مقالة منهجية

أنظمة نماذج الأنسجة العضوية للتحقيق في تفاعلات المضيف والممرض في المختبر

DOI:

10.3791/67487

⸱

مارس 28, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oral Sciences Research Group, Glasgow Dental School, School of Medicine, College of Medical, Veterinary and Life Sciences, University of Glasgow, 2Glasgow Biofilm Research Network, 3Department of Restorative Dental Sciences, College of Dentistry, Jouf University, 4Department of Biological and Biomedical Sciences, Glasgow Caledonian University, 5Safeguarding Health through Infection Prevention Research Group, Glasgow Caledonian University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يحدد البروتوكول الحالي تطبيق نماذج الأنسجة العضوية للتحقيق في تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض في المختبر. على وجه التحديد ، يستخدم النظام النموذجي الموصوف ظهارة فموية متعددة الطبقات معرضة للكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالغشية الحيوية (لوحة الأسنان) في سياق صحة الفم مقابل المرض.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يظل تلخيص واجهة الممرض المضيف في الحاجز الظهاري أو الغشاء المخاطي في المختبر احتمالا صعبا لعلماء الأحياء العدوية. في حين أن الطبقات الأحادية الظهارية ثنائية الأبعاد المزروعة داخليا تفتقر إلى التمثيل الحقيقي للحالة في الجسم الحي ، غالبا ما يتم التغاضي عن نماذج الأنسجة المتاحة تجاريا بسبب تكلفتها وعمليتها. ومع ذلك ، مع التخطيط الدقيق ، توفر هذه النماذج منصات قابلة للتكرار لمجموعة واسعة من التطبيقات المختلفة. هنا ، نبلغ عن استخدام النماذج الظهارية التي يمكن استخدامها لمجموعة متنوعة من الأغراض التجريبية للتحقيق في تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض في مختلف المنافذ البيئية ، مثل تجويف الفم والجلد والغشاء المخاطي المهبلي. من الخلايا العوالق البسيطة إلى الزراعة المشتركة المعقدة للأغشية الحيوية ، تستخدم النماذج الظهارية لتقييم الالتصاق الميكروبي والغزو ، ولتقييم استجابة المضيف على مستوى النسخ و / أو البروتين ، مع مجال للتنميط الأكثر تفصيلا باستخدام مناهج omics المختلفة. علاوة على ذلك ، يمكن استخدام هذه الأنظمة البيولوجية كأحواض اختبار أكثر دقة لتقييم النشاط المضاد للميكروبات التقليدي والجديد في بيئة مكروية معقدة لمسببات الأمراض المضيفة في المختبر. توثق البروتوكولات الموضحة هنا كيفية التعامل مع النماذج عند وصولها وإعدادها في المختبر لتحفيز الزراعة المشتركة مع مجتمعات الأغشية الحيوية. توضح الطرق بالتفصيل كيفية تحقيق المخرجات التجريبية من أنظمة النموذج ، بما في ذلك معالجة الأنسجة ، وإعداد الثقافة المشتركة ، وتوليد البيانات. تتضمن هذه التجارب التعبير الجيني المضيف من خلال تحليلات qPCR أحادية ومتعددة الإرسال والكشف عن البروتين الالتهابي باستخدام ELISAs. في الختام ، توفر النماذج الظهارية أنظمة مفيدة في المختبر لدراسات التحقيق قبل السريرية في التفاعلات البسيطة أو المعقدة بين المضيف ومسببات الأمراض.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توفر أنظمة النماذج في المختبر أسرة اختبار ممتازة للتحقيق في تفاعلات المضيف والمسببات الممرضة. تهدف هذه الأنظمة العضوية إلى تلخيص البيئة المكروية للمنافذ البيئية المختلفة المعرضة للاضطرابات الميكروبية. تم نشر عدد من المقالات البحثية باستخدام نماذج أنسجة EpiSkin (المعروفة سابقا باسم SkinEthic) لتقييم تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض في تجويف الفم1،2،3،4،5 ، وحاجز الجلد6،7،8،9،10،11 ، والغشاء المخاطي المهبلي5،12،13، من بين أمورأخرى 14،15. على عكس ثقافة الخلايا "ثنائية الأبعاد" أو "ثنائية الأبعاد" ، والتي تعتمد على استخدام طبقات أحادية من خطوط الخلايا الظهارية المعرضة للكائنات الحية الدقيقة ، تتكون هذه النماذج المتاحة تجاريا من طبقات متعددة من الخلايا المتمايزة المزروعة في واجهة الهواء والسائل. على الرغم من أنها أرخص وغالبا ما تعتبر أكثر قابلية للتكاثر ، إلا أن أنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد معرضة للتلف الخلوي عند زراعتها بالكائنات الحية الدقيقة ، والتي لا تمثل دائما بدقة الحواجز الظهارية أو المخاطية في الجسم الحي16،17.

تظهر الأدلة الحديثة أن تقنيات الزراعة "ثلاثية الأبعاد" أو "ثلاثية الأبعاد" أصبحت أكثر شيوعا في مختلف التخصصات العلمية ، بما في ذلك علوم السرطان وأبحاث الخلايا الجذعية واكتشاف الأدوية16،18. في سياق بيولوجيا العدوى ، يمكن استخدام نماذج الأنسجة ثلاثية الأبعاد للتحقيقات في تفاعلات الأنواع البكتيرية المضيفة أو الفطرية أو المختلطة في واجهة الحاجز الظهاري أو الغشاء المخاطي داخل بيئة مكروية خاضعة للرقابة في المختبر. تتمتع هذه النماذج بالعديد من المزايا لأنظمة الاستزراع ثنائية الأبعاد ، مما يسمح بتقييم استعمار الأنسجة و / أو غزو الكائنات المسببة للأمراض أو مجتمعات الأغشية الحيويةالمعقدة 17 ، وتقييم استجابات المضيف على مستوى متعدد المكونات للمؤشرات الحيوية المختلفة حيث يتم تقييد النماذج ثنائية الأبعاد أحيانا من خلال ملفات تعريف النسخ أو البروتينات16،17،18. في النهاية ، فإن التطبيقات قبل السريرية لمثل هذه الأنظمة ثلاثية الأبعاد واسعة ، مما يوفر بيانات استكشافية مهمة يمكن نقلها إلى الأمام في النماذج في الجسم الحي أو الدراسات السريرية.

في سياق صحة الفم والأمراض ، يعد فهم المسارات الالتهابية المتضمنة في سطح الغشاء المخاطي للفم أمرا مهما للأطباء ، لأن هذا قد يوجه طرق العلاج. أظهرت الدراسات السابقة أن الأغشية الحيوية "المرتبطة بالصحة" يمكن أن تثير الحد الأدنى من الاستجابات الالتهابية3،19،20،21. يمكن أن ينشأ هذا من انخفاض العبء البيولوجي الميكروبي المرتبط بصحة الفم أو بسبب تكوين الأغشية الحيوية مع المكورات العقدية spp. تعتبر على نطاق واسع معدلة للمناعة22،23. من ناحية أخرى ، فإن الأغشية الحيوية المكونة من الكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالأمراض مثل Fusobacterium nucleatum و Porphyromonas gingivalis هي مؤيدة للالتهابات بطبيعتها3،20،24،25،26،27. وصفت مراجعة أجراها Mountcastle et al. في عام 2020 جميع نماذج الثقافة المشتركة ذات الصلة التي كانت موجودة في ذلك الوقت للبيئة المكروية الفموية17. على الرغم من أن مثل هذه النماذج العضوية وفيرة ، مع إنتاج العديد منها منذ28،29 ، لا يزال هناك عدد من العقبات الصعبة المرتبطة بإنشاء مثل هذه النماذج ثلاثية الأبعاد. على سبيل المثال لا الحصر ، تتطلب هذه النماذج تحسينا كبيرا وإنتاجها كثيف العمالة والموارد. يمكن أن تكون قابلية التكاثر أيضا متغيرة للغاية ما لم يتم التحكم فيهابعناية 16،17. تتحايل النماذج المتاحة تجاريا على مثل هذه المشكلات ، وتوفر منصات للتحقيق في تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض داخل تجويف الفم وفي المنافذ البيئية الأخرى في جسم الإنسان.

