مقالة منهجية

توليد كرويات من الخلايا الغضروفية المختلفة باستخدام ظروف منخفضة الالتصاق تحت الجاذبية والمفاعلات الحيوية الصغيرة محلية الصنع

DOI:

10.3791/67481

⸱

يناير 31, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Translational Biomedicine, Cell Biology department,, Lopukhin Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine of Federal Medical Biological Agency

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الدراسة طريقة لإنتاج الكرويات الغضروفية عن طريق تجميع الخلايا إلى كرويات في ظل ظروف منخفضة الالتصاق باستخدام الجاذبية ، متبوعة بزراعة الكرويات الناتجة في المفاعلات الحيوية الصغيرة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتطلب إصلاح الغضروف في أمراض المفاصل المزمنة علاجات متقدمة قائمة على الخلايا لتجديد الأنسجة التالفة بشكل فعال. يوفر هذا البروتوكول طريقة خطوة بخطوة لتمييز الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) إلى خلايا كروية قائمة على الخلايا الغضروفية ، مما يدعم هندسة الأنسجة وتطبيقات العلاج الخلوي. يتم تنظيم عملية التمايز بعناية لتعزيز التزام النسب الغضروفية ، بدءا من iPSCs المستزرعة في وسائط محددة توجه الخلايا بالتتابع خلال المراحل الحرجة من التمايز. في البداية, يتم توسيع iPSCs للوصول إلى التقاء مثالي قبل الحث نحو النسب الغضروفي باستخدام سلسلة من التغييرات الإعلامية المحددة. بحلول اليوم العاشر ، يتم نقل الخلايا إلى وسط يعزز تكوين الغضروف يعزز تكوين الخلايا الشبيهة بالخلايا الغضروفية التي تعبر عن العلامات الرئيسية للخلايا الغضروفية الناضجة. يؤدي التجميع الإضافي في صفائح مغلفة ب 96 بئرا إلى تكوين كرويات ثلاثية الأبعاد ، والتي يتم زراعتها بعد ذلك في مفاعلات حيوية صغيرة مخصصة مصممة لمحاكاة بيئة مكروية تشجع على ترسب المصفوفة خارج الخلية (ECM). من خلال تمكين الإنتاج القابل للتطوير من كرويات الخلايا الغضروفية التي تحاكي خصائص الغضروف الأصلية ، يقدم هذا النهج حلا واعدا وقابلا للتكرار لتطوير علاجات قائمة على الخلايا لعيوب الغضروف ، مما يوفر فائدة واسعة للتطبيقات السريرية والبحثية في الطب التجديدي العضلي الهيكلي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يؤدي انتشار أمراض المفاصل إلى أعباء اقتصادية كبيرة بسبب العدد المتزايد من المرضى المعاقين والتكاليف المرتبطة برعايتهم. الغضروف الزجاجي هو نسيج لاوعائي ضام ذو إمكانات تجديديةمحدودة 1. يمكن أن يؤدي الاستخدام المطول لبعض الأدوية غير الستيرويدية المضادة للالتهابات (NSAIDs) ، والجلوكوكورتيكويد ، والعلاج الكيميائي أو العلاج الإشعاعي إلى تقليل قدرة الغضروف على التجدد ، مما يقضي تقريبا على قدرته على الشفاء2. هذا يجعل من الصعب الحصول على خلايا الغضروف الذاتية للعلاج الخلوي.

لطالما تم التعرف على تقنية زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد (3D) ، بما في ذلك الخلايا الغضروفية ، كمجال بحثي ناشئ ذو إمكانات كبيرة. تتم دراسة هذه الهياكل ثلاثية الأبعاد للتطبيقات في كل من البحوث البيولوجية الأساسية والطب التجديدي. تحمل الكرات المشتقة من الخلايا الغضروفية الذاتية وعدا علاجيا لمعالجة تنكس أنسجة الغضروف ، وهي حالة تحظى حاليا باهتمام عالميكبير 3.

