يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الرسم الميكانيكي للكرويدات باستخدام مطيافية بريلوين

2K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/67538

⸱

ديسمبر 12, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for the Cellular Microenvironment, Advanced Research Centre, 11 Chapel Lane, University of Glasgow, 2LightMachinery Inc.

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

تصف هذه المقالة بروتوكولا لتوصيف الكرويدات الحية الميكانيكية ضمن مصفوفة ثلاثية الأبعاد باستخدام مطيافية بريلوين المجهرية. تتيح هذه الطريقة البصرية بالكامل التصور الكروي بدقة دقيقة وخصائص ميكانيكية كمية. لهذا النهج آثار على التصنيف الظاهري الميكانيكي؛ على سبيل المثال، تحديد الحالات المرضية للكرويدات الورمية ضمن بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد.

الملخص

يتيح مطيافية بريلوين، وهي تقنية ناشئة تكتسب اهتماما كبيرا في العلوم الطبية الحيوية، للباحثين جمع معلومات تتعلق بالميكانيكا والبنية من خلال استكشاف الخصائص اللزجة المرنة والمعمارية للعينات بطريقة غير مدمرة وخالية من التلامس. يقوم هذا النهج بتقييم الخصائص الميكانيكية للعينات ثلاثية الأبعاد من خلال قياس تفاعل الضوء المرئي مع الموجات/الفونونات الصوتية المستحثة حراريا. المعلومات التي يوفرها مطيافية بريلوين لديها إمكانية لتقييم الفيزياء الحيوية في الجسم الحي ، وإمكانية تشخيص أمراض الأمراض. ميزة مهمة لمطيافية بريلوين هي القدرة على تقييم ميكانيكا المجهرية داخل عينة بيولوجية؛ تقنيات تقليدية أخرى يمكنها تحقيق هذه الدقة، مثل المجهر بالقوة الذرية، يمكنها فقط فحص العينات في الأبعاد ثنائية الأبعاد لأنها تتطلب تلامسا مباشرا. يصف هذا العمل تطبيق مطيافية بريلوين الدقيقة للتحقيق في ميكانيكا الكريات الحية المدمجة داخل مصفوفة هيدروجيل ثلاثية الأبعاد. تغليف الكرويدات الخلوية داخل بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد يؤسس نظاما كرويا يعيد عن كثب الواجهة بين الخلايا والمصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي. في بروتوكولنا، نصف تحضير عينات الكروية وقياسات أطياف بريلوين باستخدام التصوير الفلوري المتسلسل. بالإضافة إلى ذلك، نناقش إجراءات تحليل البيانات الطيفية والتفاصيل التقنية حول النظام البصري.

المقدمة

يعد زراعة الخلايا في نماذج ثلاثية الأبعاد ميزة مقارنة بطرق زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد النموذجية، حيث يعيد بشكل أفضل تراكيب الأنسجة والتفاعلات بين الخلايا الموجودة في الجسم الحي. الكرويدات هي تجمعات خلايا ثلاثية الأبعاد تسهل التفاعلات المعقدة بين الخلايا والخلية؛ تتأثر هذه التفاعلات في الخلايا التي تنمو كطبقة أحادية على بلاستيك زراعة الأنسجة. يمكن زراعة الكرويدات داخل هيكل يحاكي البيئة الدقيقة التي نشأت منها الخلية. على سبيل المثال، الهيدروجيلز هي مادة حيوية شائعة تستخدم لزراعة الخلايا/الكرويدات لأنها تتيح تحكما دقيقا في معايير مثل الصلابة، وقابلية التحلل، وحجم المسام، ودمج عوامل النمو1 (الشكل 1A). غالبا ما تسبق الإشارات الميكانيكية التغيرات الكيميائية الحيوية في أمراض الأمراض مثل السرطان والتليف 2,3، لذلك، فإن اكتساب التوقيع الميكانيكي الحيوي في النماذج ثلاثية الأبعاد ذات الصلة سريريا للمرض يعد أمرا أساسيا لتطوير تدخلات تشخيصية لتوجيه الممارسة العلاجية وفهم الفيزيولوجيا المرضية الأساسية4.

