يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تصور السياليل داخل الخلايا باستخدام كيمياء النقر والفحص المجهري التوسعي

1.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67479

⸱

فبراير 7, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Univ. Lille, CNRS, UMR 8576 - UGSF - Unité de Glycobiologie Structurale et Fonctionnelle, 2Univ. Lille, CNRS, UMR 8520 - IEMN – Institut d’Electronique, de Microelectronique et de Nanotechnologie, 3Univ. Lille, CNRS, Inserm, CHU Lille, Institut Pasteur de Lille, US 41 - UAR 2014 - PLBS

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقترح بروتوكولا بسيطا يجمع بين هندسة قليل السكاريد الأيضي ، وكيمياء النقر ، والفحص المجهري التمدد الذي يسمح بالتصوير البيولوجي للبروتينات السكرية N داخل الخلايا مع دقة محسنة باستخدام معدات الفحص المجهري الروتيني.

الملخص

تسمح تقنيات وضع العلامات الأيضية بدمج المراسلين المتعامدين الحيوي في الجليكان ، مما يتيح الاقتران الحيوي المستهدف للأصباغ الجزيئية داخل الخلايا من خلال النقر والكيمياء المتعامدة الحيوية. اجتذبت هندسة السكريات قليلة السكاريد الأيضية (MOE) اهتماما كبيرا بسبب الدور الأساسي للارتباط بالجليكوزيل في العديد من العمليات البيولوجية التي تنطوي على التعرف الجزيئي وتأثيره على الأمراض التي تتراوح من السرطان إلى الاضطرابات الوراثية إلى الالتهابات الفيروسية والبكتيرية.

على الرغم من أن وزارة التربية والتعليم معروفة بشكل أفضل بالكشف عن الجليكوكونقرجات على سطح الخلية ، إلا أنها أيضا منهجية مهمة جدا لدراسة الجليكان داخل الخلايا في السياقات الفسيولوجية والمرضية. تستفيد هذه الدراسات بشكل كبير من الدقة المكانية العالية. ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري فائق الدقة غير متاح بسهولة في معظم المختبرات ويشكل تحديات للتنفيذ اليومي. يعد الفحص المجهري التوسعي بديلا حديثا يعزز دقة الفحص المجهري عن طريق تكبير العينات البيولوجية المصنفة بعلامات الفلورسنت. من خلال تضمين العينة في هلام منتفخ والتسبب في تمددها بشكل متناحي الخواص من خلال المعالجة الكيميائية ، يمكن تصور الهياكل تحت الخلوية بدقة ودقة محسنة دون الحاجة إلى تقنيات فائقة الدقة.

في هذا العمل ، نوضح قدرة الفحص المجهري التوسعي على تصور الجليكان السياليلات داخل الخلايا من خلال الاستخدام المشترك لكيمياء MOE والنقر. على وجه التحديد ، نقترح إجراء لوضع العلامات المتعامدة الحيوية والفحص المجهري التوسعي الذي يستخدم مراسلا يستهدف السياليلات ، والذي قد يكون مرتبطا بالتألق المناعي لدراسات التوطين المشترك. يتيح هذا البروتوكول دراسات توطين التخليق الحيوي المترافق ، والاتجار داخل الخلايا ، وإعادة التدوير.

المقدمة

الفحص المجهري الفلوري ، بينما يستخدم على نطاق واسع لوضع العلامات على جزيئات معينة داخل الخلايا وتصورها ، محدود بطبيعته في الدقة من خلال حد حيود آبي للضوء1 ، والذي يحد من القدرة على التمييز بين الأجسام الأقرب من حوالي 200-250 نانومتر. ينشأ هذا القيد من الطبيعة الموجية للضوء والفتحة العددية للعدسة الموضوعية للمجهر ، مما يمثل تحديا عند تصوير الهياكل تحت الخلوية. يوفر التغلب على هذه القيود رؤى أفضل لبعض العمليات البيولوجية على نطاق نانومتري.

لتجاوز حد حيود الضوء ، تم تطوير تقنيات الفحص المجهري فائقة الدقة مثل STORM (الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي) و STED (استنفاد الانبعاث المحفز)2،3. تعتمد STORM على التنشيط العشوائي للفلوروفورات ، مما يسمح فقط بتصوير مجموعة فرعية متناثرة في أي وقت. يتيح ذلك التوطين الدقيق للفلوروفورات الفردية ، مما يسمح بإعادة بناء صورة عالية الدقة. من ناحية أخرى ، تعمل STED على تحسين الدقة باستخدام ليزر النضوب لإخماد التألق بشكل انتقائي حول محيط بقعة الإثارة ، مما يؤدي إلى تضييق وظيفة انتشار النقاط بشكل فعال.

تتناقض هذه الأساليب مع الفحص المجهري واسع المجال أو متحد البؤر ، حيث يتم اكتشاف جميع الفلوروفورات في وقت واحد ، مما ينتج عنه صورة تجمع بين جميع أنماط الحيود وتمنع التمييز بين الفلوروفورات الفردية القريبة ، مما يؤدي إلى فقدان الدقة. ومع ذلك ، تتطلب طرق الدقة الفائقة هذه مصادر ضوء محددة للغاية ، ومعدات ، وإعداد عينات ، و / أو فلوروفورات ، مما يجعل هذه التقنيات مكلفة ويصعب الوصول إليها في معظم المختبرات ، ويصعب تنفيذها في التجارب الروتينية. أدت هذه القيود إلى قيام المجتمع العلمي بالبحث عن حلول بديلة لتحقيق دقة أعلى ، والتي ستكون متوافقة مع معدات الفحص المجهري المتاحة بسهولة وبروتوكولات التلوين الروتينية. في عام 2015 ، تم تطوير طريقة للتحايل على قيود الفحص المجهري البصري عن طريق توسيع العينة جسديا من قبل Boyden وزملاؤه ، تسمى الفحص المجهري التوسعي (ExM) 4.