تمثل الكرات المشتقة من الخلايا الغضروفية المتمايزة عن iPSCs بديلا واعدا للخلايا الغضروفية الأولية, تقدم مزايا كبيرة لإصلاح الغضروف. توفر iPSCs قدرة غير محدودة تقريبا للتجديد الذاتي وتمتلك إمكانات تمايز واسعة, مما يسمح لإنتاج الخلايا الغضروفية بكميات كافية للتطبيقات السريرية دون إجراءات جراحية لجمعالخلايا 4. علاوة على ذلك ، فإن الانتقال من مزارع الخلايا الغضروفية التقليدية ثنائية الأبعاد (2D) إلى أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد ، مثل الغلاف الغضروفي ، يعزز من قابلية هذه الخلايا للحياة ووظائفها من خلال خلق بيئة أكثر صلة من الناحية الفسيولوجية. تشير الدراسات إلى أن الخلايا الغضروفية المستزرعة في الكرات الكروية ثلاثية الأبعاد تحافظ بشكل أفضل على نمطها الظاهري ، وتظهر معدلات أقل من عدم التمايز ومستويات تعبير أعلى لعلامات الغضروف الزجاجي الرئيسية ، مثل الكولاجين من النوع الثاني و aggrecan5.

على الرغم من إمكانات الغلاف الغضروفي المشتق من iPSC, لا تزال البروتوكولات الموحدة لتوليد الغلاف الغضروفي عالية الجودة محدودة. غالبا ما يؤدي التباين في البروتوكولات عبر الدراسات إلى تناقضات في جودة الخلايا الغضروفية وتكوين المصفوفة خارج الخلية ، مما يؤثر على فعاليتها للاستخدام العلاجي6. هنا, يتم تقديم بروتوكول مكرر يوحد توليد الكرويات من الخلايا الغضروفية المشتقة من iPSC باستخدام مفاعلات حيوية صغيرة ميسورة التكلفة حسب الطلب. تعد مرحلة زراعة المفاعل الحيوي المصغر ضرورية ، لأنها توفر إعدادا منخفض الالتصاق متحكم فيه يعمل على تحسين توزيع المغذيات ، ونضج ECM ، والضغط الكروي7. تعزز هذه المرحلة التعبير القوي عن علامات الخلايا الغضروفية الأساسية ، بما في ذلك الكولاجين من النوع الثاني ، و aggrecan ، و SOX9 ، جنبا إلى جنب مع تركيبة ECM التي تشبه إلى حد كبير الغضروف الأصلي. تضمن التغييرات المنتظمة في الوسائط والتحكم الدقيق في الظروف البيئية - درجة الحرارة ، ثاني أكسيد الكربون2 ، وسرعة الدوران - صلاحية ونضج الخلايا الكروية الغضروفية. تم تحسين هذا البروتوكول لإنشاء غلاف غضروفي عالي الجودة مع تعبير قوي عن علامات الغضروف الزجاجي بطريقة فعالة من حيث التكلفة وقابلة للتطوير ، ومناسبة للأبحاث والتطبيقات السريرية في إصلاح الغضاريف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت مراجعة الدراسة والموافقة عليها من قبل لجنة الأخلاقيات التابعة ل LOPUKHIN FRCC PCM (البروتوكول رقم 2019/02 بتاريخ 9 أبريل 2019). تم الحصول على جميع عينات المانحين وفقا لمبادئ إعلان هلسنكي. تم الحصول على الموافقة المستنيرة من جميع المشاركين و / أو الأوصياء القانونيين عليهم.

ملاحظة: حافظ على تقنية التعقيم طوال البروتوكول. قم بتسخين جميع وسائط ومحاليل الاستزراع إلى 37 درجة مئوية قبل وضعها على الخلايا أو الكرويات. زراعة الخلايا في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية ، مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 على 80٪ رطوبة. يظهر مخطط البروتوكول في الشكل 1.

figure-protocol-1
الشكل 1: بروتوكول لإنتاج الغلاف الغضروفي من خط iPSC IPSRG4S. (أ) في البداية, يتم استزراع iPSCs في وسائط الخلايا الجذعية متعددة القدرات حتى 80٪ يتم الوصول إلى التقاء. (ب) للحث على التمايز نحو النسب الغضروفية, ثم يتم استزراع iPSCs في وسط A 2 أيام. يتم استبدال الوسط لاحقا بتركيبة تفتقر إلى مثبط Chir 99021 و Rho kinase ، ويتم زراعة الخلايا لمدة 6 أيام إضافية مع تغييرات متوسطة كل يومين. (ج) ثم يتم نقل الخلايا إلى الوسط B لتعزيز تكوين الغضروف لمدة 10 أيام قادمة. (د) بمجرد تحقيق عدد كاف من الخلية، تتقدم العملية إلى مرحلة إنتاج الكرويات. (ه) يتم تجميع الخلايا في كرويات في ظروف منخفضة الالتصاق تحت الجاذبية. (و) يتم استزراع الكرويات الناتجة في مفاعلات حيوية صغيرة ذات متوسط B. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

1. تحويل أطباق بتري إلى مفاعلات حيوية صغيرة

ملاحظة: التفاصيل الواردة في مقال سابق5.