للتلخيص ، يهدف البروتوكول الحالي إلى تحديد تطبيق نماذج الأنسجة العضوية للتحقيق في تفاعلات المضيف ومسببات الأمراض في المختبر في سياق صحة الفم والأمراض. على وجه التحديد ، يستخدم النظام النموذجي الموصوف ظهارة فموية متعددة الطبقات متاحة تجاريا معرضة لمجتمع غشاء حيوي محدد يمثل مرض التهاب الفم ، التهاب اللثة.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتضمن البروتوكول التالي إعداد غشاء حيوي متعدد الأنواع ممثل التهاب اللثة ، يحتوي على ما مجموعه 7 أنواع (spp.) 7،30. يتم تضمين ثلاثة أنواع من المكورات العقدية ، والمكورات العقدية (NCTC 12261) ، والمكورات العقدية المتوسطية (DSM 20753) ، والمكورات العقدية الفموية (NTCC 11427) لتقليد صحة الفم ، وتعمل كمستعمرين أوليين للحبيبات اللعابية. تمت إضافة أربعة كائنات دقيقة لاهوائية مرتبطة بالتحول من صحة الفم إلى المرض: Veillonella dispar (NCTC 11831) ، Actinomyces naeslundii (DSM 17233) ، واثنين من Fusobacterium spp. Fusobacterium nucleatum (ATCC 10953) و Fusobacterium nucleatum (subspp.) vincentii (DSM 19507). يتم تنفيذ جميع الخطوات المتضمنة بشكل معقم إما عند اللهب أو في خزانة أمان من الفئة الثانية. يتم تعقيم جميع الوسائط والمحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) المستخدم في المستحضرات الميكروبيولوجية قبل الاستخدام ، ويتم تقييم العقم على فترات منتظمة أثناء البروتوكول. تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. إعداد المجتمعات الميكروبية للثقافة المشتركة

ملاحظة: يصور هذا البروتوكول توليد غشاء حيوي متعدد الأنواع ممثل للاتحادات المرتبط بالتهاب أنسجة اللثة ، والمعروف أيضا باسم التهاب اللثة. وقد استخدم هذا النموذج لتقييم استجابة المضيف في صحة الفم وأمراضه، كما هو موضحسابقا.

  1. قم بإحياء جميع أنواع المكورات العقدية الثلاثة على ألواح أجار الدم (قاعدة كولومبيا بلود أجار التي تحتوي على 5٪ دم حصان معقم منزوع الضرب) من المخزونات المجمدة من الخرز المسامي (التي تم الحصول عليها تجاريا) التي تحتوي على الكائنات الحية الدقيقة المخزنة عند -80 درجة مئوية. يتم تحقيق ذلك باستخدام حلقة التلقيح وتقنية لوحة الخط.
    1. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، ثم اعزل 3-4 مستعمرات للتكاثر في 10 مل من وسط مرق الصويا التربتون. مرق الثقافة لمدة 16-18 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. بالنسبة لمسببات الأمراض الوسيطة ، قم بإحياء V. dispar و A. naeslundii و F. nucleatum و F. nucleatum subspp. vincentii اللاهوائية على قاعدة أجار اللاهوائية الحساسة التي تحتوي على 5٪ دم حصان معقم منزوع الضربات الدموية لمدة 48 ساعة عند 37 درجة مئوية ، قبل الاستزراع في مرق Schaedler لمدة 24-48 ساعة إضافية تحت نفس الظروف.
  3. بعد النمو ، يتم تعليق خلايا الحبيبات عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق ، 20 درجة مئوية عند 3000 × جم ، ثم اغسل الكريات في 10 مل من PBS المعقم (الرقم الهيدروجيني 7.2-7.6). يتم تعليق خلايا الحبيبات مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق ، 20 درجة مئوية عند 3000 × جم ، ثم كرر خطوات الغسيل للمرة الثانية. أعد تعليق الخلايا المغسولة في 10 مل من PBS المعقم للتوحيد القياسي.
  4. توحيد جميع المكورات العقدية الثلاثة spp. بشكل فردي باستخدام مقياس الطيف الضوئي عند 550 نانومتر. تشير قيم الامتصاص البالغة 0.50 (تتراوح من 0.45 إلى 0.55 مقبولة) إلى عدد الخلايا ~ 1 × 108 خلايا / مل ، كما هو محدد مسبقا باستخدام تقنية عدد خلايا مايلز وميسرا31. لتحقيق قراءة الامتصاص هذه ، قم بتخفيف 10 مل من معلقات الخلايا المغسولة في PBS المعقم.
  5. بعد التوحيد القياسي ، قم بتخفيف جميع المكورات العقدية spp. 1:10 إلى 1 × 107 خلايا / مل في مزيج 1: 1 من مرق تود هيويت (THB) ومعهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) المتوسط. أضف 500 ميكرولتر من معلقات الخلايا عن طريق سحب العينة إلى صفيحة زراعة الأنسجة الدقيقة ذات 24 بئرا تحتوي على قرص هيدروكسيباتيت بقطر 13 مم. اترك الأغشية الحيوية لتنضج لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
    ملاحظة: يمكن زراعة الأغشية الحيوية متعددة الأنواع على ركائز مختلفة ذات صلة بالفم مثل المينا ، والعاج32 ، وأسطح أطقم الأسنان المصنوعة من البولي (ميثيل ميثاكريلات)33،34. يمكن أيضا استخدام الوسائط البديلة لهذه النماذج ، مثل اللعاب الاصطناعي أو الاصطناعي ، على الرغم من أنه يجب النظر بعناية اعتمادا على اتحادات الكائنات الحية الدقيقة المستخدمة: أظهرت الدراسات أن اختيار وسط النمو له آثار مهمة على نمو الأغشية الحيوية المجتمعيةالمختلطة 35،36.
  6. في اليوم التالي ، قم بتوحيد الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية الأربعة بطريقة مماثلة لما سبق (الخطوات 1.2-1.4). معلقات خلايا الحبيبات ، تغسل مرتين ، ثم توحيد V. dispar إلى 0.50 امتصاص (تتراوح من 0.45-0.55) والكائنات الحية الدقيقة الثلاثة المتبقية إلى امتصاص 0.20 (تتراوح من 0.18-0.22). بمجرد توحيدها ، قم بتخفيف جميع أنظمة التعليق من 1:10 إلى 1 × 107 خلايا / مل في مزيج 1: 1 من THB و RPMI.
  7. قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة والوسائط المستهلكة بعناية وتخلص منها من الأغشية الحيوية للمكورات العقدية عن طريق سحب العينات. استبدل آبار الألواح الدقيقة ب 500 ميكرولتر من المعلقات القياسية 1 × 107 خلايا / مل للقاعات اللاهوائية الأربعة. زراعة الأغشية الحيوية لمدة 24 ساعة في ظل ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية.
  8. بعد 24 ساعة ، قم بإزالة الخلايا غير الملتصقة والوسائط المستهلكة من الأغشية الحيوية المكونة من 7 أنواع واستبدلها ب 500 ميكرولتر من مزيج معقم 1: 1 من THB: وسائط RPMI. تترك الأغشية الحيوية لتنضج بشكل لاهوائي عند 37 درجة مئوية لمدة 4 أيام ، مع إزالة الوسائط وتجديدها على أساس يومي (أربعة تغييرات في الوسائط في المجموع).
  9. في اليوم السابع ، يكون الأغشية الحيوية متعددة الأنواع ناضجة تماما وجاهزة للتجارب النهائية. اغسل الأغشية الحيوية مرتين باستخدام 500 ميكرولتر من PBS المعقم لاستخدامه في الزراعة المشتركة.
    ملاحظة: يمكن تحديد الأغشية الحيوية باستخدام مجموعة من المنهجيات البيولوجية مثل qPCR (للتقييم التركيبي) والتنميط المجهري باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر أو الإلكترون كما هو موضحسابقا 3.

2. التعامل مع الأنسجة العضوية والإعداد التجريبي

ملاحظة: يتضمن الإعداد التجريبي الموضح أدناه أنسجة الظهارة الفموية البشرية (HOE) المكونة من خلايا TR146 المزروعة على مرشح غشاء بولي كربونات خامل. توجد نماذج أخرى ، بما في ذلك نماذج البشرة والمثانة والمريء والقرنية واللثة والظهارة المهبلية. يتم التعامل مع جميع النماذج وإعدادها بطريقة مشابهة لتلك الموضحة أدناه للتحقيق في تفاعلات المضيف والممرض.

