مقالة منهجية

جهاز تمدد متساوي المحور للفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للخلايا الحية عالية التكبير

DOI:

10.3791/67520

⸱

يونيو 13, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2University of Barcelona (UB), 3Department of Physics, King's College London, 4ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 5Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نقدم جهاز تمدد متساوي المحور متعدد الاستخدامات يتم تشغيله بالهواء المضغوط ومتوافق مع الفحص المجهري عالي الدقة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تتعرض الخلايا باستمرار للقوى الميكانيكية في المواقف الفسيولوجية والمرضية ، بما في ذلك مجموعة متنوعة من ضغوط الشد والضغط. هناك بحث نشط للغاية يستكشف كيفية استجابة الخلايا والأنسجة والتكيف مع مثل هذه الضغوط وكيف تتكامل هذه الاستجابات مع الإشارات الكيميائية الميكانيكية. وقد ولد هذا الحاجة إلى أدوات متطورة متوافقة مع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية وطرق الفحص المجهري ، مما يؤدي إلى إعادة إنتاج الضغوط الفسيولوجية في الدراسات المختبرية. تقدم هذه الدراسة تصميم ووظيفة وتوصيف جهاز تمدد متوافق مع الفحص المجهري البصري والفلوري عالي الدقة. تم تطوير العديد من أجهزة التمدد ، سواء كانت تعمل بالهواء المضغوط أو المحرك ، واستخدامها في هذا المجال. نقدم أحد هذه الأنظمة بالتفصيل ، بما في ذلك إرشادات التصميم ومجموعة متنوعة من التطبيقات وجميع الأدوات لتصنيع إعداد مماثل. يعتمد النظام على غشاء بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان قابل للتشوه (PDMS) ، يمتد بشكل متساو عند تطبيق الفراغ ، مما يجعل سلالة عينة متجانسة وقابلة للتكرار وخاضعة للرقابة. يوفر مجموعة متنوعة من ضغوط الشد ، من التمدد الفوري والفوري إلى دورات تحرير التمدد المتكررة للسعة والتردد المتحكم فيه. يسمح طلاء الركيزة ببروتينات الالتصاق ببذر الخلايا التي تحمل مراسلي الفلورسنت في جهاز التمدد وإجراء التصوير الحي لهذه الخلايا عند التمدد باستخدام مجاهر مضان عالية التكبير. يمكن أيضا تطبيق الضغوط الانضغاطية عن طريق ترك العينة تتكيف مع التمدد ثم إطلاقها لاحقا أو عن طريق زرع العينة على ركيزة ممتدة مسبقا قبل إطلاق التمدد. يتيح الزخرفة الطبوغرافية الإضافية لركيزة PDMS تصوير نفس العينة في أوضاع مجهرية مختلفة (مثل التألق والفحص المجهري الإلكتروني). يمكن أيضا ربط المواد الهلامية بولي أكريلاميد بغشاء PDMS ، مما يؤدي إلى تمدد الخلايا المصنفة على ركائز ذات صلابة مختلفة. بشكل عام ، من خلال تطبيق ضغوط الشد الخاضعة للرقابة على العينات الحية ، يمكن لجهاز التمدد هذا ، إلى جانب الفحص المجهري الفلوري عالي الجودة ، معالجة مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأسئلة في علم الأحياء الميكانيكي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستخدم أغشية polydimethylsiloxane الرقيقة القابلة للتشوه (PDMS) على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من أجهزة التمدد المصنوعة حسب الطلب1،2،3 ، حيث أن PDMS هي مادة خاملة متوافقة حيويا راسخة متوافقة مع التصوير المجهري. هنا ، مثل العديد من الآخرين4،5،6،7،8،9 ، يتم استخدام المفهوم البسيط لتطبيق الفراغ لتشويه الغشاء لتجميع جهاز تمدد متساوي المحور قوي ويمكن التحكم فيه. عن طريق تثبيت الغشاء داخل حلقة دائرية وإغلاق الحلقة أعلى "عمود التمدد" (الشكل 1A-C) ، يتم تحقيق تشوه موحد ومنظحف. تقع العينة البيولوجية في مركز الحلقة على غشاء PDMS القائم بذاته ، والذي يتيح التصوير باستخدام الفحص المجهري الفلوري. هنا ، يتم تقديم إعدادين مخصصين ، متوافقين مع نموذجين لمرحلة المجهر (الشكل 1D-F) ومتعدد الاستخدامات للغاية من حيث التطبيقات البيولوجية. في حين أن التصميم العام بسيط وقابل للنقل إلى مراحل أخرى ، يجب اختيار أبعاد الإعداد بعناية لتناسب متطلبات التصوير. بمجرد تحقيقه ، يجب تمييز ملف تعريف الإجهاد للجهاز والتحقق من صحته.

بصرف النظر عن الإعداد نفسه ، يتم تقديم طريقة بسيطة مصحوبة برمز Matlab لتوصيف حجم الإجهاد والتجانس والخواص التناحيج. يمكن استخدام جهاز التمدد لاحقا لتطبيق ضغوط الشد متساوية المحور على الأنظمة الاصطناعية10 ، أو الخلايا المفردة11،12 ، أو الطبقاتالأحادية 13 ، مع تسجيل الاستجابة البيولوجية للعينة بدقة زمانية مكانية عالية باستخدام الفحص المجهري الفلوري. يمكن طلاء الغشاء ببروتينات التصاق المصفوفة خارج الخليةالمختلفة 14،15. يمكن إضافة ميزات إضافية وفقا لاحتياجات الدراسة البيولوجية. على سبيل المثال ، يمكن ربط المواد الهلامية بولي أكريلاميد بغشاء PDMS لضبط صلابة الركيزة أثناء التمدد13،16 ، ويمكن تصنيع أغشية PDMS بشبكة مرجعية مرقمة للتصوير الخلفي لنفس منطقة الاهتمام داخل العينة12. يمكن أيضا معالجة العينات الممتدة الثابتة عن طريق التلوين المناعي ثم إعادة تمديدها لاحقا للتصوير الفلوري17. يمكن التحكم في نمط التمدد المطبق ، بدءا من نبضة تمدد فورية واحدة إلى إجهاد دوري بأحجام أو ترددات أو أشكالمتفاوتة 14،16.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم المسرح وعمود التمدد (الشكل 1)

  1. صمم عمودا مطاطيا متوافقا في الأبعاد مع حجم المسرح / حوامل وتكوين الهدف. يتم عرض عمودي التمدد المحددين في الشكل 1 أ ، د.
    ملاحظة: تتوافق ملفات FreeCAD المتوفرة في هذا البروتوكول (المجلد التكميلي 1) مع مجاهر ومراحل نيكون التالية: Eclipse Ni-E المستقيم المجهز بمرحلة NI-SH-E ، و Eclipse Ti-E / B المقلوب المزود بمرحلة TI-S-ER ، الشكل 1 د. يمكن أن يكون المنشور ثلاثي الأبعاد (3D) مطبوعا ولكن قد يتشوه بعد الاستخدام المتكرر ؛ لن تعاني المشاركات القائمة على الألومنيوم من هذا العيب. تأكد من أنودة الأعمدة القائمة على الألومنيوم لمنع الأكسدة. يسمح التكوين العمودي بسعة أكبر للحركة. بالإضافة إلى ذلك ، يوفر التكوين العمودي تصويرا مباشرا للعينة بدون واجهة ، وهو أمر موات بصريا في حالة الركيزة الغشائية PDMS القابلة للتشوه. بدلا من ذلك ، في تكوين مقلوب ، يمر شعاع الإضاءة عبر غشاء PDMS (الشكل 1F) ؛ نظرا لأنه عند تطبيق التمدد ، سيتحرك غشاء PDMS ، يجب اختيار وسائط الغمر للهدف بعناية (أنواع الغمر الموصى بها في الماء ، الهواء أو الجلسرين ؛ لا ينصح بالغمر بالزيت بسبب عدم التوافق مع ركائز PDMS). يمكن تعديل الحوامل التجارية باستخدام فتحات لولبية إضافية ؛ احذر من استخدام المسمار البلاستيكي أو التفلون لتجنب الغبار أثناء الشد. قد يكون من الملائم تصميم حامل يتيح تركيب عمود التمدد أعلى المسرح ، كما هو موضح في الشكل 1E. ملف FreeCAD المقدم في هذا البروتوكول متوافق مع مرحلة المجهر المستقيم Eclipse Ni-E.
  2. تصميم حلقات تمدد (الشكل 1 ج) متوافقة في الحجم مع عمود التمدد (الشكل 1 أ ، ب). تتوافق ملفات FreeCAD المتوفرة في هذا البروتوكول مع المنشورات المقابلة (لتغطية الحلقات أثناء التعامل مع العينات ، يمكن اختيار قطرها لتكون متوافقة مع حجم طبق بتري).
    ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون الحلقة قائمة على الألومنيوم (بأكسيد الألومنيوم) أو مطبوعة ثلاثية الأبعاد. قم بتضمين حشوات بأقطار مناسبة لإغلاق عمود التمدد والحلقات بالمكنسة الكهربائية.
  3. اختياري: تصنيع وحدة تحكم في الفراغ. يتم توفير خريطة كهربائية لصندوق التحكم في الفراغ المستخدم في هذا البروتوكول في معلومات تكميلية (انظر المجلد التكميلي 2). يسمح بالتحكم اليدوي في مستوى الفراغ المطبق على جهاز التمدد.
    ملاحظة: يمكن أن توفر وحدات التحكم في التفريغ التجارية أيضا وظائف مماثلة ويمكن أن تكون مصحوبة عادة ببرنامج تحكم يتيح تطبيق مجموعة متنوعة من أنواع الإشارات (الجيبية ، المثلثة ، إلخ.) (فلويجنت ، كوبالت).

