تحدد هذه المخطوطة بروتوكولا لإعداد مكتبة ATAC-seq للعدلات من نخاع عظم الفئران ، بهدف ضمان بقاء العدلات المثلى وجودة المكتبة العالية. يقدم إرشادات خطوة بخطوة حول إعداد BMC ، والفرز المناعي المغناطيسي ، وبناء المكتبة ، ويعمل كدليل قيم ، خاصة للوافدين الجدد لدراسة العدلات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
إعداد مكتبة ATAC-Seq للعدلات المشتقة من نخاع عظم الفئران
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مقايسة الكروماتين الذي يمكن الوصول إليه من Transposasse مع التسلسل (ATAC-seq) هي تقنية قوية وعالية الإنتاجية لتقييم إمكانية الوصول إلى الكروماتين وفهم التنظيم الجيني. تخضع العدلات ، كنوع حاسم من الكريات البيض في الاستجابات المناعية ، لتغييرات معمارية كبيرة في الكروماتين أثناء التمايز والتنشيط ، مما يؤثر بشكل كبير على التعبير الجيني الضروري لوظائفها. كان ATAC-seq مفيدا في الكشف عن عوامل النسخ الرئيسية في نضوج العدلات ، والكشف عن التوقيعات اللاجينية الخاصة بمسببات الأمراض ، وتحديد الأهداف العلاجية لأمراض المناعة الذاتية. ومع ذلك ، فإن حساسية العدلات للوسط الخارجي تعقد إنتاج بيانات ATAC-seq عالية الجودة. هنا ، نقترح بروتوكولا قابلا للتطوير لإعداد مكتبات ATAC-seq من العدلات المشتقة من نخاع عظام القوارض ، والتي تتميز بالفصل المغناطيسي المناعي المحسن لضمان بقاء الخلايا المثلى والمكتبات عالية الجودة. تتم مناقشة العناصر الحيوية التي تؤثر على جودة المكتبة ومبادئ التحسين للتوسع المنهجي بالتفصيل. سيدعم هذا البروتوكول الباحثين الراغبين في دراسة بنية الكروماتين وإعادة البرمجة اللاجينية للعدلات ، وتطوير الدراسات في علم المناعة الأساسي والسريري.
المقدمة
تعد العدلات واحدة من أكثر أنواع الخلايا المناعية وفرة وأهمية في الفقاريات ، حيث تشكل 50٪ -70٪ من الكريات البيض البشرية1. تلعب العدلات دورا مركزيا في اكتشاف الكائنات الحية الدقيقة والقضاء عليها في العوائف. أثناء تعفن الدم ، تكون العدلات الناضجة من بين المستجيبين الأوائل2. يتحركون بسرعة إلى مواقع العدوى عبر الانجذاب الكيميائي3 ، حيث يكافحون مسببات الأمراض عن طريق تناول الكائنات الحية الدقيقة (البلعمة) ، وإنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية المعتمدة على NADPH أوكسيديز (رشقات نارية في الجهاز التنفسي) ، وإفراز الحبيبات (التحلل) ، وتشكيل مصائد خارج الخلية (NETs) التي تلتقط و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
امتثلت جميع الإجراءات الحيوانية المعروضة أدناه مع المبادئ التوجيهية واللوائح الوطنية للأخلاقيات ورعاية ، والتي تمت الموافقة عليها من قبل لجنة أخلاقيات أبحاث رعاية التابعة لجامعة العاصمة الطبية ، بكين ، الصين (sjtkl11-1x-2022 (060)).
1. تحضير معلقات خلايا نخاع العظم (BMC)
- اختر ذكور الفئران C57BL / 6J الذين تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع ووزنهم 19-21 جم. قتل الفئران الرحيم باستخدام حجرة ثاني أكسيد الكربون2 ، متبوعا بخلع عنق الرحم بعد اختفاء المنعكس العميق. تطهيرها برذاذ الإيثانول بنسبة 70٪ على حصيرة التشريح.
- استخدم مقصا صغيرا وملقطا لفصل عظم الفخذ بعناية عن مفص....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم استخدام البروتوكول الموضح لعزل العدلات من نخاع العظام للفئران C57BL / 6 ومقارنة تباينها في إمكانية الوصول إلى الكروماتين قبل وبعد تحفيز عديدات السكاريد الدهنية (LPS) عبر ATAC-seq. عادة ، يمكن حصاد 2 × 107 BMCs من كل من عظم الفخذ لفأر C57BL / 6 البالغ من العمر 6-8 أسابيع ، وبالتالي ، يمكن عزل 2-5 × 106 عدلات. من بينها ، يتم استخدام 1 × 105 خلايا ل ATAC-seq ، بينما يمكن تخصيص الخلايا الفائضة لتحليل العدلات الشامل.