  1. عند الوصول ، قم بإخراج مناديل ووسائط HOE ونقلها إلى خزانة أمان من الفئة الثانية. أضف ما مجموعه 1 مل من وسائط الصيانة المزودة بالمناديل إلى 12 لوحا من 12 بئرا.
  2. قم بإزالة حشوات البولي كربونات التي تحتوي على HOE باستخدام ملاقط معقمة من الألواح المكونة من 24 بئرا وأجار المغذيات المستخدم في الشحن وانقلها إلى الألواح المكونة من 12 بئرا التي تحتوي على الوسائط ، مما يضمن عدم بقاء فقاعات الهواء تحت الأنسجة. تأكد من إزالة أي أجار زائد متصل على جوانب أو أسفل الحشوات بعناية باستخدام زوج إضافي من الملقط أو المناديل الورقية.
  3. احتضان نماذج الأنسجة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 قبل الإعداد التجريبي للتأقلم مع ظروف المختبر بعد الشحن. من الجدير بالذكر أن وسائط الصيانة الإضافية أو وسائط النمو متاحة لصيانة أطول أو مزيد من النضج لنماذج الأنسجة.
  4. يمكن الآن إجراء تجارب الزراعة المشتركة. على سبيل المثال المقدم هنا ، قم بإزالة الأغشية الحيوية المكونة من 7 أنواع التي تم إنشاؤها على النحو الوارد أعلاه (الخطوات 1.1-1.9) من ركائزها عن طريق الصوتنة. لتحقيق ذلك ، قم بإزالة أقراص HA التي تحتوي على أغشية حيوية من قاع الألواح المكونة من 24 بئرا باستخدام إبرة وملاقط 19 جم ، ثم انقل بيجو يحتوي على 1 مل من PBS المعقم من Dulbecco. صوتي عند 35 كيلو هرتز لمدة 10 دقائق في حمام مائي صوتنة.
  5. قم بإزالة الإدخالات التي تحتوي على نماذج الأنسجة باستخدام الملقط بعناية من التأقلم الليلي ، وأضف 100 ميكرولتر من تعليق سونيكات الأغشية الحيوية مباشرة إلى الأنسجة عن طريق سحب العينات. استخدم أنسجة التحكم غير المحفزة لأغراض المقارنة. بالنسبة لإدخالات أنسجة التحكم هذه ، أضف 100 ميكرولتر من PBS المعقم من Dulbecco بدون تعليق الأغشية الحيوية.
    ملاحظة: يمكن استخدام الخلايا العوالق أو المواد الطافية المستهلكة التي تحتوي على خلايا مشتتة أو الأغشية الحيوية الكاملة لنموذج الزراعة المشتركة بدلا من سونيكات الأغشية الحيوية. يتم تخطيط التطبيقات المختلفة لنماذج مسببات الأمراض المضيفة هذه باستخدام المنشطات الميكروبية المختلفة في الشكل 1 كما هو موثق في مكان آخر3،5،6،8،13،37،38.
  6. بعد الإضافة ، قم بنقل الإدخالات إلى لوحة أخرى مكونة من 12 بئرا تحتوي على 1 مل من وسائط الصيانة الجديدة ، مما يضمن مرة أخرى عدم وجود فقاعات هواء تحت الإدخالات. احتضان الألواح التي تحتوي على نماذج الأنسجة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 قبل معالجة الأنسجة للتطبيقات النهائية.
    ملاحظة: يمكن لموردي الأنسجة توفير وسائط إضافية لدعم استمرار زراعة الأنسجة بعد التعرض للمجاميع أو الأغشية الحيوية ذات الصوتنة. تحقيقا لهذه الغاية ، تم نشر العديد من النماذج السابقة التي تبحث في تلقيح الأنسجة الحيوية لفتراتطويلة 21،28،39. لتحقيق نتائج مماثلة باستخدام نموذج النمط العضوي الحالي ، صوتنة الأنسجة (على النحو الوارد أعلاه ، الخطوة 2.6) واترك الكائنات الحية الدقيقة لتعلق لمدة 24 ساعة. تخلص من أي تعليق ميكروبي متبقي واستمر في الاستزراع في واجهة الهواء والسائل للدورة الزمنية التجريبية المطلوبة.

3. معالجة الأنسجة للمخرجات التجريبية

ملاحظة: بعد الزراعة المشتركة ، تتم معالجة نماذج الأنسجة للمخرجات التجريبية. توثق الخطوات التالية كيفية استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة للتنميط النسخي ، وكيفية استخدام وسائط الأنسجة المستهلكة للكشف عن البروتين. يمكن أيضا تثبيت الأنسجة في الفورمالين أو بارافورمالدهايد أو مثبت مماثل للتقييم النسيجي ، كما هو موضح سابقا3،6.

  1. أولا ، قم بإعداد 350 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل RLT في أنابيب O-Ring ذات غطاء لولبي سعة 2.0 مل تحتوي على 1٪ من β-mercaptoethanol و ~ 100 ميكرولتر ما يعادل 0.5 مم من الخرز الزجاجي المغسول بالحمض.
  2. قم بإزالة الحشوات التي تحتوي على الأنسجة من الوسائط باستخدام الملقط ، وتخلص من أي تعليق ميكروبي متبقي من الحشوة. بعد ذلك ، امسك ، مقلوب ، على مستوى العين لسهولة السهولة. باستخدام إبرة 19 جم ، قم بتقطيع الأنسجة والغشاء بعناية من أسفل الملحق ونقله إلى المخزن المؤقت RLT.
    1. قم بتجانس الأنسجة في 30 ثانية باستخدام الخالط الخافق المصنوع من حبة الطاولة ، ثم استخرج الحمض النووي الريبي من المحللة باتباع تعليمات الشركة المصنعة لمجموعة استخراج الحمض النووي الريبي (انظر جدول المواد).
      ملاحظة: يستخدم الحمض النووي الريبي المستخرج لتخليق الحمض النووي (كدنا) لتشكيل تعريف التعبير عن جينات السيتوكين والكيموكين كعلامات للالتهاب باستخدام تسلسل PCR الكمي (qPCR) أو الحمض النووي الريبي. يتم تحقيق qPCR باستخدام مصفوفات متعددة الإرسال مثل مصفوفة RT2 PCR التي تحتوي على آبار مع بادئات جاهزة لجينات معينة ، أو كاشف SYBR الأخضر مع تسلسلات أولية مصممة داخليا و ddH2O3 الخالي من النوكلياز.
  3. اجمع وسائط الأنسجة المستهلكة المتبقية (~ 850-900 ميكرولتر) للتحليلات البروتينية باستخدام منهجيات منخفضة وعالية الإنتاجية مثل ELISAs أو المقايسات المناعية المتعددة الإرسال أو تحليل المؤشرات الحيوية للبروتينمتعدد الإرسال 7.
  4. باستخدام وسائط الأنسجة المستهلكة ، قم بتقييم مجموعة من العلامات المرتبطة بالالتهاب على مستوى البروتين. يمكن استخدام الوسائط المستهلكة مباشرة للمنهجيات المذكورة أعلاه (الخطوة 3.3) أو تخزينها عند -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. تجنب دورات التجميد والذوبان المتعددة للوسائط لمثل هذه التحليلات.
    ملاحظة: قد تحتاج الوسائط إلى التخفيف بنسبة 1:10 اعتمادا على منشط الأنسجة للحصول على توصيف بروتيني دقيق باستخدام ELISAs.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه التجربة ، تعرضت HOE لسونيكات الأغشية الحيوية المكونة من 7 أنواع تحتوي على ممثل الكائن الحي للتحول من صحة الفم إلى التهاب اللثة (المعروف باسم التهاب اللثة). ينشأ هذا المرض من التهاب الأنسجة الظهارية اللثوية أو الفموية بسبب الاضطرابات الميكروبية الناتجة عن تراكم البلاك على سطح السن. بعد التحفيز ، يتم استخدام الأنسجة والوسائط المستهلكة لتحليلات النسخ والبروتينات ، كما تمت مناقشته أعلاه. في هذه التجربة ، تم الكشف عن التعبير الجيني للوحة من المؤشرات الحيوية الالتهابية في الأنسجة بعد التحفيز باستخدام سونيكات الأغشية الحيوية (الشكل 2). تم تحقيق ذلك باستخدام مصفوفة ملفات تعريف RT2 PCR المصنوعة خصيصا تحتوي على 16 جينا مختلفا ، وتم عرض التعبير الجيني على أنه تغيير في الطية بالنسبة للأنسجة غير المحفزة بعد التطبيع لجين التدبير المنزلي GAPDH. زاد التحفيز الميكروبي من التعبير عن جميع الجينات باستثناء CXCL5 ، مع وجود اختلافات إحصائية شوهدت ل NFKB و CCL2 و CXCL1 و CXCL3 و CSF2 و CSF3 و TNF و IL1A و IL1B و TLR4 (الشكل 2 أ). لوحظ أكبر تغيير في الطية ل CCL2 و CXCL1 و CSF3 ، مع زيادات قدرها 16.9 و 10.3 و 15.1 على التوالي (الشكل 2 ب).