2. تصنيع الغشاء المطاطي

  1. تصميم لوحات دائرية (المواد الموصى بها: بولي ميثاكريلات ، PMMA). تأكد من أن هذه الألواح أعرض من الحلقات ومتوافقة في الحجم مع آلة طلاء الدوران (الشكل 2 أ). انظر الجدول 1 للاطلاع على الأبعاد المقترحة والمجلد التكميلي 3.
    ملاحظة: بالنسبة للمنشور 1 ، تم استخدام قطر 12 سم ؛ للمنشور 2 ، بقطر 18-21 سم. قبل كل استخدام وبين كل استخدام، يجب تنظيف الألواح بعناية باستخدام مناديل غير منسوجة و96٪ من الإيثانول. من المهم تجنب تراكم PDMS في الألواح ، وكذلك على الحدود وتحتها.
  2. قم بإعداد PDMS 1:10 واخلطه جيدا للحصول على مستحلب متجانس جدا (استخدم ملاعق التحريك الموصى بها).
    ملاحظة: لمدة 12 سم ، قم بإعداد 4.5 جم لكل طبق ؛ لألواح 18 سم ، 8 جم لكل طبق. لتحضير أطباق متعددة ، قم بإعداد PDMS إضافي ، على سبيل المثال 10 مل أكثر من اللازم ل 10 أطباق. للحصول على 10 أطباق بحجم 12 سم ، قم بإعداد 50 جم من المكون A و 5 جم من المكون B. من السهل استخدام أوعية كبيرة للماصة بسهولة. يجب ألا يحتوي الوعاء على غبار أو أي أوساخ أخرى قد تعيق الغزل والمعالجة المناسبين ل PDMS. استخدم قفازات من مواد متوافقة (تجنب اللاتكس ؛ قفازات الفينيل مناسبة) لضمان معالجة PDMS.
  3. ديغا لمدة لا تقل عن 1 ساعة باستخدام غرفة مفرغة.
    ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن طرد PDMS عند 0.2 × جم لمدة 5 دقائق باستخدام أنبوب سعة 50 مل ، ولكن احذر من أنه من المعقد شفط خليط PDMS من أنبوب مع حقنة الاستغناء (ضروري للخطوة 2.4). لا تقم بإزالة الغاز لفترة طويلة (لا تزيد عن ساعتين) بضوء مباشر لتجنب المعالجة المسبقة ل PDMS.
  4. طلاء يدور PDMS أعلى لوحات PMMA
    1. قم بتوزيع 4.2 مل أو 7.5 مل من PDMS منزوع الغازات فوق ألواح PMMA.
    2. قم بتدوير الألواح باستخدام الإعدادات الموصى بها التالية:
      1. طبقة تدور لمدة 5 ثوان عند 500 دورة في الدقيقة مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية.
      2. قم بتدوير الطبقة لمدة 1 دقيقة عند 500 دورة في الدقيقة بتسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية.
        ملاحظة: قد يكون من الملائم وضع علامة على مركز لوحة PMMA على جانبها السفلي لضمان توسيط الألواح أثناء الغزل والغزل المتجانس. الخطوة 2.4.2.1 ليست إلزامية خاصة إذا تعذر تعديل معلمة التسارع. يساعد على نشر PDMS قبل الدوران. ينتج عن هذا البروتوكول أغشية PDMS بسمك حوالي 140 ميكرومتر (تقاس بقياس التداخل ؛ انظر الشكل التكميلي 1 والجدول 2). يجب إجراء المعايرة قبل التجارب في حالة قيام نموذج أو معلمات المغطي الدوراني بخصائص غشاء مختلفة.
  5. قم بتخزين كل طبق في طبق بتري لتجنب تراكم الغبار والبلمرة طوال الليل عند 65 درجة مئوية داخل الفرن.
    ملاحظة: احذر من استخدام أطباق مقاومة للحرارة. ستؤثر حالة المعالجة على تشوه PDMS لمستوى فراغ معين مطبق.

3. شطيرة الغشاء في حلقات

  1. تصميم مواد التركيب.
    1. صمم حلقات PMMA ذات القطر الداخلي / الخارجي لوضع الغشاء الدائري PDMS المطلي بالدوران (الشكل 2 أ). انظر الأبعاد المقترحة في الجدول 1 والمجلد التكميلي 3.
    2. صمم دعامة تثبيت (الشكل 2 ب) تتناسب فوقها الحلقة ، وسيحدد الارتفاع أيضا التمدد المسبق عند تركيب الغشاء في الحلقة.
      ملاحظة: يمكن أن يكون دعم التركيب حلا بسيطا يعتمد على أدوات المختبر الموجودة (على سبيل المثال ، طبق بتري). الحل الأكثر أناقة هو طباعة الدعم ثلاثي الأبعاد (انظر ملف FreeCAD لهذا الجزء المقدم في هذا البروتوكول ، انظر المجلد التكميلي 3) ، حيث يمكن تحديد الارتفاع من قبل المستخدم وتغييره بسهولة (تم استخدام ارتفاع 10 مم في هذا البروتوكول للحلقات الصغيرة). يجب اختيار ارتفاع الجزء المركزي للدعامة أصغر من ارتفاع نصف الحلقة بحيث لا تلمس ركيزة PDMS الدعامة عند التركيب (انظر الاستخدام الإضافي في الخطوة 3.4.2). طابعة ثلاثية الأبعاد تستخدم خيوط حمض البولي لاكتيك (PLA) (انظر جدول المواد) مناسبة لهذا الغرض. يمكن أيضا تصميم حلقة القطع ، مطبوعة ثلاثية الأبعاد أيضا ، لتكون بمثابة دليل للمشرط (الشكل 2 أ).
    3. صمم وصنع أوزان نحاسية متوافقة في الحجم لممارسة الوزن على الحلقة أثناء تركيب الغشاء (الشكل 2C) وتؤدي إلى شد مسبق قابل للتكرار.
      ملاحظة: تتطابق ملفات FreeCAD المتوفرة هنا (انظر المجلد التكميلي 3) مع أبعاد الحلقة المعروضة في هذا البروتوكول.
  2. قم بإزالة غشاء PDMS من لوحة PMMA.
    1. قم بإعداد حلقات PMMA فوق ورقة من ورق المقعد الأبيض.
      ملاحظة: من المهم أن يظل المقعد والورق مسطحين لتجنب ملامسة الورق لغشاء PDMS أثناء التركيب.
    2. قم بالالتفاف بحذر حول حافة اللوحة بشفرة (مرة أو مرتين) ثم تتبع نفس الحافة باستخدام ملاقط حادة للتأكد من أن PDMS لديه قطع نظيف على طول محيطه بالكامل (الشكل 2 أ).
    3. استخدم الملقط لرفع الغشاء بعناية من حافة واحدة. بعد ذلك ، قم بتقشير حافة ورقة PDMS برفق بالإبهام لرفع الغشاء بالتساوي عند الحافة. افصل حافة الغشاء عن اللوحة على طول نصف محيط اللوحة (الشكل 2 أ).
      ملاحظة: سيساعد سكب بعض قطرات الإيثانول بنسبة 96٪ أسفل غشاء PDMS على رفع الغشاء دون كسره.
  3. جفف غشاء PDMS.
    1. امسح 96٪ من الإيثانول حول السطح العلوي بالكامل لحلقة PMMA المعدة مسبقا (الخطوة 3.2.1) ، باستخدام الأصابع لتوزيعها بالتساوي.
    2. قم بإزالة غشاء PDMS بعناية ، ورفعه من الحافة المرفوعة مسبقا (موضحة في الخطوة 3.2.3) ، وضعه بشكل متماثل على حلقة PMMA المغطاة بالإيثانول. قم بإزالة أي تجاعيد من PDMS ، ولكن تأكد من عدم شد الغشاء ؛ فقط تصويبها.
      ملاحظة: سيؤثر تطبيق التمدد المسبق في هذه المرحلة على تشوه PDMS لمستوى فراغ معين مطبق.
    3. بمجرد تجفيف الإيثانول تماما ، تأكد من أن غشاء PDMS ملتصق بإحكام بحلقة PMMA.
  4. قم بتجميع حلقة التمدد.
    1. خذ حلقة PMMA فارغة أخرى. ضعه أعلى حلقة التثبيت واستخدم مشابك معدنية لإغلاقها معا ، مع وضع غشاء PDMS بين الحلقتين (شطيرة غشاء PDMS ، الشكل 2 ب).
    2. ضع النصف السفلي من حلقة التمدد على دعامة التثبيت المصممة في الخطوة 3.1.2 (الشكل 2 ب).
    3. ضع شطيرة حلقة PDMS على حلقة التمدد وادفعها لأسفل بقوة حتى تصل إلى أسفل. لا تلمس ركيزة PDMS دعامة التركيب. قم بتأمين الحشية في الموضع الصحيح (الشكل 2 ب).
    4. ضع الأوزان النحاسية الدائرية أعلى العينة (الشكل 2 ج). هذا يطبق توتر مسبق ثابت مشابه لتلك الموجودة في جميع الحلقات المثبتة ، مما يضمن مزيدا من التكرار عند معايرة النظام.
    5. ضع النصف العلوي من حلقة التمدد المعدنية في الأعلى ، مع محاذاة فتحات المسامير ، ضع جميع البراغي ، وشدها (الشكل 2 ج).
      ملاحظة: في هذه المرحلة ، يحتوي غشاء PDMS على ثقوب ، لذلك لا تحاول إلغاء التثبيت أو العودة إلى الوراء في البروتوكول.
    6. قم بقص PDMS حول الحلقة برفق بشفرة (الشكل 2 ج).
    7. قم بتغطيته (على سبيل المثال ، بطبق بتري) لحماية الغشاء من الغبار (الشكل 2 ج).
      ملاحظة: إذا احتاج نظام إدارة الأبعاد السياسي إلى أن يعمل باستخدام هلام بولي أكريلاميد ، فانتقل إلى القسم 5. لقياسات المعايرة الأولية، انتقل إلى القسم 6. إذا كان سيتم استخدام حلقة PDMS لتلقيح الخلايا ، فانتقل إلى القسم 7.