ExM هي طريقة من ثلاث خطوات توفر تفاصيل نانوية للعينات البيولوجية دون تجاوز حد حيود الضوء (الشكل 1). بدلا من ذلك ، يستخدم المجاهر التقليدية المحدودة الحيود لتصوير العينات التي تم تكبيرها فيزيائيا بطريقة متناحية. تتكون الخطوة الأولى ، التي تسمى الهلام ، من تضمين العينة البيولوجية ، عادة ما تكون خلايا أو أنسجة ثابتة ، في هيدروجيل متعدد الإلكتروليت قابل للانتفاخ يعتمد على أكريلات الصوديوم والأكريلاميد. ثم تخضع العينة البيولوجية للمعالجة الأنزيمية لتحلل مكونات معينة جزئيا مثل البروتينات أو الأغشية ، وتحطيم الهياكل الخلوية الكثيفة لضمان توسع الخلايا بشكل موحد. تساعد هذه الخطوة ، التي تسمى الهضم ، على تحقيق ذلك عن طريق تجانس المكونات الهيكلية للعينة فيما يتعلق بالخواص الميكانيكية ، مما يمنع التمدد التفاضلي الذي قد يؤدي إلى تشويه العينة. أخيرا ، في الخطوة الأخيرة ، التي تسمى التمدد ، يتم وضع العينة المضمنة في الهيدروجيل والمهضومة في الماء منزوع الأيونات ، مما يؤدي إلى انتفاخها. تؤدي هذه التقنية إلى توسيع العينة بعامل تكبير خطي يبلغ حوالي 4-5 أضعاف في كل بعد ، مما يسمح بتصور التفاصيل الخلوية الدقيقة باستخدام تقنيات الفحص المجهري القياسية. نظرا للطبيعة التماثلية للتوسع ، تحتفظ العينة البيولوجية المتضخمة داخل مصفوفة الهلام بتفاصيلها الهندسية ثلاثية الأبعاد والعلاقات المكانية بين مكوناتها الهيكلية المختلفة. لذلك ، يتم الحفاظ على المعلومات المكانية عند التورم ، بينما تزداد المسافة بين ملصقات الفلورسنت أو الجزيئات الحيوية المثبتة على الهلام بشكل موحد في جميع الاتجاهات. هذا يسمح بفصل أفضل للإشارات ، مما يؤدي إلى دقة محسنة.

figure-introduction-1
الشكل 1: نظرة عامة على بروتوكول ExM. (أ) الهلام: يتم تثبيت العينة البيولوجية وتضمينها داخل هيدروجيل متعدد الإلكتروليت القابل للانتفاخ. (ب) الهضم: يتم تجانس الخواص الميكانيكية للعينة من خلال استخدام الإنزيمات والمنظفات ، وتكسير البروتينات والأغشية الدهنية التي من شأنها أن تحد من التمدد وتخلق تشوهات. (ج) التمدد: يغمر الهيدروجيل في الماء منزوع الأيونات، مما يؤدي إلى تمدده بشكل متناحي. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

منذ عام 2015 ، شهدت ExM تحسينات تكنولوجية كبيرة في الحفاظ على المعلومات المكانية. على وجه الخصوص ، تم تصميم العديد من المراسي الجزيئية لربط الجزيئات الحيوية تساهميا مباشرة بالهيدروجيل5،6 القابل للانتفاخ. في هذا البروتوكول ، استخدمنا N-acryloxysuccinimide (NAS) ، الذي يتفاعل مع مجموعات الأمين الحرة من الجزيئات الحيوية (عادة ، بقايا اللايسين أو المواضع الطرفية للبروتينات) لاقتران مجموعة أكريلويل مع بروتينات الخلية ، بما في ذلك البروتينات السكرية. ثم تتفاعل مجموعة الأكريلويل هذه مع المونومرات الأخرى من خلال تفاعلات الربط المتقاطع أثناء الهلام ، مما يؤدي إلى تثبيت هذه الجزيئات الحيوية مباشرة على البوليمر.

يتوافق ExM مع مجموعة واسعة من طرق وضع العلامات ، بما في ذلك هندسة السكريات قليلة السكاريد الأيضية (MOE). MOE هي أداة قوية تمكن من وضع العلامات على الجليكان من خلال دمج نظائر السلائف الأيضية المجهزة بمقبض كيميائي متعامد حيوي7. تندمج هذه النظائر ، المعروفة باسم المراسلين الكيميائيين ، في مسارات التمثيل الغذائي دون التسبب في السمية. في نهج وزارة التربية والتعليم ، تتم معالجة السكريات الأحادية المراسلة الأيضية إلى سكريات النوكليوتيدات المنشطة ثم يتم نقلها إلى الجليكوتيدات الناشئة. ينصب تركيزنا الأساسي على دراسة السياليل ، لا سيما الديناميكيات داخل الخلايا والاتجار بالبروتينات السكرية N السياليلاتية ، وهو أمر بالغ الأهمية في سياق الصحة والمرض نظرا لأدواره في تفاعلات الخلية والخلية ، وتنظيم المناعة ، والتنمية. يتورط السياليلات غير الطبيعية في أمراض مثل السرطان8،9،10،11 ، والأمراض المعدية12 ، والاضطرابات الوراثية13،14،15 ، مما يجعلها هدفا رئيسيا للتطوير العلاجي واكتشاف المؤشرات الحيوية. يعزز فهم السياليل رؤى حول علم السكر وآليات المرض.

يمكن فحص السياليل باستخدام وزارة التربية والتعليم مع نظائر حمض N-acetylneuraminic (Neu5Ac) ، حمض السياليك الأكثر وفرة في البشر ، أو مع نظائرها من N-acetylmannosamine (ManNAc) ، وهو مقدمة أيضية ل Neu5Ac ، يحمل مقبضا متعامداحيويا 8،16. يتم تحويل ManNAc إلى Neu5Ac في العصارة الخلوية ، ثم يتم تنشيطه إلى حمض سيتيدين -5 مونوفوسفو-N-neuraminic (CMP-Neu5Ac) في النواة. بمجرد تنشيطه في سكر النيوكليوتيدات ، يقوم سياليل ترانسفيراز في جهاز جولجي بنقل وحدات Neu5Ac إلى المواضع النهائية لسلاسل الجليكان المتنامية (الشكل 2). بعد الدمج الأيضي لمشتقات ManNAc غير الطبيعية ، يمكن ربط الجليكان السياليلايته الموسومة تساهميا بالفلوروفور الذي يحمل مجموعة تفاعلية مكملة لمقبض المراسل من خلال كيمياء النقر المتعامد الحيوي. هذا يسمح بالملاحظة المباشرة للجليكوقارنات في الجسم الحي أو خارج الجسم الحي.