تم استخدام وسائط HOE المستهلكة للتحليلات البروتينية للكشف عن البروتينات التي تنتجها وتطلقها الأنسجة بعد التحفيز. هذا مفيد لتحديد ما إذا كان التعبير الجيني يرتبط بإنتاج البروتين. للقيام بذلك ، تم تقييم التعبير الجيني IL8 وإطلاق بروتين IL-8 في الأنسجة الضابطة والأنسجة المحفزة للأغشية الحيوية والصوتي (الشكل 3). تم تقييم التعبير الجيني باستخدام qPCR المستند إلى SYBR-green مع بادئات ل IL8 و GAPDH كما هو موضحسابقا 3. تم زيادة تعبير IL8 mRNA في HOE بمقدار 8.67 أضعاف بعد التحفيز باستخدام سونيكات الأغشية الحيوية (الشكل 3 أ). على مستوى البروتين ، تم قياس مستويات IL-8 باستخدام مجموعة IL-8 ELISA. تمت زيادة تركيز IL-8 في الوسائط المستهلكة من ~ 1.005 نانوغرام / مل في الأنسجة الضابطة إلى ~ 4.245 نانوغرام / مل في الأنسجة المحفزة للأغشية الحيوية سونيكات (الشكل 3 ب).

figure-results-1
الشكل 1: تطبيقات مختلفة لنماذج الزراعة المشتركة للأنسجة العضوية. يتم تطبيق المعلقات الموحدة للكائنات الحية الدقيقة مباشرة على الأنسجة للتحقيق في تفاعلات الأنواع والمضيف (أ). غالبا ما تستخدم هذه لتقييم الاستعمار الميكروبي خلال فترة زمنية قصيرة (على سبيل المثال ، <24 ساعة). يتم صوتنة الأغشية الحيوية المعقدة للتحقيق في تأثيرات الخلايا المشتتة أو مجاميع الأغشية الحيوية على الأنسجة (ب). هذا مهم لأنه ثبت سابقا أن هذه الخلايا لها أنماط ظاهرية فريدة مقارنة بنظيراتها من العوالق أو الأغشية الحيوية. تحقيقا لهذه الغاية ، يمكن إضافة الأغشية الحيوية السليمة مباشرة إلى الأنسجة باستخدام إدخالات إضافية أصغر لإنشاء تعرض مجاور للمضيف (C). أخيرا ، تضاف خلايا العوالق إلى الأنسجة في وسط الاستزراع المناسب لتقييم الاستعمار الميكروبي وتكوين الأغشية الحيوية وديناميكيات النمو على الأنسجة (D). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التعبير الجيني لأنسجة HOE بعد التحفيز باستخدام سونيكات الأغشية الحيوية المكونة من 7 أنواع. تغيير أضعاف تعبير mRNA لما مجموعه 15 جينا التهابيا تم تطبيعها إلى جين التدبير المنزلي ، GAPDH ، في أنسجة HOE في السيطرة ، عينات غير محفزة والتي تتعرض ل 100 ميكرولتر من سونيكات الأغشية الحيوية المكونة من 7 أنواع (A). تظهر الجينات الثلاثة (CCL2 ، CXCL1 ، CSF3) التي تحتوي على أعلى التغييرات في تعبير mRNA في (B). أجريت التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار T غير المزاوج ، مع تغييرات معنوية موضحة على أنها * p < 0.05 و ** p < 0.01 و ***p < 0.001 ، على التوالي. تم رسم البيانات وتحليلها باستخدام برامج إحصائية ورسوم بيانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التعبير الجيني IL8 ومستويات بروتين IL-8 التي تنتجها أنسجة HOE. تغيير طية تعبير mRNA ل IL8 في أنسجة HOE كما هو محدد بواسطة مستويات بروتين qPCR (A) و IL-8 المستندة إلى SYBR-green من وسائط الأنسجة المستهلكة باستخدام منهجية ELISA (B). أجريت التحليلات الإحصائية باستخدام اختبار T غير المزاوج ، مع تغييرات معنوية موضحة على أنها * p < 0.05 و **** p < 0.0001 ، على التوالي. تم رسم البيانات وتحليلها باستخدام برامج إحصائية ورسوم بيانية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، يتم وصف المنهجيات لإنتاج نموذج غشاء حيوي معقد متعدد الأنواع يمثل التهاب اللثة للزراعة المشتركة مع أنسجة HOE لتقييم استجابة المضيف بعد التحفيز الميكروبي. يمكن تكييف هذا البروتوكول لاستخدامه في التحقيق في تفاعلات المضيف والممرض بين الخلايا العوالق ، أو الأغشية الحيوية أحادية أو مزدوجة أو مختلطة ، أو الخلايا المشتتة بالأغشية الحيوية مع الأنسجة الظهارية من منافذ بيئية مختلفة في جسم الإنسان. يوفر استخدام نماذج الأنسجة للتحقيق في تفاعلات المضيف وممرض الأمراض تقدما مهما لأنظمة الزراعة المشتركة السابقة التي تقتصر على طبقات أحادية ثنائية الأبعاد لا تلخص دائما حالة الجسم الحي ، حيث يحتوي النسيج الظهاري على طبقات خلوية متعددة16،17،18. علاوة على ذلك ، فإن التحديات المرتبطة بالنمو في المختبر لنماذج الأنسجة متعددة الطبقات وفيرة ، مع استخدام خطوط خلايا متعددة و / أو نمو طبقات الخلايا في واجهة الهواء والسائل المعرضة للتلوث. توفر الأنسجة المتوفرة تجاريا منصة قابلة للتكرار مع نماذج عالية الجودة باستمرار يمكن مقارنتها بين التكرارات والدفعات ، كما هو موضح في المنشورات السابقة3،7.

بالنسبة لقسم "إعداد المجتمعات الميكروبية للاستزراع المشترك" ، تم اختيار إدراج هذه الكائنات الحية الدقيقة لنموذج التهاب اللثة المكون من 7 أنواع بناء على المزايا ومسببات الأمراض المحددة بشكل شائع المرتبطة بالتحول من صحة الفم إلى المرض. كما هو الحال مع جميع أنظمة نماذج الأغشية الحيوية المعقدة في المختبر ، يتم توجيه إدراج الكائنات الحية الدقيقة من خلال دراسات الميكروبيوم المتعلقة بالمكانة البيئية الصحية أو المريضة المعينة. تحقيقا لهذه الغاية ، أبلغنا نحن وآخرون عن استخدام نموذج غشاء حيوي مرتبط بصحة الفم يحتوي على كائنات دقيقة متعايشة (على سبيل المثال ، المكورات العقدية وروثيا spp.)3،40،41. علاوة على ذلك ، يمكن إضافة مسببات أمراض إضافية إلى هذه النماذج لإنشاء أغشية حيوية مرتبطة بأمراض أخرى. على سبيل المثال ، يمكن إضافة ثلاثة كائنات دقيقة إلى الأنواع السبعة الموضحة هنا لإنشاء نموذج مرض مرتبط بالتهاب دواعم السن3 ، بينما يمكن إضافة العامل الممرض الفطري المبيضات البيضاء لزيادة تعدد الميكروبات بالإضافة إلى إضافة طبقة من التعقيد بين المملكة33. في الواقع ، يمكن أن يكون لتعزيز التفاعلات الفطرية والبكتيرية آثار هائلة على المخرجات التجريبية المختلفة باستخدام نماذج الأغشية الحيوية في المختبر عند مقارنتها بالأغشية الحيوية البكتيريةفقط 42. في النهاية ، يوصى بشدة بأخذ الاعتبار الدقيق عند إنشاء نموذج غشاء حيوي جديد متعدد الأنواع لمثل هذه الدراسات. في حين أنه يجب التعرف بسهولة على الكائنات الحية الدقيقة المضمنة من خلال عمليات البحث المكثفة في الأدبيات ، بالنسبة لمعظم المنافذ و / أو الأمراض ، فقد لا تندمج بشكل جيد في نموذج معقد في المختبر لأسباب مختلفة. يوضح ما يلي بعض الاعتبارات المحتملة الأخرى التي يجب أخذها:

