يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جهاز تمدد متساوي المحور للفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للخلايا الحية عالية التكبير

1.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67520

⸱

يونيو 13, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute for Bioengineering of Catalonia (IBEC), Barcelona Institute of Science and Technology (BIST), 2University of Barcelona (UB), 3Department of Physics, King's College London, 4ICFO-Institut de Ciencies Fotoniques, The Barcelona Institute of Science and Technology, 5Centro de Investigación Biomédica en Red en Bioingeniería, Biomateriales y Nanomedicina (CIBER-BBN), 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA)

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم جهاز تمدد متساوي المحور متعدد الاستخدامات يتم تشغيله بالهواء المضغوط ومتوافق مع الفحص المجهري عالي الدقة.

الملخص

تتعرض الخلايا باستمرار للقوى الميكانيكية في المواقف الفسيولوجية والمرضية ، بما في ذلك مجموعة متنوعة من ضغوط الشد والضغط. هناك بحث نشط للغاية يستكشف كيفية استجابة الخلايا والأنسجة والتكيف مع مثل هذه الضغوط وكيف تتكامل هذه الاستجابات مع الإشارات الكيميائية الميكانيكية. وقد ولد هذا الحاجة إلى أدوات متطورة متوافقة مع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية وطرق الفحص المجهري ، مما يؤدي إلى إعادة إنتاج الضغوط الفسيولوجية في الدراسات المختبرية. تقدم هذه الدراسة تصميم ووظيفة وتوصيف جهاز تمدد متوافق مع الفحص المجهري البصري والفلوري عالي الدقة. تم تطوير العديد من أجهزة التمدد ، سواء كانت تعمل بالهواء المضغوط أو المحرك ، واستخدامها في هذا المجال. نقدم أحد هذه الأنظمة بالتفصيل ، بما في ذلك إرشادات التصميم ومجموعة متنوعة من التطبيقات وجميع الأدوات لتصنيع إعداد مماثل. يعتمد النظام على غشاء بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان قابل للتشوه (PDMS) ، يمتد بشكل متساو عند تطبيق الفراغ ، مما يجعل سلالة عينة متجانسة وقابلة للتكرار وخاضعة للرقابة. يوفر مجموعة متنوعة من ضغوط الشد ، من التمدد الفوري والفوري إلى دورات تحرير التمدد المتكررة للسعة والتردد المتحكم فيه. يسمح طلاء الركيزة ببروتينات الالتصاق ببذر الخلايا التي تحمل مراسلي الفلورسنت في جهاز التمدد وإجراء التصوير الحي لهذه الخلايا عند التمدد باستخدام مجاهر مضان عالية التكبير. يمكن أيضا تطبيق الضغوط الانضغاطية عن طريق ترك العينة تتكيف مع التمدد ثم إطلاقها لاحقا أو عن طريق زرع العينة على ركيزة ممتدة مسبقا قبل إطلاق التمدد. يتيح الزخرفة الطبوغرافية الإضافية لركيزة PDMS تصوير نفس العينة في أوضاع مجهرية مختلفة (مثل التألق والفحص المجهري الإلكتروني). يمكن أيضا ربط المواد الهلامية بولي أكريلاميد بغشاء PDMS ، مما يؤدي إلى تمدد الخلايا المصنفة على ركائز ذات صلابة مختلفة. بشكل عام ، من خلال تطبيق ضغوط الشد الخاضعة للرقابة على العينات الحية ، يمكن لجهاز التمدد هذا ، إلى جانب الفحص المجهري الفلوري عالي الجودة ، معالجة مجموعة كبيرة ومتنوعة من الأسئلة في علم الأحياء الميكانيكي.

المقدمة

تستخدم أغشية polydimethylsiloxane الرقيقة القابلة للتشوه (PDMS) على نطاق واسع في مجموعة متنوعة من أجهزة التمدد المصنوعة حسب الطلب1،2،3 ، حيث أن PDMS هي مادة خاملة متوافقة حيويا راسخة متوافقة مع التصوير المجهري. هنا ، مثل العديد من الآخرين4،5،6،7،8،9 ، يتم استخدام المفهوم البسيط لتطبيق الفراغ لتشويه الغشاء لتجميع جهاز تمدد متساوي المحور قوي ويمكن ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. تصميم المسرح وعمود التمدد (الشكل 1)

  1. صمم عمودا مطاطيا متوافقا في الأبعاد مع حجم المسرح / حوامل وتكوين الهدف. يتم عرض عمودي التمدد المحددين في الشكل 1 أ ، د.
    ملاحظة: تتوافق ملفات FreeCAD المتوفرة في هذا البروتوكول (المجلد التكميلي 1) مع مجاهر ومراحل نيكون التالية: Eclipse Ni-E المستقيم المجهز بمرحلة NI-SH-E ، و Eclipse Ti-E / B المقلوب المزود بمرحلة TI-S-ER ، الشكل 1 د. يمكن أن يكون المنشور ثلاثي الأبعاد (3D) مطبوعا ولكن قد يتشوه بعد الاستخدام المتكرر ؛ لن تعاني ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

المعايرة والشعاع
التوصيف الصحيح للسلالة التي تم الحصول عليها هو ضمان لقابلية التكرار والتحكم في التجارب. بينما يمكن إضافة حبات الفلورسنت إلى كل عينة لتسجيل السلالة بدقة ، فإن خطوة المعايرة السابقة تضمن التخطيط المناسب للتجربة ، مع معرفة حجم الإجهاد الذي يريد التجريبي تطبيقه على العينة قبل التمدد الفعلي. لن يعتمد الإجهاد على الفراغ المطبق فحسب ، بل سيختلف اعتمادا على أبعاد حلقة التمدد ، وتكوين PDMS (خليط مختلف عن 1:10) ، وسمك الغشاء ، والتمدد المسبق لغشاء PDMS قبل التثبيت في الحلقة. لذلك ، يجب معايرة ك.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

تم استخدام عدد كبير من أجهزة التمدد لتطبيق التمدد الميكانيكي على العينات البيولوجية ، مما يحاكي الظروف الفسيولوجية في الجسم24،25. تتوفر العديد من الإعدادات في الأدبيات ، وعادة ما يتم إجراء مراقبة استجابة العينة عن طريق اقتران أجهزة التمدد بالقوة الذرية26 أو الفحص المجهري الفلوري27،11.

يتيح تصميم وتشغيل جهاز التمدد المعر.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

