هنا ، نصف تقنية لحصاد الأعضاء الطرفية الدهليزية البشرية في ظل ظروف فسيولوجية أثناء استئصال المتاهة وتحليلها باستخدام التلوين المناعي.
مقالة منهجية
حصاد الأعضاء الطرفية الدهليزية في ظل الظروف الفسيولوجية أثناء استئصال المتاهة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يصعب دراسة الأذن الداخلية للإنسان الحي لأنها مغلفة بعظم كبسولة الأذن الكثيفة التي تحد من الوصول إلى الأنسجة البيولوجية. تعتمد طرق علم الأنسجة المرضية للعظام الصدغية التقليدية على بروتوكولات إزالة الكلس الطويلة والمكلفة التي تستغرق من 9 إلى 10 أشهر وتقلل من أنواع تحليل الأنسجة الممكنة بسبب تدهور الحمض النووي الريبي. هناك حاجة ماسة لتطوير طرق للوصول إلى أنسجة الأذن الداخلية البشرية الجديدة لفهم أمراض الأذن بشكل أفضل ، مثل مرض مينيير ، على المستوى الخلوي والجزيئي. تصف هذه الورقة تقنية لحصاد الأعضاء الطرفية الدهليزية البشرية من متبرع حي في ظل ظروف فسيولوجية. خضع فرد مصاب بمرض مينيير و "نوبات قطرات" مقاومة لحقن جنتاميسين داخل الطبلة لاستئصال المتاهة. تم إجراء استئصال الخشاء التقليدي لأول مرة ، وتم تحديد القنوات نصف الدائرية الأفقية والعلوية (SCC). تم ملء تجويف الخشاء بمحلول ملحي متوازن بحيث يمكن فتح المتاهة في ظل ظروف فسيولوجية أكثر للحفاظ على سلامة الخلية. تم استخدام منظار داخلي بدرجة صفر مع نظام ري غمد لتنظيف العدسة لتصور تجويف الخشاء المغمور ، وتم استخدام لدغ ماسي 2 مم لهيكل عظمي وفتح SCCs الأفقية والعليا ، متبوعا بالدهليز. تم حصاد الأمبولات وجزء من قنوات القناة للخلايا العليا والجانبية. تم حصاد اليوتريكول بالمثل. تم وضع الأنسجة المحصودة على الفور في محلول عازل مثلج ثم تم تثبيتها لمدة ساعة واحدة في 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). تم شطف الأنسجة عدة مرات في 1x PBS وتخزينها لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية. خضعت عينات الأنسجة للتلطيخ المناعي بمزيج من الأجسام المضادة الأولية ضد tenascin-C (Calyx) ، oncomodulin (خلايا الشعر الstreolar) ، calretinin (خلايا الشعر الكأس والنوع الثاني) ، بروتين الحويصلة المشبكية 2 (الألياف والعروات الصادرة) ، β-tubulin 1 (الكأس والعروات الواردة) ، تليها الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور. ثم تم شطف عينات الأنسجة وتركيبها لفحص المجهر متحد البؤر. كشفت الصور عن وجود خلايا شعر أمبولر وبقعة وهياكل عصبية. يوضح هذا البروتوكول أنه من الممكن حصاد أنسجة الأذن الداخلية البشرية السليمة وعالية الجودة من المتبرعين الأحياء وقد يوفر أداة مهمة لدراسة أمراض الأذن.