ديناميكيات تكوين الأغشية الحيوية
غالبا ما يتضمن تكوين الأغشية الحيوية في الجسم الحي استعمارا مبكرا ومتوسطا ومتأخرا بواسطة كائنات دقيقة معينة. يتميز تكوين لويحات الأسنان فوق اللثة وتحت اللثة بشكل كبير بالارتباط الأولي للبلعابية الموجودة على المينا من قبل الأنواع الرائدة (على سبيل المثال ، أنواع المكورات العقدية ) ، مع مسببات الأمراض الوسيطة واللاحقة التي تتطلب هذه كسقالة للاستعمار43. تم اقتراح ظاهرة مماثلة في البيئة المهبلية أثناء التهاب المهبل الجرثومي ، حيث يعتقد أن Gardnerella vaginalis هو المستعمر الأولي ، يليه اللاهوائيةاللاحقة 44. ومع ذلك ، من المهم ملاحظة أن هذا قد لا يكون هو الحال بالنسبة للأمراض الأخرى في المنافذ البيئية الأخرى.

كثافة البذر لكل كائن حي دقيق
سيكون للكائنات الحية الدقيقة أحجام و / أو ديناميكيات نمو مختلفة عند زراعتها في المختبر. لذلك ، من المهم مراعاة ذلك أثناء عملية التوحيد القياسي. على سبيل المثال ، C. albicans هو 100-150 ضعف حجم الخلايا البكتيرية45،46 ، لذلك ، قد يستدعي الإضافة بتركيز أقل ، على سبيل المثال ، 1 × 106 خلايا / مل ، إلى نماذج الأغشية الحيوية هذه.

عداء الأنواع
قد تتنافس بعض الكائنات الحية الدقيقة (بما في ذلك نفس النوع ولكن العزلات المختلفة ، والسلالات المختبرية و / أو السريرية) المستخدمة في هذه النماذج مع غيرها أثناء تكوين الأغشية الحيوية ، مما يؤدي إلى تثبيط نمو بعض الأنواع الميكروبية47. أبرزت دراسة أجراها صادق وآخرون كيف يمكن للمجموعات المختلفة من الكائنات الحية الدقيقة أن تؤثر على الكتلة الحيوية للأغشية الحيوية الناتجة عن التآزر الميكروبي (أو العداء)48. على الرغم من أن التحقيق في مثل هذه التفاعلات داخل نموذج الأغشية الحيوية قد يكون مفيدا لمجموعات البحث (على سبيل المثال ، اختبار العلاج المسبق أو العلاج الحيوي) ، إلا أن الآخرين قد لا يفسرون مثل هذا العداء ، والذي يمكن أن يؤثر على تعقيد الأنواع المتعددة عند إنشاء النموذج.

مدة نضوج الأغشية الحيوية
من الأهمية بمكان تحسين الأطر الزمنية لنضج الأغشية الحيوية حيث يمكن أن يعتمد ذلك على ديناميكيات نمو الكائنات الحية الدقيقة المضمنة ونظام النموذج (بما في ذلك الطبقات السفلية) المستخدم للاستزراع. يمكن أن تؤدي أوقات النضج الأطول إلى استعمار أفضل لمسببات الأمراض اللاحقة ولكن المزيد من موت الخلايا داخل النماذج ، خاصة للمستعمرين السابقين. على العكس من ذلك ، قد تكون أوقات الحضانة الأقصر مهمة إذا كنت ترغب في التحقيق في تأثيرات نماذج الأغشية الحيوية غير الناضجة على المضيف. وصفت دراسة أجراها براون وآخرون كيف أن نفس نموذج الأغشية الحيوية للجرح المكون من 10 أنواع له ملامح التهابية مختلفة في خلايا THP-1 البشرية عندما تنضج لمدة 24 ساعة و 48 ساعة و 72 ساعة ، مما يشير إلى أنه كلما كان الأغشية الحيوية أقل نضجا ، زادت احتياجهاللالتهابات 7. يمكن ملاحظة نتائج مماثلة في نماذج الأنسجة متعددة الطبقات. من المهم أيضا ملاحظة أن التغييرات اليومية المنتظمة في الوسائط ضرورية لتقليل موت الخلايا في الأغشية الحيوية ، على الرغم من أنه يمكن تعديل ذلك اعتمادا على أنظمة العلاج المستمرة ، على سبيل المثال ، في حالة تقييم آثار التدخلات المضادة للميكروبات لفترات طويلة.

بالنسبة لقسم "التعامل مع الأنسجة العضوية ، والإعداد التجريبي ، ومعالجة الأنسجة" ، يمكن تعديل الأطر الزمنية للحضانة وفقا لاحتياجات الباحث. يمكن التحقيق في تفاعلات المضيف والممرض في نقاط زمنية مبكرة ، على سبيل المثال ، 1-12 ساعة ، إلى نقاط زمنية لاحقة من 48 ساعة و 72 ساعة ، اعتمادا على سؤال البحث. ثانيا ، يتم توفير جميع وسائط الصيانة التي تحتوي على المضادات الحيوية. وبالتالي ، يجب تقديم الطلبات إلى الشركة عند طلب إزالتها اعتمادا على التصميم التجريبي. على الرغم من أن الوسائط الموجودة أسفل الملحق لا تتلامس بشكل مباشر مع المحيط العلوي للأنسجة ، إلا إذا تم إلحاق جرح في النموذج6،8 ، إلا أن إزالة المضادات الحيوية قد تستحق النظر في حالة التحقيق في الغزو الميكروبي للأنسجة.

يمكن أيضا تغيير المواد الميكروبية المستخدمة في تحفيز الزراعة المشتركة ، كما نوقش أعلاه ، مع نطاق تقييم العوالق ، أو المواد الطافية المستهلكة للأغشية الحيوية (المفلترة وغير المصفاة) ، أو الأغشية الحيوية الكاملة ، أو حضانات الأغشية الحيوية مع الأنسجة. على سبيل المثال ، أظهرت الأدلة السابقة أن نماذج الأنسجة مثل تلك التي توفرها EpiSkin توفر نماذج مفيدة للتحقيق في تفاعلات العوالق الفطرية والمضيف: C. albicans ، المبيضات الأوريس ، الملاسيزية فورفور ، وخلايا Trichophyton rubrum قد ثبت أنها تلتصق وتتفاعل مع طبقات الأنسجة المحيطية في HOE أو البشرة البشرية المعاد بناؤها (RHE) أو الظهارة المهبلية البشرية ، مع بعض هذه الدراسات تظهر تحفيز استجابة المضيف بعد العدوى الفطرية1،5،6،11،12،49. توجد منشورات مماثلة للتفاعلات البكتيرية والمضيف ، على سبيل المثال ، تكوين الأغشية الحيوية لحب الشباب الجلدية ، وهو عامل ممرض شائع مرتبط بميكروبات فروة الرأس في قشرة الرأس ، تمت دراستها على سطح RH ، عند زراعتها بمفردها ومع كائن الجلد الفطري ، Malassezia restricta10. قام آخرون بالتحقيق في قدرة المكورات العنقودية spp. على الارتباط ب RH ، وقياس الخصائص الفيزيائية والكيميائية والميكروبيولوجية لهذا التفاعل البكتيري والمضيف50. استكشف N'Diaye والمؤلفون المشاركون كيف أثر الببتيد العصبي المشتق من الإنسان ، الببتيد المرتبط بجين الكالسيتونين ، على ضراوة المكورات العنقودية الذهبية في نموذج أنسجة RHE51. قام آخرون بالتحقيق في الآثار الوقائية لتدخلات البروبيوتيك على عدوى الزائفة الزنجارية في ظهارة القرنية البشرية14. وفي الوقت نفسه ، من منظور متعدد الميكروبات ، درست مجموعات مختلفة تأثيرات الأغشية الحيوية للأنواع المختلطة على ركائز الأنسجة المختلفة2،3،7،13.