4. تباين تصنيع غشاء PDMS: نمط شبكة مرجعية

  1. قم بإعداد لوحة PMMA (قبل طلاء الدوران PDMS) "منقوشة" بشبكة قائمة على SU8 تم إنشاؤها باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية (الشكل 2 د). لهذا ، صمم نمطا مثيرا للاهتمام لإنشاء فيلم قناع ضوئي (قناع خلات).
    ملاحظة: ينشئ ملف pdf المقدم في هذا البروتوكول (انظر المجلد التكميلي 4) شبكة بأرقام بديلة. انظر الشكل 2 د. يمكن إنشاء الشبكة باستخدام برنامج بسيط مثل Inkscape نظرا لحجم النمط (أو بدائل مثل Clewin أو FreeCAD). يمكن طباعة التصميم من قبل شركات خارجية على أفلام التصوير الفوتوغرافي (انظر جدول المواد).
  2. بروتوكول الطباعة الحجرية الضوئية على لوحة PMMA (انظر المجلد التكميلي 3 للخصائص البصرية PMMA).
    1. قم بإجراء معالجة ببلازما الأكسجين لألواح PMMA لمدة 20 دقيقة عند 7 واط مع تدفق أكسجين ثابت يبلغ 0.8 بار.
      ملاحظة: تأكد من إزالة الحماية البلاستيكية الممكنة للألواح وأن ألواح PMMA شفافة تماما.
    2. اخبزيها لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية.
    3. قم بتبريد لوحة PMMA باستخدام مسدس نيتروجين ، ثم ضع 4 مل من راتنج SU-8 2100 على لوحة PMMA مقاس 12 سم (اضبط مستوى الصوت في حالة استخدام أحجام مختلفة من اللوحة).
    4. قم بالدوران باستخدام المعلمات التالية (أو اضبط معلمات الدوران لإنشاء طبقة يبلغ ارتفاعها حوالي 10 ميكرومتر): 5 ثوان عند 500 دورة في الدقيقة مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية متبوعا ب 30 ثانية عند 4000 دورة في الدقيقة مع تسارع 300 دورة في الدقيقة / ثانية.
    5. اخبزيها لمدة 2.5 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    6. ضع لوحة PMMA على تقويم قناع في وجود قناع الأسيتات واستخدم المعلمات التالية: بدون i-line. التعرض عريض النطاق (بين 260 و 460 نانومتر) ، 25 ميجاوات / سم2 ، تعرض 7.5 ثانية.
    7. اخبزيها لمدة 3.5 دقيقة عند 95 درجة مئوية.
    8. قم بتطوير النمط لمدة 1 دقيقة باستخدام أسيتات البروبيلين جلايكول أحادي ميثيل الأثير.
    9. يغسل على نطاق واسع باستخدام الأيزوبروبانول.
    10. قم بإجراء التحقق البصري من جودة النمط باستخدام هدف تكبير منخفض (2-10x) في مجهر المجال الساطع.
      ملاحظة: يزيد سيلان اللوحة المزخرفة PMMA من طول عمر النمط للاستخدام المتكرر. لهذا ، قم بتنشيط لوحة PMMA المزخرفة لمدة 30 ثانية مع معالجة بلازما الأكسجين ثم قم بإجراء علاج لمدة ساعة واحدة باستخدام ثلاثي الكلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) silane تحت الفراغ في غطاء كيميائي.
  3. استخدم لوحة PMMA المزخرفة كما في الخطوات من 2.2 إلى 2.5 لتدوير الغشاء القابل للتمدد PDMS.
    ملاحظة: يمكن تصور PDMS المزخرف في مجهر المجال الساطع ، كما ذكرنا سابقا ، وكذلك في المجهر الإلكتروني الماسح (الشكل 2 د). احذر من أي جانب من النمط يواجه لأعلى أثناء تركيب غشاء PDMS في حلقة التمدد للحصول على النمط في الاتجاه المطلوب.

5. إرفاق جل بولي أكريلاميد (PAA) أعلى غشاء PDMS

ملاحظة: يمكن تنفيذ هذه الخطوة إما على غشاء PDMS المتصل بلوحة PMMA (انظر القسم 2) أو على حلقات التمدد المثبتة مسبقا (انظر القسم 3). العمل تحت غطاء كيميائي ؛ بالنسبة للخطوات التي تنطوي على التدفئة ، من الملائم استخدام فرن صغير مناسب أسفل الغطاء الكيميائي ، انظر جدول المواد ؛ خلاف ذلك ، احتفظ بالعينات في صندوق محكم في الفرن).