المقدمة
يصعب دراسة الأذن الداخلية للإنسان الحي نظرا لموقعها داخل عظم الكبسولة الأذنية الكثيفة للعظم الصدغي. وبالتالي ، كان الوصول إلى الأنسجة الداخلية البشرية محدودا ، واعتمد الباحثون بشكل أساسي على حصاد الأنسجة بعد الوفاة. كان علم الأنسجة العظمية الصدغي بعد الوفاة (TBH) أداة مهمة لفهم أمراض الأذن البشرية لأكثر من 100 عام1،2،3. يتم تحضير أنسجة TBH عن طريق حصاد العظم الصدغي بعد الوفاة ، وهي عملية طويلة (9-10 أشهر) لإزالة الكلس وتحضير الأنسجة ، تليها تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين. في حين أن TBH سيظل أداة أساسية للكشف عن معلومات جديدة حول الأذن الداخلية البشرية السليمة والمريضة ، فإن أوقات ما بعد الوفاة الطويلة وطرق معالجة الأنسجة الطويلة والقاسية تحد من فائدتها لأغراض معينة ، مما يستلزم طرقا مساعدة لدراسة أنسجة الأذن الداخلية البشرية. يمكن للتصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة تصور أعضاء الأذن الداخلية ولكنه يفتقر إلى الدقة الكافية لعرض الهياكل على المستوى الخلوي أو الجزيئي4،5. بسبب هذه التحديات ، لا تزال العديد من أمراض الأذن الداخلية للإنسان غير مفهومة جيدا.
النهج البديل هو حصاد أنسجة الأذن الداخلية أثناء الجراحة. أثناء استئصال المتاهة أو استئصال الورم الشفاني الدهليزي عبر التاهة ، يتم التضحية بأنسجة الأذن الداخلية عن قصد. تم استخدام الأوتريلات التي يتم حصادها من المرضى أثناء استئصال الورم الشفاني الدهليزي عبر التاهة لتوصيف مورفولوجيا خلايا الشعر الدهليزي6،7،8 ودراسة تجديد خلايا الشعر9،10. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير تقنيات لحصاد أعضاء الأذن الداخلية من المتبرعين بالأعضاء باستخدام نهج عبر القناة يمكن استخدامه لإزالة الأذن والأعضاء النهائية الدهليزية الأخرى المحتملة من خلال نافذة بيضاوية موسعة مع الحد الأدنى من صدمة الأنسجة11،12. باستخدام هذه التقنية ، كان من الممكن توصيف ملفات تعريف النسخ أحادية الخلية للجسمالبشري 13. ومع ذلك ، فإن هذه التقنيات تعرض أعضاء الأذن الداخلية لظروف غير فسيولوجية أثناء الحصاد. على وجه التحديد ، قد تتعرض أعضاء الأذن الداخلية لغياب السائل المحيط باللمف والغمر في الري الطبيعي بالحفر الملحي ، والذي يحتوي على تركيبة أيونية مختلفة اختلافا كبيرا عن السائل المحيط اللمفاوي. علاوة على ذلك ، يصعب تصور المتاهة الغشائية المجففة ، حتى مع التكبير الأقصى لمجهر التشغيل ، مما يجعل التشريح الجراحي الرضحي صعبا. قد تؤدي الصدمة الميكانيكية إلى مزيد من الضرر للأنسجة ، وتشير تجربتنا القصصية إلى أن الأنسجة الجراحية غالبا ما تكون ذات جودة غير كافية من التلوين المناعي بسبب التلف الميكانيكي والتنكس الخلوي. هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لحصاد أنسجة الأذن الداخلية البشرية بشكل غير رضحي للدراسات البيولوجية التي قد توضح أمراض الأذن الداخلية البشرية غير المفهومة جيدا. نصف هنا تقنية تحت الماء لحصاد الأعضاء النهائية الدهليزية البشرية في ظل ظروف فسيولوجية أكثر أثناء استئصال المتاهة وتحليلها باستخدام التلوين المناعي.
البروتوكول
تم تطوير هذا البروتوكول بموافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) لكلية الطب بجامعة جونز هوبكنز (IRB00203441) ووفقا للسياسات المؤسسية لاستخدام الأنسجة البشرية والمواد التي يحتمل أن تكون معدية. تم إجراء جمع الأنسجة أثناء استئصال المتاهة ، وهو جزء من الرعاية السريرية القياسية لمرض مينيير المتمرد مع نوبات التساقط.