بالنسبة لمعظم مراسلي السكريات الأحادية ، يلزم وجود شكل بيرسيتيلاتي لعبور غشاء البلازما عن طريق الانتشار السلبي. ومع ذلك ، فقد ثبت أن كلا من المراسلين المعتمدين وغير المحميين يحققون بكفاءة في السياليلات16. يمكن لمراسلي sialylation غير المحميين دخول الخلايا عن طريق آليات النقل النشطة ، وهي كثرة الخلايا لنظائر Neu5Ac ، وناقل غير معروف حتى الآن ل ManNAc. في حين أن السكريات غير المحمية تتطلب تركيزا أعلى (عادة 100-500 ميكرومتر) لتحقيق تأثيرات مماثلة ، بمجرد دخولها الخلية ، يمكنها الدخول مباشرة إلى مسار التمثيل الغذائي لحمض السياليك. في المقابل ، يجب إزالة السكريات البيرسيتيلاتية بالكامل عن طريق الاستيرازات غير المحددة داخل الخلايا قبل أن تصبح نشطة الأيضية. على الرغم من أنه يمكن استخدامها بتركيزات أقل (عادة 10-50 ميكرومتر) ، إلا أن نزع الأسيتيل غير المكتمل قد يتداخل مع نشاط الإنزيم أو يؤدي إلى دمج نظائر حمض السياليك الأسيتيل جزئيا ، مما قد يؤدي إلى تحريف التحليل النهائي. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤثر إطلاق حمض الأسيتيك على درجة الحموضة محليا ، مما قد يؤثر على الوظيفة الخلوية. أظهر تشين وزملاؤه أيضا أن السكريات لكل أسيتيل تتفاعل مع بقايا السيستين الحرة في البروتينات عبر آلية غير إنزيمية ، مما يؤدي إلى الدمج خارج الهدف وزيادة الإشارة غير المحددة17،18. في هذا البروتوكول ، نوظف مراسلي ManNAc غير محميين.

figure-introduction-2
الشكل 2: هندسة السكريات قليلة السكاريد الأيضية ووضع العلامات على أحماض السياليك. يتم تحويل UDP-GlcNAc إلى ManNAc بواسطة مجال UDP-GlcNAc 2-epimerase ل GNE / MNK في العصارة الخلوية. ثم يتم فسفرة ManNAc في العصارة الخلوية بواسطة مجال ManNAc 6-kinase من GNE / MNK لتشكيل ManNAc-6-phosphate. يحفز سينسيز N-acetylneuraminate تكثيف ManNAc-6-P مع phosphoenolpyruvate لإنتاج Neu5Ac-9-phosphate ، والذي يتم إزالته لاحقا بواسطة فوسفاتيز حمض السياليك لإنتاج Neu5Ac. يمكن أيضا توفير Neu5Ac عن طريق مسار الإنقاذ عن طريق الالتقام الخلوي وإعادة التدوير الليزوزومي8. بعد النقل إلى النواة ، يتم تحويله إلى CMP-Neu5Ac بواسطة CMP-sialic acid synthetase. في جهاز Golgi ، CMP-NeuAc هو ركيزة sialyltransferases التي تقدم جزءا من Neu5Ac في المواضع الطرفية للجليكان على الجليكو المقترتر الناضج ، والتي يتم التعبير عنها في النهاية في غشاء الخلية أو إفرازها. يمكن للمراسلين الكيميائيين ManNAz الذين يحملون مقبضا متعامدا حيويا اختراق الخلية من خلال ناقل نشط غير معروف والدخول إلى مسار التمثيل الغذائي. يتم بعد ذلك تصنيف وحدات Neu5Az الموسومة المدمجة في الجليكان بعد التخليق الحيوي من خلال الاقتران بوساطة CuAAC لمسبار الفلورسنت. الاختصارات: NAc = N-acetyl; UDP-GlcNAc = يوريدين ثنائي فوسفات N-acetylglucosamine ؛ ManNAc = N-acetylmannosamine ؛ GNE = UDP-GlcNAc 2-epimerase; MNK = ManNAc 6-kinase; ManNAc-6-P = ManNAc-6-phosphate ؛ NANS = N-acetylneuraminate synthase; PEP = فوسفوينول بيروفات. Neu5Ac = حمض N-acetylneuraminic ؛ Neu5Ac-9-P = Neu5Ac-9-phosphate ؛ NANP = فوسفاتيز حمض السياليك. CMP = سيتيدين -5 أحادي الفوسفات. CMAS = CMP-sialic حمض سينثيتاز; STs = sialyltransferases; ManNAz = N-azidoacetylmannosamine; Neu5Az = حمض N-azidoacetylneuraminic. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

من بين التفاعلات الحيوية المتعامدة المحتملة ، ركزنا اهتمامنا على الإضافة الحلقية Azide-Alkyne المحفزة بالنحاس (CuAAC) 16،19. وفقا لتجربتنا ، فإن CuAAC هو الخيار الأفضل لوضع العلامات على الجليكان داخل الخلايا في الخلايا الثابتة. هذا التفاعل راسخ ، وتمت دراسته بدقة في الكيمياء المتعامدة الحيوية ، وقد تم توحيده للاستخدام في البيئات البيولوجية المعقدة ، مما يوفر أساسا متينا للمعرفة والبروتوكولات المحسنة. توفر حركيتها السريعة بالفعل كفاءة عالية للتفاعل وخصوصية ، وتتضمن مجموعات الأزيد والألكينات التي يسهل تصنيعها ، ومستقرة ، وغائبة عن الأنظمة الحية ، وخاملة تجاه الجزيئات الحيوية الأصلية ، مما يجعلها مثالية لتطبيقات الخلايا الثابتة حيث لا تكون سمية النحاس مشكلة. إضافة الألكين الأزيد الحلقية (SPAAC) التي يتم عزيزها السلالة 20،21 ، مع تجنب سمية النحاس ، لديها حركية أبطأ ومجسات أكبر ، مما يميل إلى أن يؤدي إلى إشارة خلفية أعلى وانخفاض نسبة الإشارة إلى الضوضاء للتطبيقات داخل الخلايا بسبب الاصطياد الكارهة للماء ، في حين أن الطلب العكسي على الإلكترون Diels-Alder (IEDDA) 22،23، على الرغم من سرعتها وخاليها من النحاس ، إلا أنها تنطوي على توليف مسبار أكثر تعقيدا وتتطلب مجموعات مراسلين أكبر حجما لم يتم توصيفها بالكامل بعد في تطبيقات وزارة التربية والتعليم. نظرا لأن ExM يتطلب حصريا خلايا ثابتة ، فإن CuAAC يقدم حلا قويا وفعالا لوضع العلامات المتعامدة الحيوية.

