يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نمذجة استهلاك الكحول في القوارض باستخدام الشرب في القفص المنزلي المكون من زجاجتين وتحليل البنية المجهرية

1.9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67486

⸱

نوفمبر 8, 2024

 ,  , 
1Center for Alcohol Research in Epigenetics, Department of Psychiatry, University of Illinois Chicago

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول نموذجا قياسيا لشرب القفص المنزلي المكون من زجاجتين للوصول المتقطع لنمذجة استهلاك الكحول في الفئران. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر إرشادات خطوة بخطوة لزيادة البروتوكول القياسي باستخدام نظام الكشف عن اللعق DIY الذي يتيح التحليل المجهري لسلوك الشرب.

الملخص

يعد شرب القفص المنزلي المكون من زجاجتين أحد أكثر النماذج استخداما لدراسة استهلاك الإيثانول في القوارض. في أبسط أشكاله ، يتم تزويد بإمكانية الوصول إلى زجاجتي شرب ، إحداهما تحتوي على ماء الصنبور العادي والأخرى الإيثانول ، مع قياس المدخول اليومي بالتغير في وزن الزجاجة خلال فترة 24 ساعة. وبالتالي ، لا يتطلب هذا النهج معدات مختبرية متخصصة. في حين أن سهولة التنفيذ هذه هي على الأرجح المساهم الأكبر في اعتمادها على نطاق واسع من قبل باحثي الكحول قبل السريرية ، فإن دقة بيانات الشرب التي تم الحصول عليها باستخدام هذا النهج محدودة بعدد المرات التي يقيس فيها الباحث وزن الزجاجة (على سبيل المثال ، مرة واحدة يوميا). ومع ذلك ، فإن الرغبة في فحص أنماط الشرب في سياق المدخول الكلي والتدخلات الدوائية والتلاعب العصبي قد دفعت إلى تطوير أنظمة الكشف عن لعق القفص المنزلي التي يمكنها الحصول على البيانات على مستوى اللعقات الفردية. على الرغم من أن عددا من هذه الأنظمة قد تم تطويرها مؤخرا ، إلا أن النظام مفتوح المصدر ، LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device) ، قد حظي باهتمام كبير في هذا المجال لقدرته على تحمل التكاليف وسهولة الاستخدام. على الرغم من أنه مثير ، فقد تم تصميم هذا النظام للاستخدام في الفئران. هنا ، نراجع الإجراءات المناسبة لشرب القفص المنزلي القياسي والمجهز بزجاجتين. نقدم أيضا طرقا لتكييف نظام LIQ HD مع الفئران بما في ذلك تعديلات الأجهزة لاستيعاب حجم القفص الأكبر وحامل زجاجة مطبوع ثلاثي الأبعاد معاد تصميمه متوافق مع زجاجات الشرب القياسية الجاهزة. باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحثين فحص أنماط الشرب اليومية بالإضافة إلى مستويات المدخول في العديد من الفئران بالتوازي وبالتالي زيادة دقة البيانات المكتسبة بأقل قدر من الاستثمار في الموارد الإضافية. توفر هذه الأساليب للباحثين المرونة لاستخدام الزجاجات القياسية أو جهاز مجهز بمقياس الليكولوجي لاستجواب الآليات العصبية الحيوية الكامنة وراء شرب الكحول اعتمادا على احتياجاتهم التجريبية الدقيقة.

المقدمة

على الرغم من أن تعاطي الكحول المعتدل قد ارتبط تاريخيا بفوائد صحية معتدلة ، فقد كشفت الدراسات الشاملة الحديثة واسعة النطاق أنه لا يوجد قدر من استهلاك الكحول آمن< فئة الدعم = "xref" >1،< sup class = "xref">2. في الواقع ، يعد تعاطي الكحول عامل الخطر الرئيسي السابع للوفاة والعجز على مستوى العالم < sup class = "xref" >1 مع الأفراد الذين يشربون حتى كميات صغيرة من الكحول لديهم خطر متزايد للإصابة بالسرطان والأمراض المعدية والإصابة< sup class = "xref" >1,< sup class = "xref">3. في الولايات المتحدة ، زادت الوفيات الناجمة عن تعاطي الكحول بنسبة 30٪ تقريبا بين عامي 2016 و 2021< sup class = "xref" >4. الأهم من ذلك ، أن خطر الوفاة والعجز يزداد بشكل رتيب مع زيادة الاستهلاك < فئة الدعم = "xref" >1.

على الرغم من أن الدراسات التي أجريت على البشر قد قدمت نظرة ثاقبة حول البيولوجيا العصبية لتعاطي الكحول وإساءة استخدامه ، إلا أن التحكم التجريبي الذي توفره النماذج الحيوانية أمر بالغ الأهمية لفهم متعمق للآليات الكامنة وراء سلوك الشرب ومخاطر الإفراط في شرب الكحول. هذه النماذج هي أيضا أدوات قيمة لتطوير العلاجات التي تهدف إلى تقليل الاستهلاك غير المنضبط. يعد شرب القفص المنزلي المكون من زجاجتين أحد أكثر النماذج قبل السريرية استخداما لدراسة استهلاك الكحول في القوارض. ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى سهولة تنفيذه لأنه يسمح بقياس إجمالي شرب الكحول الطوعي وتفضيله دون الحاجة إلى معدات بحثية متخصصة أو تحليلات معقدة. باستخدام هذا النهج ، يمكن للباحثين جمع القياسات على الفترات المطلوبة (على سبيل المثال ، الساعات والأيام والأسابيع) عن طريق حساب التغيير في وزن الزجاجة من بداية جلسة الشرب إلى نهايتها. تم استخدام الاختلافات في هذه الطريقة الأساسية من قبل الكثيرين في هذا المجال لتسهيل المستويات المنخفضة إلى المتوسطة إلى الإفراط في تناول الكحول على مدى فترات قصيرة وطويلة من الزمن. على سبيل المثال ، تم استخدام إجراءات الاختيار المستمرة والمتقطعة لزجاجتين لتسهيل المستويات المنخفضة والمعتدلة من تناول الكحول ، على التوالي ، في كل من الفئران<فئة sup = "xref">5 و rats6,7,8. يمكن أن تعزز نفس النماذج مستويات عالية من تناول السلالات التي تفضل الكحول < فئة الدعم = "xref">7،< sup class = "xref">9. بدلا من ذلك ، تبين أن تكييف هذه الطريقة التي تحد من الوصول إلى الكحول إلى 2-4 ساعات يوميا بدءا من حوالي 3 ساعات بعد بدء الدورة المظلمة يولد الإفراط في الشرب في الفئران (أي الشرب في الظلام) < sup class = "xref" > 10 ، < sup class = "xref" > 11. تم استخدام اختلافات إضافية على هذه الطرق جنبا إلى جنب مع الطرق التي تسهل الاعتماد على الكحول (أي التعرض المتقطع المزمن لبخار الإيثانول) لفحص تصاعد شرب الكحول الطوعي أثناء الانسحاب < فئة الدعم = "xref" >12 ، < sup class = "xref" > 13 ، < sup class = "xref" > 14 ، < sup class = "xref" > 15 ، < sup class = "xref" > 16 ، < sup class = "xref" >17 ،<فئة التوصيل = "xref">18,19.

< p class = "jove_content" > على الرغم من تبنيه على نطاق واسع من قبل هذا المجال ، إلا أن النهج القياسي لقياس تناول الكحول عن طريق التغيير في وزن الزجاجة يقتصر في الدقة على إجمالي الاستهلاك لكل جلسة شرب. وبالتالي ، فإن هذا النهج غير قادر على التقاط أنماط الشرب ، والتي من المعروف أنها تؤثر على كل من خطر وشدة اضطراب تعاطي الكحول (AUD)< sup class = "xref">20,21,22. في الواقع ، يمكن أن يكون متوسط تناول الفرد بمرور الوقت نتيجة لعدة نوبات شرب بكثرة أو العديد من نوبات الشرب ، كل منها مرتبط باستهلاك منخفض نسبيا ، ولا يتم اكتشاف هذه الفروق الدقيقة عند قياس الاستهلاك على أنه إجمالي المدخول لكل جلسة شرب. الأهم من ذلك ، لوحظ المزيد من نوبات الشرب المرتبطة بنوبات الشرب الكبيرة (أي الابتلاع) في الأفراد المصابين باضطراب أسترالي بالنسبة للضوابط الصحية< فئة الدعم = "xref">23 وتشير البيانات الموجودة في الرئيسيات غير البشرية إلى أن الأفراد الذين يؤسسون نمطا من استهلاك الكحول يتضمن نوبات شرب كبيرة في وقت مبكر من تاريخ الشرب معرضون لخطر كبير للإصابة ب AUD22. علاوة على ذلك ، فإن نوبات الشرب التي تتضمن نوبات كبيرة من الاستهلاك تزيد بشكل كبير من خطر الإصابة بالمراضة والوفيات بغض النظر عن تشخيص AUD < sup class = "xref" >21. إجمالا ، أدت هذه البيانات إلى زيادة الاهتمام بفحص أنماط الشرب بالإضافة إلى مستويات المدخول الإجمالي في النماذج قبل السريرية ودفعت إلى تطوير عدد من الأنظمة ذات التعقيد المتفاوت القادرة على التقاط بيانات الشرب على مستوى اللعقات الفردية.