تم اعتماد التنميط المناعي FACS لتحديد نقاء الع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تشير هذه المخطوطة إلى بروتوكول تجريبي لإعداد مكتبات ATAC-seq المحسنة للعدلات المشتقة من عينات نخاع عظم القوارض. نظرا لكون العدلات شديدة الحساسية والخلايا المناعية التي يتم تنشيطها بسهولة ، أعطت جهود التحسين الأولوية للحفاظ على صلاحية العدلات المعزولة. قد يؤدي العلاج غير السليم إلى NETosis وأشكال أخرى من موت الخلايا ، مما يؤدي إلى إطلاق كميات كبيرة من الحمض النووي غير الكروماتيني وبالتالي المساهمة في ضوضاء الخلفية23. قمنا بتبسيط الإجراء قبل استخراج النواة واخترنا ع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال منح من برنامج البحث والتطوير التابع للجنة التعليم في بلدية بكين (KZ202010025041) والمعاهد الصينية للبحوث الطبية في بكين (المنحة رقم 10). CX24PY29).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 0.4٪ Trypan Blue | Scientific | T10282 | |
| 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات | Biosharp | BL302A | |
| 20 نقطة أساس & ndash ؛ 5000 نقطة أساس علامة محاذاة | بيوبتيك | C109102-100A | محلل شظايا الحمض النووي يدعم المنتجات |
| 5k علامة الحجم (سلم قياسي 50 نقطة أساس) | محلل شظايا | بيوبتيك | C109101-100A |
| Amplicons حبات تنقية | Beckman | A63881 | Amplicons Purification Beads عبارة عن مجموعة تنقية للحمض النووي للحصول على منتجات DNA عالية الجودة. |
| Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure ، الماوس | miltenyi | 130-120-337 | تم تطوير الماوس Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPure للاختيار الإيجابي أو استنفاد عدلات الفأر من معلقات خلية واحدة من نخاع عظم الفأر. |
| مضاد للفأر CD11b-BV605 (1:200) | BD | Cat # 563015 | |
| مضاد للفأر CD48-PE-Cy7 (1:400) | BD | Cat # 560731 | |
| مضاد للفأر Ly6G-BV510 (1:200) | BD | Cat # 740157 | |
| C57BL / 6J فئران ، نوع بري ، عمره 8 أسابيع ، ذكر | معهد علوم المختبر ، الأكاديمية الصينية للعلوم الطبية | معهد علوم المختبر ، الأكاديمية الصينية للطب Sciences | |
| DNA Separation Buffer | Bioptic | C104406 | محلل شظايا الحمض النووي يدعم المنتجات |
| المشتقة من E. coli مشتق LPS (النمط المصلي 0111: B4) | Sigma-Aldrich | Cat # L-2630 | |
| الكاشف الكمي للحمض النووي | فازيم | EQ111 | Quantitative Reagentt عبارة عن مجموعة فحص كمية مضان للحمض النووي مزدوج الشريطة (dsDNA) بسيطة وحساسة ودقيقة. |
| عازلة تحلل كريات الدم الحمراء (10x) | BioLegend | Cat # 420301 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | Cat # 10099141C | |
| أعمدة فصل MS | miltenyi | 130-042-201 | تم تصميم أعمدة MS للاختيار الإيجابي للخلايا. |
| RPMI 1640 متوسط | Gibco | C11875500BT | |
| S2 هلام إبرة الرحل | الحمض النووي C105101 | Bioptic المنتجات الداعمة | |
| الأدوات الجراحية: مشرط ، مقص تشريح ، مقص تشريح دقيق ، ملقط دقيق ، ملقط تشريحي حاد ، حامل إبرة | فيشر https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools العلمي | يمكن شراؤها من موردين مؤهلين آخرين | |
| حقنة (1 & nbsp ؛ م) | فيشر العلمي ؛ | https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464 | يمكن شراؤها من موردين مؤهلين آخرين |
| TruePrepTM DNA Library Prep Kit V2 ل Illumina | vazyme | TD501-01 | TruePrep DNA Library Prep Kit V2 for Illumina عبارة عن مجموعة مصممة لهذا الغرض تم تطويرها خصيصا لمنصة التسلسل عالية الإنتاجية من Illumina. باستخدام المجموعة ، يمكن إعداد الحمض النووي في مكتبات التسلسل المخصصة لمنصة التسلسل عالية الإنتاجية من Illumina. |
| مجموعة فهرس TruePrepTM V2 ل Illumina | vazyme | TD202 | TruePrep Index Kit V2 ل Illumina عبارة عن مجموعة لمجموعة TruePrep DNA Library Prep Prep V2 ل Illumina. يمكن استخدامه لإعداد 96 مكتبة فهرس مزدوجة النهايات المختلفة. |
المراجع
- Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. Update on neutrophil function in severe inflammation. Front Immunol. 9, 2171(2018).
- Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. Ann Intern Med. 109 (2), 127-142 (1988).
- De Oliveira, S., Rosowski, E. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