تقدم هذه الورقة بروتوكولا لتصور البروتينات السكرية داخل الخلايا في الخلايا ، والجمع بين الملصقات الأيضية ، وكيمياء النقر المتعامد الحيوي ، والفحص المجهري للتمدد. في الإجراءات التجريبية الموضحة في هذه الورقة ، نستخدم N-azidoacetylmannosamine (ManNAz) كمراسل كيميائي ، ويتم إجراء ربط CuAAC للفلوروفورات العضوية الصغيرة قبل إجراء التمدد. يتم تثبيت البروتينات السكرية على الهيدروجيل مع NAS قبل الهلام والهضم والتمدد. يمكن أن يرتبط وضع العلامات على وزارة التربية وأحماض السياليك بأساليب التألق المناعي لتقييم التوطين المشترك ، كما يتضح هنا من خلال الجسم المضاد الأولي للفأر المضاد ل GM130 الموضعي في جهاز رابطة الدول المستقلة. يمكن تطبيق هذا البروتوكول على الخلايا في حالتها الفسيولوجية ، أو على الخلايا التي تعرضت للمعالجة الكيميائية. لتوضيح ذلك ، تم استخدام الكلوروكين لتثبيط وظيفة الليزوزومات ، مما يؤثر على معالجة والاتجار بالبروتينات السكرية داخل الخلايا. يستخدم التلوين النووي كمعلم ، ليس فقط لتوطين الخلايا ولكن أيضا كمؤشر على جودة عملية ExM. يمكن بالفعل قياس عامل التمدد من خلال مقارنة حجم النواة قبل التمدد (preExM) وما بعد التمدد (postExM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. بذر الخلايا

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة تحت غطاء التدفق الرقائقي. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي من خطوط الخلايا المستخدمة في العمل الحالي (HeLa ، MCF7 ، الخلايا الليفية الأولية) ، أو على معظم نماذج خط الخلايا الملتصقة التي يشيع استخدامها في البحث20،24،25.

  1. تنمو الخلايا في وسط الجلوكوز العالي DMEM المكمل بمصل بقري الجنين بنسبة 10٪ (FBS) في قارورة T75 عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ CO2 .
  2. بمجرد أن تصل الخلايا إلى التقاء كامل ، قم بإزالة وسط زراعة الخلايا واغسل الخلايا ب 4 مل من PBS.
    ملاحظة: يجب أن تكون محاليل PBS المستخدمة في هذه الخطوة وجميع خطوات الغسيل اللاحقة معقمة عن طريق الترشيح من خلال غشاء PTFE 0.2 ميكرومتر قبل الاستخدام.
  3. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 2 مل من محلول 1x trypsin-EDTA يحتوي على 0.5 جم / لتر من التربسين ، لتحريرها من قاع القارورة.
  4. أضف 8 مل من وسط الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS ، واخلطه جيدا للتأكد من فصل كل خلية عن قاع القارورة.
  5. انقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 5 دقائق عند 200 × جم. في غضون ذلك ، أضف غطاء واحد (قطر 12 مم ، سمك 130-160 ميكرومتر) إلى كل بئر من صفيحة 12 بئرا.
    ملاحظة: يجب ضبط سمك الغطاء ليتناسب مع متطلبات المجهر المستخدم في خطوات التصوير اللاحقة.
  6. قم بإزالة المادة الطافية بعد الطرد المركزي وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من وسط زراعة الخلايا.
  7. حدد متوسط عدد الخلايا / مل عن طريق قياس الدم عبر قياسين على الأقل.
  8. قم بتخفيف معلق الخلية إلى تركيز 300,000 خلية لكل مل في وسط زراعة الخلايا ، وزرع 1 مل من المعلق في كل بئر.
  9. اسمح للخلايا بالاستقرار لمدة 24 ساعة في وسط الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS عند 37 درجة مئوية تحت غلاف جوي 5٪ CO2 قبل الخطوات التالية.

2. علاج الكلوروكين (اختياري)

ملاحظة: توضح الخطوات 2.1-2.8 كيفية استخدام البروتوكول على الخلايا التي تعالج بكاشف خارجي (مثبط ، مستجيب ، دواء) ، باستخدام الكلوروكين كمثال. تخطي هذه الخطوات للخلايا غير المعالجة بكواشف خارجية.

  1. قم بوزن الكمية الصحيحة من ملح ثنائي فوسفات الكلوروكين (CQ) لتحضير حجم كاف من محلول مخزون 10 ملم.
    ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة تحت غطاء التدفق الرقائقي.
  2. قم بإذابة CQ الصلب في الكمية المطلوبة من الماء منزوع الأيونات للحصول على تركيز نهائي يبلغ 10 مليمتر.
  3. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر.
  4. Aliquot 1 مل من محلول المخزون 10 ملي في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة سعة 1.5 مل وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
  5. اغسل عينة الخلية المحضرة في الخطوة 1.9 ب 1 مل من PBS.
  6. أضف 100 ميكرولتر من 10 ملي مولار CQ في 9.9 مل من وسط الغلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS ، للحصول على تركيز نهائي يبلغ 100 ميكرومتر من CQ.
  7. احتضان الخلايا لمدة 8 ساعات في 1 مل من وسط مكمل ب 100 ميكرومتر من CQ عند 37 درجة مئوية تحت غلاف جوي 5٪ CO2 .
  8. اغسل الخلايا 3x مع 1 مل من PBS.

3. هندسة السكريات قليلة السكاريد الأيضية

  1. قم بإعداد محلول مخزون 5 ملي من ManNAz (أو ManNAc لحالة التحكم السلبية) في وسط الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS.
    ملاحظة: يجب أن يكون محلول المخزون هذا بحجم كاف بحيث يمكن معالجة كل بئر ب 1 مل من محلول السكر التناظري. قم بتنفيذ الخطوات التالية في ظل ظروف معقمة تحت غطاء التدفق الصفيحي.
  2. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر وقم بتخزينه في 1 مل من الحصص عند -20 درجة مئوية لحين الحاجة.
  3. قم بإعداد وسط مكمل ب 500 ميكرومتر من ManNAz أو ManNAc عن طريق تخفيف محلول مخزون سعة 1 مل محضر في الخطوة 3.2 مع 9 مل من وسط الجلوكوز العالي DMEM الذي يحتوي على 10٪ FBS.
  4. احتضان الخلايا المحضرة في الخطوة 1.9 (للتجارب على الخلايا غير المعالجة) أو في الخطوة 2.8 (للتجارب على الخلايا المعالجة ب CQ) في 1 مل من الوسط المكمل ب 500 ميكرومتر ManNAz (أو 500 ميكرومتر ManNAc للمجموعة الضابطة) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية تحت جو 5٪ CO2 .

4. التثبيت والنفاذية

ملاحظة: يتم تنفيذ كل هذه الخطوات تحت غطاء الدخان.