  1. الطلاء المسبق لغشاء PDMS (الشكل 2E)
    1. قم بإعداد محلول الطلاء عن طريق خلط 96٪ من الإيثانول مع 10٪ (3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان (APTES) في أنبوب طرد مركزي دقيق (على سبيل المثال ، 20 ميكرولتر من APTES في 180 ميكرولتر من الإيثانول).
    2. قم بتنشيط أغشية PDMS باستخدام مفرغ بلازما الهالة لمدة 1 دقيقة (أو قم بتنشيطها لمدة 30 ثانية باستخدام منظف بلازما الأكسجين).
    3. ضع 200 ميكرولتر من محلول APTES / الإيثانول في وسط الغشاء.
    4. اترك الغشاء عند 65 درجة مئوية داخل الفرن لمدة 1 ساعة.
    5. يغسل مرتين باستخدام PBS. للغسيل الثاني ، اترك PBS لمدة 10 دقائق أثناء الرج.
    6. تحضير محلول الجلوتارالديهايد (GA) بنسبة 3٪ في PBS. ضع 200 ميكرولتر من GA لكل غشاء في نفس المنطقة من الغشاء المعالجة ب APTES.
    7. انتظر لمدة 25 دقيقة (لا تزيد عن 30 دقيقة).
    8. اغسل مرتين باستخدام PBS ، والمرة الثانية أثناء الرج.
    9. استنشق السائل وضع الحلقة في وضع منخفض ، حتى يجف PBS تماما.
  2. الغطاء: السيلان
    1. تحضير 6 مل من Repel Silane واسكبه في طبق بتري.
    2. ضع أغطية زجاجية مربعة مقاس 18 مم بعناية ، واحدة تلو الأخرى ، في السائل.
    3. احتضن الغطاء لمدة 5 دقائق.
    4. تحضير اثنين من الكأس. أحدهما يحتوي على 96٪ من الإيثانول والآخر ماء عالي النقاء.
    5. قم بإزالة الغطاء من Repel Silane بالملاقط ، واغسله أولا بنسبة 96٪ من الإيثانول ، متبوعا بغسل بالماء عالي النقاء (يجب أن يخرج الغطاء "جافا" من الغسيل المائي).
    6. اتركه يجف لمدة 30 دقيقة إضافية على حدود طبق بتري.
  3. مرفق هلام بولي أكريلاميد (PAA) بغشاء PDMS
    1. رتب نصف أغطية Repel Silane المعالجة في قاع طبق بتري.
    2. قم بإعداد مزيج جل PAA من الصلابة المطلوبة16،18.
    3. ضع قطرة من 10 ميكرولتر من مزيج الجل فوق كل غطاء.
    4. ضع غطاء آخر معالج ب Repel Silane في الأعلى لنشر الجل. لا تقم بمحاذاة الغطاء. تأكد من ترتيبها على شكل نجمة لتسهيل الفصل السهل. اضغط برفق حتى يتم تسطيح الجل ولكن لا يتجاوز منطقة الغطاء.
    5. انتظر لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة.
    6. افصل الغطاء برفق باستخدام الملقط. تأكد من أن الجل لا يزال متصلا بأحد أغطية.
    7. خذ الغطاء الذي يتم توصيل الجل به وضع الجل على اتصال بمنطقة PDMS التي سبق معالجتها ب GA (الشكل 2 ه).
    8. اضغط بإصبعين من الأسفل والأعلى لمدة 5 ثوان.
    9. احتضن عند 37 درجة مئوية طوال الليل.
    10. في اليوم التالي ، املأ الحلقة ببرنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
    11. افصل برفق الغطاء العلوي باستخدام الملقط.
    12. ارسم محيط هلام PAA بعلامة دائمة من الجانب الآخر من غشاء PDMS. يساعد هذا في تحديد موقع العينة في الخطوات التالية.
    13. استنشق برنامج تلفزيوني.
    14. قم بتنفيذ خطوة وظيفية لتسهيل ربط بروتين المصفوفة خارج الخلية المطلوب بالهلام15.

6. تشغيل جهاز التمدد ، ومعايرة الإجهاد ، وتقييم الدقة

  1. قم بإعداد حلقة مطاطية PDMS بخرز الفلورسنت لمعايرة الإجهاد.
    1. قم بإعداد تخفيف 1: 50000 من 0.1 ميكرومتر أو 0.2 ميكرومتر حبة فلورية (انظر جدول المواد) في محلول محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS) عن طريق التخفيف التسلسلي (محلول وسيط 1: 500 من 1 مل في PBS مع 2 ميكرولتر من محلول مخزون الخرز متبوعا بالتخفيف النهائي بمقدار 10 ميكرولتر من المحلول الوسيط في 1 مل من PBS).
      ملاحظة: تعتبر كثافة الخرزة العالية على الغشاء مثالية لخطوة المعايرة. لا تقم بصوتنة المحلول ، لأن كتل الخرز تساعد العملية أثناء المعايرة.
    2. ضع قطرة 10-30 ميكرولتر في وسط PDMS.
      ملاحظة: يمكن تصميم دعم التركيب بشكل ملائم من خلال ترسيب العينة عبر المركز
    3. اتركيه ليجف على درجة حرارة لا تزيد عن 40 درجة مئوية لتجنب مشاكل الارتباك بعد المعالجة.
  2. قم بإعداد حلقة تمدد PDMS بخرز الفلورسنت لتقييم الدقة.
    1. اتبع البروتوكول الذي كتبه Cole و al.19 لتحضير محلول الخرزة باستخدام خرز بأقطار أصغر من حد الحيود ، وعادة ما يكون قطره 0.1 ميكرومتر.
      (انظر جدول المواد). صوتنة بعناية حلول الخرز في كل خطوة وسيطة.
    2. استخدم علاج الهالة في وسط الحلقة لتنشيط ركيزة PDMS.
    3. انشر على الفور 20 ميكرولتر من محلول الخرزة فوق المنطقة المركزية المعالجة ل PDMS واتركها حتى تجف.
      ملاحظة: في هذه الحالة ، يتم تخفيف محلول الخرزة بشكل كبير واحتضانه على PDMS المحبة للماء لضمان الانتشار على نطاق واسع والحصول على حبات مفردة منفصلة 0,1 ميكرومتر ممتصة على الركيزة.
  3. تركيب جهاز التمدد على حامل مرحلة المجهر (الشكل 1F).
    1. قم بتركيب عمود التمدد في المجهر.
    2. ضع بسخاء مادة التشحيم (الفازلين) أعلى المنطقة الدائرية للمنشور (الجزء الأوسط ، الشكل 1D ، F).
      ملاحظة: يعد استخدام مادة التشحيم إلزاميا لركيزة PDMS للتغلب على الاحتكاكات والانزلاق على العمود ، ومن الضروري تحديث مادة التشحيم بين كل عينة. يستخدم الفازلين كمادة تشحيم مريحة للغاية في الإعداد المقدم في هذا البروتوكول.
    3. قم بتركيب حلقة التمدد المحضرة في الخطوة 6.1 في عمود التمدد وقم بربط الغطاء العلوي لإغلاق التجميع.
    4. قم بتوصيل وحدة التحكم في التفريغ بمصدر التفريغ وعمود التمدد (الشكل 3 أ).
      1. قم بتوصيل الجزء الخلفي من صندوق التحكم في التفريغ بمصدر التفريغ (الشكل 3 أ).
      2. قم بتوصيل الجزء الأمامي من الصندوق بعمود التمدد (الشكل 1 ب ، د ، و).