  1. قم بتقطيع أنابيب أجهزة الطرد المركزي إلى حلقات بارتفاع 7-8 مم باستخدام مقص الأوتوكلاف المعقم (إعدادات الأوتوكلاف: 121 درجة مئوية (250 درجة فهرنهايت) عند 15 رطل لكل بوصة مربعة ، و 30 دقيقة ، وتجفيف ما بعد الأوتوكلاف لمدة 20 دقيقة).
  2. سحق أطباق بتري منخفضة الالتصاق أو غير المعالجة أو الميكروبيولوجية إلى قطع صغيرة. قم بإذابة ما يقرب من 1 جم من جزيئات البلاستيك في 10 مل من الكلوروفورم طوال الليل لإنشاء محلول بلاستيكي سائل. قم بإجراء هذا الإجراء في غطاء الدخان.
  3. تحقق من أن البلاستيك السائل لزج بدرجة كافية لسحب العينات. تأكد من أن القطرات تحافظ على شكل كروي بدلا من انتشارها على السطح. إذا كان المحلول رقيقا جدا ، أضف المزيد من الجزيئات البلاستيكية ، وعادة ما تتطلب 1-3 جم. إذا كان سميكا جدا ، أضف كلوروفورم إضافي ، وعادة ما يتطلب ما يصل إلى 5 مل.
  4. قم بتشكيل مقبض بلاستيكي في وسط طبق بتري معقم منخفض الالتصاق 60 مم باستخدام إحدى الطريقتين الفعالتين الموضحة أدناه.
    1. الخيار 1: ضع الحلقة البلاستيكية المعقمة في وسط طبق بتري ، ثم ضع البلاستيك السائل داخل الحلقة ؛ ستتطلب قطرة واحدة حوالي 100-200 ميكرولتر قطرات من البلاستيك السائل.
    2. الخيار 2: ضع نفس عدد قطرات البلاستيك السائل مباشرة في وسط طبق بتري دون استخدام الحلقة البلاستيكية.
  5. اترك الأطباق تجف مكشوفة لمدة 2-3 ساعات في غطاء التدفق الرقائقي. بعد التجفيف ، قم بتعريض الأطباق للأشعة فوق البنفسجية لمدة 20-30 دقيقة.

2. علاج أطباق الثقافة بالجيلاتين

  1. تحضير محلول جيلاتين 0.1٪ عن طريق إذابة مسحوق الجيلاتين في الماء المقطر عند 95 درجة مئوية. قم بتمرير المحلول بالتتابع عبر مرشحات غشائية 0.45 ميكرومتر و 0.25 ميكرومتر ، ثم قم بتخزين المرشح عند 4 درجات مئوية.
  2. مباشرة قبل إعادة بذر الخلايا الغضروفية ، ضع 3 مل من محلول الجيلاتين على قارورة 25 سم2 (يوصى باستخدام ما يصل إلى 15 جم من أنسجة الغضروف لكل قارورة T25). احتضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة ، وقم بإزالة الجيلاتين ، واشطفه مرتين باستخدام PBS ، واستمر في بذر الخلايا.

3. عزل وزراعة الخلايا الغضروفية

ملاحظة: يتم عزل الخلايا الغضروفية من مناطق الغضروف غير الحاملة للوزن من المرضى الذين يخضعون لاستبدال الركبة بالكامل. حصاد جميع العينات في ظروف معقمة وتخزينها في أنابيب معقمة مملوءة ب DMEM تحتوي على 200 وحدة / مل من محلول البنسلين / الستربتومايسين. قم بتخزين مناديل الغضروف في الثلاجة عند 2-8 درجة مئوية.