  1. اغسل العينات ب 1 مل من PBS.
  2. قم بإصلاح الخلايا الموجودة في كل غطاء عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من 5٪ بارافورمالدهايد. اتركه يرتاح لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. اغسل 3x مع 1 مل من PBS.
  4. قم بإعداد غرفة رطبة مخصصة باستخدام صندوق معتم كبير بما فيه الكفاية (على سبيل المثال ، صندوق البوليسترين) بغطاء. ضع قطعة مبللة من ورق النشاف في الجزء السفلي من الصندوق ، ثم ضع طبقة من البارافيلم فوقها.
    ملاحظة: يجب أن تحمي الغرفة الرطبة العينة تماما من مصادر الضوء الخارجية عند إغلاقها.
  5. ضع الغطاء على البارافيلم ، والخلايا متجهة لأعلى.
    ملاحظة: قم بتسمية البارافيلم باسم العينات أو مرجعها مسبقا.
  6. قم بإجراء نفاذية الخلية باستخدام 200 ميكرولتر من 0.5٪ (حجم / حجم) Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  7. اغسل 3x مع 200 ميكرولتر من PBS.

5. وضع العلامات على التألق

  1. وضع العلامات على CuAAC للجليكانات ذات العلامات السياليلية
    ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت لتفاعل CuAAC حديثا قبل الاستخدام ، ويجب إضافة المواد المتفاعلة بالترتيب المحدد ، مع إضافة أسكوربات الصوديوم أخيرا. في المحاليل المائية المؤكسجة ، ستتأكسد أيونات النحاس (I) التي تتكون من اختزال النحاس (II) مع الأسكوربات تدريجيا إلى Cu (II) ، مما يؤدي إلى انخفاض تركيز الأسكوربات بمرور الوقت. للحفاظ على قابلية تكرار النتائج ، يجب عدم تخزين المخزن المؤقت لأكثر من بضعة أيام عند 4 درجات مئوية ويفضل استخدامه في نفس اليوم.
    1. لتسمية الجليكان السياليلات المعدلة بالأزيد المصممة في القسم 3 ، قم بإعداد محلول تفاعل CuAAC يتكون من 5 ميكرومتر AlexaFluor 488 ألكين (AF488Alk) ، 150 ميكرومتر CuSO4 ، 300 ميكرومتر 2- (4- ((bis ((1- (tert-butyl) -1H-1،2،3-triazol-4-yl) methyl) amino) methyl) -1H-1،2،3-triazol-1-yl) حمض الأسيتيك (BTTAA) ، 0.1 M K2HPO4 ، و 2.5 ملي مولار أسكوربات الصوديوم في الماء منزوع الأيونات. قم بإعداد محلول كاف لتطبيق 200 ميكرولتر على كل غطاء.
    2. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت CuAAC على كل غطاء لبدء التفاعل. تأكد من تغطية العينة بشكل متجانس بالقطرة ، واتركها تتفاعل لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
    3. اغسل 3x مع 200 ميكرولتر من PBS لإيقاف التفاعل وإزالة المسبار والكواشف الزائدة.
  2. تلطيخ النواة
    1. بالنسبة للوضع النووي باستخدام Hoechst 33342 ، قم بتخفيف محلول مخزون 10 مجم / مل عند 1: 2000 في PBS.
      ملاحظة: يمكن استخدام البقع النووية المكافئة مثل 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) لنفس التأثير.
    2. قم بتغطية الخلايا ب 200 ميكرولتر من هذا المحلول واحتضانها لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
    3. اغسل 3x مع 200 ميكرولتر من PBS.
  3. تلطيخ التألق المناعي
    1. قم بإعداد مخزن مؤقت لحجب ألبومين مصل الأبقار (BSA) يحتوي على 0.1 جم من الجيلاتين ، و 1 جم من BSA ، و 1 مل من FBS ، و 49 مل من PBS ل 50 مل من المخزن المؤقت.
    2. احتضان العينات لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع BSA. حماية العينة من الضوء.
    3. لتلوين التألق المناعي لجهاز جولجي باستخدام جسم مضاد للفأر المنقى المضاد ل GM130 (التعرف على الحاتمة: Rat GM130 aa. 869-982 | RRID: AB_398142) ، قم بتخفيف الجسم المضاد الأساسي عند 1: 100 في المخزن المؤقت المحضر لحجب BSA.
      ملاحظة: يمكن تكييف هذه الخطوة مع تلطيخ التألق المناعي الذي يستهدف العضيات الأخرى باستخدام أي جسم مضاد أولي ذي صلة ، وفي هذه الحالة يجب تكييف عامل التخفيف وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    4. أضف 70 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على الجسم المضاد إلى الغطاء واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ، محميا من الضوء.
    5. اغسل 3x مع 200 ميكرولتر من PBS.
    6. قم بتخفيف الجسم المضاد الثانوي الفلوري (Alexa Fluor 546 المضاد للفأر IgG) عند 1: 600 في المخزن المؤقت لحجب BSA وأضف 100 ميكرولتر على كل قسيمة.
    7. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
    8. اغسل 3x مع 200 ميكرولتر من PBS.
    9. انقل الغطاء إلى طبق 6 آبار. قم بتخزين العينات في 2 مل من PBS عند 4 درجات مئوية لبضعة أيام ، محمية من الضوء.
      ملاحظة: ينصح دائما بإعداد نسخة مكررة حصريا للتصوير المسبق كمرجع لأغراض المقارنة قبل التوسيع وبعده ولضمان عدم تشويه نمط الملصقات بعد التوسيع.

6. التصوير قبل التوسع للعينات

ملاحظة: تعتمد الخطوات التالية على معدات التصوير الحيوي المستخدمة وقد تحتاج إلى تعديلها وفقا لمتطلبات الجهاز. يرجى اتباع قواعد المختبر المحلي أو منصة التصوير الحيوي. يتم تنفيذ الخطوات 6.1-6.13 هنا على مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر.