        ملاحظة: يمكن أن يكون مصدر الفراغ هو خط التفريغ المتاح في البنية التحتية للمبنى. مطلوب فراغ معتدل لتمدد كاف ولكنه يعتمد على قطر حلقة التمدد (سيتم الحصول على سلالة أصغر عند نفس مستوى الفراغ لقطر أصغر). بدلا من ذلك ، تتوفر مضخات التفريغ تجاريا (توفر Fluigent أو Elveflow مضخات تفريغ مستقلة) ؛ في هذه الحالة ، اتبع تعليمات الشركة المصنعة للاتصال بمصدر الفراغ. لا تستخدم مصدر تفريغ بدون مصدر يتم التحكم فيه بالفراغ (مثل صندوق التحكم في التفريغ المخصص المقدم في هذا البروتوكول أو الأنظمة المتاحة تجاريا)
  4. معايرة الإجهاد
    1. اختر مجال اهتمام يتضمن كثافة حبة عالية في جميع أنحاء مجال الرؤية وكتل حبة يمكن التعرف عليها للمستخدم (انظر الشكل 3 ب).
    2. احصل على صورة "في حالة راحة" لمجال الرؤية المختار (احفظ الموضع).
    3. ضع التمدد على مستوى فراغ منخفض (في هذا الإعداد ، -20 ملي بار). سوف تتحرك العينة في جميع الاتجاهات (XYZ).
    4. أعد التركيز أولا في المستوى z.
    5. حرك المرحلة في اتجاهات xy للعثور على نفس منطقة الاهتمام التي تم تصويرها أثناء الراحة ، والتركيز بدقة على صورة الخرزات في الحالة الممتدة ، والحصول على صورة.
      ملاحظة: إذا كانت العينة بعيدة عن المركز ، فستتحرك منطقة الاهتمام بشكل كبير ، اعتمادا على حجم الإجهاد. سيكون الإزاحة أكبر بعيدا عن المركز ، لكن حجم الإجهاد مستقل عن موقع العينة على الركيزة. سجل الصور بدون تجميع ، بدقة 2048 × 2048.
    6. حرر السلالة. كرر الخطوات 6.4.3-6.4.5 بمستوى فراغ أعلى (-30 ملي بار ، -40 ملي بار ، إلخ).
      ملاحظة: لأغراض المعايرة ، عد دائما إلى حالة الراحة قبل إعادة التمدد (انظر الشكل التكميلي 3 أ) ، حيث أن PDMS له سلوك تباطؤ عند التشوه.
    7. قم بتركيب حلقة تمدد ثانية وكرر الخطوات 6.4.1-6.4.6. قم بإجراء هذه المعايرة لما لا يقل عن 3 حلقات تمدد مختلفة.
    8. قم بتخزين الصور المكتسبة في مجلد منظم حسب العينة.
    9. في كل مجلد ، قم بتسمية صورة الخرزة المرجعية التي تم الحصول عليها في reference_str1 السكون ، وتمتد الصور عند زيادة stretched_str1 الفراغ ، stretched_str2 ، stretched_str3 ، إلخ.
      ملاحظة: تشكل هذه الخطوة المعايرة الأساسية للنظام. اعتمادا على احتياجات المستخدم ، يجب إجراء معايرة إضافية باستخدام عينات حبة مماثلة ولكن باستخدام بروتوكولات تطبيق الفراغ الأخرى. تطبيق بروتوكول سلالة يشبه السلالة المطبقة على العينة البيولوجية (انظر قسم النتائج التمثيلية).
  5. استخدم كود Matlab لتحديد السلالة20.
    1. قم بتنزيل مجلد Matlab بالكامل على الرابط التالي https://github.com/xt-prc-lab/Le_Roux_et_al_2024_JOVE
      ملاحظة: يتم تسمية التعليمات البرمجية الرئيسية المراد تشغيلها باسم gel_strain وتستدعي ملفات التعليمات البرمجية Matlab الأخرى التي يجب الاحتفاظ بها كما هو موضح ، ومخزنة في نفس المجلد مثل التعليمات البرمجية الرئيسية.
    2. افتح Matlab وافتح الكود gel_strain.
    3. قم بتعيين المعلمات (انظر الجدول 3 ، Code_Parameter للإعدادات الموصى بها).
    4. حدد مسارات المجلد الأصلي والتجريبي كما هو موضح في التعليمات البرمجية.
      ملاحظة: إذا لم يكن المجلد موجودا ، فستعرض التعليمات البرمجية نافذة منبثقة للتحذير ؛ حدد إضافة إلى المسار واستعرض حتى المجلد التجريبي حيث يتم تخزين الصور.
    5. قم بتشغيل كود gel_strain .
    6. افتح stretched_str1 كما هو مطلوب في الكود.
    7. افتح reference_str1 كما هو مطلوب في الكود.
      ملاحظة: من الملائم معالجة جميع الصور الممتدة بمستويات تفريغ مختلفة في وقت واحد كما هو موضح في هذا البروتوكول ؛ يجب تخزين جميع الملفات في نفس المجلد التجريبي ولكن التعليمات البرمجية تطلب فقط فتح الصورة الممتدة الأولى. يجب أن تنتهي أسماء الصور بأسماء strX ، X هي الأرقام المتزايدة 1 ، 2 ، 3 ، إلخ ، كما هو موضح في النقطة 6.4.9 من هذا الفصل.
    8. تحقق من ظهور مجلد النتائج مع 4 مجلدات فرعية: Tractpeddata التي تحتوي على البيانات التي تم اقتصاصها ومحاذاتها. الإزاحة التي تحتوي على ملف إزاحة الخرزة; الصور التي تحتوي على مؤامرة الإزاحة الشعاعية والإجهاد ؛ السلالات التي تحتوي على جدول بيانات مصفوفة الإجهاد التي تم الحصول عليها لكل مستوى فراغ.
      1. احسب متوسط مصفوفة الإجهاد لكل مستوى فراغ.
      2. كرر لكل عينة (3 كحد أدنى).
      3. ارسم مصفوفة الإجهاد المتوسط مقابل مستوى الفراغ للعينات الثلاث للحصول على منحنى المعايرة (الشكل 3 ج).
        ملاحظة: يمكن تعديل بعض المعلمات في حالة عدم معالجة صورة الخرزة بشكل صحيح من التعليمات البرمجية. للقيام بذلك ، افتح set_settings_stretch الملف في Matlab وقم بتعديل Settings.Resolution و Settings.Overlap وفقا للتوصيات الواردة في تعليقات التعليمات البرمجية (انظر أيضا الجدول 3). اعتمادا على الاحتياجات التجريبية ، يمكن أن تتنوع السلالة المطبقة على العينة البيولوجية (سلالة دورية ، سلالة أكبر ، إلخ): يوصى بمعايرة هذه الشروط (انظر الأمثلة في الشكل التكميلي 2 والشكل التكميلي 3).
  6. تقييم القرار (اتبع البروتوكول الذي كتبه كول وآخرون 19)
    1. قم بتركيب حلقة التمدد المعدة في الخطوة 6.2.
    2. صور مجال رؤية يحتوي على نقاط حبة مفردة (قم بتصوير كومة بمسافة خطوة Z ذات صلة بالهدف المستخدم).
    3. استخدم MetroloJ (المكون الإضافي في فيجي) ، كما هو موضح في Cole et al. ، لتوصيف دقة XYZ لإعداد التمدد (الشكل 3D والشكل التكميلي 4).