  1. ابدأ العلاج الأنزيمي في غضون يومين من حصاد الغضروف. اغسل قطع الغضروف في محلول هانكسباستخدام أطباق بتري مقاس 60 مم ، ثم قم بتقطيع الغضروف إلى شظايا يبلغ قطرها حوالي 1-2 مم باستخدام مقص معقم.
  2. نقل قطع الغضروف إلى أنابيب سعة 15 مل وهضمها في محلول كولاجيناز من النوع الثاني بنسبة 0.01٪ في DMEM ، حوالي 1 مل لكل 1 غرام من الغضروف ، في غضون 8-12 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، رطوبة 100٪ ، تحت التحريك المستمر على شاكر مداري عند 150-200 دورة في الدقيقة.
  3. بعد الهضم ، اغسل شظايا الغضروف عن طريق إضافة DMEM إلى أنبوب سعة 15 مل ، ثم جهاز طرد مركزي بوزن 300 × جم لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الشظايا في وسط زراعة الخلايا الغضروفية (الجدول التكميلي 1) وبذرها في قارورة لاصقة T25 مطلية مسبقا بمحلول جيلاتين 0.1٪.
  4. مرور الخلايا الغضروفية عند تحقيق كثافة ملتقى بنسبة 80٪.
    1. للمرور ، اغسل الخلايا الغضروفية بمحلول هانكس ، ثم احتضن الخلايا بمحلول التربسين بنسبة 0.25٪ عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
    2. لتعطيل التربسين ، أضف حجما متساويا من DMEM + 10٪ FBS. أعد تعليق الخلايا الغضروفية في وسط استزراع طازج ، ثم وزعها بنسبة 1: 3 ، مع بذر 20,000-30,000 خلية لكل 1 سم2.
    3. ضع قارورة الاستزراع في حاضنة على حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 و 100٪ رطوبة.

4. زراعة الخلايا الجذعية متعددة القدرات

ملاحظة: بالتعاون مع مختبر الخلايا الجذعية لمجموعة أبحاث الدماغ الجزيئي, قسم علم الأعصاب, A.I. معهد فيرتانين, جامعة شرق فنلندا, كوبيو, فنلندا, خط iPSCs IPSRG4S, تم إنشاؤه بنجاح في دراسةسابقة 8.

  1. زراعة iPSCs في 6 لوحات الآبار المغلفة مسبقا مع مصفوفة تحتوي على بروتينات خارج الخلية ( الشكل 1 أ). استخدم وسيطا للخلايا الجذعية متعددة القدرات (الجدول التكميلي 1).
  2. مرور الخلايا عند التقاء 80٪ ، مع الحفاظ على نسبة 1: 4 (50،000-75،000 خلية لكل 1 سم2). تقريبا 2-3 ساعة قبل الانفصال, نقل iPSCs إلى وسط للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي تحتوي على مثبط رو كيناز Y27632 بتركيز نهائي 1 ميكرومتر ل 1 يوم.
  3. اغسل iPSCs بمحلول هانكس واحتضنه عند 37 درجة مئوية بمحلول التربسين 0.05٪. لتعطيل التربسين ، أضف حجما متساويا من DMEM + 10٪ FBS. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 200 × جم لمدة 5 دقائق في أنابيب 15 مل.
  4. تخلص من المادة الطافية الخلايا في وسط جديد للخلايا الجذعية متعددة القدرات. لتعزيز صلاحية الخلية ، أضف مثبط Rho kinase Y27632 إلى الوسط بتركيز نهائي قدره 1 ميكرومتر لمدة يوم واحد. ضع لوحة الاستزراع في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ورطوبة 100٪.