  1. قم بتشغيل المجهر وتأكد من تسخين مصادر الضوء (الليزر). افتح برنامج الحصول على التصوير الحيوي.
  2. حدد الأطوال الموجية لإثارة الليزر المقابلة للفلوروفورات لإنشاء القنوات (على سبيل المثال ، 405 نانومتر للتلوين النووي ، و 488 نانومتر للجليكانات السياليلية المسماة AF488Alk ، و 546 نانومتر لوضع العلامات على التألق المناعي). قم بتنشيط الليزر وفقا لذلك.
  3. ضع وقم بتأمين غطاء بقطر 32 مم (سمك 130-170 ميكرومتر) في حامل يتكيف مع المجهر.
  4. ضع العينة المحضرة في الخطوة 5.3.9 ، مع توجيه الخلايا لأسفل ، على غطاء 32 مم. أضف قطرة من الماء منزوع الأيونات لمنع العينة من الجفاف.
  5. حدد عدسة موضوعية مناسبة ، هنا هدف غمر بالزيت 63x بفتحة عددية 1.4 أو ما يعادلها.
    ملاحظة: توفر أعلى فتحة عددية أفضل دقة. عند استخدام هدف الغمر بالزيت ، تذكر إضافة قطرة من الزيت بين الهدف والغطاء.
  6. ضع الحامل على مرحلة المجهر فوق الهدف.
  7. استخدم وضع التألق الساطع أو منخفض كثافة الليزر لتحديد منطقة الاهتمام في العينة.
  8. اضبط التركيز.
  9. تصور الخلايا في البرنامج في وضع التألق الحي . اضبط شدة الليزر لكل قناة. ابدأ بطاقة ليزر منخفضة لتجنب التبييض الضوئي. قم بزيادة طاقة الليزر ببطء واضبط كسب الكاشف وإزاحة لتضخيم الإشارة دون إحداث ضوضاء مفرطة حسب الحاجة لتصور التألق بوضوح دون التعرض المفرط.
    ملاحظة: يجب ضبط المعلمات لتقليل ضوضاء الخلفية وتجنب تشبع الإشارة. من الأهمية بمكان الحفاظ على إعدادات متسقة عبر جميع العينات في سلسلة من التجارب ، بما في ذلك الضوابط السلبية.
  10. قم بتعيين معلمات الصورة مثل حجم الثقب (على سبيل المثال ، 1 وحدة جيدة التهوية) ، وسرعة المسح (على سبيل المثال ، 8) ، وعامل التكبير (على سبيل المثال ، 1) ، ونطاق قيم السطوع (على سبيل المثال ، 16 بت) ، ومتوسط الرقم (على سبيل المثال ، 2) ، والوضع (على سبيل المثال ، الخط) ، والطريقة (على سبيل المثال ، المتوسط) حسب الحاجة للوصول إلى الملاحظة المطلوبة.
    ملاحظة: تعتمد هذه القيم على النظام والعينة ويجب تحسينها قبل الاستحواذ. يعتمد حجم الثقب على الفتحة العددية والتكبير والطول الموجي: قد يؤدي تقليلها إلى تحسين الدقة على حساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء. ينصح بضبط سرعة المسح الضوئي على قيم سريعة (تتوافق مع وقت المكون الصغير لكل بكسل) لتجنب التبييض الضوئي.
  11. قم بإجراء عملية الاستحواذ وحفظ البيانات بالتنسيق المطلوب مع البيانات الوصفية المناسبة للرجوع إليها في المستقبل.
  12. بمجرد انتهاء عملية الاستحواذ ، ضع العينة مرة أخرى في اللوحة المكونة من 6 آبار عن طريق إضافة كمية صغيرة من الماء منزوع الأيونات لتسهيل النقل باستخدام زوج من الملقط.
    ملاحظة: لا يتم تنفيذ الخطوة 6.12 إلا إذا كانت هناك حاجة إلى توسيع هذه العينة المعينة. وإلا، تخلص من العينة واستخدم النسخ المتماثلة الأخرى للخطوات التالية.

7. بروتوكول الفحص المجهري التوسعي

ملاحظة: العينات محمية قدر الإمكان من الضوء لتجنب التبييض الضوئي. يتم تنفيذ خطوات التثبيت والهلام تحت غطاء الدخان.

  1. ترسيخ
    1. احتضان العينات باستخدام N-acryloylsuccinimide (NAS) بتركيز 3.2 مجم / مل في PBS على شاكر ميكانيكي لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. قم بإعداد كمية كافية من المحلول لإضافة 500 ميكرولتر من المحلول لكل بئر (محلول المخزون: 16 مجم / مل NAS في DMSO).
      ملاحظة: يتفاعل NAS مع بقايا اللايسين و N-termmini للبروتينات لتطعيم مجموعة أكريلويل ، مما يمكن البروتينات من التثبيت على الهيدروجيل في الخطوات اللاحقة.
    2. اغسل 3x مع 1 مل من PBS.
  2. الهلام
    1. قم بإعداد محلول مونومر يتكون على النحو التالي: في 50 مل من 1x PBS (الرقم الهيدروجيني 7.4) ، أضف 5.843 جم من كلوريد الصوديوم ، و 1.25 جم من الأكريلاميد ، و 0.075 جم من ثنائي الأكريلاميد ، و 4.313 جم من أكريلات الصوديوم. قم بإعداد محلول كاف لتطبيق 70 ميكرولتر على كل غطاء. قم بتجميد 1 مل من الحصص قبل 24 ساعة على الأقل من الهلام.
      تنبيه: المونومرات سامة. يجب التعامل معها بحذر باستخدام معدات الحماية المناسبة ووزنها تحت غطاء الدخان.
    2. على قطعة من البارافيلم ، يتم وضع قطرة 70 ميكرولتر من محلول المونومر ، متبوعة بإضافة 1.4 ميكرولتر من 10٪ (حجم / حجم) N ، N ، N ′ ، N ′ - رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TMEDA) ، ثم 1.4 ميكرولتر من 10٪ (وزن / حجم) بيرسلفات الأمونيوم (APS) ، والتي يتم خلطها في القطرة.
      ملاحظة: يجب إضافة كواشف الربط المتقاطع بهذا الترتيب المحدد ، TMEDA أولا ، ثم APS.
    3. بسرعة ، ضع الغطاء بعناية على المحلول بحيث تكون الخلايا متجهة لأسفل.
    4. اسمح للمحلول بالبلمرة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة رطبة.
  3. هضم
    1. قم بإعداد محلول عازل للهضم يتكون من 1x TAE buffer و 0.5٪ (حجم / حجم) Triton X-100 و 0.8 M guanidine HCl و 8 U / mL protein K.
      ملاحظة: يجب تحضير المخزن المؤقت للهضم حديثا واحتضانه مسبقا لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
    2. أضف 1 مل من المخزن المؤقت للهضم إلى الهيدروجيل المتكون في الخطوة 7.2. اسمح للهضم بالاستمرار لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية على شاكر ميكانيكي.
    3. قم بإزالة عازلة الهضم ، واغسل الجل برفق 3 مرات ب 2 مل من الماء منزوع الأيونات.
      ملاحظة: سوف يتمدد الهيدروجيل قليلا ويفصل نفسه عن زلة الغطاء.
  4. توسع
    1. اترك الهيدروجيل ليتوسع في 3 مل من الماء منزوع الأيونات لمدة ساعتين. قم بتغيير الماء كل 30 دقيقة.