7. بذر الخلايا وتمتد

  1. طلاء PDMS ببروتين التصاق الخلية
    1. قم بتعقيم حلقة PDMS عن طريق تعريضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة (الشكل 4 أ). قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة للبروتوكول تحت الغطاء الحيوي لضمان العقم.
    2. شطف اللوحة تحت غطاء محرك السيارة مع PBS معقمة.
    3. احتضان بروتين التصاق الخلية11،14،15 عن طريق إيداع قطرة 100-200 ميكرولتر من المحلول في وسط الحلقة (الشكل 4 أ).
      ملاحظة: بشكل عام ، يكون محلول 10 ميكروغرام / مل من الفبرونيكتين مناسبا11. يمكن استخدام بروتينات الالتصاق الأخرى ذات الأهمية لتغطية PDMS (على سبيل المثال ، اللامينين والكيراتين15 ؛ قد تكون هناك حاجة إلى علاجات / بروتوكولات محددة). يوصى بحضانة طلاء الفيبرونيكتين بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ؛ الطريقة البديلة هي 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    4. ارسم محيط القطرة بعلامة دائمة من الجانب السفلي من غشاء PDMS. يساعد هذا في تحديد موقع العينة في الخطوات التالية.
  2. بذر الخلايا على حلقة PDMS (الشكل 4 أ).
    1. إذا لزم الأمر ، قم بنقل الخلايا ذات الأهمية ببروتين الفلورسنت قبل تجربة التمدد (للتعداء العابرة ، قبل 1-3 أيام من التجربة ، اعتمادا على طريقة وخصائص التعدي) أو استخدم بروتوكولات محددة لتصور علامات الفلورسنت ذات الأهمية.
      ملاحظة: بالنسبة للتجارب الأولية ، من الملائم استخدام علامة غشاء البلازما مثل GFP-mem11،12 لتصور استجابة غشاء الخلية والتمزقات المحتملة. من السهل نقل العلامة ، وينصح بتمديد الخلايا المنقولة عند مستويات إجهاد متزايدة لتقييم عتبة الإجهاد التي ستؤدي إلى تمزق غشاء البلازما. انظر خريطة البلازميد في المجلد التكميلي 5. يعتمد هذا على نوع الخلية وسيكون أقل في تجارب الخلية المفردة مقارنة بالطبقات الأحادية للخلية. تتوافق علامة الغشاء هذه مع تمدد الخلية ، على عكس بعض الأصباغ التي تدخل الغشاء التي لوحظ أنها تؤدي إلى تمزق غشاء البلازما عند مستويات التمدد المنخفضة.
    2. في يوم التجربة ، قم بتسخين وسائط الخلية وإعداد وسائط مستقلة لثاني أكسيد الكربون2.
      ملاحظة: إذا كان المجهر يحتوي على تحكم ثاني أكسيد الكربون2 متوافق مع نظام التمدد ، فيمكن إجراء التجارب في وسائط زراعة الخلايا العادية (سيكون هذا إعدادا ضروريا للعينات الحساسة التي لا يمكنها البقاء على قيد الحياة في وسائط مستقلة عن ثاني أكسيد الكربون). يوصى باستخدام ثاني أكسيد الكربونالمستقل 2 المكمل بعامل مضاد للتبييض (على سبيل المثال ، بالنسبة لبروتينات GFP ، مكمل روتين21 عند 10 مجم / مل).
    3. قم بتربسين الخلايا وعدها.
    4. قم بزرع عدد مناسب من الخلايا بحجم صغير (20-50 ميكرولتر) باستخدام وسائط خلوية قياسية لتعزيز ارتباط الخلية والاحتفاظ بها في حاضنة يتم التحكم فيها بالرطوبة2 ثاني أكسيد الكربون.
      ملاحظة: بالنسبة للأرومات الليفية المسطحة والكبيرة والتجارب أحادية الخلية ، 5000 خلية. تعتمد الأرقام على نوع الخلية والتجربة نفسها.
    5. بعد 20-30 دقيقة من الحضانة (تحقق من التعلق الأولي للخلية) ، أضف وسائط 500 ميكرولتر برفق فوق الخلايا. ضعه مرة أخرى في الحاضنة للسماح بمزيد من انتشار الخلايا.
      ملاحظة: يعتمد وقت البذر على نوع الخلية وعلى المتطلبات التجريبية. من الممكن أيضا تشكيل طبقة أحادية مع حضانة بين عشية وضحاها. يجب تعديل حجم وسائط الزراعة وفقا لذلك. تلطيخ الخلايا الثانوية: بمجرد ربطها ، يمكن تلطيخ الخلايا بصبغة مثل SpyDNA (انظر جدول المواد) لتصور النوى (الشكل التكميلي 5) أو تلطيخ آخر لتصور أي بنية ذات أهمية. احذر دائما من أن تلطيخ الخلايا الحية أو الإفراط في التعبير عن البروتين عن طريق التعدي يمكن أن يؤثر على استجابة الخلية للتمدد ، خاصة في قشرة الخلية أو غشاء البلازما أو البروتينات / الهياكل الحساسة للميكانيكا.
    6. استبدلها إلى وسائط مستقلة عن ثاني أكسيد الكربون2 واستخدمها على الفور في جهاز التمدد.
      ملاحظة: الآن ، العينة جاهزة لتجربة التمدد.
  3. تجربة تمدد الخلية: مثال على دورة إطلاق واحدة وتصوير غشاء البلازما (PM) لالتقاط إعادة تشكيل PM الديناميكية للأرومات الليفية.
    1. قم بتركيب حلقة التمدد على مرحلة المجهر كما في القسم 6 ، الخطوة 6.2.
    2. ابحث عن خلية ذات أهمية ، وسجل موضعها ، والتقط صورة للخلية الممتدة مسبقا (الشكل 4 ب).
    3. قم بتطبيق الفراغ المطلوب الذي ، وفقا لمنحنى المعايرة ، يطابق سلالة الركيزة المطلوبة.
    4. للعثور على الخلية الممتدة ، أولا ، أعد التركيز في Z ثم تحرك في اتجاه XY للعثور على الخلية وتوسيطها مرة أخرى إلى مجال الرؤية.
    5. سجل الصور خلال المدة المطلوبة (الشكل 4 ب).
      ملاحظة: هناك حاجة إلى تجارب أولية بشكل شائع لتحديد استجابة الخلية لإجهاد الشد اعتمادا على نوعها (في المتوسط). قم بتمديد الخلايا في سلالات ركيزة مختلفة لتحديد الحد الأقصى للحمل الشديد الذي يمكن أن تتحمله. سيحدث تمزق غشاء البلازما ، كما هو موضح من خلال علامة غشاء الفلورسنت لغشاء البلازما ، إذا كان الإجهاد مفرطا للخلية.
    6. لإطلاق الخلية ، ارجع إلى وضع الخلية في حالة السكون وقم بتشغيل وضع الاستحواذ على المجهر للتأكد من أن الاستحواذ يمكن أن يبدأ بمجرد إعادة تركيز العينة.
    7. حرر التمدد وأعد التركيز يدويا بسرعة في Z.
    8. سجل صور الخلية التي تم تحريرها للوقت المطلوب (الشكل 4 ب). نظرا للطبيعة المرنة لغشاء PDMS ، فإن العينة تتخلص بسهولة من التركيز البؤري بمرور الوقت. لذلك ، اضبط التركيز يدويا طوال فترة الحصول على الصورة.
      ملاحظة: لإعادة التركيز بنجاح أثناء التصوير بعد التحرير، يجب تصور الصور في كثير من الأحيان بما فيه الكفاية؛ تصوير فيديو مدته 3-5 دقائق كل 3 ثوان معقول. لا تتوافق ركيزة PDMS مع نظام التركيز المثالي للمجهر ، لذلك عادة ما يكون الضبط اليدوي من قبل المستخدم للحصول على سرعة مطلوب. قد تتم تسوية تركيز البرنامج ، ولكن احذر من الأخطاء المحتملة وحركة المسرح الكبيرة التي قد تلحق الضرر بالهدف عن طريق ضرب جزء آخر ممتد. يمكن للمستخدم أن يقرر إجراء امتدادات متعددة للعينة اعتمادا على التجربة.
  4. المعالجة اللاحقة: محاذاة الصور باستخدام فيجي
    1. افتح الصور في حالة الراحة والتوتر.
    2. استخدم مطابقة قالب المكون الإضافي فيجي وحدد منطقة من الخلية لمحاذاة (الشكل 4C).
      ملاحظة: يتم عرض الإزاحة النسبية لصورة الإجهاد المحاذاة بواسطة فيجي، ويتم اقتصاص الصور ومحاذاتها. قم بتنزيل المكون الإضافي template_matching من هذا الرابط : https://sites.google.com/site/qingzongtseng/template-matching-ij-plugin

8. بذر الخلايا على ركيزة ممدودة مسبقا

  1. قم بتركيب الحلقة الممتدة المغلفة ببروتين الالتصاق في جهاز التمدد.
  2. قم بتمديد ركيزة PDMS إلى مستوى الإجهاد المطلوب.
  3. زرع الخلايا كما في القسم 7.
    ملاحظة: في هذه التجربة ، لا يتم إجراء البذر في ظروف معقمة ، لذلك قد لا يكون البروتوكول مناسبا لجميع أنواع الخلايا.
  4. بعد التصاق الخلايا ، قم بتبادل الوسائط بوسائط مستقلة عن ثاني أكسيد الكربون.
    ملاحظة: اختر خلايا سريعة الالتصاق لتقليل وقت الالتصاق.
  5. بعد وقت الحضانة المطلوب ، حرر التمدد وقم بتصوير خلية ذات أهمية.
    ملاحظة: في هذه الخطوة ، من الصعب العثور على نفس الخلية بعد إطلاق التمدد ، حيث أن موضع الخلية في حالة السكون غير معروف ، ولا يمكن التنبؤ بسهولة بحركة ركيزة PDMS.

9. إصلاح الخلايا الممتدة أو المسترخية

  1. إصلاح الخلايا في حالات ممتدة (العمل تحت غطاء المحرك الكيميائي)
    ملاحظة: بارافورمالدهيد (PFA) هو عامل تثبيت قياسي. استخدمه دافئا عند 37 درجة مئوية لضمان التثبيت السريع. بدلا من ذلك ، يسمح محلول الجليوكسال22 بتثبيت سريع للعينة مع الحفاظ على العينة بشكل جيد.
    1. تحضير عامل التثبيت.
    2. خلايا البذور على الحلقات باتباع الخطوة 7.2.
    3. قم بتركيب عمود التمدد ووحدة التحكم داخل غطاء المحرك الكيميائي وقم بتوصيله بمصدر التفريغ.
    4. ضع الحلقة ذات الخلايا المصنفة في عمود التمدد.
    5. لإصلاح الحالة الممتدة ، تمتد إلى السلالة المطلوبة. قم بإزالة وسائط زراعة الخلايا وإصلاحها عن طريق إضافة محلول PFA بنسبة 4٪ إلى الخلايا لمدة 10 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم اغسل باستخدام PBS ، مع الاحتفاظ دائما بالتمدد. حرر المكنسة الكهربائية ببطء واغسلها بمزيد من PBS.
      ملاحظة: لا تنس تحضير حالة تحكم غير قابلة للتمدد (لهذا الغرض ، يمكن قطع قطعة PDMS صغيرة وتجفيفها بكمية صغيرة من محلول الإيثانول بنسبة 96٪ تحتها ، فوق غطاء زجاجي). لتصوير العينة الثابتة ، يوصى بتمديد العينة مرة أخرى إلى نفس الحجم. نظرا لأن PFA سام ، يجب اتخاذ الاحتياطات الكافية في هذه الخطوة. من الملائم استخدام فرن صغير يمكن الاحتفاظ به تحت غطاء المحرك ، انظر جدول المواد).
    6. قم بتصوير العينة ، ويفضل تطبيق الفراغ مرة أخرى ، على نفس المستوى المستخدم عند التثبيت ، مما يضمن "إعادة تسوية" العينة (الشكل 4 د).
  2. إصلاح الخلية بعد الإفراج عن التمدد (العمل تحت غطاء المحرك الكيميائي).
    1. قم بتمديد الخلايا إلى السلالة والوقت المطلوبين. قبل تحرير التمدد مباشرة ، قم بإزالة معظم الوسائط دون تجفيف العينة تماما وتحرير السلالة. بدلا من ذلك ، قم بتطبيق امتداد دوري لمدة محددة.
    2. قم بإزالة الوسائط بسرعة وإصلاحها على الفور باستخدام المحلول المثبت لمدة 10 دقائق. يغسل مع PBS والصورة.
      ملاحظة: يمكن أيضا زرع العينة على ركيزة مشدودة مسبقا ، وبعد وقت البذر المحدد من قبل المستخدم ، يتم إطلاقها بعد التمدد الثابت كما في الخطوة 9.2.2.
  3. التألق المناعي للعينة الثابتة: اتباع البروتوكولات القياسية للتألق المناعي إما على التمدد أو الإفراج عنه. يفضل الحجب بجيلاتين السمك على BSA17.
  4. صور العينة (الشكل 4E).
  5. حفظ العينة
    1. تحضير وسائط التركيب لحفظ العينات (Mowiol أو Prolong).
    2. قم بإزالة PBS وأضف قطرة (حوالي 75 ميكرولتر) من وسائط التثبيت.
    3. احصل على غطاء بالملاقط وضعه برفق في الأعلى (تجنب الفقاعات التي من شأنها أن تعيق التصور).
    4. يجف لمدة 48 ساعة على الأقل في درجة حرارة الغرفة (RT).
    5. قم بقص العينة الثابتة ل PDMS وقم بتثبيتها على غطاء زجاجي آخر للتصوير لاحقا.
      ملاحظة: هذه الخطوة غير متوافقة مع التصوير اللاحق للعينة على الغشاء الممتد لأن تركيب غشاء PDMS على غطاء مع وسائط الحفظ ينطوي على الحفاظ على الغشاء في حالته الاسترخاء فقط.