نحن لا نعلن عن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

ودعم هذا العمل بتمويل من مؤسسة "la Caixa" (المنحة 406 LCF/PR/HR20/52400004 إلى X.T.، J.V.R.، وP.R.-C. والزمالات LCF/BQ/DR19/11740009 إلى 407 I.G.-M. و LCF/BQ/DR19/11740009 إلى M.M.J.)، ووزارة العلوم والابتكار الإسبانية 408 (PID2022-142672NB-I00 إلى P.R.-C.، PID2021-128635NB-I00 إلى XT ، و PID2022-141040NA-I00 409 إلى I.A.) ، Generalitat de Catalunya (2021 SGR 01425 إلى XT و P.R.-C.) ، جائزة "ICREA 410 Academia" للتميز في البحث ل P.R.-C. ، مؤسسة Marató de TV3 (201936-30-31 إلى 411 P.R.-C.) ، الاتحاد الأوروبي (ERC ، MECHANOSYNTH ، منح 101097753 إلى P.R-C. و ERC ، Adv-412 883739 Epifold إلى XT.). ومع ذلك ، فإن الآراء والآراء المعبر عنه....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
قناع الأسيتاتدينار أردني Photodata
أكريلاميدبيوراد161-014040٪ محلول أكريلاميد
APSسيجما ألدريتشأ 3678بيرسلفات الأمونيوم للرحلان الكهربائي ، &GE ؛ 98%
أبيتسسيجما ألدريتش281778(3-أمينوبروبيل) ثلاثي إيثوكسيسيلان
مضخة الموائع الدقيقة المستقلةElveflow الكوبالتالكوبالت المزدوجالكوبالت المزدوج
بيساكريلاميدبيوراد161-0142محلول 2٪ مكرر
شفرةفيشر العلمية11733919المجموعة التعليمية هوجا فعلت á ctica X100 عرجاء بيستوري معقم N & deg; 23  LAMD23 
مشابكسبرينتيسAKXX000001مشابك بول دوج ، 32 مم ، مصنوعة من المعدن ، سعة 10 مم ، مطلية بالنيكل
معالج كوروناالمنتجات الكهروتقنيةBD-20AC، رمز المنتج: 12051ABD-20AC مختبر كورونا المعالج
الكؤوسVWR611-1368VWR ، أكواب أكواب ، يمكن التخلص منها ، 250 مل
دابيروش10236276001تلطيخ DAPI
الإيثانول 96٪بانريك تشو í الميكا ، SLU131085-1212إيتانول 96٪ الخامس / الخامس الفقرة á ليسيس ، ACS - 2,5 لتر
فيبرونيكتينسيغماإف 0895فيبرونيكتين ، من البلازما البشرية ، سائل   ؛ 0.1%
FluoSpheres كرات مجهرية معدلة كربوكسيل ، 0.1 µ ؛ mتقنية الحياةF8801 ، F8803حبات فلورية صفراء وخضراء وحمراء لتقييم الدقة
FluoSpheres الكرات المجهرية المعدلة بالكربوكسيل ، 0.2 & mفيشر العلميةF8809 ، F8810حبات الفلورسنت الصفراء والخضراء والحمراء لمعايرة الإجهاد
جلوتارالديهايدسيجما ألدريتشجي 6403محلول جلوتارالديهايد 50٪ في فئة H2< / sub>< / font>O< / font>
مقياس التداخلVeeco ويكو NT1100مقياس التداخل لقياس سمك أغشية PDMS
إيزوبوبانولبانريك تشو í الميكا ، SLU131090-1212 2-Propanol (Reag. Ph. Eur.) para an á lisis ، ACS ، ISO
Laiton يزنحسب الطلب
الأنسجة الخالية من الوبربيركشايرDURX670 ، DR670090920مناديل غير منسوجة
زيوت التشحيم (الفازلين)سيغما16415الفازيلين
تقويم القناعS ü ss MicroTec MJB4 تقويم القناع للطباعة الحجرية الضوئية على لوحات PMMA
مويولCalbiochem - ميرك475904كاشف MOWIOL 4-88
مجهر نيكون القرص الغزل متحد البؤرنيكونالكسوف Ti-E / Bمجهزة ب Nikon Ti-S-ER   ؛ مرحلة
مجهر نيكون عمودينيكونكسوف Ni-Eمجهزة بمرحلة نيكون NI-SH-E
الهدف 60xنيكونCFI Apo NIR 60X WNIR Apo 60X / 1.0w DIC N2 WD 2.8
حل PBSجيبكو14200067DPBS، 10 أضعاف
نظام PDMSداو كورنينج2401673921سيلجارد - 184 طقم مطاط صناعي من السيليكون DN 109
غطاء حلقة طبق بتري (كبير)بروكينورت93060Plato de cultivo celular TPP رمز المنتج: 07177925 diametro 100
غطاء حلقة طبق بتري (صغير)بروكينورت93060Plato de cultivo celular TPP رمز المنتج: 07177924
منظف البلازماهاريك   ؛PDC-002مولد بلازما الأكسجين
لوحات وحلقات PMMAراجع جدول مواصفات Excel في المستندات التكميلية
أطالإنفيتروجينP36930 / P36934كاشف مضاد للتلاشي ProLong Gold
بيل سيلانجنرال إلكتريك للرعاية الصحية17-1332-01بلسوون بيل سيلان ES
خواتم / حلقة مطاطيةتكنيفيلحسب الطلب
تدور المغطيالغارWS-650Szتدور المغطي
SPY650-DNAسبيروكرومإس سي 501SPY650-DNA
ملعقة التوجيهVWR231-0416ملعقة إيكولوجية قصيرة يمكن التخلص منها ، ملعقة مزدوجة النهايات ومغرفة ، مادة مضافة PP و EcoPure
راتنج SU8 2100ميكروكيمY111075SU8-2100
مطور SU8سيجما ألدريتش484431البروبيلين جلايكول مونوميثيل إيثر أسيتات
TEMEDسيجما ألدريتشT9281-50 ملN,N,N',N'-TETRAMETHYLETHYLENEDIAMINE, BIOREAGENT SUITAB. كاشف الرحلان الكهربائي
ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) سيلان   ؛سيجما ألدريتش448931  ثلاثي كلورو (1H ، 1H ، 2H ، 2H-perfluorooctyl) سيلان
الملقطإيسماتT5039 دومون اتش بي ملاقط 7 ستانلس ستيل. طرف 0.17 × 0.10 مم. (أجار العلمية المحدودة)
تحكم فراغجاركاب / باركر  990-005203-005 Controlador de vacio 
وحدة تحكم فراغ متألقةمتألقلو-فاس-N800خط تدفق EZ (n800mbar)
ورقة مقاعد البدلاء البيضاءرايما931.1001  ورق Raima 42 × 52

المراجع

  1. Huang, L., Mathieu, P. S., Helmke, B. P. A stretching device for high-resolution live-cell imaging. Ann Biomed Eng. 38 (5), 1728-1740 (2010).
  2. Meza, D., Abejar, L., Rubenstein, D. A., Yin, W. A shearing-stretching device that ca....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

المجهرية للخلايا الحيةغشاء PDMSالمحفزات الميكانيكيةمعايرة الإجهادهلامات البولي أكريلاميدتطبيق الفراغبروتينات التصاق الخلاياالتصوير متعدد الوسائط
جهاز تمدد متساوي المحور للفحص المجهري الفلوري متحد البؤر للخلايا الحية عالية التكبير
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.