8. تصوير ما بعد التوسع للعينات

  1. ضع غطاء بقطر 32 مم (سمك 130-170 ميكرومتر) وثبته على حامل.
  2. اقطع قطعة من الهيدروجيل وضعها على زلة الغطاء ، مع وجود الخلايا في الجزء السفلي من الجل.
    ملاحظة: يجب أن تكون القطع المقطوعة كبيرة بما يكفي لتوفير مساحة سطح كافية للمراقبة ولكن ليست كبيرة جدا ، لأن هذا قد يجعل التعامل مع الجل صعبا ويزيد من خطر الكسر (الحجم الموصى به: 5 إلى 8 مم). ضع ما يكفي من قطع الهيدروجيل لتغطية سطح الغطاء بالكامل ؛ سيساعد ذلك في تثبيت القطع في مكانها ومنع أي انجراف أثناء التصوير. في حالة وجود مشكلات في الانجراف ، قد يكون طلاء الأغطية مسبقا ب poly-D-lysine مفيدا6.
  3. ضع الحامل على مرحلة المجهر فوق الهدف.
  4. قم بإجراء الحصول على الصورة على مجهر متحد البؤر للمسح الضوئي بالليزر بهدف غمر الزيت كما هو موضح في الخطوة 6.

9. حساب عامل التمدد (EF) في ImageJ

  1. افتح بيانات التصوير في برنامج ImageJ المجاني أو ما يعادله.
  2. إذا كنت تعمل على صورة قنوات متعددة، فقم بتقسيم القنوات والعمل فقط على قناة النواة من خلال الانتقال إلى تحديد صورة | اللون | تقسيم القنوات.
  3. لقياس قطر النواة ، قم بتمييز الإشارة المقابلة للنواة عن طريق تحديد عتبة بالنقر فوق تحديد صورة | ضبط | عتبة .... اختر طريقة في القائمة المنسدلة الافتراضية تناسب الصورة على أفضل وجه (على سبيل المثال ، Otsu) ، واضبط العتبة حتى يتم قطع شكل النواة بوضوح من الخلفية.
    ملاحظة: يجب ضبط إعداد الحد لكل صورة حيث قد لا يناسب إعداد واحد جميع الصور أو كل عينة.
  4. اضبط القياس لتحديد قطر النمس بالنقر فوق تحديد تحليل | تعيين القياسات .... من القائمة ، حدد قطر Feret واضبط العلامة العشرية إذا لزم الأمر.
  5. لبدء تحليل الصورة ، انقر فوق تحديد تحليل | تحليل الجسيمات لضبط حجم الجسيمات. بالنسبة للنواة ، اختر 5 ميكرومتر² اللانهائي | عرض النتائج | إضافة إلى المدير | استبعاد على الحواف والتراكب. ابدأ التحليل.
  6. مع بدء التحليل ، ستظهر نوافذ متعددة. في نتائج النافذة ، ابحث عن الحد الأقصى لقطر النمس لكل نواة في العمود Feret. نسخ البيانات الأولية ولصقها في جدول بيانات وحساب متوسط حجم النواة للعينات الموسعة والموسعة.
    ملاحظة: تأكد من أن مناطق الاهتمام (ROIs) المقابلة لكل نواة تتبع محيط النواة بالكامل.
  7. احسب معامل التمدد (EF) على النحو التالي:
    EF = figure-protocol-1
    ملاحظة: يحدد عامل EF مقدار توسيع العينة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الموضح أدناه هو تطبيق البروتوكول لتصور البروتينات السكرية السياليلية في خلايا HeLa (الشكل 3 أ) وخلايا MCF7 (الشكل 3 ب) ، مع حذف علاج CQ (قسم البروتوكول 2) وتلوين التوطين المشترك للتألق المناعي (خطوة البروتوكول 5.3).

figure-results-1
الشكل 3: مقارنة بين نمط وضع العلامات على sialylation قب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لا يتضمن بروتوكول وضع العلامات CuAAC الحالي أمينوجوانيدين في المخزن المؤقت للتفاعل. نظرا لأنه يهدف إلى تصور الاقتران الجليكي داخل الخلايا ، يتم إجراؤه على الخلايا التي يتم إصلاحها بعد خطوة دمج التمثيل الغذائي ، لتجنب أي مشكلة في السمية الخلوية وتحسين امتصاص الجهاز التحفيزي. يوصى عادة باستخدام aminoguanidine لوضع العلامات على سطح الخلية للخلايا الحية لمنع التفاعلات الجانبية بين dehydroascorbate و arginine و histidine و lysine بقاياالبروتينات 28. يمكن أن تؤثر هذه التعديلات بالفعل على وظيفة البروتين ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وليس لدى أصحاب البلاغ مصالح مالية متنافسة أو أي تضارب في المصالح أخرى.

شكر وتقدير

نشكر مرافق TisBio ومنصة PLBS على توفير البيئة التقنية المواتية لتحقيق هذا العمل. ودعم هذا العمل بمنح من المجلس الوطني للبحوث ووزارة البحوث العليا والبحث. نود أن نشكر الدكتور فرانسوا فولكييه ، والدكتورة زوي دورين ، والسيدة دوروثي فيكوني ، والسيدة سيلين شولتز على تحفيز المناقشات وتزويدنا بخط خلايا الخلايا الليفية 533T والجسم المضاد الأساسي GM130.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
(+) الصوديوم L-ascorbateSigma Aldrich11140
12 لوحة ثقافة خلية جيدةCorning3513
AcrylamideSigma AldrichA8887
حمض الأكريليك N-hydroxysuccinimide ester   ؛سيجما ألدريتشA8060
أليكسا فلور 488 ألكين   ؛جينا بيوساينسCLK-1277-5
Alexa Fluor 546 الماعز المضاد للفأر IgGInvitrogenA11003
بيرسولفات الأمونيومسيجما ألدريتش9913
Bis-AcrylamideSigma Aldrich146072
BSASigma AldrichA7906
BTTAAJena BioscienceCLK-067-100
أنبوب الطرد المركزي 2 ململح ثنائي
سيجما ألدريتشC6628
أنبوب مخروطي 15 ملغطاء 352097فالكون
12 مم # 1CB00120RA120MNZ0إيبريديا
32 مم # 1إيبريدياCB00320RA140MNZ0
CuSO4< / sub>سيجما ألدريتش209198
DMEM ارتفاع الجلوكوز المتوسط DutscherL0104-500
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)  DutscherL0615-500
مصل الأبقار الجنينيbiowestS1810-500
Fibroblast 533T-تم جمعها من فرد
سليم FIJI ImageJ 2.9.0-
الجيلاتينBio-RAD170-6537
Guanidine HClSigma Aldrich50950
خلايا HeLaATCCCCL-2
Hoechst 33342Sigma Aldrich14533
Imaris 10.2-K
2HPO4EuromedexPB0447-BLSM اللامائي
780 الفحص المجهري متحد البؤر Zeiss-MCF7
ATCCHTB-22
N-acetylmannosamine (ManNAc)BIOSYNTHMA05269
كلوريد الصوديومكارلو إربا479687
N-azidoacetylmannosamine (ManNAz) BIOSYNTHMA46002
Objectif "Plan-Apochromat" 63x / 1،4 Oil DIC M27Zeiss420782-9900-799   ؛
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) 10xEuromedexET330
Proteinase KSigma AldrichP2308من  ألبوم Tritirachium
منقى الفأر GM130 الجسم المضادBD Bioscience61082250 & micro ؛ ز
أكريلات الصوديوم  قارورة سيجما ألدريتش408220
T75كورنينج430641
تيميدسيجما ألدريتشT9281
تريس أسيتات EDTA (TAE) 10xEuromedexEU0202-B
Triton X-100Sigma AldrichX-100
Trypan BlueDutscher702630
Trypsine-EDTA 1xDutscherL0930-100
فوسفات الكلوروكين 30120094 زلات زلات غطاء