مجهر بريلوان (BM) هو تقنية تصوير تسمح بقياس الخصائص الميكانيكية للمواد البيولوجية في مستويات ثنائية الأبعاد 5,6,7. يمتلك BM بعض المزايا الرئيسية مقارنة بطرق أخرى أكثر استخداما، مثل المجهر القيطي الذري (AFM) والتصوير المرن. من المعروف جيدا أن AFM يمكنه تحقيق دقة ميكانيكية مكانية زمانية عالية، وأن التصوير المرن يمكنه استكشاف الميكانيكا داخل العينات 8,9. لا يتطلب BM تلامسا مباشرا مع المادة قيد البحث، مما يجعله تقنية مثالية عبر AFM للعينات أو الخلايا التي يصعب الوصول إليها، مثل الكرويدات داخل الهيدروجيلات. ميزة رئيسية أخرى ل BM هي أنه لا يتطلب وضع علامات على العينات ويمكنه توفير دقة على نطاق مجهري داخل العينات البيولوجية، والتي لا يمكن لطرق الإلاستوغرافيا المستخدمة عادة تحقيق7؛ يمكن لتقنيات الاستوغرافيا البصرية المتقدمة العمل بدقةالمجهرية 10. يجب ملاحظة أن الدقة الفعالة الدقيقة في تصوير بريلوين للعينات البيولوجية غير المتجانسة ليست سهلة التعريف. أولا، بالنسبة لطول موجة إضاءة معين، يعتمد ذلك على الخصائص البصرية التي تصف حجم النقطة البؤرية (الفتحة العددية، NA، للعدسة الموضوعية وعتامة العينة). بالإضافة إلى ذلك، تتأثر دقة فحص الخصائص الميكانيكية للعينة، وكذلك شكل طيف بريلوين، بالخصائص الصوتية للمادة (طول موجة الفونون وطول الانتشار)11,12. الظاهرة الأساسية وراء مطيافية بريلوين هي تشتت بريلوين، حيث يتفاعل ضوء الليزر أحادي اللون الساقط مع الفونونات الصوتية التلقائية المستحثة حراريا داخل الوسط البيولوجي. ينتج عن ذلك تشتت غير مرن للضوء (إزاحة تردد بريلوين، BFS) في الشكل 1B ، وعادة ما يكون في حدود عدة جيجاهرتز، واعتمادا على فقدان الفوتون أو اكتساب الطاقة، يتم اكتشاف قمم بريلوين ستوكس ومضادة ستوكس في طيف الضوء المتشتت على التوالي. من خلال اعتماده على سرعة الصوت المحلية في الوسط، يرتبط BFS بمعامل طولي مرن، والذي يرتبط تجريبيا بمعامل يونغ 7,13؛ ومع ذلك، يجب توخي الحذر عند إجراء المقارنات بين هذه المعاملات، حيث (1) ليست مرتبطة مباشرة ببعضها البعض، (2) معامل يونغ عادة ما يكون في نطاق Pa-kPa للعينات البيولوجية والمادة اللينة، بينما معامل الطول المستخرج من بريلوين يكون ضمن نطاق GPa، و(3) يجب أخذ معاملات مثل تغيرات معامل الانكسار وكثافة المواد في الاعتبار7. عرض خط بريلوان (في الشكل 1B) هو مقياس آخر تم الحصول عليه من BM. يرتبط بمعامل الخسارة الطولي، مما يعطي رؤى حول لزوجة العينة؛ يمكن ربط هذه الخصائص باللزوجة المرونة14. لذا، يسمح BM بتقييم خصائص اللزجة المرنة، حيث أن BFS أكبر يعني مادة أكثر صلابة، وعرض خط أكبر يعني مادة أكثر لزوجة (الشكل 1B). يجدر بالذكر أن التشتت المرن (رايلي)، حيث لا تخضع الفوتونات لتغير ترددي، لديه احتمال أكبر بكثير للحدوث مقارنة بتشتت بريلوين. لذلك، يجب تجهيز مطياف بريلوين لقمع إشارة رايلي.

تم استخدام BM لتوصيف الخصائص الميكانيكية لمختلف الأنسجة والمواد الحيوية ونماذج زراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. على سبيل المثال، تم استخدام BM للتمييز بين الميلانوما والأنسجة السليمة المحيطة، مما أظهر أن النسيج غير السرطاني كان أكثر ليونة بكثير من الميلانوما15. أظهر راد وآخرون أن زيادة تركيز البوليمر للهيدروجيلز أدت إلى زيادة BFS وعرض الخط. عند أدنى تركيزات بوليمر، أظهرت الهيدروجيل مع الخلايا انخفاضا أكبر في تحولات تردد بريلوين خلال سبعة أيام مقارنة بالهيدروجيلين الفارغ، والذي اقترح أن يكون ذلك بسبب إعادة تشكيل الخلوية للهيدروجيل. لم يلاحظ ذلك عند تركيز بوليمر بنسبة 10٪، مما يدل على احتمال نقص في قابلية الخلية الموجودة فيهذه الهيدروجيلات.

ومن الأهمية الأكبر لهذه الدراسة، فقد تم استخدام BM لدراسة الخصائص الميكانيكية للكرويدات 17,18,19,20. على وجه الخصوص، يمكن اكتشاف تأثير البيئة الدقيقة المحلية على ميكانيكا الكرويدات باستخدام BM20. مقارنة بالكرويدات الورمية التي تزرع في هيدروجيلز متوافقة، أظهرت الكرويدات المزروعة في الهيدروجيلز الصلبة نسبة BFS أعلى، مما يدل على زيادة معامل المرونة20. يمكن أيضا وصف التغير المكاني للخصائص الميكانيكية داخل الكروي باستخدام BM. على سبيل المثال، وجد أن BFS للكرويدات الورمية يزداد نحو النواة الكروية20,21. علاوة على ذلك، يرتبط انخفاض متلازمة BFS بزيادة التوغل في كرويدات الأورام20. تم استخدام BM لدراسة التغيرات الميكانيكية في الكريات الورمية استجابة للصدمة الأسموزية22. في الدراسة، تم مراقبة نمو الكرويدات على مدى 5 أيام، ووجد أن الفروق الميكانيكية الأولية بين السرطان والكرويدات الصحية التي لوحظت مع الكتلة الجنائية فقدت مع مرور الوقت. وجدت دراسة أخرى زيادة في BFS للكروي بعد 7 أيام، مما عزى إلى زيادة حجم الكروي وعدد الخلايا16.

علاوة على ذلك، أجريت دراسات متعددة الوسائط باستخدام مجهر بريلوين إلى جانب AFM والريولوجيا لاستكشاف الخصائص الميكانيكية للخلايا والهيدروجيلز 16,23,24. استخدم راد وآخرون علم الريولوجيا لوضع الاتجاهات المقاسة باستخدام BM في سياقها، مما أثار وجود ارتباط إيجابي قوي بين معامل الطول ومعامل القص المخزن بالنسبة لتركيز البوليمر للهيدروجيل16. تم استخدام مجهر بريلوين وميكروريولوجيا الملاقط البصرية لقياس ميكانيكا الخلايا السرطانية المزروعة في الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد23. في هذه الدراسة، تم العثور على انخفاض في التغاير الميكانيكي بين الخلايا في الكرويدات مقارنة بالخلايا المفردة المعلقة في الهيدروجيلات.