10. التثبيت بالشبكة لتصوير نفس منطقة العينة في أوضاع مختلفة - تصوير المحرك عبر محرك البحث كمثال

ملاحظة: يمكن استخدام هذا البروتوكول لتصوير نفس الخلية المفردة في مجهرين مختلفين ، المجهر الفلوري والفحص المجهري الإلكتروني الماسح ، كما هو موضح هنا. يتطلب التصوير المترابط معالجة صور متقدمة لا تدخل في نطاق هذا البروتوكول. يمكن أن تكون التطبيقات المفيدة الأخرى ، على سبيل المثال ، تصور العينة في الوضع المباشر ، ومزيد من التثبيت تحت الغطاء ، وتصور نفس الخلية بعد التلوين المناعي (البروتوكول المستخدم في الشكل التكميلي 5).

  1. قم بإعداد حلقة تمدد باستخدام ألواح PMMA المزخرفة من القسم 4.
  2. زرع الخلايا كما في الخطوة 7.2.
    ملاحظة: احذر من أنه يجب تطبيق محلول الطلاء بعناية لضمان التغطية الكاملة ل PDMS ، حتى في فتحات الشبكة الصغيرة.
  3. الإصلاح كما هو موضح في القسم 8 ولكن باستخدام المثبت والبروتوكول المناسب المتوافق مع العينة والتصوير المجهري الإلكتروني.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم مزيجا من PFA + الجلوتارالديهايد (على سبيل المثال ، 2٪ -2.5٪) ، احذر من التألق الذاتي الناتج عن وجود كاشف الجلوتارالديهايد وفي النهاية قم بإجراء خطوة التبريد23.
  4. قم بتصوير العينة في وضع التألق وسجل موضع الخلية (اطبع الشبكة ولاحظ الموضع بعلامة صليب ، على سبيل المثال).
  5. بمجرد التقاط جميع الصور ، قم بإعداد العينة ل EM عن طريق قص PDMS أولا حول العينة (إزالة مادة التشحيم مسبقا).
  6. قم بمعالجة غشاء PDMS + عينة للمسح المجهري الإلكتروني (والذي يتضمن بروتوكولا قياسيا لتجفيف العينة والاخرق المعدني)12.
  7. عند التصوير في مجهر SEM ، ابحث عن مواضع الشبكة وابحث عن الخلايا التي تم تصويرها مسبقا في وضع الفلورسنت (الشكل 4F ، G).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المعايرة والشعاع
التوصيف الصحيح للسلالة التي تم الحصول عليها هو ضمان لقابلية التكرار والتحكم في التجارب. بينما يمكن إضافة حبات الفلورسنت إلى كل عينة لتسجيل السلالة بدقة ، فإن خطوة المعايرة السابقة تضمن التخطيط المناسب للتجربة ، مع معرفة حجم الإجهاد الذي يريد التجريبي تطبيقه على العينة قبل التمدد الفعلي. لن يعتمد الإجهاد على الفراغ المطبق فحسب ، بل سيختلف اعتمادا على أبعاد حلقة التمدد ، وتكوين PDMS (خليط مختلف عن 1:10) ، وسمك الغشاء ، والتمدد المسبق لغشاء PDMS قبل التثبيت في الحلقة. لذلك ، يجب معايرة ك...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم استخدام عدد كبير من أجهزة التمدد لتطبيق التمدد الميكانيكي على العينات البيولوجية ، مما يحاكي الظروف الفسيولوجية في الجسم24،25. تتوفر العديد من الإعدادات في الأدبيات ، وعادة ما يتم إجراء مراقبة استجابة العينة عن طريق اقتران أجهزة التمدد بالقوة الذرية26 أو الفحص المجهري الفلوري27،11.