من بين أولها تطوير نظام من زجاجتين مزود بكشف لعق شعاع ضوئي مصمم للاستخدام في الفئران < فئة sup = "xref" >24. تم تكييف هذا النظام لاحقا من قبل مجموعة منفصلة لاستخدامه في الفئران < sup class = "xref" >25. في السنوات التي تلت ذلك ، تم استخدام الاختلافات في هذا الموضوع لتطوير أنظمة مماثلة موجودة في سكن القوارض المخصص < sup class = "xref" >26 ، والتي تسمح باكتشاف الفردية المأهولة اجتماعيا < sup class = "xref" > 27 ، < sup class = "xref" >28 ، والتي تلتقط كلا من سلوك التغذية والشرب< فئة sup = "xref">29. من بين هؤلاء ، حظي LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device) < sup class = "xref" >30 باهتمام كبير لتقديم نظام للاستخدام في الفئران يوازي سهولة التنفيذ والقدرة على تحمل التكاليف للنظام الذي طوره Godnyuck et al.< sup class = "xref">24. يستخدم هذا النظام الاستشعار السعوي للكشف المباشر عن التلامس بين اللسان وأنبوب الشرب المعدني الموصل ، على عكس التدابير غير المباشرة مثل نهج الشرب أو التفاعل الذي يتم توفيره باستخدام نظام الكشف عن الشعاع الضوئي. يقدم المؤلفون بيانات توضح أن نظام الاستشعار السعوي الخاص بهم يوفر دقة وحساسية أكبر بكثير في اكتشاف اللعق ، مما ينتج عنه ارتباطات أقوى بين رقم اللعق والتغيير في وزن الزجاجة من اكتشاف الشعاع الضوئي. يوضح المؤلفون أيضا القدرة على استخدام هذا النظام جنبا إلى جنب مع نموذج الشرب في القفص المنزلي المكون من زجاجتين للوصول المستمر لالتقاط مقاييس البنية المجهرية لشرب الكحول بالإضافة إلى مقاييس المدخول اليومي الإجمالي< فئة sup = "xref">30.

هنا ، نصف إجراءات شرب الكحول في القفص المنزلي باستخدام نهج قياسي بالإضافة إلى الطرق التي تتيح اكتشاف اللعق (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1). نقدم أيضا طرقا لبناء وتنفيذ LIQ HDR - وهو تكيف ل LIQ HD30 للاستخدام في الفئران التي تتضمن تعديلات على الأجهزة لاستيعاب أحجام أكبر من الأقفاص وحامل زجاجة مطبوع ثلاثي الأبعاد معاد تصميمه متوافق مع الزجاجات القياسية الجاهزة. توفر هذه الأساليب للباحثين المرونة لاستخدام نهج قياسي أو مجهز بمقياس المقياس اعتمادا على مواردهم التجريبية واحتياجات جمع البيانات.

فيما يلي وصف للمواد المطلوبة وإرشادات خطوة بخطوة لالتقاط الشرب في القفص المنزلي باستخدام إجراء الشرب المكون من زجاجتين للوصول المتقطع المقتبس من Simms et al.7. في هذا الإجراء ، يتم تزويد الفئران بإمكانية الوصول على 24 ساعة إلى زجاجتين للشرب 7 أيام في الأسبوع. في أيام الاثنين والأربعاء والجمعة (MWF) ، تتلقى الفئران زجاجة واحدة تحتوي على الماء (H2O) وزجاجة أخرى تحتوي على الإيثانول (EtOH). تتم إزالة هذه الزجاجات أيام الثلاثاء والخميس والسبت (TRS) واستبدالها بزجاجتين من الماء. تشرب الفئران من نفس زجاجتي الماء يومي السبت والأحد. لاحظ أنه يمكن تعديل هذه الطرق بسهولة لجداول بديلة للوصول إلى الإيثانول (على سبيل المثال ، مستمر ، بنهم ، إلخ) إذا رغبت في ذلك. يتم توفير تعليمات منفصلة للأساليب القياسية والمجهزة بمقياس الليكومتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

جُمعت جميع البيانات التمثيلية باستخدام جرذان Long-Evans بالغة ومسكنة بشكل فردي، وذلك بعد الحصول على موافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية بجامعة إلينوي شيكاغو ووفقاً لإرشادات المعاهد الوطنية للصحة (NIH) لرعاية واستخدام حيوانات المختبر. يُعد الإسكان الفردي ضرورياً لمراقبة استهلاك السوائل بدقة لكل حيوان. كانت جرذان Long-Evans البالغة من الذكور (n = 38) والإناث (n = 22) في المرحلة العمرية P50-80 عند وصولها، وسُمح لها بالتكيف مع مكان التربية لمدة أسبوع واحد قبل بدء التجربة. توفرت للجرذان تغذية ad libitum على العلف القياسي (Teklad 7912, Envigo) والمياه ما لم يُذكر خلاف ذلك.

1. التحضير قبل التجربة

  1. ضع ملصق H على زجاجات الشرب2أو EtOH. ثم، يتم وضع علامة تعريف فريدة لكل جرذ H12وواحدة من زجاجات EtOH لـ MWF واثنتان من H2زجاجات لـ TRS.
    ملاحظة: يمكن اختيارياً استخدام شريط لاصق بلون مختلف لتمييز H2زجاجات O وEtOH للمساعدة في تجنب الأخطاء المحتملة أثناء تغيير الزجاجات.
  2. املأ H2تُملأ الزجاجات بمياه الشرب قبل يوم واحد من تاريخ بدء التجربة. ويُحضّر محلول الإيثانول (EtOH) عن طريق خلط الإيثانول بتركيز 190 درجة مع مياه الشرب (20% حجماً/حجماً) قبل يوم واحد من تاريخ بدء التجربة.
    تنبيه: من الضروري استخدام الإيثانول (EtOH) غير المسوّغ، لأن الإيثانول المسوّغ مادة سامة.
  3. قم بتجهيز قفص فارغ على نفس الرف الذي توجد عليه الجرذان المشاركة في التجربة. سيُستخدم هذا القفص لحساب كمية الطعام المنسكب.
  4. جهز الأقفاص بنظام LIQ HDR في حال استخدامه (راجع الخطوة 3، الشكل 2, الشكل 3, الشكل 4, الشكل 5, الشكل 6، و الشكل التكميلي 1).
  5. حدد الوقت الدقيق من اليوم لتغيير الزجاجات قبل بدء الدراسة. يجب استبدال الزجاجات في الوقت نفسه من كل يوم من أجل الحصول على قياس دقيق لمعدل الاستهلاك خلال 24 ساعة.
    ملاحظة: أظهرت الأبحاث السابقة أن القوارض تظهر أعلى درجة من الاستهلاك في وقت مبكر بعد بدء الدورة المظلمة.10,31لذلك، ومن أجل رصد كمية التناول خلال هذه الفترة عالية النشاط (راجع الخطوة 2.3.1 لرصد الشرب الشره)، يُوصى بتغيير الزجاجات بعد 30-60 دقيقة من إطفاء الأنوار. استخدم مصابيح حمراء أثناء تغيير الزجاجات للسماح بالرؤية دون تعطيل دورة الضوء والظلام.