في هذا العمل، تم تفصيل بروتوكول للتحقيق في الخصائص الميكانيكية للكرويدات الحية المدمجة في الهيدروجيلز باستخدام مجهر بريلوين التجاري (الشكل 1). وصف بيرغاوس وآخرون بروتوكولا يوضح خطوات بناء مطياف بريلوين عالي الدقة وطريقة معايرته باستخدام المواد المرجعية25. علاوة على ذلك، يصف بروتوكول من شي وآخرين استخدام مجهر بريلوين لمراقبة التغيرات في الخصائص الميكانيكية للأنسجة الجنينية26. نستخدم كريات الخلايا الجذعية المتوسطة (MSCs) في هيدروجيلات بولي (إيثيلين) جليكول (PEG)-ماليميد لمحاكاة موضع نخاع العظم ودراسة الخصائص الميكانيكية لهذا البيئة. هذا النموذج ثلاثي الأبعاد لديه القدرة على كشف التوقيع الميكانيكي لأمراض نخاع العظم، بما في ذلك اللوكيميا، والورم النخاعي المتعدد، وسرطان العظام الثانوي. لذلك، يمكن نقل البروتوكول مباشرة إلى نماذج ثلاثية الأبعاد لأمراض أخرى حيث قد يكون لاضطراب علم الميكانيكية دورا مهما في علم الأمراض. تم تفصيل تقنيات تحضير الكروي والهيدروجيل، والتصوير الفلوري، وتقنيات المجهر بريلوين. تناقش الإجراءات الموصى بها، والعيوب المحتملة، والتحسينات المحتملة للتقنية. يتم عرض الوصف التفصيلي لإعداد التجارب في الشكل S1 وضمن قسم المواد الإضافية والأساليب المتعلقة بإعداد التجريب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. زراعة الخلايا ثنائية الأبعاد

ملاحظة: حيثما أمكن، تأكد من أن جميع أعمال زراعة الخلايا تتم في بيئة معقمة باستخدام غطاء تدفق طبقي قياسي لزراعة الأنسجة لتجنب التلوث. تم استخدام الخلايا المجهزة في البروتوكول الحالي، لكن يمكن استخدام أنواع أخرى من الخلايا لإنشاء كرويات، حسب الأهداف المحددة للدراسة.

  1. زراعة الخلايا العضلية في وسط زرع الخلايا المعدل (DMEM) من دولبيكو، بحجم كاف لتغطية الخلايا، ويحتوي على 4.5 جرام/لتر D-جلوكوز، + L-جلوتامين مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، 100 ميكرومولار بيروفات الصوديوم، 1٪ أحماض أمينية غير ضرورية (NEAA)، 1٪ بنسلين وستربتومايسين. حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. الخلايا الممررة عند التقاء 70-80٪، عن طريق الحضانة مع حمض الإيثيلين ديامين رباعي الأسيتيك (EDTA) بنسبة 0.05٪ (حجم التريبسين المضاف يجب أن يكون ثلث حجم DMEM) لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لفصل الخلايا عن اللوحة. لإيقاف التفاعل، أضف وسط ثقافي يحتوي على FBS (على الأقل بمطابقة حجم التريبسين المضاف). عد الخلايا باستخدام مقياس الدم الخلوي.

2. تحضير الكرويدات

ملاحظة: حيثما أمكن، تأكد من أن جميع أعمال زراعة الخلايا تتم في بيئة معقمة باستخدام غطاء تدفق طبقي قياسي لزراعة الأنسجة لتجنب التلوث. في هذه الدراسة، استخدمت صفائح البئر الدقيقة لإنشاء كرويدات MSC. تتكون هذه الألواح من 24 بئرا، ويحتوي كل بئر على 1200 بئر صغير بقطر 400 ميكرومتر. وهذا يسمح بتحضير عدد كبير من الكرويدات (الشكل 2).

  1. لتحضير لوحة البئر الدقيق، عالج الآبار مسبقا بإضافة 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق إلى كل بئر. لوحة الطرد المركزي على 1300 جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تحت المجهر بتكبير 20x، تحقق مما إذا كانت هناك فقاعات هواء. إذا وجدت، كرر خطوة الطرد المركزي. أزل محلول الشطف المضاد للالتصاق.
  2. لغسل اللوحة، أضف 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واسحب المعدن. قم بذلك مرتين للتأكد من إزالة محلول الشطف بالكامل.
  3. حدد عدد الخلايا لكل كروي وعدد الكرويدات لكل جل. هذا يعتمد على أسئلة البحث الفردية. على سبيل المثال، استخدمنا 100 خلية لكل كروي و100 كروي لكل جل. لذلك، كان مطلوبا لهذا البروتوكول بئر واحد فقط من صفيحة البئر الدقيقة، حيث ينتج 1200 كروي إجمالا. لحساب عدد الخلايا المطلوبة لبئر واحد، قمنا بالحساب التالي: 1200 × 100 = 1.2 × 105. احسب حجم تعليق الخلية الذي يحتوي على 1.2 ×10 5 خلايا. قم بعمل جهاز الطرد المركزي في تعليق الخلية بحرارة 300 جرام لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة المادة الفائقة.
  4. أعد تعليق الخلايا بمقدار 1 مل من DMEM (+4.5 جرام/لتر D-جلوكوز، + إل-جلوتامين) مع 100 ميكرومولار بيروفات الصوديوم، 1٪ NEAA، 1٪ بنسلين وستربتومايسين. أضف 1 مل من تعليق الخلية إلى أحد آبار لوح البئر الدقيق، واستخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل لتوزيع الخلايا بشكل متساو في جميع أنحاء البئر. كن حذرا من إدخال فقاعات هواء. قم بطرد الطرد المركزي على اللوحة على حرارة 100 جرام لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، لا نضيف FBS إلى وسائل الإعلام. وذلك لمنع الخلايا من التصاق بالبلاستيك الذي يزرع الأنسجة.
  5. راقب الصفيحة تحت المجهر لضمان توزيع الخلايا بشكل متساو وأنها غاصت إلى قاع الآبار الدقيقة. حضانة الخلايا عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2. راقب تكوين الكروي بعد 24 ساعة.
    ملاحظة: يمكن ترك الكرويدات في الصفيحة لمدة تصل إلى 48 ساعة، حسب نوع الخلية ومدى انضغاطها المطلوب.
  6. لاستخراج الكرويدات من الطبق، أولا إزالة وسط الزراعة ببطء ورفق، بهدف عدم إزعاج الكرويدات. لمنع التصاق الكرويدات بالبلاستيك، قم بطلاء رؤوس وأنابيب الماصات باستخدام PBS بنسبة 1٪ FBS. لتجنب تعلق الكرويدات في أطراف الماصة، اقطع الطرف لتوسيع الفتحة. يمكن استخدام نصائح الاسترداد القصوى خلال هذه الخطوات كإجراء إضافي لمنع فقدان الكرويات. أضف 500 ميكرولتر من PBS إلى كل بئر من صفيحة البئر الدقيقة واستخدم الماصة صعودا وهبوطا لإزالة الكرويدات. اجمع PBS مع الكرويدات المعلقة في أنبوب (الشكل 2).
  7. شاهد اللوح تحت المجهر بتكبير 20x وكرر هذه الخطوة حتى يتم إزالة معظم الكرويدات بنجاح.
  8. لحساب عدد الكرويدات في نظام التعليق، انقل 50 ميكرولتر من التعليق إلى بئر من صفيحة بسعة 96 بئر. عد عدد الكرويدات في 50 ميكرولتر. للمساعدة في العد، يمكن رسم صليب في قاع البئر باستخدام علامة دائمة. احسب عدد الكرويدات باستخدام المعادلة (1):
    figure-protocol-1