يتيح تصميم وتشغيل جهاز التمدد المعر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن لا نعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ودعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة "la Caixa" (المنحة 406 LCF/PR/HR20/52400004 إلى X.T.، J.V.R.، وP.R.-C. والزمالات LCF/BQ/DR19/11740009 إلى 407 I.G.-M. و LCF/BQ/DR19/11740009 إلى M.M.J.)، ووزارة العلوم والابتكار الإسبانية 408 (PID2022-142672NB-I00 إلى P.R.-C.، PID2021-128635NB-I00 إلى XT ، و PID2022-141040NA-I00 409 إلى I.A.) ، Generalitat de Catalunya (2021 SGR 01425 إلى XT و P.R.-C.) ، جائزة "ICREA 410 Academia" للتميز في البحث ل P.R.-C. ، مؤسسة Marató de TV3 (201936-30-31 إلى 411 P.R.-C.) ، الاتحاد الأوروبي (ERC ، MECHANOSYNTH ، منح 101097753 إلى P.R-C. و ERC ، Adv-412 883739 Epifold إلى XT.). ومع ذلك ، فإن الآراء والآراء المعبر عنها هي آراء المؤلفين (المؤلفين) فقط ولا تعكس بالضرورة آراء الاتحاد الأوروبي أو الوكالة التنفيذية للمجلس الأوروبي للبحوث. لا يمكن تحميل الاتحاد الأوروبي ولا السلطة المانحة المسؤولية عنها. A.E.M.B. مدعوم من زمالة السير هنري ويلكوم (210887/Z/18/Z). يقر المؤلفون بالتمويل من زمالة Juan de La Cierva بدعم من MCIU / AEI / 10.13039 / 501100011033 والصندوق الاجتماعي الأوروبي الإضافي (FSE +) (JDC2023-051559-I to V.V). حصلت IBEC على جائزة Severo 415 Ochoa للتميز من MINCIN. نشكر V González-Tarragó على المساعدة في نظام التمدد و Evelyn Coderch على الدعم الفني. ونود أيضا أن نعرب عن تقديرنا للدعم المقدم من Unitat de Criomicroscòpia Electrònica TEM/SEM (Unitat de Criomicroscòpia Electrònica TEM/SEM (مراكز العلوم التكنولوجية لجامعة برشلونة، CCiTUB) ومرفق توصيف MicroFabSpace والفحص المجهري، الوحدة 7 من تكنولوجيا المعلومات والاتصالات "NANBIOSIS" من CIBER-BBN في IBEC. نشكر أيضا Maria Garcia Parajo لتسهيل الاتصال بورشة ICFO الميكانيكية و Tecnifill للمساعدة السلسة في هندسة الأجزاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قناع الأسيتاتدينار أردني Photodata
أكريلاميدبيوراد161-014040٪ محلول أكريلاميد
APSسيجما ألدريتشأ 3678بيرسلفات الأمونيوم للرحلان الكهربائي ، &GE ؛ 98%
أبيتسسيجما ألدريتش281778(3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان
مضخة الموائع الدقيقة المستقلةElveflow الكوبالتالكوبالت المزدوجالكوبالت المزدوج
بيساكريلاميدبيوراد161-0142محلول 2٪ مكرر
شفرةفيشر العلمية11733919المجموعة التعليمية هوجا فعلت á ctica X100 عرجاء بيستوري معقم N & deg; 23  LAMD23 
مشابكسبرينتيسAKXX000001مشابك بول دوج ، 32 مم ، مصنوعة من المعدن ، سعة 10 مم ، مطلية بالنيكل
معالج كوروناالمنتجات الكهروتقنيةBD-20AC، رمز المنتج: 12051ABD-20AC مختبر كورونا المعالج
الكؤوسVWR611-1368VWR ، أكواب أكواب ، يمكن التخلص منها ، 250 مل
دابيروش10236276001تلطيخ DAPI
الإيثانول 96٪بانريك تشو í الميكا ، SLU131085-1212إيتانول 96٪ الخامس / الخامس الفقرة á ليسيس ، ACS - 2,5 لتر
فيبرونيكتينسيغماإف 0895فيبرونيكتين ، من البلازما البشرية ، سائل   ؛ 0.1%
FluoSpheres كرات مجهرية معدلة كربوكسيل ، 0.1 µ ؛ mتقنية الحياةF8801 ، F8803حبات فلورية صفراء وخضراء وحمراء لتقييم الدقة
FluoSpheres الكرات المجهرية المعدلة بالكربوكسيل ، 0.2 & mفيشر العلميةF8809 ، F8810حبات الفلورسنت الصفراء والخضراء والحمراء لمعايرة الإجهاد
جلوتارالديهايدسيجما ألدريتشجي 6403محلول جلوتارالديهايد 50٪ في فئة H2< / sub>< / font>O< / font>
مقياس التداخلVeeco ويكو NT1100مقياس التداخل لقياس سمك أغشية PDMS
إيزوبوبانولبانريك تشو í الميكا ، SLU131090-1212 2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para an á lisis ، ACS ، ISO
Laiton يزنحسب الطلب
الأنسجة الخالية من الوبربيركشايرDURX670 ، DR670090920مناديل غير منسوجة
زيوت التشحيم (الفازلين)سيغما16415الفازيلين
تقويم القناعS ü ss MicroTec MJB4 تقويم القناع للطباعة الحجرية الضوئية على لوحات PMMA
مويولCalbiochem - ميرك475904كاشف MOWIOL 4-88
مجهر نيكون القرص الغزل متحد البؤرنيكونالكسوف Ti-E / Bمجهزة ب Nikon Ti-S-ER   ؛ مرحلة
مجهر نيكون عمودينيكونكسوف Ni-Eمجهزة بمرحلة نيكون NI-SH-E
الهدف 60xنيكونCFI Apo NIR 60X WNIR Apo 60X / 1.0w DIC N2 WD 2.8
حل PBSجيبكو14200067DPBS، 10 أضعاف
نظام PDMSداو كورنينج2401673921سيلجارد - 184 طقم مطاط صناعي من السيليكون DN 109
غطاء حلقة طبق بتري (كبير)بروكينورت93060Plato de cultivo celular TPP رمز المنتج: 07177925 diametro 100
غطاء حلقة طبق بتري (صغير)بروكينورت93060Plato de cultivo celular TPP رمز المنتج: 07177924
منظف البلازماهاريك   ؛PDC-002مولد بلازما الأكسجين
لوحات وحلقات PMMAراجع جدول مواصفات Excel في المستندات التكميلية
أطالإنفيتروجينP36930 / P36934كاشف مضاد للتلاشي ProLong Gold
بيل سيلانجنرال إلكتريك للرعاية الصحية17-1332-01بلسوون بيل سيلان ES
خواتم / حلقة مطاطيةتكنيفيلحسب الطلب
تدور المغطيالغارWS-650Szتدور المغطي
SPY650-DNAسبيروكرومإس سي 501SPY650-DNA
ملعقة التوجيهVWR231-0416ملعقة إيكولوجية قصيرة يمكن التخلص منها ، ملعقة مزدوجة النهايات ومغرفة ، مادة مضافة PP و EcoPure
راتنج SU8 2100ميكروكيمY111075SU8-2100
مطور SU8سيجما ألدريتش484431البروبيلين جلايكول مونوميثيل إيثر أسيتات
TEMEDسيجما ألدريتشT9281-50 ملN,N,N',N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE, BIOREAGENT SUITAB. كاشف الرحلان الكهربائي
ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) سيلان   ؛سيجما ألدريتش448931  ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) سيلان
الملقطإيسماتT5039 دومون اتش بي ملاقط 7 ستانلس ستيل. طرف 0.17 × 0.10 مم. (أجار العلمية المحدودة)
تحكم فراغجاركاب / باركر  990-005203-005 Controlador de vacio 
وحدة تحكم فراغ متألقةمتألقلو-فاس-N800خط تدفق EZ (n800mbar)
ورقة مقاعد البدلاء البيضاءرايما931.1001  ورق Raima 42 × 52

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. A stretching device for high-resolution live-cell imaging. Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).
  2. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that can apply physiological fluid shear stress and cyclic stretch concurrently to endothelial cells. J Biomech. Eng. 138 (3), 4032550(2016).
  3. Constantinou, I., Bastounis, E. E. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 41 (7), 939-950 (2023).
  4. Trepat, X., et al. Viscoelasticity of human alveolar epithelial cells subjected to stretch. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 287 (5), L1025-L1034 (2004).
  5. Kaunas, R., Nguyen, P., Usami, S., Chien, S. Cooperative effects of Rho and mechanical stretch on stress fiber organization. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (44), 15895-15900 (2005).
  6. Barbee, K. A., Macarak, E. J., Thibault, L. E. Strain measurements in cultured vascular smooth muscle cells subjected to mechanical deformation. Ann Biomed Eng. 22 (1), 14-22 (1994).
  7. Wipff, P. J., et al. The covalent attachment of adhesion molecules to silicone membranes for cell stretching applications. Biomaterials. 30 (9), 1781-1789 (2009).
  8. Wen, H., Blume, P. A., Sumpio, B. E. Role of integrins and focal adhesion kinase in the orientation of dermal fibroblasts exposed to cyclic strain. Int Wound J. 6 (2), 149-158 (2009).
  9. Chu, S. Y., et al. Mechanical stretch induces hair regeneration through the alternative activation of macrophages. Nat. Commun. 10 (1), 1524(2019).
  10. Le Roux, A. L., et al. Dynamic mechanochemical feedback between curved membranes and BAR protein self-organization. Nat. Commun. 12 (1), 6550(2021).
  11. Kosmalska, A. J., et al. Physical principles of membrane remodelling during cell mechanoadaptation. Nat. Commun. 6 (1), 7292(2015).
  12. Quiroga, X., et al. A mechanosensing mechanism controls plasma membrane shape homeostasis at the nanoscale. Elife. 12, e72316(2023).
  13. Casares, L., et al. Hydraulic fracture during epithelial stretching. Nat Mater. 14 (3), 343-351 (2015).
  14. Beedle, A. E. M., et al. Fibrillar adhesion dynamics govern the timescales of nuclear mechano-response via the vimentin cytoskeleton. bioRxiv. , (2023).
  15. Kechagia, Z., et al. The laminin-keratin link shields the nucleus from mechanical deformation and signalling. Nat Mater. 22 (11), 1409-1420 (2023).
  16. Andreu, I., et al. The force loading rate drives cell mechanosensing through both reinforcement and cytoskeletal softening. Nat. Commun. 12 (1), 4229(2021).
  17. Phuyal, S., et al. Mechanical strain stimulates COPII -dependent secretory trafficking via Rac1. EMBO J. 41 (18), e110596(2022).
  18. Oria, R., et al. Force loading explains spatial sensing of ligands by cells. Nature. 552 (7684), 219-224 (2017).
  19. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nat Protoc. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  20. Faure, M. L., Gómez-González, M., Baguer, O., Comelles, J., Martínez, E., Arroyo, M., Trepat, X., Roca-Cusachs, P. 3D Micropatterned Traction Force Microscopy: A Technique to Control 3D Cell Shape While Measuring Cell-Substrate Force Transmission. Advanced Science. 46, 2406932(2024).
  21. Bogdanov, A. M., Kudryavtseva, E. I., Lukyanov, K. A. Anti-fading media for live cell GFP imaging. PLoS One. 7 (12), 53004(2012).
  22. Richter, K. N., et al. Glyoxal as an alternative fixative to formaldehyde in immunostaining and super-resolution microscopy. EMBO J. 37 (1), 139-159 (2018).
  23. Kopek, B. G., et al. Diverse protocols for correlative super-resolution fluorescence imaging and electron microscopy of chemically fixed samples. Nat Protoc. 12 (5), 916-946 (2017).
  24. Balachandran, K., et al. Cyclic strain induces dual-mode endothelial to mesenchymal transformation of the cardiac valve. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (50), 19943-19948 (2011).
  25. Kamble, H., Barton, M. J., Jun, M., Park, S., Nguyen, N. T. Cell stretching devices as research tools: Engineering and biological considerations. Lab Chip. 16 (17), 3193-3203 (2016).
  26. Jorba, I., et al. Nonlinear elasticity of the lung extracellular microenvironment is regulated by macroscale tissue strain. Acta Biomater. 92, 265-276 (2019).
  27. Mayer, C. R., Arsenovic, P. T., Bathula, K., Denis, K. B., Conway, D. E. Characterization of 3D printed stretching devices for imaging force transmission in live-cells. Cell Mol Bioeng. 12 (4), 289-300 (2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة