يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تحضير مزرعة المتفطرة السلية لفهم التسبب في السل

1.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/67540

⸱

مارس 28, 2025

 , 
1CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology (CSIR-CCMB), 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), 3National Institute of Immunology

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نوضح تحضير مرشح ثقافة Mtb (CF) ، وهو وسط نمو البكتيريا الذي يتكون من البروتينات التي تفرزها البكتيريا. يفرز Mtb البروتينات لتعديل إشارات المضيف والاستجابة المناعية ، والتي تعتبر ضرورية للتسبب في المرض. يتم تحليل التليف المكثف المحضر عن طريق قياس الطيف الكتلي لتحديد جميع العوامل الإفرازية.

الملخص

تفرز المتفطرة السلية (Mtb) العديد من البروتينات في المضيف لتعديل العمليات الخلوية المختلفة ، مثل إشارات المضيف ، والاستجابة المناعية ، وموت الخلايا المبرمج ، وما إلى ذلك ، لتعزيز البقاء على قيد الحياة. في حين تم توضيح وظيفة بعض العوامل الإفرازية ، لم يتم وصف العديد منها بعد. ومن ثم ، فإن التحقيق في البروتين الإفرازي Mtb هو مجال أساسي للبحث. يفرز Mtb البروتينات في الفضاء خارج الهيولى بمساعدة ثلاثة أنظمة إفراز مختلفة: نظام إفراز عام ، ومزدوج الأرجينين ، ونظام إفراز متخصص من النوع السابع. يتعين على المرء تحضير السكرتيوم لتحديد الجزيئات الإفرازية الجديدة وتوصيف العوامل المعروفة وظيفيا. هنا ، نوضح طريقة تحضير الإفرازات وتحضير العينة لقياس الطيف الكتلي. يتطلب تحضير الإفرازات أقصى درجات العناية لتجنب تلوث البروتينات العصارية الخلوية ، والتي يمكن مراقبتها عن طريق التحقيق بالأجسام المضادة ضد البروتينات الغشائية والإفرازية والعزلية الخلوية المميزة جيدا. يمكن استخدام مرشح الثقافة المحضر بهذه الطريقة لأغراض مختلفة ، والتي تشمل التحقيق في خصائص التعديل المناعي للمضيف.

المقدمة

تصيب المتفطرة السلية (Mtb) ، وهي واحدة من أكثر مسببات الأمراض فتكا في جميع أنحاء العالم ، الأفراد الأصحاء من خلال الهباء الجوي الذي ينتقل من شخص مصاب أثناء العطس أو السعال1. بمجرد دخوله إلى الرئتين ، تغمره البلاعم السنخية ، مما يؤدي إلى اختطاف الجهاز المناعي المضيف للبقاء على قيد الحياة. من بين آليات تعديل المضيف المختلفة التي يمتلكها Mtb للبقاء على قيد الحياة ، تعد عوامل الفوعة الإفرازية واحدة منها. تسمى البروتينات التي تفرزها العصيات في وسط الثقافة أثناء نموها بروتينات الترشيح الثقافي (CF)2. تساعد بروتينات ترشيح المزرعة هذه البكتيريا على البقاء في ظروف قاسية داخل الخلايا المضيفة. تم تجهيز Mtb بثلاثة أنواع مختلفة من أنظمة الإفراز: نظام إفراز متخصص من النوع السابع (T7SS) ، ونظام إفراز Sec العام (نظام Sec) ، ونظام إفراز مزدوج الأرجينين (نظام Tas). T7SS هو نظام الإفراز الأكثر تميزا في البكتيريا الشعاعية ، على عكس النوع I-VI في البكتيريا سالبةالجرام 3. يشارك إفراز البروتين غير المطوي عبر الغشاء بشكل رئيسي في نظام Sec ، ويتم التعرف على البروتينات من خلال تسلسل إشارة N-terminal4،5. يتم نقل البروتينات المطوية أو المطوية جزئيا من خلال نظام Tat ، والذي يتم تحديده بواسطة تسلسل إشارة N-terminal مع شكل مزدوج الأرجينين6،7. لم يتم بعد تحديد كيفية تنظيم نظام Sec و Tat لإفراز البروتين.

بعض بروتينات ترشيح المزرعة المعروفة في Mtb والتي تساعد على تحمل الهجوم التأكسدي للمضيف عند الإصابة والبقاء على قيد الحياة هي إنزيمات مثل KatG و SodA8،9 ، ضرورية لتحطيم أنواع الأكسجين التفاعلية. بالإضافة إلى ذلك ، يلعب CFP10-ESAT6 ، وهو مركب بروتين غير متجانس ، دورا حيويا في تنظيم استجابات السيتوكين ، والهروب البكتيري ، وإنتاج ROS ، وما إلى ذلك.10. يشارك موضع RD1 في تعديل نظام إفراز النوع السابع ، والذي يتضمن إفراز CFP10-ESAT6 ، والحذف الجيني ل cpf10-esat6 يضر ببقاء البكتيريا في نماذج العدوى خارج الجسم الحي وفي الجسم الحي . المتفطرة بوفيس تفتقر سلالة لقاح BCG إلى موضع RD1 المسؤول عن إفراز عوامل الفوعة وبالتالي يمكن استخدامه كلقاح حي موهن11. تنظم العمليات الخلوية المختلفة غير المستكشفة عملية الإفراز بإحكام. تحتوي بروتينات ترشيح الثقافة على عوامل معززة للإنعاش (RpFs) تساعد البكتيريا على النمو من الحالة الكامنة. العوامل المعززة للإنعاش (Rpfs) هي إنزيمات التحلل المائي الببتيدوغليكان المعروفة بأنها تلعب دورا في السكون. يقوم Mtb بتشفير خمسة جينات شبيهة ب rpf (rpf A-E) تساعد البكتيريا على النمو من السكون إما بمفردها أو عن طريق التفاعل مع البروتينات الأخرى12. تم العثور على Rpfs في ترشيح الثقافة البكتيرية ومن المعروف أنها متورطة في ضراوة Mtb ومناعة المضيف13،14. تظهر جينات rpf التي تمت دراستها على نطاق واسع rpfE و rpfB مناعة وقائية في المختبر13 وتعزز الاستجابات المناعية في الجسم الحي. وبالتالي ، يمكن استخدام rpfE و rpfB كمرشحين للقاح Mtb .

الفسفرة العكسية15 هي تعديل ما بعد الترجمة يغير العمليات الخلوية المختلفة ، وتوازن الخلايا ، وانقسام الخلايا ، وما إلى ذلك. على سبيل المثال ، تلعب فسفرة CFP10 دورا تنظيميا مهما ، حيث تفشل كل من الطفرات الفوسفورية والمحاكية ل CFP10 في استعادة النمط الظاهري المرصود في سلالة حذف CFP10-ESAT6 16. من ناحية أخرى ، فإن SecA2 هو بروتين إفرازي يشارك في تلف الحمض النووي للخلية المضيفة17. إفراز طفرة SecA2 كافية لتغيير الاستجابة المناعية للمضيف وسلسلة الإشارات18،19. وبالتالي ، من الضروري والمثير التحقيق في إفراز H37Rv وطفرات Mtb ، حيث يتم حذف جينات البروتينات الإفرازية (بيانات غير منشورة) ، لاكتساب نظرة بصرى حول كيفية تأثيرها على التعديل المناعي للمضيف والبقاء على قيد الحياة.

يركز هذا التقرير على ثلاثة جوانب: الخطوات المتبعة في تحضير مرشح ثقافة Mtb ، ومعالجة العينات لقياس الطيف الكتلي ، وإجراء تجارب خارج الجسم الحي مع مرشحات الثقافة لفحص وظائف التعديل المناعي. أظهرت الدراسات السابقة تحديد بروتينات ترشيح الثقافة عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد متبوعا بتحليل طيفي الكتلة8. تم تحديد بروتينات ترشيح الثقافة من السلالات الحساسة للأدوية والمقاومة باستخدام قياس الطيف الكتلي لاكتساب نظرة ثاقبة حول تغيرات الإفرازات وتحديد عوامل الفوعة التي قد تلعب دورا في مقاومة الأدوية20. لقد حققنا سابقا في إفراة Mtb و phosphosecretome بمساعدة قياس الطيف الكتلي16. تقنيات مثل الرحلان الكهربائي للهلام ثنائي الأبعاد منخفضة الإنتاجية ولا تستخدم للتحقيق في التغيرات العالمية في البروتين أو الإفراز. تختلف بروتينات ترشيح الثقافة عن السلالات البكتيرية ومراحل الخلايا النامية وحتى في ظروف الإجهاد المختلفة. اعتمادا على المواقف المختلفة ، فإن التغيير في تجمعات البروتين الإفرازي داخل الخلايا سيوفر استكشاف الإفرازات بأكملها بشكل شامل وتوفير مزيد من المعلومات حول نظام الإفراز البكتيري للتدخلات العلاجية. سيكون من الأكثر جاذبية النظر إلى السكرتوم في الضربات القاضية أو سلالات النضوب للأنظمة الإفرازية لاكتساب مزيد من الأفكار حول مسارات وأهداف كل مسار إفرازي. معالجة الخلايا ببروتينات ترشيح المزرعة بدلا من البكتيريا يغير مستويات السيتوكين والعوامل المناعية الأخرى17. بمساعدة دراسة السكرتيوم ، يمكن للمرء تحديد عوامل الفوعة الجديدة ودورها في الفوعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: هنا ، نستخدم سلالة المختبر المسببة للأمراض H37Rv من Mtb. يجب على المرء تنفيذ الخطوات المطلوبة لزراعة المزرعة البكتيرية وعزل المادة الطافية المزروعة في مختبر السلامة الحيوية المستوى 3 (BSL-3). من إحياء المزرعة إلى تحضير الترشيح ، يتم استخدام منشأة BSL-3.

1. تلقيح ثقافة Mtb

  1. إعداد منطقة العمل في BSL-3
    1. قم بتشغيل ضوء الأشعة فوق البنفسجية لخزانة السلامة الحيوية لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام. نظف خزانة السلامة الحيوية بنسبة 75٪ من الإيثانول قبل الاستخدام وبعده. تخلص من المواد المستخدمة في صناديق النفايات المناسبة باتباع إرشادات السلامة البيولوجية.
  2. تحضير مزارع Mtb H37Rv الأولية والثانوية
    1. خذ مخزون الجلسرين من -80 درجة مئوية وقم بإذابة المرق في درجة حرارة الغرفة. استخدم أربعة مخزونات مستقلة للتوائم الرباعية البيولوجية.
    2. خذ 10 مل من وسط 7H9 (الجدول 1) يحتوي على 10٪ ADC (9 مل من 7H9 متوسط و 1 مل من ADC) في قارورة مخروطية معقمة سعة 100 مل مع غطاء لولبي.
      ملاحظة: 7H9 + ADC: 7H9 هي وسائط غنية بالمغذيات تم الحصول عليها تجاريا ، ونضيف إليها ADC (ADC: الألبومين ، سكر العنب ، والكاتالاز. الجدول 2). يمكن استخدام كل من ADC و OADC لتنمية الثقافة. توفر القوارير المخروطية مزيدا من التهوية للثقافة. ومع ذلك ، يمكن للمرء أيضا استخدام قارورة زراعة الأنسجة لزراعة الخلايا البكتيرية.
    3. تلقيح مخزون الجلسرين بالكامل لوسائل الإعلام لإحياء الثقافة التي تصبح الثقافة الأساسية. خذ ثقافة Mtb متنامية 600 ~ 0.8 لصنع مخزون الجلسرين. امزج 15٪ جلسرين وثقافة Mtb المتنامية في كريوفيال واحفظها عند -80 درجة مئوية.
    4. احتضان قوارير الاستزراع عند 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة لمدة 3-4 أيام عند 100 دورة في الدقيقة.
    5. فياليوم الخامس ، قم بقياس الامتصاص عند 600 نانومتر (A600). عندما تصل الثقافات إلى A600 ~ 0.8-1 ، استخدم المزرعة لتلقيح الثقافة الثانوية عند A600 ~ 0.2 في 100 مل من وسائط 7H9 + 10٪ ADC في قارورة 500 مل. قم بتنفيذ نفس الخطوات للنسخ المتماثلة.
      1. قم بقياس A600 للثقافة الأولية. إذا كان A600 هو ~ 0.8 ، فقم بتكسير المزرعة عن طريق الطرد المركزي عند 2100 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسائط ADC 7H9 + 10٪ ، وقم بقياس A600. احسب مقدار اللقاح الذي سيتم إضافته إلى 100 مل من الثقافة الثانوية لA 600 ~ 0.2. على سبيل المثال ، إذا تم استخدام A600 ~ 4 ، فيجب إضافة 5 مل من تلك الثقافة إلى 100 مل من الثقافة الثانوية الطازجة 7H9 + 10٪ ADC من A600 ~ 0.2.
    6. قم بزراعتها عند 37 درجة مئوية في شاكر حاضنة عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 2-3 أيام حتى ODA 600 ~ 0.8.
    7. اسحب 10 ميكرولتر باستخدام رجل ماصة مزود بطرف مرشح واكتشف المزرعة على صفيحة LB Agar التي لا تحتوي على مضادات حيوية في الغطاء البكتيري. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 12-16 ساعة لتصور التلوث البكتيري (إن وجد). تخلص من الثقافات وقم بإحياء الثقافات الجديدة للتجربة إذا تم اكتشاف أي تلوث بكتيري.
  3. نمو البكتيريا في وسائط Sauton
    1. في A600 ~ 0.8 ، قم بتلقيح البكتيريا في A600 ~ 0.2 في 100 مل من وسائط Sauton في قارورة 500 مل (الجدول 3) وتنمو لمدة 3-4 أيام بعد وصول OD إلى ~ 0.8.
    2. استخدم الثقافات المزروعة حتىA 600 ~ 0.8 في وسائط Sauton (ثقافة Sauton الأساسية) لتلقيح الثقافات لاستخدامها في تحضير ترشيح الثقافة.
      ملاحظة: 7H9 + ADC عبارة عن وسائط غنية بالمغذيات تحتوي على الألبومين. لا يمكن استخدام الألبومين في تحليل الإفرازات لأن الألبومين يمكن أن يخفي بروتينات ترشيح المزرعة. ومن ثم ، يتم استخدام وسائط Sauton لتحضير ترشيح الثقافة. يتم إعداد وسائط ساوتون من خلال إعادة تشكيل المكونات المذكورة في الجدول 3.

2. تحضير بروتينات ترشيح ثقافة Mtb

  1. الطرد المركزي للطافية الثقافية
    1. استخدم ثقافة Sauton الأولية لتلقيح 300 مل من ثقافة Sauton الثانوية عندA 600 ~ 0.2. تنمو الثقافات حتى ODA 600 هو ~ 0.4-0.5. استخدم مزارع مرحلة السجل المبكرة التي تنمو بنشاط لتجنب التلوث من الخلايا الميتة.
      1. قياس OD للثقافة الثانوية. إذا وصل OD إلى A600 ~ 0.8 ، فقم بتكبيب المزرعة عن طريق الطرد المركزي عند 2,100 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في 10 مل من وسائط Saoton ، واستأعد OD. احسب مقدار اللقاح الذي سيتم إضافته إلى مزرعة 300 مل من 0.2 OD من OD المقاسة. على سبيل المثال ، إذا كان OD 8 ، فيجب إضافة 7.5 مل من تلك الثقافة إلى 300 مل من وسائط Sauton الطازجة البالغة 0.2 OD.
        ملاحظة: التزم ب OD المذكور لتقليل تحلل الخلايا وتلوث GroEL. GroEL هو مرافق ويتم التعبير عنه بشكل أساسي في الخلايا البكتيرية. أظهرت بعض الأدبيات وجود GroEL في مرشحات الثقافة بسبب الإجهاد أثناء النمو. هنا ، نستخدم وسائط Sauton لإعداد الترشيح المزروع ، والذي يوفر ضغطا خفيفا للخلايا. وبالتالي ، قد يتواجد GroEL في ترشيح المزرعة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت OD للثقافة أكثر من 1 ، فسيحدث تحلل الخلية ، مما يؤدي إلى تلوث GroEL في مرشح المزرعة.
    2. بيليه أسفل 300 مل من المزارع النامية في 6 ، 50 مل أنابيب عند 2,100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية (الشكل 1 أ).
    3. اسحب 45 مل من المادة الطافية، مع ترك الحبيبات كما هي، باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل إلى أنبوب جديد في كل حالة. احتفظ بالحبيبات جانبا لتحضير محللة الخلية الكاملة (WCL).
    4. كرر الطرد المركزي عند 2,100 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اسحب 40 مل من المادة الطافية (ترك 5 مل من المزرعة دون أن تمس) باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل إلى أنبوب جديد وكرر خطوة الطرد المركزي.
    5. اسحب 35 مل من المادة الطافية في أنبوب جديد وقم بتصفية المادة الطافية المزروعة باستخدام مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر. قم بالتصفية في أنبوب جديد للقضاء على التلوث البكتيري المسببة للأمراض. من 300 مل من المزرعة ، يتم استرداد 210 مل من مرشح المزرعة لكل تكرار.
      ملاحظة: المرشح الذي تم استخدامه هنا لتصفية الترشيح المزروعة هو مرشح حقنة معقم بحجم 0.22 ميكرومتر (النوع SY25PL-S).
    6. بعد ترشيح مرشح المزرعة ، قم بتلقيح 1 مل من مرشح الثقافة المفلترة على صفيحة أجار واحتضانه في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 4 أسابيع لضمان وجود تلوث بكتيري مسبب للأمراض في مرشح المزرعة. خذ 1 مل من محللة الخلية الكاملة (WCL) واتبع نفس تدابير السلامة.
    7. امسح أنابيب العينة بنسبة 75٪ من الإيثانول وأخرجها من BSL-3 من خلال صندوق تمرير.
  2. تحضير محللة الخلية الكاملة (WCL)
    1. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من 1x PBSG التي تحتوي على فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) ، وكوكتيل مثبط البروتياز 1x ، ونقل المحللة إلى 2 مل من أنابيب خفق حبة الغطاء اللولبي تحتويعلى 1/ 3 حجم من حبات الزركونيا 0.1 مم.
      ملاحظة: يتكون 1x PBSG من 1x PBS + 5٪ جلسرين. خذ نسبة وزن الحبيبات إلى المخزن المؤقت 1: 3.
    2. قم بتقطيع العينات عن طريق ضربها بالخرزة في مضرب حبة صغيرة: 1 دقيقة من خفق الخرزة متبوعا بدقيقتين من الحضانة على الجليد. كرر هذا 8x.
    3. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 18,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل واحتفظ به على الجليد.
    4. كرر خطوة الطرد المركزي. مرر المادة الطافية من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر للقضاء على التلوث البكتيري المسببة للأمراض.
      ملاحظة: المرشح المستخدم هنا لتصفية الترشيح المزروعة هو مرشح حقنة معقم بحجم 0.22 مم (النوع SY25PL-S).
    5. امسح العينات التي تحتوي على 75٪ من الإيثانول وأخرجها من BSL-3 من خلال صندوق تمرير. تحقق من تركيزات المحللات باستخدام مجموعة فحص BCA ، كما هو مذكور أدناه. قم بتخزين المحللات عند -80 درجة مئوية.
  3. تركيز بروتينات ترشيح الثقافة باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي.
    1. تركيز 210 مل من بروتينات ترشيح ثقافة Mtb بمساعدة وحدات مرشح الطرد المركزي. استخدم أنابيب وحدة مرشح الطرد المركزي 3 كيلو دالتون 15 مل (المركزيات) لتركيز ترشيح الثقافة في ~ 1 مل (الشكل 1 أ). تحتفظ أنابيب وحدة مرشح الطرد المركزي 3 كيلو دالتون ببروتينات من نفس الحجم أو أكبر من 3 كيلو دالتون.
    2. أضف حوالي 15 مل من كل تكرار من مرشح الاستزراع في أنبوب مركزي واحد وجهاز طرد مركزي عند 2,100 × جم لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
    3. تخلص من التدفق وفقا للمعايير ، وكرر الخطوة 2.3.2 لمدة 15x-16x حتى 210 مل من تركيز ترشيح المزرعة إلى ~ 1 مل.
    4. Aliquot 100 ميكرولتر من المزرعة المركزة تقوم بترشيح البروتينات إلى عشرة أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة البروتين وتقدير تركيز البروتين باستخدام مجموعة BCA.
  4. تقدير البروتينات المركزة
    1. تقدير تركيز البروتين فيما يتعلق ب BSA كمعيار. استخدم 1 ميكروغرام و 2 ميكروغرام و 3 ميكروغرام و 4 ميكروغرام من BSA في حجم 25 ميكرولتر في التكرارات. إذا كانت العينة غير مخففة ، فاستخدم عينة مخففة 5x (في PBS) بحجم 25 ميكرولتر في نسخ مكررة للتقدير. يتم إجراء التقديرات في 96 لوحة بئر. أستخدم عنصر تحكم بدون عينة (فارغ) يحتوي على 25 ميكرولتر من PBS.
    2. أضف 175 ميكرولتر من الكاشف المختلط حسب تعليمات الشركة المصنعة. امزج العينات بمساعدة ماصة متعددة القنوات واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. قم بقياس القراءات عند 562 نانومتر باستخدام قارئ ELISA. خصم القيم من القيم الفارغة للحصول على قيم BSA والعينات.
    3. قم بتركيب المنحنى القياسي لمنحنى الانحدار الخطي وتقدير العينات فيما يتعلق بالمعيار. اتبع مجموعة BCA للحصول على دليل تقدير البروتين.

3. تأكيد بروتينات ترشيح الثقافة باستخدام علامات مختلفة

  1. الكشف عن البروتينات عن طريق تلطيخ كوماسي
    1. لتأكيد وجود البروتينات في ترشيح المزرعة ، خذ 30 ميكروغرام من البروتين وقم بحل الرحلان الكهربائي لهلام دوديسيل الصوديوم بنسبة 10٪ (SDS-PAGE; الجدول 4).
      ملاحظة: اتبع وصف الجدول لعمل مخازن SDS-PAGE و Coomassie تلطيخ ومزيلات الصبغ.
    2. أضف 20 مل من محلول تلطيخ Coomassie (الجدول 5) إلى الجل واحتضنه لمدة 30 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. تجاهل محلول تلطيخ.
    3. أضف 30 مل من محلول إزالة البقع (الجدول 6) إلى الجل واحتضنه لمدة 30 دقيقة على الروك في درجة حرارة الغرفة. تخلص من محلول إزالة البقع وأضف محلول إزالة البقع الجديد. كرر حتى يتلطخ الجل بشكل صحيح.
    4. تحقق من خط البروتين على المصباح العابر (الشكل 1 ب). نظرا لأن بروتين ترشيح الثقافة يحتوي على العديد من البروتينات ، يمكن رؤية سلسلة من نطاقات البروتين في الجل بعد إزالته (الشكل 1 ب).
  2. تأكيد اللطخة الغربية لعلامة البروتين المفرزة
    1. استخدم الجسم المضاد للبروتين المفرز للتحقق من وجود البروتين المفرز في مرشح المزرعة. Ag85B (ab43019) هو بروتين معروف يفرز Mtb في ترشيح الثقافة وهو موجود في العصارة الخلوية. يستخدم الجسم المضاد Ag85B (تركيز 5 مجم / مل) (تخفيف 1: 5000 في 5٪ BSA) كعنصر تحكم إيجابي للبروتين المفرز.
    2. قم بتحميل WCL ببروتينات ترشيح الثقافة للتمييز بين كسور البروتين الخلوي / الغشاء والبروتين المفرز. Ag85B هو العصارة الخلوية ويفرز ، لذلك يجب أن يكون هذا موجودا في كلا الكسرين. من ناحية أخرى ، من المعروف أن PknB موضعي في الغشاء وغير موجود في مرشح الثقافة.
    3. حدد تركيز البروتينات في ترشيح WCL / الثقافة بمساعدة مجموعة BCA. امزج 30 ميكروغرام من مرشح WCL / المزرعة مع 2x-lamelli buffer بحجم 30 مل (الجدول 7). قم بحل العينات في 10٪ SDS-PAGE ل PknB و 12٪ SDS-PAGE ل Ag85B حتى تصل مقدمة الصبغة إلى القاع باستخدام المخزن المؤقت SDS gel runnimg (الجدول 8). لا تدع الصبغة الأمامية تتدفق من الجل.
      ملاحظة: حجم Ag85B هو ~ 35 كيلو دالتون ، لذلك يتم استخدام 12٪ SDS-PAGE.
    4. قطع غشاء النيتروسليلوز 9 سم × 6 سم 0.2 ميكرومتر لنقل البروتين (الجدول 9) من الجل إلى الغشاء. قم بإعداد النقل باستخدام كاسيت نقل ، ونقع الكاسيت ، ووسادات الرغوة ، وورق النشاف ، والهلام ، والغشاء في 1x عازلة لنقل الجليد البارد.
    5. ضع وسادة الرغوة على جانب واحد من الدرج ، ثم ضع ورقة نشاف ، ضع الجل ، ضع غشاء النيتروسليلوز فوق الجل ، ضع ورقة نشاف مرة أخرى ، وأخيرا ، ضع وسادة رغوية أخرى وأغلق حامل الكاسيت. ضع حامل الكاسيت في خزان النقل بحيث يكون جانب الغشاء متجها نحو الأنود ووجه جانب الجل نحو الكاثود.
    6. قم بتوصيل الكاثود وسلك الأنود بالخزان لإغلاق الإعداد وضبطه على تيار 120 مللي أمبير لمدة 120 دقيقة. ابدأ في تشغيل النقل في غرفة باردة.
    7. ضع الغشاء في صندوق بلاستيكي صغير بعد انتهاء النقل. قم بسد الغشاء باستخدام 10 مل من محلول BSA بنسبة 5٪ مصنوع في 1x PBST20 لتقليل الارتباط غير المحدد لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على الروك.
    8. قم بإزالة محلول المنع ، وأضف 5-10 مل من الجسم المضاد الأساسي ، وهو جسم مضاد Ag85B مضاد للفأر (1: 5,000 تخفيف في محلول BSA بنسبة 5٪) ، واحتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل في هزاز. قم بتخزين الجسم المضاد عند -20 درجة مئوية وأعد استخدامه حتى 3 أضعاف.
    9. قم بإزالة الجسم المضاد الأساسي ، وأضف 5-10 مل من 1x PBST20 ، واغسل الغشاء لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة عن طريق الرج القوي. قم بإزالة الغسيل الأول ، وأضف 5-10 مل من 1x PBST20 مرة أخرى ، واغسل. كرر هذا 2x.
    10. أضف 5-10 مل من 1x PBST20 الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي ، وهو جسم مضاد مترافق مضاد للأكسدة والاختزال (HRP) المضاد للفأر (تخفيف 1: 10،000) ، واحتضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على هزاز.
    11. اغسل الغشاء بعد الجسم المضاد الثانوي باتباع الخطوة 3.2.9. أضف كمية متساوية من ركيزة ومحسن HRP لتطوير الغشاء تحت مقياس اللومينومتر الكيميائي (الشكل 1 ج).
      ملاحظة: لتأكيد عدم وجود تلوث بالبروتين العصاري الخلوي ، قمنا بفحص اللطخة الغربية بجسم مضاد مضاد ل PknB (الشكل 1 ج). تم رفع الجسم المضاد في المعهد الوطني لعلم المناعة ، وهو منشأة حيوانية ، ضد المجال خارج الهيولى المنقى ل PknB. يمكن للمرء أن يلاحظ نطاق PknB في WCL ، وليس في مرشحات الثقافة ، و PknB هو العصارة الخلوية فقط ومرتبط بالغشاء ويجب ألا يكون موجودا في مرشح المزرعة.

4. تحضير عينات لقياس الطيف الكتلي

  1. قم بإجراء هضم البروتين في المحلول بواسطة Trypsin.
    1. خذ 100 ميكروغرام من بروتين ترشيح المزرعة ، وأضف 6 أضعاف حجم الأسيتون المثلج ، واحتفظ به عند -20 درجة مئوية طوال الليل.
      ملاحظة: استخدم الأواني الزجاجية لإعداد جميع الكواشف لعينة قياس الطيف الكتلي. استخدم أنابيب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة البروتين وأطراف ربط منخفضة البروتين. لا تستخدم المواد البلاستيكية لتجنب تلوث البوليمر في تحليل قياس الطيف الكتلي.
    2. قم بترسيب البروتينات عن طريق الطرد المركزي عند 18,000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. تخلص من المادة الطافية.
    3. اغسل الحبيبات ب 500 ميكرولتر من الأسيتون ، وقم بالحبيبات عند 18,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية. قم بإزالة الأسيتون المتبقي بمساعدة مكثف الفراغ.
    4. أضف 20 ميكرولتر من 8 M اليوريا المذابة في 25 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم (2 م مخزون محضر في ماء من الدرجة MS). دوامة العينات واحتضانها لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. Ad 60 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 25 ملي مولار لتخفيف 8 م من اليوريا إلى 2 م. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. أضف 4 ميكرولتر من TCEP (تركيز نهائي 10 ملي مولار مصنوع من بيكربونات الأمونيوم 25 مليمتر) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مع رج عند 1,800 × جم.
    6. أضف 4 ميكرولتر من IAA (تركيز نهائي 25 ملي مولار مصنوع من بيكربونات الأمونيوم 25 مليمتر) واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة ، مع رج الرج عند 1,800 × جم في الظلام. أضف 110 ميكرولتر من بيكربونات الأمونيوم 25 مليمتر.
    7. أضف التربسين (1:20; التربسين: بروتين بالميكروغرام) إلى المحلول واحتفظ به عند 37 درجة مئوية ، مع الاهتزاز عند 300 دورة في الدقيقة ، للهضم طوال الليل (الشكل 2). أوقف تفاعل الهضم عن طريق إضافة 10٪ TFA (حمض الخليك ثلاثي الفلور). سرعة تفريغ العينات تماما حتى تجف.
  2. تحلية العينة
    1. أضف 100 ميكرولتر من 5٪ ACN + 0.1٪ TFA إلى الببتيدات المهضومة. دوامة لمدة 30 دقيقة عند 1,500 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. جهاز طرد مركزي عند 18,000 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. خذ المادة الطافية (الببتيد) دون لمس الحبيبات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الطازجة واستمر في تحلية المياه. اصنع جميع محاليل الغسيل والشطف قبل خطوة التحلية الكهربائية.
    3. قم بموازنة طرف العمود C-18 مع 100 ميكرولتر من 100٪ ACN + 0.1٪ TFA عن طريق سحب المحلول وتكرار العملية 5x.
    4. أضف 100 ميكرولتر من 50٪ ACN + 0.1٪ TFA وكرر العملية 5x. أضف 100 ميكرولتر من 5٪ ACN + 0.1٪ TFA وكرر العملية 5x.
    5. اسمح بحدوث ارتباط الببتيد في طرف العمود C-18 عن طريق سحب العينات 30x. احتفظ بالمحلول عند -20 درجة مئوية حتى تتم معالجة العينة لقياس الطيف الكتلي. الآن ، يرتبط الببتيد بعمود C-18.
    6. اغسل العمود C-18 ب 100 ميكرولتر من ماء درجة MS + 0.1٪ TFA عن طريق سحب العينات وكرر العملية 5x.
    7. اغسل العمود C-18 ب 100 ميكرولتر من 5٪ ACN + 0.1٪ TFA عن طريق سحب العينات وكرر العملية 5x. قم بإزالة الببتيدات من العمود C-18 في 100 ميكرولتر من 50٪ ACN + 0.1٪ TFA عن طريق سحب العينات 30x (الشكل 2).
      ملاحظة: بعد الشطف ، يمكن تخزين طرف العمود C-18 عند 4 درجات مئوية حتى يتم قياس الطيف الكتلي.
    8. قم بتفريغ الببتيد المغطى بالكامل وتخزينه عند -20 درجة مئوية حتى يتم إعطاء العينة لقياس الطيف الكتلي.
  3. حقن عينات الببتيد في قياس الطيف الكتلي.
    1. أضف 20 ميكرولتر من المحلول A (المقدم من مرفق قياس الطيف الكتلي) إلى عينات الببتيد المجففة. دوامة العينات لمدة 30 دقيقة وأجهزة الطرد المركزي لمدة 90 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
    2. حقن 20 ميكرولتر من العينة في آلة قياس الطيف الكتلي لتشغيل التدرج لمدة 90 دقيقة.

5. تحليل البيانات للبروتينات المفرزة الموجودة في ترشيح الثقافة

  1. تحديد البروتين
    1. تحليل عينات البروتينات باستخدام مطياف الكتلة رباعي الأقطاب. الاستعلام عن الأطياف التي تم الحصول عليها مقابل قاعدة بيانات Mtb H37Rv UniprotKB.
    2. اضبط تفاوتات كتلة السلائف والشظايا عند 10 جزء في المليون و 0.5 Da. اضبط الإنزيم على Trypsin مع قيمة انقسام قصوى مفقودة تبلغ اثنين.
    3. استخدم برنامج البروتيوم مع Sequest كخوارزمية بحث مع كارباميدوميثيل السيستين كتعديل ثابت.
    4. تحديد جميع تطابقات طيف الببتيد (PSM) بمعدل اكتشاف خاطئ 1٪. تطبيق الإعدادات الافتراضية لجميع المعلمات الأخرى.
    5. قم بتعيين ملفات قياس الطيف الكتلي الخام لتسلسل الببتيد باستخدام معرف UniProt لبروتينات Mtb المعنية. ضع قائمة بجميع بروتينات Mtb ومعرفات Uniprot الخاصة بها والتصنيف الوظيفي باستخدام قاعدة بيانات Mycobrowser.
    6. لمزيد من التحليل ، قم بتعيين معرفات UniProt للبروتينات المحددة إلى رقم RV الخاص بها. قم بإيداع بيانات إفراد قياس الطيف الكتلي في اتحاد ProteomeXchange من خلال شريك PRIDE

6. معالجة H37Rv ببروتين ترشيح الثقافة للتحقق من التغيير في إشارات المضيف

  1. عزل البلاعم البريتونية من الفئران.
    ملاحظة: اتبع المرجع21 لعزل البلاعم البريتونية ، وبذر الخلايا ، والعدوى.
    1. حقن الفئران Balb / c (4-6 أسابيع العمر) مع 1 مل من 4 ٪ ثيوغليكولات وعزل البلاعم البريتونية من الصفاق الفأرفي اليوم الرابع من الإصابة21 (الشكل 3).
    2. اجمع خلايا البلاعم عن طريق حقن 1x PBS في الصفاق الماوس. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 1,800 × جم لمدة 5 دقائق ، وتخلص من المادة الطافية ، وأضف 5 مل من وسائط 1640-RPMI مكملة بنسبة 10٪ FBS (مصل الأبقار الجنينية ؛ وسائط كاملة) و 1x القلم العقدي (المضادات الحيوية).
    3. قم بالبذور 3 × 105 خلايا لكل بئر في 24 لوحا جيدا واحتضان الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسائط إلى وسائط جديدة وكاملة ، وستكون الخلايا جاهزة للعدوى أو العلاج ببروتينات ترشيح المزرعة.
  2. معالجة البلاعم البريتونية ببروتينات ترشيح الثقافة
    1. خذ خلايا البلاعم إلى BSL-3 واحتفظ بها في الحاضنة. عالج الخلايا ببروتينات ترشيح مزرعة 1 مجم / مل (الشكل 3). احصد الخلايا في نقاط زمنية مختلفة من 4 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة بعد معالجة الترشيح بعد الزراعة.
      1. قم بزرع خلايا البلاعم المعزولة في 24 لوحة بئر في ثلاث نسخ في كل نقطة زمنية. عالج الخلايا ب 1 مجم / مل من بروتينات ترشيح المزرعة واحتضانها عند 37 درجة مئوية حاضنة في وجود ثاني أكسيد الكربون2. حصاد الخلايا في ثلاث نقاط زمنية ، 4 ساعات و 24 ساعة و 48 ساعة بعد العلاج.
      2. عالج الخلايا باستخدام i) 2x-lamella buffer لجعل خلايا البلاعم تحلل وتحقق من وجود علامات مختلفة للخلايا المضيفة عن طريق إجراء النشاف الغربي ، و ii) مخازن مؤقتة مختلفة للمقايسات المناعية التي يوفرها المصنعون جنبا إلى جنب مع المجموعات.
    2. قم بإعداد محللات الخلايا للمضيف والتحقق من وجود علامات مختلفة ، وتوصيف السيتوكين للخلايا المضيفة ، وتعبيرات بروتين مسار الإشارات المختلفة على خلايا البلاعم المعالجة بالترشيح المزروعة.
      ملاحظة: إذا كان المختبر يحتوي على طفرة بديلة للجين لبروتين المسار الإفرازي ، فيمكن استخدام مرشحات الثقافة المحضرة من Mtb H37Rv وطفرة Mtb لتقييم تأثيرها على معلمات المعدل المناعي للمضيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

في هذا البروتوكول ، أظهرنا عزل بروتينات ترشيح الثقافة عن البكتيريا الفطرية (الشكل 1 أ). ثم تم فحص بروتينات ترشيح المزرعة بحثا عن علامات مختلفة لتأكيد عزل ترشيح المزرعة. كما هو مذكور في البروتوكول ، تم إجراء تلطيخ Coomassie للتحقق من تحميل البروتين. يمكن للمرء أن يلاحظ نطاق بروتيني مخططا في جزء WCL (في الممر الأخير الشكل 1 ب) ، بينما في ممرات CF (ترشيح الثقافة) ، لم تكن جميع البروتينات مرئية ، وكان تحميل البروتين في جميع الممرات متساويا. تم إجراء اللطخات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يتعلق أحد مجالات البحث الهامة بفهم التسبب في Mtb وتطوير التشخيص واللقاحات الفعالة22،23. إن عزل بروتينات ترشيح الثقافة عن وسائط زراعة Mtb هي عملية تمكن من تحديد عوامل الفوعة التي يفرزها العامل الممرض. ينتج عن التحقيق في دور البروتينات الإفرازية في تعديل التسبب في Mtb رؤى ميكانيكية وقد يوفر أيضا مرشحين للتدخل العلاجي. أظهرت الدراسات أن مرشح ثقافة H37Rv يحتوي على بروتينات تعدل توازن الخلية المضيفة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 وميكرو ؛ م مرشحات الحقنةmdiSYPL0601MNXX204
0.2 & micro; م غشاء النيتروسليلوزAmersham10600001
37٪ HClMerckH1758
AcetoneEMPLURA MERCKSL9F690866
AcetonytrileSigma-Aldrich34851-2L
AcrylamideBIORAD1610107
AlbuminBio Basic CanadaCat No: AD0023
Amicon ألترا 15ميرك ، ميليبورUFC900396
الأمونيوم كربونات حيويةسيجما ألدريتش09830-500G
الأمونيوم بيرسولباهسيجما ألدريتشA3678-100G
مضاد ل Ag85BAbcamAB43019
المضاد للفأر HRP مترافق الجسم المضاد الثانويثيرمو فيشر62-6520
الهليونسيجما ألدريتشA0884-500G
مكرر أكريلاميدSIGMA146072-500G
BSAMerckMB083-500G
C-18 العمودThermo FischerSEM SS18V
Catalase سيجما ألدريتشC1345
حامض الستريكسيجما-ألدريتشC0759-500G
سكر العنبسيجما-ألدريتشG7021-1KG
Difco Middle brook 7H9 مرق    فيشر Scientific271310
أمونيوم الحديديك (III) ستراتسيجما ألدريتشF5879-100G
حمض الفورميك 98-100٪ميركZ0823704246
حمض الخليك الجليدي 100٪ميركCD0C700160
جلايسينسيجما ألدريتشG8898-1KG
جلايسينسيجماG8898-1KG
GycerolSigma-AldrichG5516
Immobilion Western Chemiluminescent HRP الركيزةMerckWBKLS0500
IodoacetamideAmershamRPN6302V
كبريتات المغنيسيومSigma-AldrichM7506-500G
Mycobroswer
حمض الأوليكSigmaCat No: O1008
بيرس BCA اختبار الفحصثيرمو فيشر23225
بيرس تريبسين بروتازثيرمو فيشر90058
Proteome Discoverer 2.0Thermo Fischer Scientific
Q-Exactive HF (Thermo Scientific) (تجارب البروتينات - تسلسل الببتيد وتحديد البروتين والقياس الكمي)ثيرمو فيشر العلمي
كلوريد الصوديومسيجماالقط رقم: S3014
كلوريد الصوديومسيجما-ألدريتشS7773-1KG
كبريتات دوديسيل الصوديومسيجما-ألدريتشL3771-1KG
TCEPسيجما-ألدريتشC4706-25
TemedSigma-AldrichT9281-100ML
تريس بيسBioRad161-0719
Tris-HClAMRESCO0234-500G
Tween 80Sigma-AldrichP1754
UniProt قاعدة
UreaMP Bio194857
كيت بيانات البروتين

المراجع

  1. Campbell, I. A., Bah-Sow, O. Pulmonary tuberculosis: diagnosis and treatment. Br Med J. 332 (7551), 1194-1197 (2006).
  2. Sonnenberg, M. G., Belisle, J. T. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture filtrate proteins by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65 (11), 4515-4524 (1997).
  3. Burts, M. L., Williams, W. A., DeBord, K., Missiakas, D. M. EsxA and EsxB are secreted by an ESAT-6-like system that is required for the pathogenesis of Staphylococcus aureus infections. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (4), 1169-1174 (2005).
  4. Braunstein, M., Brown, A. M., Kurtz, S., Jacobs, W. R. Jr Two nonredundant SecA homologues function in Mycobacteria. J Bacteriol. 183 (24), 6979-6990 (2001).
  5. Feltcher, M. E., et al. Label-free quantitative proteomics reveals a role for the Mycobacterium tuberculosis SecA2 pathway in exporting solute binding proteins and Mce transporters to the cell wall. Mol Cell Proteomics. 14 (6), 1501-1516 (2015).
  6. McDonough, J. A., Hacker, K. E., Flores, A. R., Pavelka, M. S. Jr, Braunstein, M. The twin-arginine translocation pathway of Mycobacterium smegmatis is functional and required for the export of mycobacterial beta-lactamases. J Bacteriol. 187 (22), 7667-7679 (2005).
  7. Saint-Joanis, B., et al. Inactivation of Rv2525c, a substrate of the twin arginine translocation (Tat) system of Mycobacterium tuberculosis, increases beta-lactam susceptibility and virulence. J Bacteriol. 188 (18), 6669-6679 (2006).
  8. Braunstein, M., Espinosa, B. J., Chan, J., Belisle, J. T., Jacobs, W. R. Jr SecA2 functions in the secretion of superoxide dismutase A and in the virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 48 (2), 453-464 (2003).
  9. Zulauf, K. E., Sullivan, J. T., Braunstein, M. The SecA2 pathway of Mycobacterium tuberculosis exports effectors that work in concert to arrest phagosome and autophagosome maturation. PLoS Pathog. 14 (4), e1007011(2018).
  10. Guinn, K. M., et al. Individual RD1-region genes are required for export of ESAT-6/CFP-10 and for virulence of Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol. 51 (2), 359-370 (2004).
  11. Lewis, K. N., et al. Deletion of RD1 from Mycobacterium tuberculosis mimics bacille Calmette-Guerin attenuation. J Infect Dis. 187 (1), 117-123 (2003).
  12. Kana, B. D., et al. The resuscitation-promoting factors of Mycobacterium tuberculosis are required for virulence and resuscitation from dormancy but are collectively dispensable for growth in vitro. Mol Microbiol. 67 (3), 672-684 (2008).
  13. Russell-Goldman, E., Xu, J., Wang, X., Chan, J., Tufariello, J. M. A Mycobacterium tuberculosis Rpf double-knockout strain exhibits profound defects in reactivation from chronic tuberculosis and innate immunity phenotypes. Infect Immun. 76 (9), 4269-4281 (2008).
  14. Biketov, S., et al. The role of resuscitation promoting factors in pathogenesis and reactivation of Mycobacterium tuberculosis during intra-peritoneal infection in mice. BMC Infect Dis. 7, 146(2007).
  15. Verma, R., et al. Quantitative proteomic and phosphoproteomic analysis of H37Ra and H37Rv strains of Mycobacterium tuberculosis. J Proteome Res. 16 (4), 1632-1645 (2017).
  16. Malakar, B., et al. Phosphorylation of CFP10 modulates Mycobacterium tuberculosis. mBio. 14 (5), e0123223(2023).
  17. Lochab, S., Singh, Y., Sengupta, S., Nandicoori, V. K. Mycobacterium tuberculosis exploits host ATM kinase for survival advantage through SecA2 secretome. Elife. 9, e51466(2020).
  18. Kurtz, S., McKinnon, K. P., Runge, M. S., Ting, J. P., Braunstein, M. The SecA2 secretion factor of Mycobacterium tuberculosis promotes growth in macrophages and inhibits the host immune response. Infect Immun. 74 (12), 6855-6864 (2006).
  19. Sullivan, J. T., Young, E. F., McCann, J. R., Braunstein, M. The Mycobacterium tuberculosis SecA2 system subverts phagosome maturation to promote growth in macrophages. Infect Immun. 80 (3), 996-1006 (2012).
  20. Putim, C., et al. Secretome profile analysis of multidrug-resistant, monodrug-resistant and drug-susceptible Mycobacterium tuberculosis. Arch Microbiol. 200 (2), 299-309 (2018).
  21. Naz, S., Dabral, S., Kumar, D., Nandicoori, V. K. Protocol for ex vivo competition and sequencing of Mycobacterium isolated from infected guinea pigs. STAR Protoc. 3 (4), 101804(2022).
  22. Xu, D. D., et al. Discovery and identification of serum potential biomarkers for pulmonary tuberculosis using iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics. 14 (2-3), 322-331 (2014).
  23. Prasad, T. S., et al. Proteomic analysis of purified protein derivative of Mycobacterium tuberculosis. Clin Proteomics. 10 (1), 8(2013).
  24. Miller, B. K., et al. Mycobacterium tuberculosis SatS is a chaperone for the SecA2 protein export pathway. Elife. 8, e40063(2019).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

البروتينات الإفرازيةأنظمة الإفرازمطيافية الكتلةتركيز البروتينعوامل الضراوة البكتيريةالتعديل المناعي للمضيفالطرد المركزي
تحضير مزرعة المتفطرة السلية لفهم التسبب في السل
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.