3. تحضير الهيدروجيلز PEG

ملاحظة: حيثما أمكن، تأكد من أن جميع أعمال زراعة الخلايا تتم في بيئة معقمة باستخدام غطاء تدفق طبقي قياسي لزراعة الأنسجة لتجنب التلوث. في هذه الدراسة، تم استخدام هيدروجيلز PEG-ماليميد، لكن يمكن أيضا استخدام أنواع أخرى. تم تشكيل هيدروجيلز PEG-ماليميد باستخدام تفاعل إضافة ثيول-مايكلرقم 27. كانت الروابط المتقاطعة المستخدمة مزيجا من PEG-dithiol والببتيد القابل للتحلل بالبروتياز، محاطا ببقايا سيستين (ببتيد VPM، GCRDVPMSMRGGDRCG). استخدمت الهلام في هذه الدراسة 70٪ من PEG-dithiol و30٪ ببتيد VPM قابل للتحلل.

  1. اصنع محلول مخزوني بحجم 200 ملغ/مل من ببتيد VPM وأضف 2.4 ميكرولتر من الببتيد لكل جل. اصنع محلول مخزوني بحجم 200 ملغ/مل من PEG-dithiol وأضف 5.6 ميكرولتر لكل جل.
  2. أعد تعليق الكرويدات في PBS قبل الخلط مع الروابط المتقاطعة (الشكل 2). اخلط تعليق الكروي مع PEG-ديثيول (5.6 ميكرولتر لكل جل) وVPM (2.4 ميكرولتر لكل جل). يسمى هذا الحل الحل ب.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول، تمت إضافة 100 كروي لكل جل.
  3. اصنع محلول مخزون PEG-Maleimide بسعة 250 ملغ/مل. أضف 50 ميكروغرام من الفيبرونكتين لكل جل. امزج محلول PEG-ماليميد مع محلول الفيبرونكتين؛ يسمى هذا المحلول A. محلول البيبيت A (40.3 ميكرولتر لجل 100 ميكرولتر) على قاع صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا. أضف المحلول B (59.7 ميكرولتر لجل 100 ميكرولتر) بنسبة مولر 1:1 ماليميد:ثيول لضمان الربط المتقاطع الكامل؛ تأكد من حدوث التجلات الفورية. الحجم النهائي للهيدروجيلز هو 100 ميكرولتر.
  4. احتضن الجل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربونللسماح بالتجلل. أضف وسائط الزراعة الكاملة (DMEM مع 10٪ FBS، 100 ميكرومولار بيروفات الصوديوم، 1٪ NEAA، و1٪ بنسلين وستربتومايسين) إلى البئر، مما يضمن أن الجل مغمور بالكامل (الشكل 2). حضن الهلام عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربونحتى يكون جاهزا لإجراء القياسات تحت مجهر بريلوين.
    ملاحظة: مدة زراعة الكروية داخل الهيدروجيلين قبل قياسات بريلوين تعتمد على نوع الخلية وسؤال البحث. على سبيل المثال، في هذه الدراسة، عادة ما يتم زراعة الكرويدات داخل الهيدروجيلز لمدة تصل إلى 7 أيام، وخلال هذه الدراسة تتم مراقبة الكرويدات بواسطة مجهر بريلوين. تم تمييز خصائص الهيدروجيلات اللزجة المرنة مع أو بدون تغليف الكرويدات ولم تظهر تأثيرا كبيرا للكرويدات على ميكانيكا الجل (الشكل S2).

4. التلوين الفلوري وتصوير الكرويدات في الهيدروجيلز

ملاحظة: في هذه الدراسة، تم صبغ وخيوط الأكتين التي تشكل الهيكل الخلوي بشكل فلوري وتصويرها قبل قياسات بريلوين.

  1. لصبغ الأكتين، أضف صبغة الأكتين الحية إلى وسائط الزراعة بمقدار 1 في 500 تخفيف قبل 3 ساعات من التصوير. حافظ على العينة خارج الضوء عن طريق لفها بورق الألمنيوم. حضن الجل عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون2.
  2. لصبغ النوى، أضف قطرتين/مل من صبغة النوى الحية إلى وسط الزراعة المحيط بالجل قبل 40 دقيقة من التصوير. أعد العينات إلى الحاضنة.
  3. احصل على صور فلورية في أقرب وقت ممكن بعد انتهاء فترة الحضانة بالصبغ. تحقق من اختيار المسار البصري المناسب (تعريض كاميرا المجهر) والموقع الصحيح لعجلة الفلتر. خفف الأضواء في الغرفة والتقط الخلفية. شغل مصدر ضوء الصمام الثنائي الصادر للضوء (LED) واختر الطول الموجي حسب بروتوكول التلوين (هنا، استخدم 385 نانومتر للنوى و621 نانومتر لتصوير الأكتين). احصل على صور فلورية للكرويدات بتكبير 20 مرة باستخدام البرامج المفضلة. أطفئ مصدر LED عند الانتهاء.

5. مجهر بريلوين للكرويدات

  1. تشغيل الأجهزة وانبعاث الليزر
    1. شغل الأجهزة: الكمبيوتر، المطياف، كاميرات المجهر، المجهر، مروحة التبريد بالليزر، والانبعاث بالليزر عن طريق تشغيل المفتاح في وحدة التحكم. تأكد من أن ذلك يتم قبل 15 دقيقة من تحسين المطيافية لضمان أن الليزر قد تم تثبيته حرارية. تحقق من أن طاقة الليزر المنبعثة كما هي متوقعة باستخدام مقياس القدرة (100 ميلي واط في تجربتنا).
  2. قم بتشغيل تطبيق التحكم في درجة الحرارة (انظر جدول المواد) وتحقق من أن درجة حرارة الإيتالون محسنة عن طريق قياس قدرة الشعاع بعد الإيتالون. إذا كانت أقل بكثير من المتوقع (بعد احتساب مرشح الكثافة الضوئية (OD) المستخدم)، غير درجة الحرارة المستهدفة بمقدار 1 °م وراقب إذا كان هناك زيادة في القدرة مع مرور الوقت. إذا حدث انخفاض، اعكس اتجاه التغير. بمجرد أن تقترب القدرة من المتوقع، قم بضبط الضبط بزيادات صغيرة (0.1 درجة مئوية) حتى تصل إلى الحد الأقصى.
  3. ضبط نقطة التركيز في العدسة الموضوعية داخل مكعب الأكريليك
    ملاحظة: يتم تحسين تقليل التشتت المرن والاقتران من "قاتل المضخة" إلى مقياس الطيف باستخدام عينة من المادة المرجعية الصلبة والمتجانسة قبل كل تجربة. في هذه الدراسة، تم استخدام مكعب أكريليك.
  4. افتح برنامج SpectraLok وانتظر حتى يتم اكتشاف جميع الأجهزة. على الجانب الأيسر من النافذة الرئيسية (الشكل 3)، اختر كاميرا المطياف.
    1. ثبت مكعب الأكريليك على حامل عينات المجهر بحيث يكون الجانب الشفاف مواجها للعدسة الموضوعية. خفض العدسة الموضوعية قدر الإمكان وحول المكعب تحتها. تأكد من اختيار المسار البصري في المجهر بحيث تكون كاميرا المقياس الطيفي مكشوفة (اضبط محدد المنفذ الدوار على L).
      ملاحظة: في إعدادنا، يتم توصيل منفذ L بجهاز الدوران الكونفوكالي، بينما يتم توصيل منفذ R بمنفذ كاميرا المجهر.
    2. في نافذة كاميرا SpectraLok، اضبط زمن تعريض المستشعر إلى 500 مللي ثانية وكسب البرنامج إلى 100. إعداد كسب البرنامج يعزز التباين لأغراض التصور.
  5. افتح فتحة غالق الليزر.
    ملاحظة: بما أن انبعاث الليزر مفعل، احرص على عدم وضع الرأس/العينين في مسار شعاع الليزر.
    1. اضغط على زر الالتقاط وحرك العدسة الموضوعية للأعلى. سيكون هناك زيادة كبيرة في شدة الإشارة، وسيظهر نمط مشبع (الشكل 4A). يحدث ذلك بسبب انعكاس قوي لضوء الليزر عند واجهة مكعب الهواء والأكريليك. عند رفع العدسة أكثر، ستنخفض شدة الإشارة، وستصبح قمم بريلوين واضحة. استمر في إعادة تموضع العدسة الموضوعية حتى تصبح شدة قمم بريلوين ثابتة (الشكل 4B). وهذا يتوافق مع النقطة البؤرية الموجودة بالكامل داخل مكعب الأكريليك.
  6. تحسين ضغط الإيتالون لتقليل الضوء المتناثر مرنا المتبقي
    ملاحظة: الغرض من الخطوات التالية هو كبح إشارة رايلي المتناثرة مرنيا بحيث يصل ضوء بريلوين المتحول تردديا فقط إلى كاميرا المطياف.
  7. في برنامج SpectraLok، افتح نافذة التحكم في قاتل المضخة (PK) (الشكل 5).
  8. قم بتكبير واحدة من ألمع أوامر بريلوين وضبط موضع مشغل الضغط بزيادات قدرها 100 ميكرومتر عن طريق النقر على زر الحركة لتقليل شدة رايلي القصوى. إذا كانت إشارة رايلي تزداد، اعكس اتجاه التغيير بالضغط على العكس. بعد ذلك، ضبط ضغط الإيتالون بدقة بزيادات قدرها 10 ميكرومتر.
    ملاحظة: في مكعب الأكريليك، يمكن كبت ضوء رايلي تماما؛ قد لا يكون هذا هو الحال في عينة بيولوجية غير متجانسة.
  9. تحسين تراكب الشريط ل "فك" بيانات الطيف
    ملاحظة: يضمن الإجراء التالي تعيين إحداثيات بكسل (x, y) لحساس الكاميرا بشكل مناسب إلى الطول الموجي من خلال تطبيق LUT لجدول البحث.
  10. في نافذة الكاميرا ، قم بالتكبير على أحد طلبات بريلوين.
  11. اضغط s لرؤية الخطوط التي يطبق عليها LUT على صورة الكاميرا (الشكل 6A). افتح نافذة الإعدادات واضغط معايرة سريعة لإعادة حساب الإزاحة الأفقية المثلى للخطوط. إذا كان المستشعر مشبعا، قلل وقت التعريض قبل هذه الخطوة.
    1. في نافذة الكاميرا ، تحقق من أن الخطوط البنفسجية متراكبة جيدا مع المنطقة المركزية لقمم بريلوين (الشكل 6B).
  12. تحسين اقتران مطياف PK
  13. يسمح ضبط محاور عدسة الكوليمياتور بتعظيم كفاءة اقتران الضوء من PK إلى مقياس الطيف.
  14. افتح نافذة الطيف وانقر على فك التغليف لاسترجاع الطيف (الشكل 7).