المراجع

  1. De Souza, N. Light microscopy at the limit. Nat Cell Biol. 11 (Suppl 1), S22(2009).
  2. Tam, J., Merino, D. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) in comparison with stimulated emission depletion (STED) and other imaging methods. J Neurochem. 135, 643-658 (2015).
  3. Jeong, S., Widengren, J., Lee, J. C. Fluorescent probes for STED optical nanoscopy. Nanomaterials. 12 (1), 21(2021).
  4. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543548(2015).
  5. Kang, S., et al. Expansion microscopy with a thermally adjustable expansion factor using thermoresponsive biospecimen-hydrogel hybrids. ACS Appl Mater Interfaces. 13 (24), 2896228974(2021).
  6. Sun, D., et al. Click-ExM enables expansion microscopy for all biomolecules. Nat Methods. 18 (1), 107113(2020).
  7. Dube, D., Bertozzi, C. Metabolic oligosaccharide engineering as a tool for glycobiology. Curr Opin Chem Biol. 7 (5), 616625(2003).
  8. Scache, J., et al. Switching azide and alkyne tags on bioorthogonal reporters in metabolic labeling of sialylated glycoconjugates: a comparative study. Sci Rep. 12 (1), 22129(2022).
  9. Holst, S., Wuhrer, M., Rombouts, Y. Glycosylation characteristics of colorectal cancer. Adv Cancer Res. 126, 203256(2015).
  10. Boyaval, F., et al. N-Glycomic signature of stage II colorectal cancer and its association with the tumor microenvironment. Mol Cell Proteomics. 20, 100057(2021).
  11. Ferreira, J. A., et al. Protein glycosylation in gastric and colorectal cancers: Toward cancer detection and targeted therapeutics. Cancer Lett. 387, 32-45 (2017).
  12. Jennings, M. P., Day, C. J., Atack, J. M. How bacteria utilize sialic acid during interactions with the host: snip, snatch, dispatch, match and attach. Microbiology. 168 (3), 001157(2022).
  13. Gilormini, P. A., et al. A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways. Chem Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).
  14. Vanbeselaere, J., et al. Alkynyl monosaccharide analogues as a tool for evaluating Golgi glycosylation efficiency: application to Congenital Disorders of Glycosylation (CDG). Chem Commun. 49 (96), 11293-11295 (2013).
  15. Gilormini, P. A., et al. Chemical glycomics enrichment: imaging the recycling of sialic acid in living cells. J Inherit Metab Dis. 4 (3), 515523(2018).
  16. Rigolot, V., Biot, C., Lion, C. To view your biomolecule, click inside the cell. Angew Chem. 60 (43), 2308423105(2021).
  17. Qin, W., et al. Artificial cysteine S-glycosylation induced by per-O-acetylated unnatural monosaccharides during metabolic Glycan Labeling. Angew Chem. 130 (7), 1835-1838 (2018).
  18. Qin, K., Zhang, H., Zhao, Z., Chen, X. Protein S-glyco-modification through an elimination-addition mechanism. J Am Chem Soc. 142 (20), 9382-9388 (2020).
  19. Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. A. Stepwise Huisgen cycloaddition process: Copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes. Angew Chem. 41 (14), 25962599(2002).
  20. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted [3 + 2] azide−alkyne cycloaddition for covalent modification of biomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126 (46), 15046-15047 (2004).
  21. Mbua, N. E., et al. Strain-promoted alkyne-azide cycloadditions (SPAAC) reveal new features of glycoconjugate biosynthesis. ChemBioChem. 12 (12), 19121921(2011).
  22. Blackman, M. L., Royzen, M., Fox, J. M. Tetrazine ligation: Fast bioconjugation based on inverse-electron-demand Diels-Alder reactivity. J Am Chem Soc. 130 (41), 1351813519(2008).
  23. Devaraj, N. K., Weissleder, R., Hilderbrand, S. A. Tetrazine-based cycloadditions: Application to pretargeted live cell imaging. Bioconjug Chem. 19 (12), 22972299(2008).
  24. Bird, R. E., et al. Bioorthogonal chemistry and its applications. Bioconjug Chem. 32 (12), 2457-2479 (2021).
  25. Slade, P. G., et al. Identifying the CHO secretome using mucin-type O-linked glycosylation and click-chemistry. J Proteome Res. 11 (12), 61756186(2012).
  26. Gambarotto, D., Hamel, V., Guichard, P. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM). Methods Cell Biol. 161, 5781(2021).
  27. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat. Methods. 16, 71-74 (2019).
  28. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. Copper-catalyzed azide-alkyne click chemistry for bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  29. Santiago, F., et al. Synthesis and swelling behaviour of poly(sodium acrylate)/sepiolite superabsorbent composites and nanocomposites. Polym Int. 55 (8), 843848(2006).
  30. Wen, G., et al. Evaluation of direct grafting strategies via trivalent anchoring for enabling lipid membrane and cytoskeleton staining in expansion microscopy. ACS Nano. 14 (7), 78607867(2020).
  31. Wen, G., et al. Current progress in expansion microscopy: Chemical strategies and applications. Chem Rev. 123 (6), 32993323(2023).
  32. Drelich, L., et al. Toward high spatially resolved proteomics using expansion microscopy. Anal Chem. 93 (36), 12195-12203 (2021).
  33. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  34. Liu, J., et al. Expansion microscopy with multifunctional polymer dots. Adv Mater. 33 (25), 2007854(2021).
  35. Klimas, A., et al. Magnify is a universal molecular anchoring strategy for expansion microscopy. Nat Biotechnol. 41 (6), 858869(2023).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تصور السياليل داخل الخلايا باستخدام كيمياء النقر والفحص المجهري التوسعي
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.