, J., Wang, J., Li, P., Lin, J. Treatment of Pseudomonas aeruginosa infectious biofilms: Challenges and strategies. Front Microbiol. 13, 955286(2022).
  45. Ledger, E. L., et al. Impact of CFTR modulation on Pseudomonas aeruginosa infection in people with Cystic Fibrosis. J Infect Dis. 230 (3), e536-e547 (2024).
  46. Armbruster, C. R., et al. Persistence and evolution of Pseudomonas aeruginosa following initiation of highly effective modulator therapy in cystic fibrosis. mBio. 15 (5), e00519-e00524 (2024).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الزائفة الزنجاريةالغشاء الحيوي متعدد الميكروباتاختبار مضادات الميكروباتالعلاج بالميروبينيماستخلاص الحمض الريبوزي النوويالوحدات المكونة للمستعمراتالعلاجات المضادة للضراوة
نموذج الأغشية الحيوية المجمعة للتليف الكيسي لدراسة التعبير الجيني المرتبط بالعدوى
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.