5. التمايز الغضروفي من iPSCs

  1. ابدأ التمايز نحو سلالة الغضروف عن طريق زراعة الخلايا في الوسط أ (الجدول التكميلي 1) لأول يومين. في اليوم 3 ، استبدل Medium A بمحلول يستبعد Chir 99021 ومثبط Rho kinase مع الحفاظ على جميع المكونات الأخرى دون تغيير. قم بتغيير الوسيط كل يومين من الأيام 3 إلى 9 (الشكل 1 ب).
  2. في اليوم 10 ، انقل الخلايا الشبيهة بالخلايا الغضروفية إلى الوسط B (الجدول التكميلي 1) ، الذي تمت صياغته لتسهيل تكوين الغضروف. قم بتغيير الوسيط كل يومين لمدة 10 أيام (الشكل 1 ج).
  3. قم بإعداد لوحة ثقافة معلقة من 96 بئرا مسبقا عن طريق طلاء كل بئر بنسبة 1.5٪ من الاغاروز في الماء المقطر. تذوب الاغاروز في الميكروويف حتى الغليان (حوالي 60-90 ثانية عند 700 واط). بمجرد تسييل الاغاروز ، أضف 75 ميكرولتر من الاغاروز إلى كل بئر واتركه يتماسك عند RT (حوالي 15 دقيقة).
  4. أضف 150 ميكرولتر من وسط DMEM إلى كل بئر واحتضن اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 12 ساعة على الأقل.
    ملاحظة: يمكن تخزين الألواح المحضرة لمدة تصل إلى شهر واحد في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 عند 37 درجة مئوية إذا تم تجديد الوسط في كل بئر للتعويض عن التبخر.
  5. في اليوم 12 ، بعد ملاحظة التغيرات الظاهرية المرتبطة بتكوين الغضروف ، ابدأ تكوين الكرويات باستخدام الخلايا الشبيهة بالخلايا الغضروفية المتولدة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة, من المستحسن تحليل التعبير عن علامات غضروف الخلايا الرئيسية مع الكيمياء المناعية (المحكمة الجنائية الدولية) وتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) باستخدام طريقة 2-ΔΔCT 9 لتأكيد التمايز الغضروفي الناجح من iPSCs. أثناء الانتقال من صفيحة 6 آبار إلى قارورة ثقافة خلية 75 سم2 ، يمكن زرع جزء صغير من الخلايا في صفيحة 48 بئرا ، مطابقة لعدد العلامات المراد تحليلها. قم بإجراء تحليل ICC على هذه العينات للتحقق من التعبير الجيني.

6. تكوين الكرات من الخلايا المشتقة من الخلايا المشتقة من iPSC الشبيهة بالخلايا الغضروفية