بشكل عام ، توثق هذه البروتوكولات والدراسات المشار إليها أعلاه مجموعة واسعة من التطبيقات لنماذج الأنسجة العضوية للتحقيق في تفاعلات المضيف والمسببات الممرضة. على الرغم من أن الدراسات أظهرت أن نماذج EpiSkin ، وخاصة نموذج الجلد RHE ، تتمتع بقابلية تطبيق جيدة لاختبار مستحضرات التجميل للتآكل / التهيج52،53،54،55 ، إلا أن بعض القيود موجودة بين هذه النباتات والنباتات التفاعلية للأنسجة خارج الجسم الحي في العالم الحقيقي أو غيرهم من الموردين للأنسجة المتاحةتجاريا 56،57. أحد القيود الواضحة هو أن جميع نماذج الأنسجة المتاحة تجاريا يتم إنشاؤها من خطوط الخلايا في بيئة معقمة "خالية من الجراثيم" ، مما يعني أن الأنسجة لم تتعرض أبدا للاضطرابات الميكروبية: قد يؤدي ذلك إلى تفاقم أي استجابة التهابية في المضيف ، بما يتجاوز بكثير ما يمكن رؤيته في الجسم الحي أو بعد تحفيز نباتات الأنسجة خارج الجسم الحي 57. على العكس من ذلك ، لن تحتوي أنظمة النماذج المختبرية هذه على طبقات ضامة أساسية أو الأوعية الدموية التي يمكن للمرء أن يرتبط بها الأنسجة في الجسم الحي ، والخصائص التي يمكن الحفاظ عليها أثناء استخلاص الأنسجة خارج الجسم الحي ، والميزات التي تؤثر على الاستجابات الالتهابية. في الواقع ، سلطت مراجعة منهجية حديثة الضوء على أنه يجب النظر بعناية في استخدام نماذج الأنسجة مع الأوعية الدموية المناسبة التي تم إنشاؤها باستخدام تقنيات هندسية مختلفة ، بما في ذلك الموادالحيوية 58. على سبيل المثال ، استخدمت إحدى الدراسات الحديثة مصفوفة قائمة على الفيبرين مدمجة في الخلايا الليفية اللثوية والخلايا البطانية للأوعية الدموية الدقيقة لإنشاء نسيج اللثة الوعائي المكافئ. وصف المؤلفون استجابة التهابية تفاضلية في النموذج بعد التعرض للكائنات الحية الدقيقة المرتبطة بالصحةأو الأمراض 59. من وجهة نظر تجارية ، توجد الآن نماذج أكثر تعقيدا ، مثل "نموذج T-Skin" ، الذي يحتوي على نسيج كامل السماكة يتكون من أدمة تتكون من الخلايا الليفية المغطاة بالبشرة. سيكون من المثير للاهتمام أن نرى كيف تقارن هذه النماذج المعقدة بأنظمة البشرة فقط.

على الرغم من عدم وجود نموذج مثالي ، إلا أن نماذج الأنسجة العضوية تمثل بدائل واعدة للاختبارات قبل السريرية ، بما يتماشى مع الإطار الذي حددته R الثلاثة ، للاستبدال والتقليل والتنقيح في إجراء البحوث على. تحقيقا لهذه الغاية ، على الرغم من أن النماذج الحيوانية توفر رؤى مهمة حول الطبيعة الفيزيولوجية المرضية المعقدة للأمراض البشرية المرتبطة بالغشاء الحيوي ، إلا أنها تأتي مع عيوب واضحة. هذه النماذج ثلاثية الأبعاد قابلة للتلاعب بسهولة ، مما يسمح بإجراء تغييرات كبيرة ودقيقة في التحقيقات دون موافقة أخلاقية. يمكن أن يؤدي الجمع بين هذه النماذج وأنظمة الأغشية الحيوية المعقدة الحالية الموضحة أعلاه إلى تحسين فهمنا لتفاعلات المضيف والممرض بشكل كبير والتنبؤ بشكل أفضل بنجاح العلاجات الجديدة قبل التحقيقات في الجسم الحي .

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود المؤلفون أن يشكروا Haleon على تمويل دعمهم لسعيد القحطاني لإدارة المشاريع المرتبطة بنماذج الأنسجة الموصوفة، وكذلك وزارة التربية والتعليم في المملكة العربية السعودية لتمويل الدكتوراه لمهنا الشهري.