2. الإجراءات والصيانة اليومية

  1. في اليوم الأول من التجربة، قم بما يلي:
    1. أزل زجاجات المياه القياسية من الأقفاص.
    2. اختياري: غالبًا ما تقوم الجرذان بهز الجزء العلوي من القفص أثناء البحث عن الطعام، مما قد يؤدي إلى انسكاب لا يمكن تصحيحه بواسطة قفص الانسكاب الفارغ. يمكن أن يخفف استخدام أكواب الطعام داخل القفص من هذه المشكلة. في حالة الاستخدام، أزل الطعام من الجزء العلوي للقفص الآن، وأضف كوب طعام داخل القفص، واملأه بالعلف. تأكد من أن مساحة الأرضية المخصصة للجرذ لا تزال تفي بالإرشادات المؤسسية بناءً على حجم قفص الجرذ وحجم كوب الطعام.
    3. أبلغ موظفي الرعاية والتربية، حسب الاقتضاء، بأن أفراد البحث سيوفرون الطعام والماء طوال فترة التجربة.
    4. يمكن أن تؤدي تغييرات الأقفاص إلى تعطيل عملية جمع البيانات. قم بإجراء تغييرات الأقفاص بالتزامن مع قياسات وزن الجسم. يجب على الباحثين الذين يختارون القيام بذلك إبلاغ موظفي الرعاية والتربية لديهم وفقًا لذلك.
  2. في الأيام التالية، اتبع الإجراءات الموضحة أدناه.
    ملاحظة: تذكر أن أي حركة للأقفاص والزجاجات قد تؤدي إلى حدوث انسكاب. لذلك، من المهم توخي الرفق في الحركات واستخدام نفس طرق تركيب وإزالة الزجاجات من قفص الانسكاب كما يتم استخدامها مع أقفاص الجرذان.
    1. ادخل إلى الغرفة قبل وقت تغيير الزجاجات، مع ضمان توفر وقت كافٍ لتنفيذ الخطوات المذكورة أدناه، وضع زجاجات جديدة على الأقفاص في وقت بدء الجلسة المناسب.
    2. أزل الأغطية المرشحة (filter tops) من الأقفاص. إذا كان اليوم من أيام MWF، انتقل إلى الخطوة 2.2.3. وإذا كان من أيام TRS، انتقل إلى الخطوة 2.2.4.
    3. في أيام الاثنين والأربعاء والجمعة (MWF)، أزل زجاجات TRS من أعلى الأقفاص. قم بوزن زجاجات MWF (زجاجة واحدة EtOH وزجاجة واحدة H2O). سجل الوزن الابتدائي للزجاجة لجلسة الشرب لهذا اليوم. وفر طعامًا إضافيًا في الجزء العلوي من القفص أو في أكواب الطعام إذا لزم الأمر. في وقت بدء الجلسة المحدد، ضع الزجاجات على الجزء العلوي من قفص كل جرذ بحيث يكون الشريط موجهًا للأعلى حتى لا تقوم الجرذان بمضغ ملصق الزجاجة.
      ملاحظة: عادةً لا يتم تسجيل أو الإبلاغ عن استهلاك المياه في أيام TRS، ولكن يمكن للباحثين اختيارياً جمع هذه البيانات عن طريق الحصول على أوزان الزجاجات عند التركيب والإزالة كما هو موضح أدناه في الخطوة 2.2.3 والخطوة 2.2.4 إذا رغبوا في ذلك. يجب تبديل جانب زجاجة EtOH بعد كل جلسة شرب لتجنب تطور تفضيل جانبي محتمل، والذي قد يؤدي عن غير قصد إلى تحريف بيانات الاستهلاك.
      1. اختياري: أظهرت أعمال سابقة أن العديد من الجرذان تظهر شرباً شرهًا (binge-like drinking) عند بداية جلسة الشرب8,32,33. يقوم معظم الباحثين الذين يرصدون الشرب الشره خلال هذا الوقت بتسجيل كمية التناول خلال أول 30-60 دقيقة من جلسة الشرب. للحصول على بيانات التناول خلال نوبة الشرب الشره المحتملة هذه، اتبع الخطوات الموضحة أدناه.
      2. اضبط مؤقتًا بعد تركيب الزجاجات في القفص الأخير. اترك الغرفة دون إزعاج خلال الفترة المحددة بالمؤقت.
      3. أعد الدخول إلى الغرفة عند انتهاء المؤقت. أزل زجاجات EtOH وH2O وسجل أوزان الزجاجات. أعد زجاجات EtOH وH2O إلى الأقفاص.
        ملاحظة: هذه الخطوة غير مطلوبة لرصد نوبات الشرب الشره عند استخدام نظام مجهز للكشف عن اللعق (lick detection).
    4. في أيام الثلاثاء والخميس والسبت (TRS)، أزل زجاجات MWF من الأقفاص في وقت انتهاء الجلسة المحدد، والذي يوافق بعد 24 h من وقت البدء. زن كل زجاجة وسجل الوزن النهائي للزجاجة لجلسة شرب MWF. احصل على وزن جسم كل جرذ وسجله. إذا لزم الأمر، وفر طعامًا إضافيًا في الجزء العلوي من القفص أو في أكواب الطعام. ضع زجاجات H2O الخاصة بـ TRS على الجزء العلوي من قفص كل جرذ بحيث يكون الشريط موجهًا للأعلى حتى لا تقوم الجرذان بمضغ ملصق الزجاجة.
    5. أعد الأغطية المرشحة إلى الأقفاص وغادر غرفة الحيوانات.
      ملاحظة: اختيارياً، قم بتغطية مصاصات زجاجة EtOH لمنع التبخر. إذا كان أفراد البحث هم من يقومون بتغيير الأقفاص، فخصص يومًا واحدًا أسبوعيًا خلال مهام TRS لأداء هذه المهمة. ضع كل جرذ في قفص نظيف بعد الحصول على وزن الجسم.
  3. اغسل الزجاجات وجدد السوائل على أساس أسبوعي أو كل أسبوعين بانتظام وفقًا لإجراءات الرعاية والتربية الحيوانية في المؤسسة. احرص على أداء هذه المهام بطريقة لا تقاطع جلسات الشرب. على سبيل المثال، يمكن غسل زجاجات H2O الخاصة بـ TRS وإعادة ملئها بعد إزالتها في أيام MWF. وبالمثل، يمكن غسل زجاجات H2O وEtOH الخاصة بـ MWF وإعادة ملئها بعد إزالتها في أيام TRS.

3. الكشف عن اللعق خلال تجارب الاختيار بين زجاجتين

ملاحظة: يمكن للباحثين المهتمين بالتقاط بيانات شرب عالية الدقة تعديل الإجراء المذكور أعلاه من خلال إضافة قدرات الكشف عن اللعق إلى الزجاجات. LIQ HD30 هو نظام منخفض التكلفة يعتمد على مبدأ "افعلها بنفسك" (DIY)، ويسمح بهذا النوع من جمع البيانات في الفئران. تصف الإجراءات الموضحة أدناه التعديلات اللازمة لتكييف نظام LIQ HD لاستخدامه في الجرذان (والذي يُشار إليه باسم LIQ HDR). انظر جدول المواد لقائمة بجميع القطع المباعة تجارياً والمطبوعة ثلاثية الأبعاد حسب الطلب واللازمة لبناء نظام واحد للكشف عن اللعق، والذي يمكنه تسجيل بيانات اختيار زجاجتين لما يصل إلى 18 جرذًا. يمكن العثور على ملفات .stl للطباعة ثلاثية الأبعاد والتعليمات على الموقع الإلكتروني للمؤلف (www.ejgloverlab.com/3dprints).