1. استئصال المتاهة وحصاد الأنسجة
- الحصول على موافقة مجلس إدارة مجلس المراجعة المؤسسية المحلية (IRB) ، ومراجعة السياسات المؤسسية لاستخدام المواد البشرية والمعدية ، والحصول على الموافقة على التبرع بالأنسجة قبل استخدام هذا البروتوكول. إجراء حصاد الأنسجة أثناء استئصال المتاهة الجراحية أو نهج translabyrinthine للقناة السمعية الداخلية ، والتي تعد جزءا من الرعاية السريرية القياسية.
- جهز المريض.
- قبل تحريض التخدير ، ناقش مع فريق التخدير تجنب الشلل طويل المفعول حتى يمكن مراقبة العصب الوجهي.
- بمجرد تحفيز التخدير العام ، قم بتنبيب المريض وتدوير طاولة العمليات 180 درجة. ضع أقطاب مراقبة العصب الوجهي وتأكد من إعطاء الوقاية بالمضادات الحيوية قبل الجراحة.
- حقن 1٪ ليدوكائين مع 1: 100،000 أدرينالين في القناة السمعية الخارجية ومنطقة ما بعد الأذن. تحضير الأذن بالطريقة القياسية باستخدام البيتادين.
- استخدم شفرة # 15 لإنشاء شق منحني قياسي (5-6 سم) خلف الطية الخلفية للأذن.
- ارفع الأنسجة الرخوة بعد الأذن.
- تحديد اللفافة الصدغية بشكل متفوق ورفع سديلة الجلد بعد الأذن الأمامية باتجاه قناة الأذن.
- قم بإنشاء شق معياري على شكل 7 أشكال السمحاق ورفع السمحاق من الأمام حتى يتم تحديد العمود الفقري لهينلي وقناة الأذن العظمية. ضع ضاعدات إعادة التدريب الذاتي.
- إجراء استئصال الخشاء
- إجراء استئصال الخشاء الكامل ، وتحديد التيجمين بشكل متفوق ، والجيب السيني للخلف ، وترقق القناة السمعية الخارجية من الأمام.
- تحديد القناة نصف الدائرية الأفقية والعملية القصيرة للإنكوس.
ملاحظة: لا ينبغي صحن الخشاء لضمان بقائها وعاء قادر على الاحتفاظ بالسائل لجمع الأنسجة تحت الماء.
- تحديد القنوات نصف الدائرية (SC).
- تحت مجهر التشغيل (تكبير 2-4x) ، استخدم لدغ ماسي خشن 3 مم لإزالة الخلايا الهوائية المحيطة بالمتاهة الجانبية إلى SC العلوي ، والخلايا الهوائية تحت المقوسة ، والخلايا الهوائية المتاهة الرجعية خلف SC الخلفي ، وتمتد بشكل متفوق إلى crus المشترك.
- اغمر المتاهة.
- اغمر تجويف الخشاء في محلول ملحي متوازن (BSS) وتصور المتاهة باستخدام منظار داخلي بدرجة صفر مع نظام ري غمد لتنظيف العدسة.
- استخدم نظام الري بغمد تنظيف العدسة لري تجويف الخشاء باستخدام BSS ، مما يؤدي إلى إزالة الدم والسماح بتحسين الرؤية للمتاهة.
- الخط الأزرق 'SCs.
- مع الحفاظ على مستوى مناسب من BSS في تجويف الخشاء واستخدام المنظار للتصور ، استخدم نتوءا ماسيا مقاس 3 مم إلى "الخط الأزرق" جميع القنوات الثلاث نصف الدائرية عن طريق الحفر بعناية بعيدا عن عظم الكبسولة الأذنية حتى تظهر القناة نصف الدائرية كخط مزرق عند عرضها بالمنظار الداخلي.
- قم بالري بشكل متقطع بمحلول BSS باستخدام نظام الري لغسل الدم وتحقيق التصور المناسب ، كما هو موضح في الشكل 1.
- حصاد SC ampullae.
- تحت BSS ، أدخل قبة القناة نصف الدائرية الجانبية واتبع ذلك من الأمام حتى يتم تحديد الأمبولات الخاصة بها. أدخل SC العلوي واتبع هذا وسطيا نحو الأمبولات ، والتي يمكن حصادها باستخدام أمبولات SC العليا ، اقطع قناة SC الجانبية بشكل حاد لتسهيل الإزالة.
- ارفع أمبولات SC الأفقية والفائقة عن الكريستا باستخدام إبرة روزين وافصل الألياف الواردة عن الظهارة والمتاهة الغشائية. ثم قم بإزالة هذه الهياكل.
- قم بعبور قبة SC الخلفية واتبع هذا بشكل أدنى وأمام أمبولاته. وبالمثل ، قم بحصاد أمبولات SC الخلفية وضع جميع الأنسجة في BSS على الجليد.
- حصاد البقعة.
- قم بإزالة العظم بين أمبولات SC الأفقية والخلفية لكشف الدهليز. ستتمزق الجدران الغشائية للرحم مع إزالة الأمبولات. طالما يتم الحفاظ على مستوى السوائل ، ستظل البقعة ملتصقة من الأمام. ارفعه وقم بإزالته.
- الكيس يجلس داخل التجويف الكروي. ارفعه بشكل حاد وإزالته من العطلة. وبالمثل ، ضع عينات الأنسجة في BSS على الجليد.
- نقل عينات الأنسجة على الجليد من غرفة العمليات إلى المختبر لتثبيتها في غضون ساعة واحدة من الحصاد.
2. الكيمياء المناعية والتصوير
- إصلاح العينة.
- ضع عينة الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) في درجة حرارة الغرفة (RT) مع هزاز لطيف أو اهتزاز مداري (100 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة واحدة.
ملاحظة: محلول PFA بنسبة 4٪ (لإجمالي 5 مل): 625 مل من محلول مخزون PFA بنسبة 32٪ + 500 مل من 10xPBS + 3875 مل من ddH2O.
- ضع عينة الأنسجة في 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (1x PBS) في درجة حرارة الغرفة (RT) مع هزاز لطيف أو اهتزاز مداري (100 دورة في الدقيقة) لمدة ساعة واحدة.
- انقل عينات الأنسجة إلى محلول 1x PBS واشطفها 3 × 15 دقيقة (أو أكثر إذا لزم الأمر) في RT مع هزاز لطيف أو اهتزاز مداري.
- قم بإزالة النسيج الضام الزائد تحت مجهر التشريح في 1x PBS في RT.
- قم بفك الكلس للعينة.
- نقل عينات الأنسجة إلى 5٪ حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) في محلول 1x PBS لتنظيف الظهارة الحسية من بقايا العظام الدقيقة والأذن. قم بتشغيل الحضانة لمدة 15-30 دقيقة في RT ، مع هزاز لطيف أو اهتزاز مداري.
- مرة أخرى ، انقل عينات الأنسجة إلى محلول 1x PBS واشطفها 3 × 15 دقيقة (أو أكثر إذا لزم الأمر) في RT مع هزاز لطيف أو اهتزاز مداري.
- ضع 125-200 مل من المخزن المؤقت للحجب 2x (2x BB) على كل عينة واحتضنه لمدة 1.5-5 ساعات عند RT أو بين عشية وضحاها (ON) عند 4 درجات مئوية. قم بتشغيل الحضانة تحت اهتزاز مداري مستمر.
ملاحظة: 2x المخزن المؤقت للحجب (2x BB): 1 جم من ألبومين مصل الأبقار (BSA) مذاب في ما يصل إلى 5 مل من 1x PBS مكمل بنسبة 0.5٪ Triton X-100. يعمل BSA كعامل حجب لمواقع ربط المستضد غير المحددة. - صبغة باستخدام الأجسام المضادة الأولية.
- ضع 120-150 مل من مجموعة من الأجسام المضادة الأولية المذابة في 1x BB على التخفيف المطلوب. ضع الأجسام المضادة للأرانب المضادة للتناسين سي عند تخفيف 1: 200 (2.5 ميكروغرام / مل) ، والأجسام المضادة للأونكومودولين للماعز عند تخفيف 1: 200 (2.5 ميكروغرام / مل) ، والفأر المضاد للكالريتينين عند تخفيف 1: 300 (2.2 ميكروغرام / مل) ، و DAPI عند تخفيف 1: 1000 (1 ميكروغرام / مل). بعد ذلك ، انقل العينة (المغطاة) إلى 4 درجات مئوية (الثلاجة أو الغرفة الباردة) تحت اهتزاز مداري لطيف لحضانة ON.
ملاحظة: 1x BB: امزج حجما متساويا من 2x BB و 1x PBS مع 0.5٪ Triton X-100.
- ضع 120-150 مل من مجموعة من الأجسام المضادة الأولية المذابة في 1x BB على التخفيف المطلوب. ضع الأجسام المضادة للأرانب المضادة للتناسين سي عند تخفيف 1: 200 (2.5 ميكروغرام / مل) ، والأجسام المضادة للأونكومودولين للماعز عند تخفيف 1: 200 (2.5 ميكروغرام / مل) ، والفأر المضاد للكالريتينين عند تخفيف 1: 300 (2.2 ميكروغرام / مل) ، و DAPI عند تخفيف 1: 1000 (1 ميكروغرام / مل). بعد ذلك ، انقل العينة (المغطاة) إلى 4 درجات مئوية (الثلاجة أو الغرفة الباردة) تحت اهتزاز مداري لطيف لحضانة ON.
- اشطف عينات المناديل في محلول 1x PBS ، 3 × 15 دقيقة (أو أكثر إذا لزم الأمر) ، في RT مع هزاز لطيف.
- وصمة عار باستخدام الجسم المضاد الثانوي.
- ضع 120-150 مل من مزيج من الأجسام المضادة الثانوية المترافقة بالفلوروفور المذابة في 1x BB عند تخفيف 1: 2000 (1 ميكروغرام / مل). قم بتطبيق الجسم المضاد الثانوي المترافق المضاد للأرانب 488 نانومتر ، والجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر 568 نانومتر ، والجسم المضاد الثانوي المضاد للماعز 647 نانومتر.
- بعد ذلك ، قم باحتضان العينة (المغطاة) عند RT تحت اهتزاز مداري لطيف لمدة 1.5-2 ساعة (أو ON عند 4 درجات مئوية).
- اشطف عينات المناديل في محلول 1x PBS ، 3 × 15 دقيقة (أو أكثر إذا لزم الأمر) ، في RT مع هزاز لطيف.
- إجراء التشريح الدقيق والتركيب.
- تحت المجهر التشريح ، قم بإزالة الأنسجة الزائدة والأغشية من حول الظهارة الدهليزية الحسية. استخدم 70٪ من الإيثانول لتنظيف سطح شريحة الأنسجة الزجاجية ، وجففها في الهواء ، وقم بتطبيق قطرة 55 مل من وسط التثبيت المناسب.
- انقل عينات الأنسجة الحسية إلى وسط التركيب. استخدمي ملقطا دقيقا لتوجيه العينات برفق مع وضع جانب حزمة الشعر لأعلى في وسط التثبيت.
- ضع زجاج غطاء بالحجم المناسب برفق على وسط التثبيت الذي يحتوي على العينات ، في محاولة للحد من فقاعات الهواء. تأكد من أن زجاج الغطاء بدرجة سمك # 1.5 مطلوبة للفحص المجهري متحد البؤر.
- ضع الشرائح في منطقة مظلمة (على سبيل المثال ، درج مقاعد البدلاء) للسماح لوسط التثبيت بالضبط. أغلق زجاج الغطاء بالشريحة باستخدام طلاء أظافر شفاف واتركه يجف في منطقة مظلمة قبل فحصه بالمجهر متحد البؤر. بعد ذلك ، قم بتخزين الشرائح المختومة في الظلام (صندوق الشرائح لمجلد الشرائح) عند 4 درجات حتى التصوير.
- استخدم مجهرا متحد البؤر بتكبير 40x-100x مع قنوات 488 نانومتر و 657 نانومتر لتصوير العينة.
النتائج
باستخدام هذه التقنية ، تم حصاد أمبولات القناة البشرية والجانبية والعليا سليمة مع الحد الأدنى من الصدمات (الشكل 2). كما يتضح من الشكل 2 ، يمكن حصاد الأمبولات بجزء كبير من القناة الغشائية. أظهرت الملصقات المناعية الفلورية باستخدام مضاد تيناسين سي (بروتين مصفوفة خارج الخلية) ومضاد للأونكومودولين (بروتين صغير مرتبط بالكالسيوم من عائلة بروتين بارفألبومين) خلايا شعر دهليزية سليمة من النوع 1 (الشكل 3). كانت كثافة خلايا الشعر 82 لكل 10,000 ميكرومتر2. توضح هذه النتائج فائدة هذه التقنية في حصاد أنسجة الأذن الداخلية للإنسان مع الحد الأدنى من الصدمات للظهارة العصبية.
الشكل 1: رسم توضيحي للإعداد الجراحي. رسم توضيحي للإعداد الجراحي: يظهر تجويف الخشاء الأيسر مع القنوات نصف الدائرية الجانبية والعلوية والخلفية. يتم غمر تجويف الخشاء في محلول ملحي متوازن ويستخدم منظار داخلي بدرجة صفر لتصور تجويف الخشاء بينما يتم استخدام مثقاب ماسي لفتح المتاهة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: متاهة غشائية. تم حصاد (أ) القناة البشرية والجانبية و (ب) أمبولات القناة العلوية تحت مجهر مجسمة ضوئي بتكبير 5x. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: Utricle. إسقاطات الكثافة القصوى لوضع العلامات على الفلورسنت المناعي للرحم البشري بتكبير 40x مأخوذة بمجهر متحد البؤر. يتم تمييز الشقوق المشبكية الكأسي بالأجسام المضادة للتيناسين سي (أخضر). الخلايا الدهليزية من النوع 1 ملطخة بمضاد للأورام (أحمر). شريط المقياس: 50 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
المناقشة
تصف هذه الورقة تقنية جديدة للحصاد تحت الماء للأعضاء الطرفية الدهليزية في BSS باستخدام المناظير الداخلية وتحليلها باستخدام التصوير المناعي الفلوري. هنا ، نوضح حصاد الأعضاء الطرفية الدهليزية السليمة مع خلايا الشعر الدهليزي السليمة وجودة الأنسجة الكافية لنجاح الملصقات المناعية. كانت كثافة خلايا الشعر في عينتنا مشابهة لتلك التي تم الحصول عليها في دراسات أخرى من متبرعين بالأعضاءالأحياء 13. على حد علمنا ، هذا هو التقرير الأول لتقنية تحت الماء لحصاد الأعضاء الطرفية الدهليزية التي تسمح بالحفاظ على الظروف الفسيولوجية القريبة. كان هذا تكيفا لتقنية تحت الماء لإصلاح تفكك القناة نصف الدائرية الفائقة التي تستخدم BSS للحفاظ على الظروف الفسيولوجية بينما يتم فتح المتاهة لتوصيل14،15.
يتوسع هذا العمل في التقنيات السابقة التي تم تطويرها لحصاد الأعضاء الدهليزية أثناء استئصال المتاهة أو استئصال الورم الشفاني الدهليزي6،7،8 ومن المتبرعين بالأعضاء الأحياء11،12. يمكن التكيف بسهولة مع تقنية الورم الشفاني الدهليزي ، حيث يتم فتح المتاهة بالمثل بعد استئصال الخشاء تم إجراء حصاد الأعضاء الطرفية الدهليزية من المتبرعين بالأعضاء الأحياء على أساس محدود ومن خلال نهج عبرالقناة 12. يعتمد هذا النهج عبر القناة على إزالة الغشاء الطبلي وعظيمات الأذن وتوسيع النافذة البيضاوية قبل حصاد الأعضاء الطرفية الدهليزية. يتطلب حصاد الأنسجة من المتبرعين بالأعضاء الأحياء العمل بالتزامن مع فريق جراحة الزرع في مساحة محدودة يتم مشاركتها مع التخدير على رأس سرير المريض. من غير المحتمل أن تكون التقنية المعروضة هنا قابلة للتكيف مع قيود الوقت والمكان لحصاد الأعضاء الدهليزية أثناء التبرع بالأعضاء الحية. ومع ذلك ، توفر هذه التقنية ميزة تعريض وحصاد أمبولات القنوات نصف الدائرية بسهولة ، والتي يصعب إجراؤها من خلال النافذة البيضاوية.