  1. بعد الحصول على مشتقات تشبه الخلايا الغضروفية ، تمر الخلايا عند التقاء 80٪. افصل الخلايا عن الألواح المكونة من 6 آبار باستخدام محلول التربسين بنسبة 0.05٪. لتعطيل التربسين ، أضف حجما متساويا من DMEM + 10٪ FBS ، ثم انقل الخلايا إلى أنبوب 15 مل وجهاز طرد مركزي عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
  2. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الخلايا في 1 مل من Medium B ، وانقلها إلى قارورة ثقافة خلية مقاس 75 سم2 مغلفة مسبقا بمحلول جيلاتين 0.1٪ (الشكل 1 د). بمجرد أن تصل الخلايا إلى 80٪ من التقاء كطبقة أحادية ، افصل الخلايا مرة أخرى باستخدام التربسين وأعد تعليقها في الوسط B كما هو موضح.
  3. نقل الخلايا إلى صفيحة 96 بئرا مغلفة بنسبة 1.5٪ agarose بكثافة 100,000 خلية لكل بئر. ازرع في الوسط ب ، مع إضافة 150 ميكرولتر من الوسط الكامل لكل بئر (الشكل 1 د ، 3 أ).
  4. حافظ على الخلايا في صفيحة 96 بئرا مغطاة ب 1.5٪ agarose لمدة لا تقل عن يوم واحد وبحد أقصى 3 أيام حتى تتشكل الكرويات (الشكل 2 ب). انقل الكرات الكروية من الآبار باستخدام طرف ماصة سعة 1 مل بنهاية مشذبة، ثم انقلها إلى أنبوب سعة 15 مل. اترك الكرويات تستقر لمدة 2-3 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية.
  5. اغمر الكرويات في محلول مصفوفة غشاء القاعدي المذاب حديثا وغير المخفف الذي يتم الحفاظ عليه عند 4 درجات مئوية. بعد 30 دقيقة ، اجمع الكرات عن طريق الترسيب السلبي في أنبوب سعة 15 مل أو عن طريق الطرد المركزي اللطيف عند 100 × جم لمدة دقيقة واحدة.
    ملاحظة: يجب إذابة المصفوفة طوال الليل على الثلج في ثلاجة 2-8 درجة مئوية. بعد الذوبان الأول ، يتم إجراء حصص ذات استخدام واحد للمصفوفة لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. يتم استخدام وتخزين البولي بروبلين أو غيرها من الأنابيب المتوافقة مع المجمد عند -70 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية. كن حذرا لتاريخ انتهاء صلاحية الدفعة / الدفعة ، وهو 2 سنوات من تاريخ التصنيع.
  6. انقل الكرويات إلى مفاعلات حيوية صغيرة وأضف 6 مل من Medium B. ضع المفاعل الحيوي الصغير على شاكر مداري داخل حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 مضبوطة على 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ورطوبة 100٪ وسرعة تحريك 70-75 دورة في الدقيقة (الشكل 1F).
  7. قم بتغيير الوسط أسبوعيا أو كما هو مطلوب من خلال النضوب المتوسط أو تغيير لون مؤشر القاعدة الحمضية. للقيام بذلك ، اسمح للكرويات بالاستقرار عن طريق الجاذبية في أنبوب سعة 15 مل ، ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية. أضف Medium B الطازج إلى الأنبوب ، وانقل الكرويات مرة أخرى إلى المفاعلات الحيوية الصغيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول الموضح موضح موضح في الشكل 1. تستخدم هذه المنهجية اثنين من وسائل الإعلام الثقافية المتميزة لدفع تمايز iPSCs إلى الخلايا الكروية الغضروفية على مدى مدة لا تقل عن 1 شهر (الشكل 2). تبدأ عملية التمايز عندما تحقق iPSCs 75٪-90٪ التقاء (الشكل 1 ب). تظهر المؤشرات المبكرة للتمايز الغضروفي في حوالي الأيام 9-10 من الزراعة في الوسط A ، والتي تتميز بالخلايا التي تتبنى خاصية مورفولوجية للخلايا الغضروفية. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثل iPSCs أداة تحويلية في الطب التجديدي, توفر القدرة على توليد الخلايا الغضروفية الخاصة بالمريض لإصلاح الغضروف. تستفيد البروتوكولات الحالية من التمايز الموجه من خلال مسارات الأديم المتوسط ، مع جزيئات الإشارات الرئيسية مثل TGF-β و BMP-2 التي تعزز التزام النسب الغضروفية. تهدف هذه الطرق إلى تكرار تطور الغضروف الجنيني ، مما يتيح إنتاج مكونات المصفوفة خارج الخلية مثل الكولاجين من النوع الثاني والأجغريكان ، وهو ضروري لأنسجة الغضروف الوظيفية. عززت التطورات في تقنيات الزراعة ثلاثية الأبعاد ، بم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أن البحث أجري في غياب أي علاقات تجارية أو مالية يمكن تفسيرها على أنها تضارب محتمل في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم البحث بالتخصيص # 22-15-00250 من قبل مؤسسة العلوم الروسية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.05٪ محلول التربسينثيرمو فيشر العلمي25300-062
0.25٪ محلول التربسينثيرمو فيشر العلمي25200-072
المتقدم DMEM / F12 متوسط Eagle'sThermo Fisher Scientific12634028
Aggrecan أحادي النسيلة الأجسام المضادةInvitrogenAHP0022المضيف: الماوس ؛ التخفيف: 1/500
حمض الأسكوربيكسيجماA454450 & مو ؛ جم / مل
B-27 مكملThermo Fisher Scientific175040441x أو 2٪
بيتا ميركابتو إيثانولسيرفا2862590 ملي
مولار BMP2Miltenyi biotec130-110-92210 نانوغرام / مل
شير 99021ميلتيني بيوتيك130-103-92610 & مو ؛ M
COL1A1 (E6A8E) الجسم المضاد أحادي النسيلةCellSignalling39952المضيف: أرنب ؛ التخفيف: 1/800