  1. إعداد وحدات الاستشعار السعوية
    ملاحظة: يتكون كل نظام LIQ HDR من ثلاث وحدات استشعار سعوية، تعمل معاً على التقاط بيانات اللعق من 36 زجاجة بالتوازي، بما يقابل 18 جرذاً مُسكناً بشكل فردي. وتتكون كل وحدة استشعار من مدخل تفاضلي واحد I2لوحة توزيع اتصالات C ولوحة مستشعر سعوي ذات 12 مفتاحاً، والتي ستتصل بأجهزة قياس اللعق (lickometers) من ستة أقفاص منفصلة عبر ستة أزواج من الكابلات ذات السِنّين، والمكودة بالألوان لكل جهاز قياس لعق (الشكل 2أ).
    1. اجمع المواد المطلوبة لبناء جميع وحدات المستشعر السعوية الثلاث، كما هو موضح في الشكل 2ب، بالإضافة إلى أدوات اللحام المطلوبة.
    2. لبدء بناء وحدة الاستشعار A، قم بتغطية كابل موصل أنثوي ذي سنين بأنبوب انكماش حراري أحمر بطول 7 بوصات، ثم أدخل نهايتي السلكين الأحمر والأسود في السن رقم 0 والرقم 1 على لوحة الاستشعار (الشكل 2ج-1)، ولحمها في مكانها (الشكل 2ج-2). تأكد من وضع الكابل في مقدمة لوحة المستشعر كما هو موضح، وذلك من أجل ترتيب الأقفاص بترتيب رقمي من اليسار إلى اليمين في منشأة تربية الحيوانات (vivarium)، لتجنب تداخل الكابلات الذي قد يؤدي إلى تعطيل التسجيل (راجع الخطوة 3.6 و الشكل 6).
    3. قم بتغطية خمسة كابلات أخرى بأنابيب انكماش حراري ذات ألوان مميزة، ثم قم بلحامها بالدبابيس من رقم 2 إلى 11 كما هو موضح (الشكل 2ج-3تأكد من لحام جميع الأسلاك الحمراء في الدبابيس ذات الأرقام الزوجية، والتي ستتصل بجميع الزجاجات الموجودة على الجانب الأيسر، ولحام جميع الأسلاك السوداء في الدبابيس ذات الأرقام الفردية، والتي ستتصل بجميع الزجاجات الموجودة على الجانب الأيمن.
    4. قم بتغطية وصلات اللحام بالغراء الساخن من جميع الجوانب للحماية (الشكل 2ج-4). قم بتمييز الموصلات بترتيب رقمي، مع تخصيص معرف فريد لكل مقياس لعق اللسان (الشكل 2ج-4).
    5. لتجميع وحدة المستشعر A، قم بتوصيل لوحة المستشعر A بنقطة نهاية توزيع الاتصالات (communication breakout EndPoint) باستخدام كابل رباعي السنون بطول 50 مم، ثم قم بتوصيل نقطة النهاية بمخرج 3.3 فولت الخاص بمحول المستوى من 5 فولت إلى 3 فولت باستخدام كابل رباعي السنون بطول 100 مم (الشكل 2D-1). وعلى الرغم من وجود موصلين متطابقين بأربعة دبابيس في كل من لوحة المستشعر ولوحة توصيل الاتصالات، إلا أنه من المهم التأكد من أن التوصيلات مطابقة تماماً لما هو موضح (الشكل 2د-1 و الشكل 2F) من أجل استخدام أغلفة المستشعرات المطبوعة ثلاثية الأبعاد وإعدادات التربيوم المقترحة (انظر الخطوة 3.6 و الشكل 6). ثبّت وحدة المستشعر A داخل الغطاء المطبوع ثلاثي الأبعاد (الشكل 2د-2). أغلق الغطاء برفق، مع الحرص على عدم سحق كابل مُزيّح المستوى (الشكل 2D-3).
    6. تعديل الـ I2عناوين C للوحات المستشعرات B وC عن طريق لحام سلك وصلة (jumper wire) من دبوس ADDR إلى دبوس 3Vo أو SDA كما هو موضح (الشكل 2E).
    7. قم بلحم ستة كابلات موصلات أنثوية مرمزة بالألوان بلوحات الاستشعار B وC، باستخدام نفس الترتيب المستخدم في اللوحة A. ضع علامة على كل موصل برقم تعريف مقياس اللعق (lickometer ID) المقابل. صِل اللوحة B بنقطة تفرع الاتصالات MidPoint واللوحة C بنقطة نهاية EndPoint باستخدام كابلات ذات 4 دبابيس وطول 50 مم (الشكل 2F).
    8. ضع وحدتي الاستشعار B وC في أغلفتهما المطبوعة ثلاثية الأبعاد. صِل وحدات الاستشعار الثلاث معاً على التوالي باستخدام كابلات إيثرنت (Ethernet) لإتمام إعداد المستشعرات (الشكل 2G).
  2. إعداد واجهة المتحكم الدقيق
    ملاحظة: واجهة المتحكم الدقيق LIQ HDR (الشكل التكميلي 1A) هو نفس الإجراء الموصوف لـ LIQ HD30 مع إجراء تعديلات طفيفة جداً. توفر الإجراءات الموضحة أدناه نظرة عامة شاملة على الخطوات اللازمة لإعداد الواجهة، مع التعديلات الموضحة في الخطوتين 3.2.6 و3.2.8. ويُرجى من الباحثين الرجوع إلى البروتوكول الأصلي والدرس التعليمي المرئي المتاح على صفحة المؤلف في GitHub للحصول على تعليمات أكثر تفصيلاً لكل خطوة.30.
    1. قم بتجميع المواد وأدوات اللحام المطلوبة لبناء واجهة المتحكم الدقيق (الشكل التكميلي 1ب). على الجانب الخلفي من واقي اللمس (الشكل التكميلي 1C-1)، وقم بعمل وصلة لحام (solder jumper) عبر منصات لحام الإضاءة الخلفية (back lite solder pads) (الشكل التكميلي 1C-2).
    2. على الجانب الخلفي لدرع تسجيل البيانات (data logging shield)، اقطع مسار لوحة الوصلة (jumper pad trace) الخاصة بدبوس اختيار الشريحة (CS pin) (الشكل التكميلي 1D-1قم بتلحيم سلك توصيل قصير على الجانب الأمامي من مسجل البيانات، ممتداً من دبوس CS إلى الدبوس رقم 7 (الشكل التكميلي 1D-2).
    3. لتثبيت رؤوس تكديس الدرع، قم أولاً بتكديسها في الجزء الخلفي من درع شاشة اللمس (الشكل التكميلي 1E-1قم بتثبيت مسجل البيانات فوق شاشة اللمس، واستخدم شريطاً لاصقاً لتثبيتهما، ثم قم بلحام جميع دبابيس التوصيل (header pins) بمسجل البيانات.الشكل التكميلي 1E-2). ثم قم بإزالة شاشة اللمس.
    4. قم بتركيب موصل الرأس المتبقي (2 × 3) فوق المتحكم الدقيق (الشكل التكميلي 1F-1)، ثم قم بتركيب مسجل البيانات فوق المتحكم الدقيق قبل لحام دبابيس الرأس في مكانها (الشكل التكميلي 1F-2).
    5. أدخل البطارية القرصية في مسجل البيانات (الشكل التكميلي 1G-1). ثبّت شاشة اللمس فوق مسجل البيانات (الشكل التكميلي 1G-1). أدخل بطاقة microSD مع المحول الخاص بها في مسجل البيانات (الشكل التكميلي 1G-2).
    6. لصنع سلك تأريض إضافي، اقطع وصلة ذكر واحدة من سلك توصيل (jumper wire) ثم قم بتعرية طرفه لمسافة تبلغ حوالي 1/4 بوصة (الشكل التكميلي 1H-1قم بلحم قطعة من سلك ذو قلب صلب مقشر بسلك توصيل، ثم غطِّ نقطة اللحام بأنبوب انكماش حراري.الشكل التكميلي 1H-2).
    7. قم بتوصيل أسلاك الوصل رباعية الدبابيس وسلك التأريض الإضافي بالمتحكم الدقيق (الأسود - GND، الأحمر - 5V، الأصفر - الدبوس رقم 21، الأزرق - الدبوس رقم 20، الشكل التكميلي 1I-1). قم بتثبيت الوصلات باستخدام الغراء الساخن (الشكل التكميلي 1I-2). واختياريًا، قم بتغليف الأسلاك القفزيّة (jumper wires) بأنابيب انكماش حراري (الشكل الإضافي 1I-2).
    8. ضع واجهة المتحكم الدقيق المجمعة بالكامل في العلبة المطبوعة ثلاثية الأبعاد، مع تمرير أسلاك الوصل ذات الـ 4 دبابيس وسلك التأريض عبر الفتحة الموجودة في الأعلى (الشكل التكميلي 1J).
    9. اتبع البروتوكول الأصلي لتثبيت برنامج واجهة المتحكم الدقيق30.
  3. بناء أجهزة قياس اللعق LIQ HDR
    ملاحظة: صُممت القطعة المطبوعة ثلاثية الأبعاد والمخصصة لحمل الزجاجات للاستخدام مع زجاجة شرب قياسية للقوارض بقطر أنبوب شرب يبلغ 8 مم (انظر جدول المواد، الشكل 3أ). ويمكن تكييف حامل الزجاجات هذا بسهولة لاستخدامه مع زجاجات وأنابيب سحب (sipper tubes) مماثلة مع إجراء تعديلات طفيفة أو بدون تعديلات على الإطلاق.
    1. قم بتجميع المواد والمطبوعات ثلاثية الأبعاد وأدوات اللحام المطلوبة لبناء مقياس لعق واحد كما هو موضح في الشكل 3Bعلماً بأن كل نظام LIQ HDR يستوعب 18 مقياس لعق كحد أقصى لـ 36 زجاجة.
    2. لتمديد كبل الموصل الذكري، قم بتعرية كلا طرفيه بطول يبلغ حوالي 1/4 بوصة، وكذلك تعرية الأسلاك السوداء والحمراء الخاصة بالتمديد (الشكل 3ج-1).
    3. قم بلحام أسلاك التمديد بكابل الموصل (الشكل 3ج-2) وتغطية وصلات اللحام بأنابيب الانكماش الحراري (الشكل 3ج-3). قم بتغطية كابل الموصل الذكر بأنبوب انكماش حراري يتطابق لونه مع كابل الموصل الأنثى المقابل له في وحدة الاستشعار (الشكل 3ج-4).
    4. لكي يتوافق ذلك مع توصيلات لوحة المستشعر (الشكل 2)، ثم مرر السلكين الأحمر والأسود عبر ممر الكابل الداخلي الأيسر والأيمن لحامل الزجاجة، على التوالي (الشكل 3-د-1).
    5. قم بلحم كل سلك عند الطرف النهائي تماماً لـ 1 ¾ شريط نحاسي موصل بقياس بوصة (الشكل 3D-2) وطي أشرطة النحاس من المنتصف (الشكل 3D-3).
    6. قم بنزع الشريط النحاسي واستخدم ملقطاً لتوجيهه بعناية داخل حامل الماصة (الشكل 3E-1) قبل لصقها بإحكام على الجدران الداخلية لحامل الماصة (الشكل 3E-2). تأكد من أن جانب اللحام لشريط النحاس ملتصق بالجدار الأقرب إلى الخط المتوسط لحامل الزجاجة، كما هو موضح (الشكل 3E-2). ادفع أنبوب السحب عبر الدعامة لضغط الشريط بإحكام مقابل الجدار وتهيئة الدعامة.
    7. لتعزيز جانب اللحام في الشريط النحاسي، والذي يكون أقل التصاقاً ويميل إلى التقشر، ضع كمية صغيرة من الغراء الساخن على وصلة اللحام (الشكل 3E-3). قم بدهن الغراء لتغطية كل من الشريط النحاسي وأي جزء مكشوف مجاور من المطبوعة ثلاثية الأبعاد (الشكل 3E-4).
    8. مرر الكابل عبر الممر الداخلي لواقي الكابلات (الشكل 3-و). تأكد من اختيار واقي الكابل المناسب (المواجه لليسار أو اليمين) لكل مقياس لعق (lickometer) من أجل استخدام إعدادات المربى (vivarium) المقترحة (انظر الخطوة 3.6 و الشكل 6)."ملاحظة: تتطلب أجهزة قياس اللعق (Lickometers) رقم 5-6، و11-12، و17-18، والتي تظهر كابلاتها باللون الأزرق أو الأرجواني في الإعداد الحالي، واقياً للكابلات يتجه نحو اليسار (الشكل 4-د-1)، بينما تتطلب جميع أجهزة قياس اللعق الأخرى واقياً للكابل يتجه نحو اليمين (الشكل 4D-2).
    9. لتثبيت مشبك الكابل، قم أولاً بتركيب سلك واحد في المجرى الموجود في أحد نصفي مشبك الكابل (الشكل 3G-1)، ثم ضع النصف الآخر فوق السلك الثاني، ثم أغلق النصفين بإحكام باستخدام الصامولة (الشكل 3G-2).
    10. ضع علامة على الموصل الذكري برقم تعريف مقياس اللعق (lickometer) المقابل (الشكل 3H). كرر هذه الخطوات حتى يتم بناء جميع أجهزة قياس اللعق (lickometers) الـ 18.
  4. تركيب أجهزة قياس اللعق LIQ HDR
    ملاحظة: صُمم LIQ HDR للتركيب على قفص جرذان قياسي من نوع "صندوق الأحذية" (shoebox) ذي سقف سلكي معدني (الشكل 4أ-1).
    1. حدد زوجين من القضبان بمسافة تبلغ حوالي 75 ملم من المركز إلى المركز على الجزء العلوي من القفص السلكي لاستيعاب حامل الزجاجة. استخدم كماشة لفتح القضبان المعدنية قليلاً حول فتحات أنابيب السحب. اعزل هذه القضبان بشريط لاصق كهربائي لمنع التلامس المعدني بين أنابيب السحب والجزء العلوي من القفص (الشكل 4-أ-2).
      ملاحظة: على الرغم من أن الشريط اللاصق الكهربائي غير متاح للجرذان، وبالتالي غير معرض للقرض، إلا أننا نوصي بالتخلص منه في نهاية الدراسة وعدم إعادة استخدامه بين الدراسات.
    2. ثبّت مقياس اللعق واللوح الأكريليكي الليزري بسمك 1/8 بوصة في الجزء العلوي من القفص باستخدام مجموعتين من البراغي والصواميل من مقاس M5 (الشكل 4Bتأكد من محاذاة فتحات الماصات في جهاز قياس اللعق (lickometer) واللوح الأكريليكي، ومن عدم ملامسة الماصات لأي جزء من سقف القفص.
    3. ثبّت مشبك الكابل بالقضيب الخارجي (بقطر 4 مم تقريباً) من الجزء العلوي للقفص السلكي (الشكل 4ج). قم بتعديل مشبك الكابل إذا لزم الأمر للتأكد من استقرار الجزء العلوي من القفص بإحكام على الجزء السفلي منه، وعدم تعرض الكابل للشد أو الثني تحت ضغط مفرط. تأكد من استخدام واقي الكابل الصحيح لكل مقياس لعق (lickometer) (الشكل 4-د (وانظر الخطوة 3.8.8).
    4. اضبط أنابيب السحب حسب الضرورة بحيث يبرز من أنبوب السحب حوالي 2 سم فقط من الغطاء (الشكل 4E-1). لتركيب الزجاجات، أدخل أنبوب السحب عبر دعامة السحب الخاصة بحامل الزجاجات حتى يتوقف (الشكل 4E-2). يجب ألا يبرز من اللوح الأكريليكي سوى الطرف النهائي لأنبوب السحب (الشكل 4E-3). ومن الضروري ألا يكون أي جزء آخر من أنبوب الرشف مكشوفاً، وذلك لتجنب حدوث لعقات إيجابية كاذبة ناتجة عن سلوكيات غير استهلاكية، مثل لمس الجرذ لأنبوب الرشف أو اللعب به. كما يجب أن يكون غطاء المرشح قادراً على الاستقرار بإحكام فوق الجزء العلوي من القفص السلكي ومشبك الكابل دون أن يتسبب في تحريك الكابل نفسه (الشكل 4F).
      ملاحظة: يمكن استخدام لوح أكريليك أكثر سمكاً أو مجموعة من عدة ألواح بسمك 1/8 بوصة لإغلاق أنابيب الشرب ذات الأطوال الأكبر بالكامل في التجارب التي تتطلب تمدد أنابيب الشرب لمسافة أبعد داخل القفص، كما هو الحال عند قياس شرب الجرذان الصغيرة التي قد تجد صعوبة في الوصول إلى أنبوب شرب قصير.
  5. تركيب واستخدام سدادات أنبوب الشفط (sipper blockers)
    ​ملاحظة: سدادة أنبوب السحب (الشكل 5-أصُمم لتقييد وصول الجرذ إلى المشرب أثناء تغيير الزجاجات، ولضمان معايرة دقيقة لمقياس اللعق (lickometer) عند بداية كل جلسة شرب.
    1. اجمع الأجزاء المطبوعة ثلاثية الأبعاد ومسمار M5 وصامولة وحلقة مخصصة لسدادة واحدة للماصة كما هو موضح في الشكل 5B.
    2. أدخل ترس جهاز SIPPER (SIPPER_Gear) في قاعدة جهاز SIPPER (SIPPER_Base) (الشكل 5ج-1). تأكد من توجيه SIPPER_Gear تماماً كما هو موضح في الصورة المصغرة للتجسيم ثلاثي الأبعاد. أدخل SIPPER_Worm في الفتحة الموجودة في الجزء العلوي من SIPPER_Base. أدر البرغي باتجاه عقارب الساعة أثناء الإدخال حتى يصبح الرأس بمستوى القاعدة (الشكل 5 ج-2).
    3. قم بربط صامولة SIPPER_Nut بنهاية الدودة (Worm) من أسفل القاعدة (Base) (الشكل 5 ج-3). استخدم ملقطاً لشد الصامولة أثناء تدوير قرص الدودة. أدخل الرقاب المستديرة والضيقة لقطع SIPPER_Blockers في فتحات الترس (الشكل 5C-4).
    4. قم بتركيب سدادة أداة السحب المجمعة على الجزء العلوي من القفص باستخدام مجموعة براغي M5 (الشكل 5دتأكد من محاذاة كلا سدادي أنبوب السحب (sipper blockers) مع فتحات أنبوب السحب.
    5. لمنع الوصول إلى أنابيب السحب، أدر قرص الدودة في اتجاه عقارب الساعة لخفض السدادات حتى تغطي فتحات أنابيب السحب بالكامل (الشكل 5E).
    6. لتوفير إمكانية الوصول إلى نقاط الشرب، أدر القرص عكس اتجاه عقارب الساعة حتى تصبح الحواجز في وضع عمودي متعامد مع سقف القفص (الشكل 5F-1). اسحب كل ذراع من أذرع الحواجز يدويًا إلى الأعلى حتى تصبح الرؤوس أسفل الجزء العلوي من القفص السلكي مباشرة. قم بتدوير الحواجز 90° بحيث تكون الرؤوس موازية للقضبان المعدنية الموجودة في الجزء العلوي من القفص، وتكون الأذرع مثبتة في مكانها (الشكل 5F-2استمر في تدوير القرص عكس اتجاه عقارب الساعة حتى يرتفع كلا الحاجزين فوق الجزء العلوي من القفص (الشكل 5F-3) وتكون أنابيب الشرب متاحة بالكامل (الشكل 5F-4).
  6. استخدام نظام LIQ HDR في منشأة تربية الحيوانات (vivarium)
    ملاحظة: تم تحسين إعداد هذا الحيوان المختبري (vivarium) لرصد خيار الشرب من زجاجتين باستخدام واجهة متحكم دقيق واحدة متصلة بـ 18 قفصاً قياسياً للجرذان من نوع "صندوق الأحذية" (shoebox). تم تثبيت جميع المكونات الإلكترونية، بما في ذلك واجهة المتحكم الدقيق ووحدات الاستشعار والكابلات المختلفة، على رفوف سلكية معدنية مثبتة على الحائط تحمل الأقفاص (الشكل 6أ). قد تكون بعض التعديلات مطلوبة للتكيف مع مرافق تربية الحيوانات واحتياجات المستخدم.
    1. ثبّت كل وحدة استشعار على أرفف الحيواني (vivarium) باستخدام برغي التثبيت المطبوع بتقنية ثلاثية الأبعاد والمصمم خصيصاً لهذا الغرض (الشكل 6بتأكد من تركيب كل وحدة استشعار مباشرة أسفل القفص الذي يحتوي على مقياس لعق (lickometer) أصفر اللون، وذلك لتجنب أي شد غير ضروري في الكابلات.الشكل 6أ).
    2. قم بترتيب وتثبيت كل كبل توصيل أنثوي مع التأكد من عدم تداخل الكبلات مع بعضها البعض أو انثنائها بشكل مفرط عند أطراف اللحام، مما قد يؤدي إلى ضعف في الكشف عن التسرب (الشكل 6Bوإذا كانت الرفوف المستخدمة من القضبان المعدنية، فيمكن تحقيق ذلك بسهولة عن طريق ربط كابلات التوصيل بقضبان منفصلة على الرف باستخدام أربطة الكابلات كما هو موضح.
    3. ثبّت واجهة المتحكم الدقيق بجوار وحدة الاستشعار A باستخدام برغي التثبيت نفسه المطبوع ثلاثياً، وقُم بتوصيل موصلها المكون من 4 دبابيس بمدخل 5 فولت الخاص بمحول المستوى من 5 فولت إلى 3 فولت المتصل بوحدة الاستشعار A (الشكل 6ج).
    4. استخدم شريطاً لاصقاً عازلاً لتثبيت سلك التأريض الإضافي بمصدر تأريض، مثل الأرفف المعدنية (الشكل 6D).
    5. قم بترتيب كل قفص بناءً على لون ومعرّف مقياس اللعق (lickometer) المثبت وفقاً لـ الشكل 6أ تصوير لتقليل تداخل الكابلات والشد إلى أدنى حد.
    6. قم بتوصيل جميع كابلات موصلات مقياس اللعق (lickometer) الذكرية بإحكام بكابلات موصلات المستشعرات الأنثوية المطابقة (الشكل 6E). قم بتوصيل وحدة تزويد الطاقة لتشغيل واجهة المتحكم الدقيق (الشكل 6F).
    7. في صفحة واجهة المستخدم الرسومية (GUI) الرئيسية (الشكل 6G)، اضغط على رمز الضبط لفتح صفحة الإعدادات. يمكن للمستخدمين تغيير وقت تشغيل وإيقاف الإضاءة بناءً على جدول الحيوانة (vivarium) لضمان خفوت عرض الواجهة تلقائياً عند بدء دورة الظلام (الشكل 6H-1).
    8. صنبور تعديل إعدادات المستشعر (الشكل 6-H-1) لضبط عتبة اللمس (Touch Threshold) على 8 وعتبة التحرير (Release Threshold) على 2، وهي القيم التي وجدنا أنها تتيح الكشف الأكثر اتساقاً عن لعق الجرذان باستخدام الإعداد الحالي (الشكل 6H-2). ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن المستخدمين قد يحتاجون إلى تجربة إعدادات مختلفة في حال إدخال أي تعديلات على النظام الحالي.
    9. إلغاء تحديد المعايرة التلقائية إذا تم جمع البيانات على مدار فترة زمنية تبلغ 24 ساعة أو أقل (الشكل 6H-2).