  15. افتح نافذة التحكم في PK . مع زيادات 0.0005°، قم بتعديل محوري الكوليماتور 1 و2 بشكل تكراري لتعظيم إشارة بريلوين. إذا لزم الأمر، يمكن تحسين التحكم في ضغط الإيتالون بشكل أكبر. في مكعب أكريليك متجانس، يمكن قمع إشارة رايلي بالكامل (الشكل 7A). بينما يمكن إجراء قياسات دقيقة لبريلوين مع بعض إشارة رايلي المتبقية (الشكل 7B)، في حالات ضعف القمع (الشكل 7C)، يحجب الضوء المتناثر مرنا إشارة بريلوين.
  16. تحقق من أن إشارة بريلوين المحققة قابلة للمقارنة مع السعة المرجعية. على سبيل المثال، في نظامنا، عند تعريض 500 مللي ثانية ومع OD 0.3، تبلغ سعة شدة بريلوين القصوى حوالي 3000 عد. لحفظ تغييرات معلمات PK في ملف التكوين، في نافذة PK اضغط على تحديث كل وحفظ الكل. علاوة على ذلك، في النافذة الرئيسية، اضغط الحفظ في قسم الإدخال/الإخراج الملف.
  17. التحول إلى برامج المسح والتحقق من أن المعاملات لا تزال محسنة
  18. أغلق SpectraLok وافتح برنامج المسح. في هذا البروتوكول، تم استخدام برنامج يعتمد على LabVIEW وتم وصفه بمزيد من التفصيل في الشكل S3. لضبط هندسة المسح، تستخدم واجهة المستخدم (UI) الخاصة هذه للتحكم في مرحلة الترجمة السابقة XY-Z؛ ومع ذلك، يمكن استخدام طرق أخرى.
    1. قم بتركيب طبق البتريل ذو القاع الزجاجي مع عينة الهيدروجيل-الكروي بدلا من مكعب الأكريليك (الشكل 8). لمنع جفاف الجل، يتم ضبط الحاضنة عند 37 درجة مئوية ورطوبة نسبية 95٪. أزل غطاء طبق البتري وأضف الوسائط لغمس الجل. أضف غطاء غطاء في أعلى الجل لمنع حركة الجل.
    2. حدد موقع الكروي. مع حجب شعاع الليزر، حول المسار البصري للمجهر إلى العدسة العينية. شغل إضاءة الضوء الأبيض. باستخدام عصا التحكم، تحكم يدويا في مرحلة العينة، حدد موقع الكرة وركز عليها.
    3. احصل على صورة ساطعة للكرويد. اضبط سطوع الإضاءة عن طريق تدوير عجلة التحكم. اضبط المسار البصري على R، مما يعرض كاميرا المجهر. يمكن ضبط زمن التعريض حسب الحاجة للحصول على صورة عالية التباين (أي 50 مللي ثانية).
    4. تحقق من أن مقياس الطيف ومعاملات فك التغليف لا تزال محسنة. اضبط منفذ المجهر على L والتقط الخلفية مع حظر الليزر. قم بفك الليزر عن طريق تدوير العجلة لوضع الإطلاق. استنادا إلى نسبة الإشارة إلى الضوضاء المطلوبة، اختر وقت التعريض. زمن التعريض النموذجي لهذه القياسات هو 200-500 مللي ثانية.
    5. إذا مر بعض الوقت (أي عدة ساعات) منذ المعايرة الأولية أو حدث اضطراب ميكانيكي في النظام، فقد لا يكون إعداد ضغط الإيتالون أو اقتران مطياف PK هو الأمثل. كرر الخطوات 5.3-5.5 لإعادة تحسين ما ذكر أعلاه إذا لزم الأمر.
    6. من الطيف غير المغلف، اختر نطاق ملاءمة بريلوين القصوى. اضبط قيمة العتبة إلى حوالي نصف شدة قمم بريلوين. تجاهل قمم بريلوين ذات السعة التي تقل عن هذه العتبة. صحح طول موجة الليزر وفقا لجميع أزواج ذروات بريلوين المحددة.
  19. تحديد هندسة المسح متعدد الأبعاد
  20. اختر هندسة المسح النقطي عن طريق ضبط عرض منطقة المسح وحجم الخطوة.
    ملاحظة: بالنسبة للكرويدات التي يبلغ حجمها حوالي 70 ميكرومتر، في المسح منخفض الدقة، نستخدم عادة مساحة مسح 150 ميكرومتر × 150 ميكرومتر وحجم خطوة 10 ميكرومتر. هذا ينتج خريطة ثنائية الأبعاد منخفضة الدقة في حوالي 3.4 دقيقة.
    1. ابدأ الفحص.
  21. إيقاف نظام بريلوان
    1. أغلق البرنامج وأغلق الكمبيوتر. أوقف انبعاث الليزر باستخدام المفتاح في وحدة التحكم. اترك عجلة الغالق في الوضع المحجوب . أطفئ تبريد مروحة الليزر. أطفئ المجهر والكاميرات المطيافية الكهربائية. وأخيرا، أطفئ المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تشمل الملفات التي يتم الحصول عليها بعد المسح الأطياف، ومعلمات ملاءمة المسح (.csv)، ومعلمات المسح والتحليل، وخرائط BFS وعرض الخط، وصورة الحقل الساطع مع تحديد منطقة المسح المهتمة، ولقطة شاشة لنافذة واجهة المستخدم. لكل نقطة في مسح بريلوين متعدد الأبعاد يتم الحصول على قيمة BFS. في الشكل 9، يعرض نموذج مسح عالي الدقة إلى جانب صورة الحقل المضيء، وصور فلورية تظهر خيوط الأكتين ونوى. لاحظ أنه في نظامنا، يستخدم الفلورة لتوجيه التصوير وتفسير خرائط بريلوين، وليس للقياس ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

لقد أنشأنا بروتوكولا لاستخدام مجهر بريلوين لتصوير الكرويدات الحيوية المدمجة في الهيدروجيلز بدقة مجهرية. يمكن تمييز الهيدروجيل عن الكروي الحي من خلال الفروق في قيم BFS التي تم الحصول عليها. في النتائج الممثلة، استخدمنا كرويدات MSC وهيدروجيلات PEG-ماليميد؛ ومع ذلك، فإن هذا البروتوكول قابل للتطبيق بشكل واسع على أنواع خلايا أخرى (مثل خطوط الخلايا السرطانية). تم تصوير الخلايا في هذه الدراسة حية وضمن بيئة دقيقة ثلاثية الأبعاد ذات صلة، مما يوضح جدوى هذه المنصة بالتعاون مع نماذج ذات صلة بيولوجية...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يشير المؤلفون إلى أن تي. ألين وجي. واردل هما موظفان في شركة لايت ماشينري، التي تصنع وتبيع مطياف بريلوين المستخدم في هذه الدراسة. قد تستفيد الشركة من نشر هذا العمل. جميع المؤلفين الآخرين يعلنون عدم وجود مصالح متنافسة.

شكر وتقدير

يقر المؤلفون بالتمويل الذي حصل عليه من منحة MechanoMeds المرحلة الثانية، UKRI/EPSRC، رقم المنحة EP/X033554/1 لدعم تطوير هذه الطريقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مدفع PEG-ماليميد بأربع أذرع (20 كيلو دالتون)بيغووركس الإبداعيونPSB-455https://creativepegworks.com/product/4-arm-peg-mal-mw-20k
ألواح أجر ويل 400تقنيات الخلايا الستيمية34411http://stemcell.com/products/aggrewell400.html
إيتالون فضاءلايت ماشينريHF-16074-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-spectroscopy-excitation-laser-optimization/
محلول الشطف المضاد للالتصاقتقنيات الخلايا الستيمية7010https://www.stemcell.com/products/aggrewell-rinsing-solution.html
حاضنة المرحلة العليا الخط العريضأوكولابH301-NIKON-NZ100/200/500-Nhttps://www.oko-lab.com/live-cell-imaging/stage-top-digital-gas/chamber/nikon/h301-nikon-nz100-200-500-n
كوبولت فلامنكو-100 ليزر 660 نانومترهوبنر0660-05-01-0100-700https://hubner-photonics.com/products/lasers/single-frequency-lasers/05-01-series/
الدورانية الكونفوكاللايت ماشينريHF-13311لا يوجد
نظام إضاءة الفلورة D-LEDi  نيكونMBF83000https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/light-sources/d-ledi
وحدة EPI-FLنيكونTi2-LA-FL-3https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/intermediate-modules
الفيبرونكتين (الإنسان)YoProteins663https://www.yoproteins.com/fibronectin-human-5-mg-663.html
جيبكو دولبيكو النسر المتوسط المعدل (DMEM)ثيرموفيشر11965092https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11965092
مطياف بريلوان فائق الدقةلايت ماشينريHF-8999-PK-660https://lightmachinery.com/spectrometers/brillouin-hyperfine-spectrometer/
مكعب مرشح رباعي النطاق LED-DA/FI/TR/CY5-BنيكونMXR00753https://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/accessories/fluorescent-filter-cubes
الخلايا الجذعية الميزنشيمية (MSCs)بروموسيلC-12974https://promocell.com/us_en/human-mesenchymal-stem-cells-hmsc.html
مرحلة الترجمة الآلية  السابقة العلميةH117E2NNhttps://www.prior.com/imaging-components/motorized-stages?filter=MicroscopeBrand-33
NucBlue & trade; Live Ready Probes&Trade؛ كاشف (هوشت 33342)ثيرموفيشرR37605https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R37605
الهدف، S Plan فلور 20X NA 0.45، الهواءنيكونMRH08230https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/selector/comparison/-1708
كاميرا ORCA-Fusion CMOSهاماماتسوC14440-20UPhttps://www.hamamatsu.com/eu/en/product/cameras/cmos-cameras/C14440-20UP.html
PEG-dithiol، 2 كيلو دالتونبيغووركس الإبداعيونPLS-613https://creativepegworks.com/product/hs-peg-sh-mw-2k-10g
كاميرا sCMOS  حلول تيليداين فيجن01-IRIS-15-USB-M-16-Chttps://www.teledynevisionsolutions.com/en-gb/products/iris/?model=01-IRIS-15-USB-M-16-C&vertical=tvs-photometrics&segment=tvs ؛
SPY555-actin سبيروكرومCY-SC202https://spirochrome.com/product/spy555-actin/
تطبيق الحرارةبرنامج التحكم في درجة الحرارة
ببتيد VPM، GCRDVPMSMRGGDRCGGenScriptلا يوجدلا يوجد
مجهر إكليبس Ti-2Aنيكونإكليبس Ti-2Ahttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/en_EU/products/inverted-microscopes/eclipse-ti2-series ؛

المراجع

  1. Caleb, J., Yong, T. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Front Mol Biosci. 7, 33(2020).
  2. Walker, M., Gourdon, D., Cantini, M. Beyond static models: mechanically dynamic matrices reveal new insights into cancer and fibrosis progression. Curr Opin Biomed Eng. 33, 100570(2025).
  3. Walker, M., Morton, J. P. Hydrogel models of pancreatic adenocarcinoma to study cell mechanosensing. Biophys Rev. 16 (6), 851-870 (2024).
  4. Ryu, S., Martino, N., Kwok, S. J. J., Bernstein, L., Yun, S. H. Label-free histological imaging of tissues using Brillouin light scattering contrast. Biomed Opt Express. 12 (3), 1437-1448 (2021).
  5. Zhang, J., Scarcelli, G. Mapping mechanical properties of biological materials via an add-on Brillouin module to confocal microscopes. Nat Protoc. 16 (2), 1251-1275 (2021).
  6. Kabakova, I., et al. Brillouin microscopy. Nat Rev Methods Primers. 4, 8(2024).
  7. Prevedel, R., Diz-Muñoz, A., Ruocco, G., Antonacci, G. Brillouin microscopy: an emerging tool for mechanobiology. Nat Methods. 16 (10), 969-977 (2019).
  8. Czajkowsky, D. M., Iwamoto, H., Shao, Z. Atomic force microscopy in structural biology: from the subcellular to the submolecular. J Electron Microsc. 49 (3), 395-406 (2000).
  9. Glaser, K. J., Manduca, A., Ehman, R. L. Review of MR elastography applications and recent developments. J Magn Reson Imaging. 36 (4), 757-774 (2012).
  10. Jordan, J., et al. Rapid stiffness mapping in soft biologic tissues with micrometer resolution using optical multifrequency time-harmonic elastography. Adv Sci. 12 (8), e2410473(2025).
  11. Mattarelli, M., Vassalli, M., Caponi, S. Relevant length scales in Brillouin imaging of biomaterials: the interplay between phonons propagation and light focalization. ACS Photonics. 7 (9), 2319-2328 (2020).
  12. Caponi, S., Fioretto, D., Mattarelli, M. On the actual spatial resolution of Brillouin imaging. Opt Lett. 45 (5), 1063-1066 (2020).
  13. Wu, P. H., et al. A comparison of methods to assess cell mechanical properties. Nat Methods. 15 (7), 491-498 (2018).
  14. Rodríguez-López, R., et al. Network viscoelasticity from Brillouin spectroscopy. Biomacromolecules. 25 (2), 955-963 (2024).
  15. Troyanova-Wood, M., Meng, Z., Yakovlev, V. V. Differentiating melanoma and healthy tissues based on elasticity-specific Brillouin microspectroscopy. Biomed Opt Express. 10 (4), 1774-1781 (2019).
  16. Rad, M. A., et al. Micromechanical characterisation of 3D bioprinted neural cell models using Brillouin microspectroscopy. Bioprinting. 25, e00179(2022).
  17. Conrad, C., Gray, K. M., Stroka, K. M., Rizvi, I., Scarcelli, G. Mechanical characterization of 3D ovarian cancer nodules using Brillouin confocal microscopy. Cell Mol Bioeng. 12 (3), 215-226 (2019).
  18. Yan, G., Monnier, S., Mouelhi, M., Dehoux, T. Probing molecular crowding in compressed tissues with Brillouin light scattering. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (4), e2113614119(2022).
  19. Hilai, K., et al. Mechanical evolution of metastatic cancer cells in 3D microenvironment. Small. 21, 2403242(2025).
  20. Mahajan, V., et al. Mapping tumor spheroid mechanics in dependence of 3D microenvironment stiffness and degradability by Brillouin microscopy. Cancers. 13 (21), 5549(2021).
  21. Margueritat, J., et al. High-frequency mechanical properties of tumors measured by Brillouin light scattering. Phys Rev Lett. 122 (1), 018101(2019).
  22. Zhang, J., Nikolic, M., Tanner, K., Scarcelli, G. Rapid biomechanical imaging at low irradiation level via dual line-scanning Brillouin microscopy. Nat Methods. 20 (5), 677-681 (2023).
  23. Nikolić, M., Scarcelli, G., Tanner, K. Multimodal microscale mechanical mapping of cancer cells in complex microenvironments. Biophys J. 121 (19), 3586-3599 (2022).
  24. Scarcelli, G., et al. Noncontact three-dimensional mapping of intracellular hydromechanical properties by Brillouin microscopy. Nat Methods. 12 (12), 1132-1134 (2015).
  25. Berghaus, K. V., Yun, S. H., Scarcelli, G. High speed sub-GHz spectrometer for Brillouin scattering analysis. J Vis Exp. (106), e53468(2015).
  26. Shi, C., et al. Monitoring the mechanical evolution of tissue during neural tube closure of chick embryo. J Vis Exp. (201), e66117(2023).
  27. Trujillo, S., et al. Engineered 3D hydrogels with full-length fibronectin that sequester and present growth factors. Biomaterials. 252, 120104(2020).
  28. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  29. Chiu, C. L., Clack, N. Napari: a Python multi-dimensional image viewer platform for the research community. Microsc Microanal. 28 (S1), 1576-1577 (2022).
  30. Passeri, A. A., et al. Brillouin spectroscopy for accurate assessment of morphological and mechanical characteristics in micro-structured samples. J Phys Photonics. 6 (3), 035016(2024).
  31. Scarcelli, G., Yun, S. H. In vivo Brillouin optical microscopy of the human eye. Opt Express. 20 (8), 9197(2012).
  32. Pollard, T. D., Cooper, J. A. Actin, a central player in cell shape and movement. Science. 326, 1208-1212 (2009).
  33. Antonacci, G., Braakman, S. Biomechanics of subcellular structures by non-invasive Brillouin microscopy. Sci Rep. 6 (1), 37217(2016).
  34. Coker, Z. N., et al. Brillouin microscopy monitors rapid responses in subcellular compartments. PhotoniX. 5 (1), 9(2024).
  35. Yang, F., et al. Pulsed stimulated Brillouin microscopy enables high-sensitivity mechanical imaging of live and fragile biological specimens. Nat Methods. 20 (12), 1971-1979 (2023).
  36. Antonacci, G., et al. Recent progress and current opinions in Brillouin microscopy for life science applications. Biophys Rev. 12 (3), 615-624 (2020).
  37. Savitzky, A., Golay, M. Smoothing and differentiation of data by simplified least squares procedures. Anal Chem. 36, 1627-1639 (1964).
  38. Yan, G., et al. Evaluation of commercial virtually imaged phase array and Fabry-Pérot based Brillouin spectrometers for applications to biology. Biomed Opt Express. 11 (12), 6933-6944 (2020).
  39. Elsayad, K. Spectral phasor analysis for Brillouin microspectroscopy. Front Phys. 7 (62), 1-8 (2019).
  40. Mahmodi, H., et al. Principal component analysis in application to Brillouin microscopy data. J Phys Photonics. 6 (2), 025009(2024).
  41. Antonacci, G., Foreman, M. R., Paterson, C., Török, P. Spectral broadening in Brillouin imaging. Appl Phys Lett. 103 (22), 221105(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الرسم الميكانيكي للكرويدات باستخدام مطيافية بريلوين
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.