المواد

أقراص 4368814 CM0331B أجار

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
هيدروكسيباتيت 13 مم (HA)Plasma Biotal Limitedn / a (مصنوعة حسب الطلب)الركيزة لتشكيل الأغشية الحيوية عن طريق الفم ، تحاكي سطح السن
إبرة 19 جم (40 مم)   ؛VWR613-2028تستخدم للمساعدة في إزالة أقراص HA من الألواح وقطع الأنسجة من إدخالات
24 لوحة ميكروتيتر مسطحة القاع المعالجة جيدا مع أغطية   ؛مستلزمات المختبرات العلمية3524 (عبوة من 100)ألواح لزراعة الأغشية الحيوية وتجارب زراعة الأنسجة
المشتركة حبات زجاجية مغسولة بالحمض (425-600 مو ؛ م)ميرك: سيجما ألدريتشG8772لتحلل الأنسجة لتحسين إنتاجية استخراج الحمض النووي الريبي   ؛  
Actinomyces naeslundii DSM 17233 معهد لايبنيز DSMZن / أواحدة من الكائنات الحية الدقيقة المستخدمة في نموذج الأغشية الحيوية المعقدة
مطحنة الخرزة 24 الخالط (أو ما يعادلها)  فيشر ساينتفيك15-340-163لتحلل الأنسجة لتحسين إنتاجية استخراج الحمض النووي الريبي   ؛  
Bijouxes  (7 مل)Greiner Bio-One189170 (700 لكل كيس)تستخدم لصوتنة الأغشية الحيوية   ؛  
مجموعة تخليق (كدنا) (عالية السعة)Thermo Fisher Scientific(ل 200 تفاعل)تخليق (كدنا) من قاعدة الحمض النووي
الريبي الأنسجة كولومبيا بلود أجار (CBA)  Thermo Fisher Scientific(ل 500 جرام)تستخدم لتحضير ألواح CBA لزراعة الكائنات الحية الدقيقة الهوائية دم
الحصان منزوع الرجفانE & O LaboratoriesDHBتستخدم لتكملة ألواح CBA و FAA لزراعة الكائنات الحية الدقيقة الهوائية واللاهوائية
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (dPBS: بدون CaCl 2< / sub > و MgCl 2< / sub>)Merck: Sigma-AldrichDB537dPBS للزراعة المشتركة للخلية مع الأغشية الحيوية الصوتية
Fusobacterium nucleatum ATCC 10953مجموعة الثقافة من النوع الأمريكيn / aواحدة من الكائنات الحية الدقيقة المستخدمة في نموذج الأغشية الحيوية المعقد
Fusobacterium nucleatum subspecies (subspp.) vincentii DSM 19507Leibniz Institute DSMZn / aواحدة من الكائنات الحية الدقيقة المستخدمة في نموذج الأغشية الحيوية المركب
GraphPad Prism (الإصدار 10)GraphPad Software، Incn / aلإنشاء الرسم البياني وتحليلات البيانات  
طقم IL-8 ELISA البشري (طقم ELISA غير المطلي مع لوحات) ThermoFisher Scientific (Invitrogen)88-8086-86 (ل 10 × 96 اختبارات) مجموعةELISA ولوحات لتقييم البروتين لوسائط الأنسجة المستهلكة
الظهارة الفموية البشرية (HOE)   ؛Episkinn / a (صنع حسب الطلب)الأنسجة الظهارية المستخدمة لنظام نموذج الزراعة
المشتركة حلقات التلقيح (يمكن التخلص منها ، 10 وميكرو ؛ L ، أو ما يعادلها)  فيشر 12870155 العلمي (عبوة من 1000)للاستزراع الميكروبيولوجي في الوسائط الصلبة والسائلة
MicroAmp Fast Reaction 96-well qPCR (0.1 مل)  Thermo FisherScientific 4346907 (ل 10 لوحات)لتنميط التعبير الجيني qPCR للأنسجة
حبات MicrobankPro-Lab DiagnosticsPL.170تخزين الكائنات الحية الدقيقة وحفظها   ؛
ماء خال من النوكليازThermo Fisher ScientificAM9935 (10 × 1.5 مل) ماءمن الدرجة RT-PCR لتجارب qPCR   ؛
أطباق بتري (90 مم)فيشر ساينتيك (Sterilin) 11309283 (عبوة من 500)تستخدم لتحضير ألواح أجار للاستزراع الميكروبي
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)ثيرمو فيشر العلمي   ؛18912014 (عبوة من 100 قرص)PBS لتوحيد الكائنات الحية الدقيقة وخطوات غسل الأغشية الحيوية
مجموعة صغيرة من RneasyQiagen74106 (ل 250 تفاعلا)طقم استخراج الحمض النووي الريبي القائم على العمود للأنسجة   ؛
معهد روزويل بارك التذكاري 1640متوسط ميرك: Sigma-AldrichR7755-10L (ل 10 لتر)  وسائل الإعلام لثقافة الأغشية الحيوية 
مصفوفة ملفات تعريف RT2Qiagen330171 (حسب الطلب)مصفوفة qPCR تحتوي على بادئات جاهزة لتنميط التعبير الجيني
قاعدة أجار Schaedler anaerobeميرك: Sigma-Aldrich (Millipore)91019 (ل 500 g)تستخدم لتحضير ألواح أجار اللاهوائية Fastdious   ؛
Schaedler مرق anaerobeThermo Fisher Scientific CM0497B (ل 500 جم) وسائلالإعلام السائلة لنمو الكائنات الحية الدقيقة اللاهوائية
أنبوب Bou-Ring Boadbug O   ؛مستلزمات المختبرات العلميةZ763837-1000EA (عبوة من 1000)للاستخدام في مطحنة الخرزة 24 الخالط ، لتحلل الأنسجة
حمام صوتيةفيشر Scientific (Fisherbrand)n / aلصوتنة الأغشية الحيوية من أقراص HA   ؛
المكورات العقدية intermedius DSM 20753 معهد لايبنيز DSMZن / أواحدة من الكائنات الحية الدقيقة المستخدمة في نموذج الأغشية الحيوية المعقد
Streptococcus mitis NCTC 12261المجموعة الوطنية لثقافات النوعن / أواحدة من الكائنات الحية الدقيقة المستخدمة في نموذج الأغشية الحيوية المعقد
Streptococcus oralis NTCC 11427   ؛المجموعة الوطنية لثقافات النوعن / أواحدة من الكائنات الحية الدقيقة المستخدمة في نموذج الأغشية الحيوية المعقدة
SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX) PCRBiosystemsPB20.12SYBR-green mix for qPCR   ؛
مرق تود هيويتميرك: سيجما ألدريتشT1438   ؛وسائل الإعلام لثقافة الأغشية الحيوية 
مرق الصويا التربتون (TSB) متوسطMerck: Sigma-Aldrich22092 (ل 500 g)وسائط سائلة لنمو الكائنات الحية الدقيقة الهوائية
ملاقط (150 مم ، الفولاذ المقاوم للصدأ ، مسننة)RS-Pro   ؛545-187تستخدم لنقل أقراص HA وإدراج الأنسجة / مستخلصات الأنسجة
أنابيب عالمية & nbsp ؛ (30 مل)Greiner Bio-One201150 (400 لكل كيس)أوعية لزراعة الكائنات الحية الدقيقة في الثقافة السائلة 
Veillonella dispar NCTC 11831المجموعة الوطنية لثقافات النوعn / a'أحدالكائنات الحية الدقيقة المستخدمة في نموذج الأغشية الحيوية المركب
& beta ;-metacapthoethanolMerck: تعطيل Sigma-AldrichM3148RNase في عينات الأنسجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moyes, D. L., et al. A biphasic innate immune MAPK response discriminates between the yeast and hyphal forms of candida albicans in epithelial cells. Cell Host Microbe. 8 (3), 225-235 (2010).
  2. Morse, D. J., et al. Denture-associated biofilm infection in three-dimensional oral mucosal tissue models. J Med Microbiol. 67 (3), 364-375 (2018).
  3. Brown, J. L., et al. Biofilm-stimulated epithelium modulates the inflammatory responses in co-cultured immune cells. Sci Rep. 9 (1), 15779(2019).
  4. Yadev, N. P., Murdoch, C., Saville, S. P., Thornhill, M. H. Evaluation of tissue engineered models of the oral mucosa to investigate oral candidiasis. Microb Pathog. 50 (6), 278-285 (2011).
  5. Schaller, M., Zakikhany, K., Naglik, J. R., Weindl, G., Hube, B. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia. Nat Protoc. 1 (6), 2767-2773 (2006).
  6. Brown, J. L., et al. Candida auris phenotypic heterogeneity determines pathogenicity in vitro. mSphere. 5 (3), e00371-e00420 (2020).
  7. Brown, J. L., et al. Assessing the inflammatory response to in vitro polymicrobial wound biofilms in a skin epidermis model. NPJ Biofilms Microbiomes. 8 (1), 19(2022).
  8. Butcher, M. C., et al. Antifungal-loaded calcium sulfate beads as a potential therapeutic in combating candida auris. Antimicrob Agents Chemother. 66 (1), e0171321(2022).
  9. Duckney, P., et al. The role of the skin barrier in modulating the effects of common skin microbial species on the inflammation, differentiation and proliferation status of epidermal keratinocytes. BMC Res Notes. 6, 474(2013).
  10. Meloni, M., Balzaretti, S., Collard, N., Desaint, S., Laperdrix, C. Reproducing the scalp microbiota community: Co-colonization of a 3D reconstructed human epidermis with c. Acnes and m. Restricta. Int J Cosmet Sci. 43 (2), 235-245 (2021).
  11. Pedrosa, A. F., et al. Malassezia colonisation on a reconstructed human epidermis: Imaging studies. Mycoses. 62 (12), 1194-1201 (2019).
  12. Schaller, M., Weindl, G. Models of oral and vaginal candidiasis based on in vitro reconstituted human epithelia for the study of host-pathogen interactions. Methods Mol Biol. 470, 327-345 (2009).
  13. Rosca, A. S., et al. Six bacterial vaginosis-associated species can form an in vitro and ex vivo polymicrobial biofilm that is susceptible to thymbra capitata essential oil. Front Cell Infect Microbiol. 12, 824860(2022).
  14. Paterniti, I., et al. Protective effect of probiotics against pseudomonas aeruginosa infection of human corneal epithelial cells. Int J Mol Sci. 25 (3), 1770(2024).
  15. Pellegatta, G., et al. Evaluation of human esophageal epithelium permeability in presence of different formulations containing hyaluronic acid and chondroitin sulphate. Med Devices (Auckl). 13, 57-66 (2020).
  16. Jensen, C., Teng, Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, (2020).
  17. Mountcastle, S. E., et al. A review of co-culture models to study the oral microenvironment and disease. J Oral Microbiol. 12 (1), 1773122(2020).