4. الإجراءات اليومية لاختيار الشرب من زجاجتين في القفص المنزلي باستخدام الكشف عن اللعق

  1. اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 2 لإجراءات الاختيار القياسية بين زجاجتين مع التعديلات التالية.
  2. في أيام الاثنين والأربعاء والجمعة، وقبل وضع زجاجات MWF، استخدم سدادات الفوهات لتغطية فتحات الشرب في جميع الأقفاص (راجع الخطوة 3.5.5 والشكل 5E).
  3. قبل التسجيل، اختر الجانب التجريبي (Experimental Side) الصحيح في صفحة واجهة المستخدم الرسومية الرئيسية، والذي سيكون جانب زجاجة EtOH لذلك اليوم (الشكل 6G).
  4. بعد تركيب جميع زجاجات MWF، اضغط على ابدأ! (!START) في الصفحة الرئيسية (الشكل 6G) لبدء معايرة المستشعرات، وخلال هذه العملية يُنصح المستخدمون بالابتعاد عن النظام والتأكد من أن الجرذان لا تلعق الفوهات (الشكل 6I-1). تستغرق المعايرة بضع ثوانٍ للاكتمال، وبعد ذلك ينتقل النظام إلى صفحة التسجيل الرئيسية التي تعرض الأعداد التراكمية للعقّات على كل زجاجة لكل مقياس لعق (الشكل 6I-2).
  5. ارفع جميع سدادات الفوهات فوق الجزء العلوي من القفص للسماح بالوصول إلى الفوهات (راجع الخطوة 3.5.6 والشكل 5F)، وأعد جميع أغطية المرشحات برفق كما هو موضح (راجع الخطوة 3.4.4 والشكل 4F).
  6. اضغط على تحديث (Refresh) لتحديث أعداد العقّات على الشاشة، والتي لن تُحدث تلقائيًا في الوقت الفعلي (الشكل 6I-2).
  7. في أيام الثلاثاء والخميس والسبت، اضغط على حفظ وخروج (Save & Quit) لإيقاف التسجيل والعودة إلى الصفحة الرئيسية (الشكل 6I-2) قبل إزالة زجاجات MWF.
  8. لإزالة بطاقة SD لنقل البيانات، اضغط على إخراج SD (Eject SD) قبل فصل بطاقة SD (الشكل 6G). أدخل بطاقة SD في أي جهاز كمبيوتر وقم بنسخ/لصق ملف البيانات بصيغة .csv المسمى بتاريخ تفعيل الزجاجة إلى ذلك الكمبيوتر (الشكل 6K). لإعادة تركيب بطاقة SD للتسجيل التالي، أدخل البطاقة في الواجهة واضغط على تركيب SD (Mount SD) (الشكل 6J).
    ملاحظة: نوصي بنسخ ملفات البيانات احتياطيًا يوميًا.
  9. يُنصح بقصر قياسات وزن الجسم على مرة واحدة في الأسبوع بما يتوافق مع نموذج الحيوان وبروتوكول استخدام الحيوانات، وتنفيذ هذه المهمة في اليوم المخصص لتغيير القفص من أجل تقليل الإزعاج غير الضروري لمقاييس اللعق والمستشعرات. افصل جميع كابلات مقياس اللعق الذكرية من كابلات المستشعرات الأنثوية المطابقة قبل نقل الأقفاص. بعد وزن كل جرذ، أعد الجرذ إلى قفص نظيف. انقل مقياس اللعق إلى الجزء العلوي من قفص جديد وأعد توصيل كل مقياس لعق بالمستشعر المقابل عند الضرورة.
  10. بالنسبة للتجارب التي تختبر تأثير تدخل معين (على سبيل المثال، حقن دواء) على تناول EtOH وبنية الشرب الدقيقة، حدد مواعيد هذه التدخلات قبل بدء جلسة الشرب كلما أمكن ذلك. في الحالات التي لا يكون فيها ذلك ممكنًا، يمكن للباحثين مقاطعة الكشف عن اللعق بالضغط على إيقاف مؤقت (Pause) (الشكل 6I-2) واستئناف التقاط البيانات بالضغط على استئناف (Resume) بعد اكتمال التدخل. نقترح جمع أوزان الزجاجات خلال كل توقف مؤقت في جلسة الشرب من أجل رصد التغيرات في تناول EtOH قبل التدخل وبعده، وكذلك لحساب أي انسكاب قد يحدث عند إزالة الجزء العلوي من القفص للوصول إلى الحيوان.
  11. في نهاية الدراسة، يجب تعقيم جميع المكونات الموجودة داخل القفص جيدًا قبل استخدامها مع حيوانات جديدة للحد من انتقال الملوثات بين الحيوانات. نوصي برش ومسح مقياس اللعق برفق بمحلول EtOH بتركيز 70%، مع التأكد من عدم إتلاف المكونات الكهربائية الداخلية. يمكن غسل سدادة الفوهة واللوح الأكريليكي بماء وصابون دافئ.

5. تحليل البيانات

  1. قبل تقييم المقاييس التابعة، قم بتصحيح بيانات الاستهلاك لتعويض الانسكاب الذي يحدث حتماً نتيجة تغيير الزجاجات يومياً. وللقيام بذلك، احسب متوسط التغير في وزن زجاجات EtOH وزجاجات H2O في قفص الانسكاب على مدار فترة الدراسة بأكملها.
  2. استبعد أي قيم تزيد عن انحرافين معياريين عن المتوسط لكل زجاجة. بعد استبعاد هذه القيم الشاذة، اطرح المتوسطات المحسوبة من التغيرات في وزن زجاجات EtOH وH2O التي تم الحصول عليها من الزجاجات الموجودة في أقفاص الحيوانات. ومن خلال طرح هذه القيمة، يمكن للباحثين التأكد من أن متوسط الفقد الناتج عن انسكاب محلول معين لا يدخل في مقاييس الاستهلاك. قد يؤدي طرح متوسط كمية الانسكاب إلى قيمة سالبة لبعض الحيوانات في بعض المناسبات؛ قم بتحويل هذه القيم إلى صفر وفسرها على أنها غياب تام للاستهلاك لهذا المحلول.
  3. تتمثل المقاييس التابعة الأساسية لتجارب شرب الاختيار بين زجاجتين في استهلاك EtOH (g/kg) والتفضيل (%). احسب الاستهلاك من التغير في وزن زجاجة EtOH (g) وقم بتوحيده وفقاً لوزن الجسم (kg) باتباع الخطوات التالية:
    1. حول التغير في وزن الزجاجة (g) إلى التغير في الحجم (mL) باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-1
      تبلغ كثافة الإيثانول النقي 0.789 g/mL. وبناءً عليه، فإن الكثافة المساهمة لـ 20% EtOH هي 0.1578 g/mL. ويزن H2O بمقدار 1 g/mL، لذا فإن الكثافة المساهمة لـ 80% H2O = 0.80 g/mL. وبالتالي، فإن كل mL من محلول 20% EtOH (v/v) يتكون من 0.1578 (EtOH) + 0.80 (H2O) = 0.9578 g/mL. وبناءً عليه، تكون المعادلة النهائية عند استخدام تركيز 20% (v/v) EtOH هي:
      figure-protocol-2
    2. احسب جرعة الإيثانول المستهلكة باستخدام المعادلة أدناه. استخدم أوزان الجسم التي تم الحصول عليها خلال نفس أسبوع بيانات الاستهلاك لحساب كمية الإيثانول المستهلكة بدلالة وزن جسم الحيوان.
      figure-protocol-3
    3. احسب التفضيل باستخدام المعادلة التالية:
      figure-protocol-4
  4. على غرار نظيره في الفئران30، يقوم نظام LIQ HDR برصد مجموعة متنوعة من متغيرات البنية الدقيقة للشرب، بما في ذلك مدة اللعق، وعدد فترات الشرب، ومدة الفترة، وعدد اللعقات في الفترة الواحدة، ومدة اللعق في الفترة الواحدة (الشكل 6K). وتُعرَّف فترة الشرب بأنها سلسلة من اللعقات تبدأ بـ 3 لعقات على الأقل يتم تنفيذها في أقل من 1 sec وتنتهي بعد مرور 3 sec دون لعقات إضافية. ويمكن بعد ذلك استخدام هذه المقاييس لحساب متوسط مدة اللعقة الفردية، ومتوسط مدة فترة الشرب الفردية، ومتوسط عدد اللعقات لكل فترة، ومتوسط تردد اللعق، والفاصل الزمني التقديري بين اللعقات، والفاصل الزمني التقديري بين فترات الشرب.
    ملاحظة: توفر واجهة المتحكم الدقيق بيانات البنية الدقيقة هذه بدقة زمنية قدرها 1-min في ملف .csv (الشكل 6K). ويمكن للباحثين استخدام تطبيق التحليل المرفق مع بروتوكول LIQ HD الأصلي30 أو منصة ما بعد المعالجة المفضلة لديهم لتجميع البيانات وتلخيصها وفقاً لاحتياجات البحث. وعادةً ما يتم تجميع بيانات البنية الدقيقة على مدار فترة 24 h كاملة لمقارنة متوسط الاختلافات على المستوى الكلي، أو في فترات زمنية تتراوح من 30 min إلى 1 h لفحص تغيرات نمط الشرب عبر دورة الضوء والظلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بيانات شرب الإيثانول من زجاجتين بطريقة الاختيار المتقطع القياسية داخل قفص السكن
باستخدام الإجراء القياسي (الشكل 7A)، يمكن للباحثين تسجيل كمية التناول على مدار 24 ساعة (الشكل 7B-دوكذلك الشرب الشبيه بالإفراط إذا جُمعت أوزان الزجاجات بعد وقت قصير من بدء جلسة الشرب (الشكل 7E-ف). وباحتساب استهلاك الإيثانول بالنسبة إلى استهلاك الماء، يمكن للباحثين أيضًا الحصول على بيانات التفضيل عند...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر البروتوكول الحالي إرشادات خطوة بخطوة لالتقاط بيانات شرب الإيثانول باستخدام إجراء قفص منزلي لاختيار زجاجتين للوصول المتقطع. يمكن تنفيذ هذه الطريقة بسهولة نسبية وبتكلفة قليلة أو معدومة أو حاجة إلى معدات بحث متخصصة. باستخدام الإجراءات المنصوص عليها هنا لإنشاء وتنفيذ LIQ HDR - وهو نظام للكشف عن اللعق للاستخدام في الفئران - يمكن للباحثين التقاط بيانات البنية المجهرية عالية الدقة للشرب بالإضافة إلى المقاييس القياسية للدخول والتفضيل.

يعد جدول الوصول المتقطع الموصوف في البروتوكول الحالي إجراء مست...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن جميع المؤلفين عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون جوزيف بيتوك وكاتي برزيبيز ، دكتوراه على المساعدة الفنية أثناء تطوير LIQ HDR. نشكر أيضا نيكولاس بيترسن وماري دويل ، دكتوراه على العديد من المحادثات المفيدة أثناء تطوير LIQ HDR. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني لتعاطي الكحول وإدمان الكحول في المعاهد الوطنية للصحة (P50 AA022538 و R01 AA029130 إلى EJG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > مكونات متوفرة تجاريا < قوي ><قوي > الكمية < / قوي >
12 مفتاحا (MPR121)Adafruit19823
زوج من الكابلات ثنائية السن (JST XH 2.5 مم)Adafruit487218
(Qwiic)SparkFunPRT-179121
كابل 4 سنون (100 مم Qwiic)SparkFunPRT-172591
كابل 4 سنون (50 مم Qwiic)SparkFunPRT-172603
5 فولت إلى 3 فولت اندلاعناقل الحركة Adafruit56371
درع يعمل باللمس بالسعة (2.8 بوصة)Adafruit19471
شريط موصل نحاسي (1/4 بوصة)بيانات DigiKey4393-CFT-1 / 4-ND1
درع تسجيلAdafruit11411
مجموعة اندلاع الاتصالات التفاضلية I2C (QwiicBus)SparkFunKIT-172501
شريط كهربائيDigiKey3M156004-ND1
أنابيب الانكماش الحراري (3/16 بوصة بألوان مختلفة)روابط الكابلات والمزيدHS357-S106
طقم أنابيب الانكماش الحراري (4 بوصة أسود)Jameco20959631
بطارية ليثيوم معدنية (3 فولت 12.5 مم)غسالة مسطحة DigiKey1908-CR1220JAUCHSB-ND1
M5Grainger54FN661
M5 عرافة الجوزGrainger6CA721
M5 آلة المسمار (12 مم)Grainger6GU881
M5 آلة برغي (25 مم)Grainger  6GU912
سلك العبور الذكور / الذكورAdafruit19571
لوحة متحكم (Arduino Mega 2560 Rev3)DigiKey1050-1018-ND1
خيوط PETG (فضة 2.85 مم)MatterHackersM-DDH-UZR22
خيوط جيش التحرير الشعبى الصينى (2.85 مم أسود)MatterHackersM-SEW-RUAW2
خيوط جيش التحرير الشعبى الصينى (2.85 مم فضي)MatterHackersM-66P-6CLE1
مزود طاقة (تيار مستمر 9 فولت 1 أمبير)Newegg9SIBPPKJYR59911
بطاقة ذاكرة SD / microSD (8 جيجابايت)Adafruit12941
رؤوس تكديس الدرعAdafruit851
سلك صلب النواة (22AWG أحمر)Adafruit2881
سلك مجدولة (22AWG أسود)Adafruit29761
سلك مجدولة (22AWG أحمر)Adafruit30681
أنبوب شفق غطاء ملتوي مع كرةتصميم بديلTCCN8.5-ST2.5SB38
زجاجة ماء (8 أونصات)تصميم بديلWB8FS38
<قوي > مخصص مكونات مطبوعة ثلاثية الأبعاد < قوي >< قوي > الكمية < / قوي >
مطبوع أسفل علبة اردوينوN / AARDUINO_Bottom.stl1
3D مطبوعة اردوينو حالة أعلىN / AARDUINO_Top.stl1
3D مطبوعة كابل كليب LN / ACLIP_L.stl18
3D مطبوعة كابل كليب الجوزN / ACLIP_Nut.stl18
3D مطبوعة كابل كليب RN / ACLIP_R.stl18
3D مطبوعة lickometer حامل زجاجةN / ALICKOMETER_Bottle Holder.stl19
3D مطبوعة لسكومتر حامي الكابل LN / ALICKOMETER_Cable Protector_L.stl6
3D مطبوعة lickometer كابل حامي RN / ALICKOMETER_Cable Protector_R.stl12
3D مطبوعة حروف مقياس اللمسN / ALICKOMETER_Letters.stl19
3D المطبوعة جبل برغيN / AScrew.stl4
حالة الاستشعار المطبوعة ثلاثية الأبعاد A أسفلN / ASENSOR_A_Bottom.stl1
حالة الاستشعار المطبوعة ثلاثية الأبعاد أعلىN / ASENSOR_A_Top.stl1
حالة الاستشعار المطبوعة ثلاثية الأبعاد B أسفلN / ASENSOR_B_Bottom.stl1
حالة الاستشعار المطبوعة ثلاثية الأبعاد B أعلىN / ASENSOR_B_Top.stl1
حالة الاستشعار المطبوعة ثلاثية الأبعاد C أسفلN / ASENSOR_C_Bottom.stl1
3D المطبوعة حالة الاستشعار C أعلىN / ASENSOR_B_Top.stl1
3D المطبوعة حالة الاستشعار رسائلN / ASENSOR_Letters.stl1
3D المطبوعة مانع الشربN / ASIPPER_Blocker.stl36
3D المطبوعة قاعدة مانع الشربN / ASIPPER_Base.stl18
3D المطبوعة الشرب مانع والعتادN / ASIPPER_Gear.stl18
3D المطبوعة الشرب مانع الجوزN / ASIPPER_Nut.stl18
3D المطبوعة الشرب مانع دودةN / ASIPPER_Worm.stl18
لوحة أكريليك lickometer مقطوعةبالليزر N / ALICKOMETER_Acrylic Panel_Sketch.dxf19
4 سنون 3D جبل

المراجع

  1. GBD 2016 Alcohol Collaborators. Alcohol use and burden for 195 countries and territories, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet. 392 (10152), 1015-1035 (2018).
  2. Fillmore, K. M., Stockwell, T., Chikritzhs, T., Bostrom, A., Kerr, W. Moderate alcohol use and reduced mortality risk: systematic error in prospective studies and new hypotheses. Annals Epidemiol. 17 (5 Suppl), S16-S23 (2007).
  3. GBD 2020 Alcohol Collaborators. Population-level risks of alcohol consumption by amount, geography, age, sex, and year: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2020. Lancet. 400 (10347), 185-235 (2020).
  4. Esser, M. B., Sherk, A., Liu, Y., Naimi, T. S. Deaths from excessive alcohol use - United States, 2016-2021. Morbidity Mortality Weekly Rep. 73, 154-161 (2024).
  5. Melendez, R. I. Intermittent (every-other-day) drinking induces rapid escalation of ethanol intake and preference in adolescent and adult C57BL/6J mice. Alcohol Clin Exp Res. 35 (4), 652-658 (2011).
  6. Wise, R. A. Voluntary ethanol intake in rats following exposure to ethanol on various schedules. Psychopharmacologia. 29 (3), 203-210 (1973).
  7. Simms, J. A., et al. Intermittent access to 20% ethanol induces high ethanol consumption in Long-Evans and Wistar rats. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1816-1823 (2008).
  8. Carnicella, S., Ron, D., Barak, S. Intermittent ethanol access schedule in rats as a preclinical model of alcohol abuse. Alcohol. 48 (3), 243-252 (2014).
  9. Loi, B., et al. Increase in alcohol intake, reduced flexibility of alcohol drinking, and evidence of signs of alcohol intoxication in Sardinian alcohol-preferring rats exposed to intermittent access to 20% alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34 (12), 2147-2154 (2010).
  10. Rhodes, J. S., Best, K., Belknap, J. K., Finn, D. A., Crabbe, J. C. Evaluation of a simple model of ethanol drinking to intoxication in C57BL/6J mice. Physiol Behavior. 84 (1), 53-63 (2005).
  11. Thiele, T. E., Navarro, M. "Drinking in the dark" (DID) procedures: a model of binge-like ethanol drinking in non-dependent mice. Alcohol. 48 (3), 235-241 (2014).
  12. Rimondini, R., Sommer, W., Heilig, M. A temporal threshold for induction of persistent alcohol preference: behavioral evidence in a rat model of intermittent intoxication. J Studies Alcohol. 64 (4), 445-449 (2003).
  13. Sommer, W. H., et al. Upregulation of voluntary alcohol intake, behavioral sensitivity to stress, and amygdala crhr1 expression following a history of dependence. Biol Psychiatry. 63 (2), 139-145 (2008).
  14. Nentwig, T. B., et al. The lateral habenula is not required for ethanol dependence-induced escalation of drinking. Neuropsychopharmacol. 47 (12), 2123-2131 (2022).
  15. Becker, H. C., Lopez, M. F. Increased ethanol drinking after repeated chronic ethanol exposure and withdrawal experience in C57BL/6 mice. Alcohol Clin Exp Res. 28 (12), 1829-1838 (2004).
  16. Lopez, M. F., Becker, H. C. Effect of pattern and number of chronic ethanol exposures on subsequent voluntary ethanol intake in C57BL/6J mice. Psychopharmacology. 181 (4), 688-696 (2005).
  17. Griffin, W. C., Lopez, M. F., Becker, H. C. Intensity and duration of chronic ethanol exposure is critical for subsequent escalation of voluntary ethanol drinking in mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (11), 1893-1900 (2009).
  18. Hwa, L. S., et al. Persistent escalation of alcohol drinking in C57BL/6J mice with intermittent access to 20% ethanol. Alcohol Clin Exp Res. 35 (11), 1938-1947 (2011).
  19. Vierkant, V., Xie, X., Wang, X., Wang, J. Experimental models of alcohol use disorder and their application for pathophysiological investigations. Curr Prot. 3 (6), e831(2023).
  20. Greenfield, T. K., et al. Risks of alcohol use disorders related to drinking patterns in the U.S. general population. J Studies Alcohol Drugs. 75 (2), 319-327 (2014).
  21. Rehm, J., Greenfield, T. K., Rogers, J. D. Average volume of alcohol consumption, patterns of drinking, and all-cause mortality: results from the US National Alcohol Survey. Am J Epidemiol. 153 (1), 64-71 (2001).
  22. Grant, K. A., et al. Drinking typography established by scheduled induction predicts chronic heavy drinking in a monkey model of ethanol self-administration. Alcohol Clin Exp Res. 32 (10), 1824-1838 (2008).
  23. Nathan, P. E., O'Brien, J. S. An experimental analysis of the behavior of alcoholics and nonalcoholics during prolonged experimental drinking: A necessary precursor of behavior therapy. Behav Ther. 2 (4), 455-476 (1971).
  24. Godynyuk, E., Bluitt, M. N., Tooley, J. R., Kravitz, A. V., Creed, M. C. An open-source, automated home-cage sipper device for monitoring liquid ingestive behavior in rodents. eNeuro. 6 (5), (2019).
  25. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. An open source automated two-bottle choice test apparatus for rats. HardwareX. 5, e00061(2019).
  26. Melo, M. C., Alves, P. E., Cecyn, M. N., Eduardo, P. M. C., Abrahao, K. P. Development of eight wireless automated cages system with two lick-o-meters each for rodents. eNeuro. 9 (4), (2022).
  27. Wong, K., et al. Socially integrated polysubstance (SIP) system: An open-source solution for continuous monitoring of polysubstance fluid intake in group housed mice. Addiction Neurosci. , (2023).
  28. Frie, J. A., Khokhar, J. Y. FARESHARE: An open-source apparatus for assessing drinking microstructure in socially housed rats. NPP-Digit Psychiatry Neurosci. 2 (1), 1-7 (2024).
  29. Zhao, Z., et al. INGEsT: An open-source behavioral setup for studying self-motivated ingestive behavior and learned operant behavior. bioRxiv. , (2024).
  30. Petersen, N., Adank, D. N., Raghavan, R., Winder, D. G., Doyle, M. A. LIQ HD (Lick Instance Quantifier Home Cage Device): An open-source tool for recording undisturbed two-bottle drinking behavior in a home cage environment. eNeuro. 10 (4), (2023).
  31. Trujillo, J. L., Roberts, A. J., Gorman, M. R. Circadian timing of ethanol exposure exerts enduring effects on subsequent ad libitum consumption in C57 mice. Alcohol Clin Exp Res. 33 (7), 1286-1293 (2009).
  32. Nentwig, T. B., Margaret Starr, E., Judson Chandler, L., Glover, E. J. Absence of compulsive drinking phenotype in adult male rats exposed to ethanol in a binge-like pattern during adolescence. Alcohol. 79, 93-103 (2019).
  33. Patwell, R., Yang, H., Pandey, S. C., Glover, E. J. An operant ethanol self-administration paradigm that discriminates between appetitive and consummatory behaviors reveals distinct behavioral phenotypes in commonly used rat strains. Neuropharmacology. 201, 108836(2021).
  34. Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Chatterjee, S., Holgate, J., Bartlett, S. E. Varenicline, a partial agonist at neuronal nicotinic acetylcholine receptors, reduces nicotine-induced increases in 20% ethanol operant self-administration in Sprague-Dawley rats. Addict Biol. 16 (3), 440-449 (2011).
  35. Mill, D. J., Bito-Onon, J. J., Simms, J. A., Li, R., Bartlett, S. E. Fischer rats consume 20% ethanol in a long-term intermittent-access two-bottle-choice paradigm. PloS One. 8 (11), e79824(2013).
  36. Carnicella, S., Amamoto, R., Ron, D. Excessive alcohol consumption is blocked by glial cell line-derived neurotrophic factor. Alcohol. 43 (1), 35-43 (2009).
  37. Moore, C. F., Lynch, W. J. Alcohol preferring (P) rats as a model for examining sex differences in alcohol use disorder and its treatment. Pharmacol Biochem Behav. 132, 1-9 (2015).
  38. Pitock, J. R., et al. Presence of distinct operant phenotypes and transient withdrawal-induced escalation of operant ethanol intake in female rats. bioRxiv. , (2024).
  39. Carnicella, S., Yowell, Q. V., Ron, D. Regulation of operant oral ethanol self-administration: a dose-response curve study in rats. Alcohol Clin Exp Res. 35 (1), 116-125 (2011).
  40. De Oliveira Sergio, T., et al. Sex- and estrous-related response patterns for alcohol depend critically on the level of compulsion-like challenge. Prog Neuro-Psychopharmacol Biol Psychiatry. 133, 111008(2024).
  41. Foo, J. C., Skorodumov, I., Spanagel, R., Meinhardt, M. W. Sex- and age-specific effects on the development of addiction and compulsive-like drinking in rats. Biol Sex Diff. 14 (1), 44(2023).
  42. Moolten, M., Kornetsky, C. Oral self-administration of ethanol and not experimenter-administered ethanol facilitates rewarding electrical brain stimulation. Alcohol. 7 (3), 221-225 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

استهلاك الكحول في القوارضالبنية الدقيقة للشربنظام قياس عدد اللعقات (Lickometer System)تناول الإيثانول في الجرذانأنماط الشربتركيز الإيثانول في الدمالشرب النهمي
نمذجة استهلاك الكحول في القوارض باستخدام الشرب في القفص المنزلي المكون من زجاجتين وتحليل البنية المجهرية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.