ستكون دراسة أنسجة الأذن الداخلية البشرية حاسمة لتوضيح الفيزيولوجيا المرضية لاضطرابات الأذن الداخلية ، والتي لا يزال الكثير منها مجهول السبب. على سبيل المثال ، يتم اكتشاف مرض مينيير بشكل شائع في عيادات الأذن ، ومع ذلك لا تزال مسباراته غير معروفة ، ولا توجد خيارات علاجيةمثبتة 16،17. توفر تقنيات مثل النسخ المكاني والتصوير المناعي الفلوري فرصة مثيرة لتسليط الضوء على أمراض الأذن الداخلية ، وحتى الآن ، تم استخدامها فقط على أساس محدود. توفر طرق حصاد أعضاء الأذن الداخلية المحفوظة فرصة لاستخدام تقنيات جزيئية أحدث وقد تقدم مساعدا مفيدا ل TBH القياسي. في حين أن الطريقة الموضحة هنا قد تم استخدامها فقط لتلوين الفلورسنت المناعي ، فإننا نعتقد أن هذا النسيج سيكون ذا جودة كافية لعلم النسخ المكاني.
يتمثل القيد الرئيسي لهذا البروتوكول في أنه يعتمد على المواد الجراحية المتاحة بسهولة. يعد استئصال المتاهة حاليا علاجا غير متكرر الاستخدام لمرض مينيير ، وحتى مراكز الإحالة المزدحمة قد تقوم فقط بالعديد من هذه الإجراءات في السنة. يتم إجراء استئصال الورم الشفاني الدهليزي عبر التتاهة بشكل متكرر. ومع ذلك ، قد تضيف هذه التقنية وقتا لإجراء طويل بالفعل. نقدر أن غمر تجويف الخشاء وفتح القنوات تحت الماء يضيف ما يقرب من 30 دقيقة للجراحة. علاوة على ذلك ، لم يتم إجراء تحليل جنبا إلى جنب لمقارنة جودة الأنسجة التي تم الحصول عليها باستخدام هذه التقنية مع حصاد الأعضاء الدهليزية القياسي أثناء استئصال المتاهة أو استئصال الورم الشفاني الدهليزي ، حيث لا يمكن إجراء مثل هذا التحليل مع الأنسجة التي تم حصادها من متبرع واحد. هناك حاجة إلى مزيد من البحث لتحديد تأثير الظروف أثناء حصاد الأعضاء على جودة الأنسجة للفحص المجهري والتقنيات الأخرى.
باختصار ، نصف تقنية جديدة للحصاد تحت الماء للأعضاء الطرفية الدهليزية أثناء استئصال المتاهة وقدرتها على إنتاج عينات أنسجة عالية الجودة مع خلايا الشعر الدهليزي المحفوظة والملامسات العصبية. تسمح هذه التقنية بحصاد الأنسجة في بيئة أقرب ما يمكن إلى الظروف الفسيولوجية الطبيعية وقد توفر أداة مفيدة لدراسة الأذن الداخلية للإنسان.
الإفصاحات
المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
نشكر محمد ليهار على مساعدته في هذا المشروع. تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم واضطرابات التواصل الأخرى (U24DC020850).
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 10x الفوسفات مخزن المحلول الملحي | Sigma-Aldrich | P5493 | |
| 32٪ محلول مخزون بارافورمالدهيد | ThermoFisher Scientific | 50-980-495 | |
| Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة الثانوية المضادة للأرانب | Jackson Immunoresearch | 111545144 | |
| Alexa Fluor 568 الأجسام المضادة الثانوية المضادة للفأر | Jackson Immunoresearch | 115575146 | |
| Alexa Fluor 647 الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماعز | Jackson Immunoresearch | 705607003 | |
| محلول ملح متوازن | ThermoFisher Scientific | 14040117 | |
| الأبقار مصل الألبومين | Sigma-Aldrich | 10711454001 | |
| مجهر متحد البؤر | Nikon A1 & nbsp ؛ | غطاء زجاج A1 | |
| (18 مم × 18 مم ، سمك # 1.5 | Corning ؛ | 2850-18 | |
| غمد تنظيف العدسة Endo-Scrub 2 | Medtronic | IPCES2SYSKIT | |
| Ethylenediaminetetraacetic (EDTA) | Sigma-Aldrich | E8008 | |
| Goat Anti-oncomodulin Antibody | R & D Systems | AF6345 | |
| Hopkins تلسكوب 0 درجة | Karl Storz | ||
| Mouse Anti-Calretinin الأجسام المضادة | BD Biosciences | 610908 | |
| ProLong Gold الكاشف المضاد للبهتان | Invitrogen | P10144 | |
| الأرنب المضاد للتيناسين C الأجسام المضادة | Millipore | AB19013 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9036-19-5 |
المراجع
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, Current Situation, and Future Perspectives. Otol Neurotol. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal. , Williams and Wilkins Pubs. Baltimore, MD. (1993).
- Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger Pubs. Philadelphia, PA. (1993).
- Swartz, J. D., Loevner, L. A. Imaging of the Temporal Bone. , 4th edition, Thieme Medical Pubs. Stuttgart. (2009).
- Nagururu, N. V., Akbar, A., Ward, B. K. Using magnetic resonance imaging to improve diagnosis of peripheral vestibular disorders. J Neurol Sci. 439, 120300(2022).
- Hızlı, Ö, et al. Quantitative vestibular labyrinthine otopathology in temporal bones with vestibular schwannoma. Otolaryngol Head Neck Surg. 154 (1), 150-156 (2016).
- Sans, A., Bartolami, S., Fraysse, B. Histopathology of the peripheral vestibular system in small vestibular schwannomas. Am J Otol. 17 (2), 326-324 (1996).
- Johnson Chacko, L., et al. Growth and cellular patterning during fetal human inner ear development studied by a correlative imaging approach. BMC Dev Biol. 19 (1), 11(2019).
- Taylor, R. R., et al. Regenerating hair cells in vestibular sensory epithelia from humans. Elife. 7, e34817(2018).
- Warchol, M. E., Lambert, P. R., Goldstein, B. J., Forge, A., Corwin, J. T. Regenerative proliferation in inner ear sensory epithelia from adult guinea pigs and humans. Science. 259 (5101), 1619-1622 (1993).
- Aaron, K. A., et al. Selection criteria optimal for recovery of inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e507-e514 (2022).
- Vaisbuch, Y., et al. Surgical Approach for rapid and minimally traumatic recovery of human inner ear tissues from deceased organ donors. Otol Neurotol. 43 (4), e519-e525 (2022).
- Wang, T., et al. Single-cell transcriptomic atlas reveals increased regeneration in diseased human inner ear balance organs. Nat Commun. 15 (1), 4833(2024).
- Creighton, F. X., Zhang, L., Ward, B., Carey, J. P. Hearing outcomes for an underwater endoscopic technique for transmastoid repair of superior semicircular canal dehiscence. Otol Neurotol. 42 (10), e1691-e1697 (2021).
- Schoo, W. W., Schoo, D. P., Chen, J. X., Carey, J. P. Underwater plugging of superior canal dehiscence via the middle cranial fossa is possible. Otolaryngol Head Neck Surg. 169 (6), 1702-1703 (2023).
- Basura, G. J., et al. Clinical practice guideline: Ménière's disease. Otolaryngol Head Neck Surg. 162 (2_suppl), S1-S55 (2020).
- Chandrasekhar, S. S., et al. Clinical practice guideline: Sudden hearing loss (Update). Otolaryngol Head Neck Surg. 161 (1_suppl), S1-S45 (2019).
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