COL2A1 (M2139) الجسم المضاد أحادي النسيلةسانتا كروزsc-52658المضيف: الفأر. التخفيف: 1/50
محلول الكولاجيناز من النوع الثاني  PanEcoP011-20.01٪
DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole)Sigma-AldrichD9542-5MG1 & mu ؛ جم / مل
DMEM متوسط مع الجلوتامينPanEco420؟
مصل الأبقار الجنينية ثيرمو فيشر 10270106 العلمية10٪
حل هانكس بانيكو؟020؟
Hybris 8 متوسطPanEco× 780 / 780
محلول الأنسولين ترانسفيرين السيلينيوميحتوي محلول PanEco?0651x على التركيزات التالية: الأنسولين: 10 & جم / مل ؛ ترانسفيرين: 5.5 وميكرو ؛ جم / مل ؛ السيلينيوم 5 نانوغرام / مل
L-alanyl-L-الجلوتامين   ؛ثيرمو فيشر العلمي2 ملي متر
ماتريجل ماتريكسBD354277300 مو ؛ جم / مل
محلول البنسلين الستربتومايسينPanEco؟063؟100 وحدة / مل
حمض الريتينويكMiltenyi biotec130-117-33910 نانومتر
Rho kinase مثبط Y27632Miltenyi biotec130-103-922 10 ملم
الأجسام المضادة الثانوية للماعز المضادة للفأر IgG (H + L) الممتزة عبر ، Alexa Fluor 555Thermo Fisher Scientific   ؛A21422المضيف: ماعز. التخفيف: 1/500
الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) ممتص للغاية ، Alexa Fluor Plus 555Thermo Fisher Scientific   ؛?32732المضيف: ماعز; التخفيف: 1/500
Sox9 (D8G8H) خلية الجسم المضاد أحادي النسيلةSignalling82630المضيف: Rb ؛ التخفيف: 1/400
TeSR-1 تقنياتالخلايا الجذعية85850
TGF- & beta ؛ 1 ميلتيني بيوتيك130-095-06710 نانوغرام / مل
35050038 المتوسطة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cieza, A., Causey, K., Kamenov, K., Hanson, S. W., Chatterji, S., Vos, T. Global estimates of the need for rehabilitation based on the Global Burden of Disease study 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 396, e10267(2021).
  2. Hua, C., Buttgereit, F., Combe, B. Glucocorticoids in rheumatoid arthritis: Current status and future studies. RMD Open. 6 (1), e000536(2020).
  3. Wang, M., et al. Articular cartilage repair biomaterials: Strategies and applications. Materials Today Bio. 24, e100948(2024).
  4. Lee, N., Bayaraa, O., Zechu, Z., Kim, H. Biomaterials-assisted spheroid engineering for regenerative therapy. BMB Rep. 54 (7), 356-367 (2021).
  5. Eremeev, A., Pikina, A., Ruchko, E., Sidorov, V., Ragozin, A. Fabrication of cartilage tissue substitutes from cells with induced pluripotency. Med Extrem Situat. 4, 30-41 (2022).
  6. Rodríguez Ruiz, A., et al. Cartilage from human-induced pluripotent stem cells: comparison with neo-cartilage from chondrocytes and bone marrow mesenchymal stromal cells. Cell Tissue Res. 386, 309-320 (2021).
  7. Eremeev, A., et al. Brain organoid generation from induced pluripotent stem cells in homemade mini bioreactors. J Vis Exp. 178, e62987(2021).
  8. Holmqvist, S., et al. Creation of a library of induced pluripotent stem cells from Parkinsonian patients. NPJ Parkinsons Dis. 2, e16009(2016).
  9. Livak, K., Schmittgen, T. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method. Methods. 25 (40), 402-408 (2001).
  10. De Kinderen, P., et al. Differentiation of induced pluripotent stem cells into chondrocytes: Methods and applications for disease modeling and drug discovery. J Bone Miner Res. 37 (3), 397-410 (2022).
  11. Ali, E., et al. iPSCs chondrogenic differentiation for personalized regenerative medicine: a literature review. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 185(2024).
  12. Reina-Mahecha, A., Beers, M., van der Veen, H., Zuhorn, I., van Kooten, T., Sharma, P. A Review of the role of bioreactors for iPSCs-based tissue-engineered articular cartilage. Tissue Eng Regen Med. 20 (7), 1041-1052 (2023).
  13. Fu, L., et al. The application of bioreactors for cartilage tissue engineering: Advances, limitations, and future perspectives. Stem Cells Int. 2021, 6621806(2021).
  14. Castro-Viñuelas, R., et al. Tips and tricks for successfully culturing and adapting human induced pluripotent stem cells. Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 569-581 (2021).
  15. Endo, K., Fujita, N., Nakagawa, T., Nishimura, R. Effect of fibroblast growth factor-2 and serum on canine mesenchymal stem cell chondrogenesis. Tissue Eng Part A. 25 (11-12), 901-910 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Chondrocyte SpheroidsInduced Pluripotent Stem CellsCartilage Repair3D Cell CultureChondrogenic DifferentiationAgarose Coated PlatesExtracellular Matrix DepositionGene Expression AnalysisCartilage Tissue Engineering

مقالات ذات صلة