  18. Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. 3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications. Front Physiol. 13, 836480(2022).
  19. Langfeldt, D., et al. Health- and disease-associated species clusters in complex natural biofilms determine the innate immune response in oral epithelial cells during biofilm maturation. FEMS Microbiol Lett. 360 (2), 137-143 (2014).
  20. Ramage, G., et al. The epithelial cell response to health and disease associated oral biofilm models. J Periodontal Res. 52 (3), 325-333 (2017).
  21. Shang, L., et al. Multi-species oral biofilm promotes reconstructed human gingiva epithelial barrier function. Sci Rep. 8 (1), 16061(2018).
  22. Myers, S., et al. Immunomodulatory streptococci that inhibit cxcl8 secretion and NF-kappaB activation are common members of the oral microbiota. J Med Microbiol. 70 (3), 001329(2021).
  23. Tang, Y. L., Sim, T. S., Tan, K. S. Oral streptococci subvert the host innate immune response through hydrogen peroxide. Sci Rep. 12 (1), 656(2022).
  24. Peyyala, R., Kirakodu, S. S., Novak, K. F., Ebersole, J. L. Oral microbial biofilm stimulation of epithelial cell responses. Cytokine. 58 (1), 65-72 (2012).
  25. Yee, M., Kim, S., Sethi, P., Duzgunes, N., Konopka, K. Porphyromonas gingivalis stimulates il-6 and il-8 secretion in gsm-k, hsc-3 and h413 oral epithelial cells. Anaerobe. 28, 62-67 (2014).
  26. Groeger, S., Jarzina, F., Domann, E., Meyle, J. Porphyromonas gingivalis activates NF-kappaB and MAPK pathways in human oral epithelial cells. BMC Immunol. 18 (1), 1(2017).
  27. Groeger, S., Zhou, Y., Ruf, S., Meyle, J. Pathogenic mechanisms of fusobacterium nucleatum on oral epithelial cells. Front Oral Health. 3, 831607(2022).
  28. Li, X., et al. Saliva-derived microcosm biofilms grown on different oral surfaces in vitro. NPJ Biofilms Microbiomes. 7 (1), 74(2021).
  29. Krishnamoorthy, A. L., Lemus, A. A., Solomon, A. P., Valm, A. M., Neelakantan, P. Interactions between Candida albicans and Enterococcus faecalis in an organotypic oral epithelial model. Microorganisms. 8 (11), 1771(2020).
  30. Brown, J. L., et al. Generation of multi-species oral bacteria biofilm models. Methods Mol Biol. 2588, 187-199 (2023).
  31. Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. The estimation of the bactericidal power of the blood. J Hyg (Lond). 38 (6), 732-749 (1938).
  32. Lukic, D., Karygianni, L., Flury, M., Attin, T., Thurnheer, T. Endodontic-like oral biofilms as models for multi-species interactions in endodontic diseases. Microorganisms. 8 (5), 674(2020).
  33. Sherry, L., et al. Viable compositional analysis of an eleven-species oral polymicrobial biofilm. Front Microbiol. 7, 912(2016).
  34. Brown, J. L., et al. An in vitro evaluation of denture cleansing regimens against a polymicrobial denture biofilm model. Antibiotics (Basel). 11 (1), 113(2022).
  35. Ammann, T. W., Gmur, R., Thurnheer, T. Advancement of the 10-species subgingival zurich biofilm model by examining different nutritional conditions and defining the structure of the in vitro biofilms. BMC Microbiol. 12, 227(2012).
  36. Montelongo-Jauregui, D., Srinivasan, A., Ramasubramanian, A. K., Lopez-Ribot, J. L. An in vitro model for oral mixed biofilms of candida albicans and streptococcus gordonii in synthetic saliva. Front Microbiol. 7, 686(2016).
  37. Rumbaugh, K. P., Sauer, K. Biofilm dispersion. Nat Rev Microbiol. 18 (10), 571-586 (2020).
  38. Chua, S. L., et al. Dispersed cells represent a distinct stage in the transition from bacterial biofilm to planktonic lifestyles. Nat Commun. 5, 4462(2014).
  39. Buskermolen, J. K., Janus, M. M., Roffel, S., Krom, B. P., Gibbs, S. Saliva-derived commensal and pathogenic biofilms in a human gingiva model. J Dent Res. 97 (2), 201-208 (2018).
  40. Rosier, B. T., Buetas, E., Moya-Gonzalvez, E. M., Artacho, A., Mira, A. Nitrate as a potential prebiotic for the oral microbiome. Sci Rep. 10 (1), 12895(2020).
  41. Rosier, B. T., Moya-Gonzalvez, E. M., Corell-Escuin, P., Mira, A. Isolation and characterization of nitrate-reducing bacteria as potential probiotics for oral and systemic health. Front Microbiol. 11, 555465(2020).
  42. Young, T., et al. Candida albicans as an essential "keystone" component within polymicrobial oral biofilm models. Microorganisms. 9 (1), 59(2020).
  43. Marsh, P. D., Lewis, M. A., Rogers, H., Williams, D., Wilson, M. Marsh and Martin's oral microbiology-e-book: Marsh and Martin's oral microbiology-e-book. , Elsevier Health Sciences. (2016).
  44. Johnston, W., et al. In vitro bacterial vaginosis biofilm community manipulation using endolysin therapy. Biofilm. 5, 100101(2023).
  45. Janus, M. M., Willems, H. M., Krom, B. P. Candida albicans in multi-species oral communities; a keystone commensal. Adv Exp Med Biol. 931, 13-20 (2016).
  46. Delaney, C., et al. Fungi at the scene of the crime: Innocent bystanders or accomplices in oral infections. Curr Clin Microbiol Rep. 5, 190-200 (2018).
  47. Luo, A., Wang, F., Sun, D., Liu, X., Xin, B. Formation, development, and cross-species interactions in biofilms. Front Microbiol. 12, 757327(2021).
  48. Sadiq, F. A., De Reu, K., Burmolle, M., Maes, S., Heyndrickx, M. Synergistic interactions in multi-species biofilm combinations of bacterial isolates recovered from diverse food processing industries. Front Microbiol. 14, 1159434(2023).
  49. Liang, P. P., et al. A trichophyton rubrum infection model based on the reconstructed human epidermis - EpiSkin(r). Chin Med J (Engl). 129 (1), 54-58 (2016).
  50. Lerebour, G., Cupferman, S., Bellon-Fontaine, M. N. Adhesion of staphylococcus aureus and staphylococcus epidermidis to the EpiSkin reconstructed epidermis model and to an inert 304 stainless steel substrate. J Appl Microbiol. 97 (1), 7-16 (2004).
  51. N'diaye, A. R., et al. Skin-bacteria communication: Involvement of the neurohormone calcitonin gene-related peptide (cgrp) in the regulation of staphylococcus epidermidis virulence. Sci Rep. 6, 35379(2016).
  52. Géniès, C., et al. Comparison of the metabolism of 10 cosmetics-relevant chemicals in EpiSkin s9 subcellular fractions and in vitro human skin explants. J Appl Toxicol. 40 (2), 313-326 (2020).
  53. Alépée, N., Grandidier, M. -H., Cotovio, J. Usefulness of the EpiSkin reconstructed human epidermis model within integrated approaches on testing and assessment (IATA) for skin corrosion and irritation. Toxicol Vitro. 54, 147-167 (2019).
  54. Spielmann, H., et al. The ECVAM international validation study on in vitro tests for acute skin irritation: Report on the validity of the EpiSkin and epiderm assays and on the skin integrity function test. Alternatives to Laboratory Animals. 35 (6), 559-601 (2007).
  55. Cotovio, J., Grandidier, M. -H., Portes, P., Roguet, R., Rubinstenn, G. The in vitro acute skin irritation of chemicals: Optimisation of the EpiSkin prediction model within the framework of the ECVAM validation process. Alt Lab Anim. 33 (4), 329-349 (2005).
  56. Netzlaff, F., Lehr, C. M., Wertz, P. W., Schaefer, U. F. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and epiderm: An evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 60 (2), 167-178 (2005).
  57. Larson, P. J., Chong, D., Fleming, E., Oh, J. Challenges in developing a human model system for skin microbiome research. J Invest Dermatol. 141 (1), 228-231.e4 (2021).
  58. Dechelette, C., Smirani, R., Medina, C., Naveau, A. Cellularized biomaterials used as gingival connective tissue substitutes in vivo: A systematic review. Tissue Eng Part B Rev. , (2024).
  59. Makkar, H., Lim, C. T., Tan, K. S., Sriram, G. Modeling periodontal host-microbe interactions using vascularized gingival connective tissue equivalents. Biofabrication. 15 (4), (2023).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة